BR102013001773A2 - evento de algodão pdab4468.19.10.3 tolerante a herbicidas - Google Patents

Abstract

evento de algodão pdab4468.19.1o.3 tolerante a herbicidas. a presente invenção refere-se a um evento de algodão pdab4468.19.1o.3 que compreende genes que codificam aad-12 e pat, fornecendo tolerância a herbicidas às plantações de algodão que contêm o evento e possibilitando métodos para proteção da plantação

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EVENTO DE ALGODÃO pDAB4468.19.10.3 TOLERANTE A HERBICIDAS".

REIVINDICAÇÃO PRIORITÁRIA

Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. de Série 61/589.594, depositado em 23 de janeiro de 2012.

ANTECEDENTES O gene que codifica AAD-12 (ariloxialcanoato dioxigenase-12) é capaz de conferir níveis comerciais de tolerância aos herbicidas de ácido fenoxiacético, 2,4-D e MCPA e os herbicidas de ácido piridiloxiacético, triclo-pir e fluroxipir, quando expresso em plantas transgênicas. O gene que codifica PAT (fosfinotricina acetiltransferase) é capaz de conferir tolerância ao herbicida fosfinotricina (glufosinato) quando expresso em plantas transgênicas. PAT foi expresso de forma bem sucedida no algodão para uso tanto como um marcador selecionável na produção de plantas de cultivo transgênicas quanto para conferir níveis comerciais de tolerância ao herbicida glufosinato em plantas transgênicas. É sabido que a expressão de transgenes em plantas é influenciada por sua localização no genoma da planta, talvez devido à estrutura da cromatina (por exemplo, heterocromatina) ou à proximidade dos elementos reguladores da transcrição (por exemplo, intensificadores) próximos ao sítio de integração (Weising e outros, Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988). Ao mesmo tempo a presença do transgene em localizações diferentes no genoma influenciará o fenótipo geral da planta de maneiras diferentes. Por esta razão, é frequentemente necessário verificar um grande número de eventos transgênicos com a finalidade de identificar um evento transgênico específico caracterizado pela expressão ótima de um gene introduzido de interesse. Por exemplo, foi observado em plantas e outros organismos que podia haver uma ampla variação nos níveis de expressão de um gene introduzido entre os eventos. Pode também haver diferenças nos padrões espaciais ou temporais de expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos de plantas, que podem não corresponder aos padrões esperados partindo de elementos reguladores transcricionais presentes na construção gênica introduzida. Por esta razão, é comum produzir centenas até milhares de eventos diferentes e verificar tais eventos em relação a um único evento que possui níveis de expressão do transgene desejado e padrões para finalidades comerciais. Um evento que possui níveis desejados ou padrões de expressão do transgene é útil para a introgressão do transgene dentro de outras estruturas genéticas através de cruzamento sexual utilizando métodos de cruzamento convencionais. A progênie de tais cruzamentos mantém as características de expressão do transgene do transformante original. Esta estratégia é utilizada para garantir uma expressão gênica confiável em um número de variedades que são bem adaptadas às condições de crescimento locais. É desejável ser capaz de detectar a presença de um evento particular com a finalidade de determinar se a progênie de um cruzamento sexual contém um transgene ou um grupo de transgenes de interesse. Em adição, um método para a detecção de um evento particular seria útil para cumprir os regulamentos que requerem a aprovação pré-mercado e a rotula-ção de alimento ou fibra derivada de plantas de cultivo recombinantes, por exemplo, ou para uso no monitoramento ambiental, monitoramento das características nas plantas de cultivo no campo ou monitoramento de produtos derivados de uma colheita de plantas de cultivo, bem como para uso garantindo o cumprimento do objetivo das partes em termos reguladores ou contratuais. É possível detectar a presença de um evento transgêníco através de qualquer método de detecção de ácido nucleico conhecido na arte incluindo, mas não limitado à reação em cadeia da polimerase (PCR) ou hi-bridização de DNA utilizando sondas de ácido nucleico. Estes métodos de detecção geralmente se concentram nos elementos genéticos frequentemente utilizados, tais como promotores, terminadores, genes marcadores etc., porque para muitas construções de DNA, a região codificadora é inter-cambiável. Como um resultado, tais métodos podem não ser úteis para discriminar entre eventos diferentes, particularmente aqueles produzidos utili- zando a mesma construção de DNA ou construções muito similares a não ser que a sequência de DNA do DNA flanqueador adjacente ao DNA heteró-logo inserido seja conhecida. Por exemplo, um ensaio de PCR específico ao evento é descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos da América 2006/0070139 para o evento de milho DAS-59122-7. Seria desejável ter um método simples e discriminador para a identificação do evento de algodão pDAB4468.19.10.3.

DESCRIÇÃO A presente invenção refere-se a um novo evento de transformação de algodão transgênico tolerante a herbicida, denominado como evento de algodão pDAB4468.19.10.3, que compreende aad-12 e pat, como descrito aqui, inseridos dentro de um sítio específico dentro do genoma de uma célula de algodão. Uma semente de algodão representativa foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) com o No. de Acesso identificado no parágrafo [0032], O DNA de plantas de algodão que contém este evento inclui as sequências de junção/flanqueadoras descritas aqui que caracterizam a localização do DNA inserido dentro do genoma do algodão. A SEQ ID NO:1 e a SEQ ID NO:2 são diagnosticas para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Mais particularmente, sequências que circundam as junções nos bp 1354/1355 da SEQ ID NO:1 e bp 168/169 da SEQ ID NO:2 são diagnosticas para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. O parágrafo [0013] a seguir descreve exemplos de sequências que compreendem estas junções que são características do DNA de plantas de algodão que contêm o evento de algodão pDAB4468.19.10.3.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma planta de algodão ou parte da mesma, que é tolerante aos herbicidas de ácido fenoxiacético tais como 2,4-D e MCPA. Em outra modalidade, a invenção fornece uma planta de algodão ou parte da mesma, que é tolerante aos herbicidas de á-cido piridiloxiacético tais como triclopir e fluroxipir. Em uma modalidade adicional a invenção fornece uma planta de algodão que possui um genoma que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1329-1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 - 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas. Em outra modalidade, a invenção fornece semente de tais plantas.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma planta de algodão ou parte da mesma, que é tolerante a compostos que são convertidos a herbicidas de auxina fenoxiacetato tais como 2,4-D e MCPA (por exemplo, 2,4-DB, MCPB etc.). Em uma modalidade adicional, a invenção fornece uma planta de algodão ou parte da mesma, que é tolerante a compostos que são convertidos em herbicidas de ácido piridiloxiacético tais como triclopir e flu-roxipir (por exemplo, tríclopirB, fluroxipirB etc.). O grupamento do ácido butí-rico presente em herbicidas de auxina fenoxiacetato e do ácido piridiloxiacé-tico é convertido através de β-oxidação na forma fitotóxica dos herbicidas. As formas de ácido butanóico dos herbicidas são por si só não herbicidas. Estas são convertidas em sua respectiva forma ácida através de β-oxidação dentro de plantas suscetíveis (isto é, plantas de algodão) e é a forma de ácido acético do herbicida que é fitotóxica. As plantas incapazes de β-oxidação rápida não são danificadas pelos herbicidas de ácido butanóico. Entretanto, as plantas que são capazes de β-oxidação rápida e podem converter o herbicida de ácido butanóico na forma acética são subsequentemente protegidas por AAD-12. Consequentemente, a invenção fornece uma planta de algodão que possui um genoma que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1329 — 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 -1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118-219 da SEQ ID NO:2; bp 68-269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas, que são diagnósticos para a presença do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Em outra modalidade, a invenção fornece sementes de tais plantas.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método de controle de ervas daninhas em uma plantação de algodão que compreende a apli- cação herbicidas de ácido fenoxiacético tais como 2,4-D e MCPA, à plantação de algodão, em que a plantação de algodão compreende plantas de algodão que possuem um genoma que contém uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1329 — 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 -1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118-219 da SEQ ID NO:2; bp 68 -269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas, que são diagnósticos para a presença do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Em outra modalidade, a invenção fornece um método de controle de ervas daninhas em uma plantação de algodão que compreende a aplicação de herbicidas de ácido piridíloxíacético, tais como triclopir e fluroxipir, na plantação de algodão, em que a plantação de algodão compreende plantas de algodão que possuem um genoma que contém uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1329 - 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 -1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254- 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154- 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118-219 da SEQ ID NO:2; bp 68-269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 -369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas, que são diagnósticos para a presença do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. A presença do gene aad-12 no evento de algodão pDAB4468.19.10,3 confere tolerância a herbicidas de ácido fenoxiacético e herbicidas de ácido piridiloxiacético.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método de controle de ervas daninhas em uma plantação de algodão que compreende a aplicação de herbicida glufosinato na plantação de algodão, a dita plantação de algodão compreendendo plantas de algodão que possuem um genoma que contém uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp1329 - 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 - 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO: 1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas, que são diagnósticos para a presença de evento de algodão pDAB4468.19.10.3. A presença do gene pat no evento de algodão pDAB4468.19.10.3 confere tolerância ao herbicida glufosinato.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método de detecção do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 em uma amostra que compreende DNA de algodão, o dito método compreendendo: (a) o contato da dita amostra com um primeiro iniciador com pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência flanqueadora dentro dos bp 1 — 1354 da SEQ ID NO:1 ou o complemento da mesma e um segundo iniciador com pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de inserto dentro dos bp 1355 -1672 da SEQ ID NO:1 ou o complemento da mesma; e (b) a análise em relação a um amplicon gerado entre os ditos iniciadores; ou (c) o contato da dita amostra com um primeiro iniciador com pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de inserto dentro dos bp 1 - 168 da SEQ ID NO:2 ou o complemento da mesma e um segundo iniciador com pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência flanqueadora dentro dos bp 169 -2898 da SEQ ID NO:2 ou o complemento da mesma; e (d) a análise em relação a um amplicon gerado entre os ditos iniciadores.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método de detecção do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 que compreende: (a) o contato da dita amostra com um primeiro iniciador que se liga seletivamente a uma sequência flanqueadora selecionada do grupo que consiste em bp 1 — 1354 da SEQ ID NO:1 e bp 169 — 2898 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas; e um segundo iniciador que se liga seletivamente à SEQ ID NO:3 ou ao complemento da mesma; (b) submeter a dita amostra à reação em cadeia da polime- rase;e (c) a análise em relação a um amplicon gerado entre os ditos iniciadores.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método de cruzamento de uma planta de algodão que compreende: o cruzamento de uma primeira planta com uma segunda planta de algodão para produzir uma terceira planta de algodão, a dita primeira planta compreendendo DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1329 - 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 - 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 -1655 da SEQ ID NO:1; bp 143-194 da SEQ ID NO:2; bp 118-219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas; e a análise da dita terceira planta de algodão em relação à presença do DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1329 - 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 -1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118-219 da SEQ ID NO:2; bp 68-269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma molécula de DNA isolada que é diagnostica para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Tais moléculas incluem, em adição às SEQ ID NOS: 1 e 2, moléculas de pelo menos 50 bp de comprimento que compreendem uma sequência de polinu-cleotídeo que abrange a junção dos bp 1354/1355 da SEQ ID NO:1 e moléculas de pelo menos 50 bp de comprimento que compreendem uma sequência de polinucleotídeo que abrange a junção dos bp 168/169 da SEQ ID NO:2. Os exemplos são bp 1329 — 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 — 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254- 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154- 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas.

Em outra modalidade, a invenção fornece fibra, grão, semente, óleo de semente ou farinha grossa de semente de algodão que compreende o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 na dita fibra, grão, semente, óleo de semente ou farinha grossa de semente que é demonstrado pela dita fibra, grão, semente, óleo de semente ou farinha grossa de semente que compreende DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1329 — 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 — 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254- 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154- 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO: 1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 -219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas.

As modalidades da invenção incluem ainda células de planta de algodão e partes da planta que incluem, mas não são limitadas a, pólen, óvulos, flores, brotos, raízes e folhas e núcleos de células vegetativas, células de pólen, células de semente, óleo de semente e farinha grossa de semente e óvulo, que contêm o evento de algodão pDAB4468.19.10.3.

Em algumas modalidades, o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 pode ser combinado com outras características, incluindo, por exemplo, outro(s) gene(s) de tolerância a herbicida e/ou proteínas inibidoras de insetos e sequências reguladoras da transcrição (isto é, interferência com RNA, dsRNA, fatores de transcrição etc.). As características adicionais podem ser acumuladas dentro do genoma da planta através de cruzamento de plantas, re-transformação da planta transgênica que contém o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 ou adição de novas características através de integração direcionada via recombinação homóloga.

Outras modalidades incluem a excisão de sequências de polinu-cleotídeo que compreendem o evento de algodão pDAB4468.19.10.3, incluindo por exemplo, o cassete de expressão do gene pat Após a excisão de uma sequência de polinucleotídeo, o evento modificado pode ser redirecionado para um sítio cromossômico específico em que sequências de polinucleotídeo adicionais são acumuladas com o evento de algodão pDAB4468.19.10.3.

Em uma modalidade, a presente invenção abrange um sítio alvo cromossômico de algodão localizado no cromossomo 3 do subgenoma A entre as sequências flanqueadoras apresentadas nas SEQ ID NOS:1 e 2.

Em uma modalidade, a presente invenção abrange um método de produção de uma planta de algodão transgênica que compreende a inserção de um ácido nucleico heterólogo em uma posição do cromossomo 3 do subgenoma A entre as sequências genômicas apresentadas nas SEQ ID NOS:1 e 2, isto é, entre bp 1 — 1354 da SEQ ID NO:1 e bp 169 — 2898 da SEQ ID NO:2.

Adicionalmente, as modalidades da invenção fornecem ainda ensaios para a detecção da presença do evento de objetivo em uma amostra (de fibras de algodão, por exemplo). Os ensaios podem ser baseados na sequência de D NA da construção recombinante, inserida dentro do genoma do algodão e nas sequências genômicas que flanqueiam o sítio de inserção. Os kits e as condições úteis na condução dos ensaios também são fornecidos.

As modalidades da invenção referem se ainda em parte à clonagem e à análise das sequências de DNA das regiões de borda que resultam da inserção de T-DNA proveniente do pDAB4468 em linhagens de algodão transgênicas. Estas sequências são únicas. Com base nas sequências de inserto e de junção, iniciadores específicos ao evento podem ser e foram gerados. A análise de PCR demonstrou que estes eventos podem ser identificados através da análise dos amplicons de PCR gerados com estes conjuntos de iniciadores específicos ao evento. Assim, estes e outros procedimentos relacionados podem ser utilizados para identificar exclusivamente linhagens de algodão que compreendem o evento da presente invenção.

Uma modalidade fornece um método de controle de ervas daninhas em uma plantação de algodão que compreende a aplicação de herbicida de ácido fenoxiacético na plantação de algodão, a dita plantação de algodão compreendendo plantas de algodão que compreendem DNA que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 1329 — 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 - 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2. Em um aspecto adicional deste método, o herbicida de ácido fenoxiacético é 2,4-D. Em um as- pecto adicional deste método, o herbicida de ácido fenoxiacético é MCPA.

Uma modalidade fornece um método de controle de ervas daninhas em uma plantação de algodão que compreende a aplicação de herbicida de ácido piridiloxiacético na plantação de algodão, a dita plantação de algodão compreendendo plantas de algodão que compreendem DNA que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 1329 - 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 - 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054- 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2. Em um aspecto adicional deste método, o herbicida de ácido piridiloxiacético é triclopír. Em um aspecto adicional deste método, o herbicida de ácido piridiloxiacético é fluroxipir.

Uma modalidade fornece um método de controle de ervas daninhas em uma plantação de algodão que compreende a aplicação de herbicida glufosinato na plantação de algodão, a dita plantação de algodão compreendendo plantas de algodão que compreendem DNA que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 1329 - 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 - 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2.

Uma modalidade fornece uma sequência de DNA isolada que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1329 - 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 - 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 -1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2.

Uma modalidade fornece um método de cruzamento de uma planta de algodão que compreende: o cruzamento de uma primeira planta com uma segunda planta de algodão para produzir uma terceira planta de algodão, a dita primeira planta compreendendo DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1329 — 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154- 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas; e a análise da dita terceira planta de algodão em relação à presença de DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1329 - 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 - 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 — 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas.

Uma modalidade fornece uma molécula de DNA isolada que compreende uma sequência de junção que compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 1329 - 1380 da SEQ ID NO: 1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154-1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054-1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 -194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas.

Uma modalidade fornece uma semente de algodão que compreende em seu genoma uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em resíduos 1329 - 1380 da SEQ ID NO:1; resíduos 1304 — 1405 da SEQ ID NO:1; resíduos 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; resíduos 1154 -1555 da SEQ ID NO:1; resíduos 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; resíduos 143 - 194 da SEQ ID NO:2; resíduos 118 - 219 da SEQ ID NO:2; resíduos 68 -269 da SEQ ID NO:2; e resíduos 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas. Uma modalidade adicional fornece uma semente de algodão que compreende em seu genoma o evento de algodão AAD-12/PAT pDAB4468.19.10.3 e que possui uma semente de algodão representativa depositada na Type Culture Collection sob o No. de Acesso PTA-12457. Uma modalidade adicional fornece uma planta de algodão produzida através do crescimento de uma semente de algodão de qualquer uma destas duas modalidades. Uma modalidade adicional fornece uma semente de algodão produzida por esta planta de algodão, em que a dita semente compreende em seu genoma o evento de algodão AAD-12/PAT pDAB4468.19.10.3 que está presente em uma semente de algodão depositada na American Type Culture Collection sob o No. de Acesso PTA-12457. Uma modalidade adicional fornece uma parte desta planta de algodão, em que a dita parte é selecionada do grupo que consiste em pólen, óvulo, flores, cápsulas, brotos, raízes e folhas e a dita parte compreende o dito evento. Uma modalidade adicional fornece uma composição derivada da planta de algodão ou uma parte da mesma, em que a dita composição é um produto consumível selecionado do grupo que consiste em farinha grossa de algodão, fibra de algodão e óleo de algodão.

Em uma modalidade adicional, a planta de algodão compreende uma sequência de DNA que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com resíduos 1.355 — 7.741 da SEQ ID NO:21. Uma modalidade fornece uma progênie de planta de algodão da planta da modalidade anterior, em que a dita planta exibe tolerância aos herbicidas de ácido fenoxiacéti-co, de ácido piridiloxiacético e glufosinato e a dita tolerância é devida à expressão de uma proteína codificada no dito evento ou no dito genoma.

Uma modalidade adicional fornece uma semente de algodão que compreende um genoma que compreende uma sequência de DNA que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:21. Uma modalidade adicional fornece uma planta produzida através do crescimento desta semente de algodão.

Uma modalidade fornece uma planta de algodão transgênica ou parte da mesma que compreende o evento de algodão pDAB4468.19.10.3, em que sementes de algodão representativas que compreendem o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foram depositadas na American Type Culture Collection sob o No. de Acesso PTA-12457.

Depósito de Sementes Como parte desta descrição pelo menos 2500 sementes de uma linhagem de algodão que compreende o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foram depositadas e tornadas disponíveis ao público sem restrição (mas sujeitas aos direitos de patente), na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. O depósito, denominado como No. de Depósito na ATCC PTA-12457, foi feito em nome da Dow AgroSciences LLC em 23 de janeiro de 2012. Este depósito foi feito e será mantido de acordo com e sob os termos do Tratado de Budapeste em relação aos depósitos de sementes para as finalidades de procedimento de patente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS A SEQ ID NO:1 é a sequência de borda flanqueadora de DNA a 5’ para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Os nucleotídeos 1 - 1354 são a sequência genômica. Os nucleotídeos 1355 — 1672 são a sequência de inserto. A SEQ ID NO:2 é a sequência de borda flanqueadora de DNA a 3' para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Os nucleotídeos 1 - 168 são a sequência de inserto. Os nucleotídeos 169 - 2898 são a sequência genômica. A SEQ ID NO:3 é a sequência de DNA do filamento T de pDAB4468, que é detalhada abaixo na Tabela 1. A SEQ ID NO:4 é o iniciador de oligonucleotídeo 3endG1 para confirmação de DNA genômico de borda a 3’. A SEQ ID NO:5 é o iniciador de oligonucleotídeo 3endG2 para confirmação de DNA genômico de borda a 3’. A SEQ ID NO:6 é o iniciador de oligonucleotídeo 3endG3 para confirmação de DNA genômico de borda a 3’. A SEQ ID NO:7 é o iniciador de oligonucleotídeo 5endG1 para confirmação de DNA genômico de borda a 5’. A SEQ ID NO:8 é o iniciador de oligonucleotídeo 5endG2 para confirmação de DNA genômico de borda a 5’. A SEQ ID NO:9 é o iniciador de oligonucleotídeo 5endG3 para confirmação de DNA genômico de borda a 5’. A SEQ ID NO:10 é o iniciador de oligonucleotídeo 5endT1 para confirmação de DNA genômico de borda a 5’. A SEQ ID NO:11 é o iniciador de oligonucleotídeo 5endT2 para confirmação de DNA genômico de borda a 5’. A SEQ ID NO:12 é o iniciador de oligonucleotídeo 5endT3 para confirmação de DNA genômico de borda a 5’. A SEQ ID NO:13 é o iniciador de oligonucleotídeo 3endT1 para confirmação de DNA genômico de borda a 3’. A SEQ ID NO:14 é o iniciador de oligonucleotídeo 3endT2 para confirmação de DNA genômico de borda a 3’. A SEQ ID NO:15 é o iniciador de oligonucleotídeo 3endT3 para confirmação de DNA genômico de borda a 3’. A SEQ ID NO:16 é o iniciador de oligonucleotídeo BACG6 para confirmação de DNA genômico de borda a 5’. A SEQ ID NO:17 é o iniciador de oligonucleotídeo UbiRev para confirmação de DNA genômico de borda a 5’. A SEQ ID NO:18 é o iniciador de oligonucleotídeo GHBACA6 para confirmação de DNA genômico de borda a 5’. A SEQ ID NO:19 é o iniciador de oligonucleotídeo AAD3B1 para confirmação de DNA genômico de borda a 5’. A SEQ ID NO:20 é o iniciador de oligonucleotídeo 5endPLs para confirmação de DNA genômico de borda a 5’.

A SEQ ID NO:21 é a sequência do evento de algodão pDAB4468.19.10.3, incluindo a sequência genômica flanqueadora a 5', inser-to de filamento T de pDAB4468 e sequência genômica flanqueadora a 3'. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é um mapa de plasmídeo de pDAB4468 que contém os cassetes de expressão dos genes aad-12 e pat. A Figura 2 representa as localizações dos iniciadores para a confirmação da sequência de borda a 5' e a 3' do evento de algodão pDAB4468.19.10.3.

MODOÍS) PARA A REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

Ambas as extremidades da inserção pDAB4468.19.10.3 de al- godão foram sequenciadas e caracterizadas. Ensaios específicos ao evento foram desenvolvidos. O evento foi mapeado sobre o genoma de algodão (cromossomo 3 do subgenoma A). O evento pode sofrer introgressão em linhagens de elite adicionais. Como é feita referência anteriormente na seção de Fundamentos, a introdução e a integração de um transgene dentro de um genoma de planta envolve alguns eventos aleatórios (assim o nome "evento" para certa inserção que é expressa). Isto é, com muitas técnicas de transformação tais como transformação com Agrobacterium, a transformação bio-lística (isto é, pistola gênica) e transformação mediada por carbureto de silício (isto é, WHISKERS), não pode ser previsto onde no genoma um transgene ficará inserido. Assim, a identificação do DNA genômico da planta flan-queador em ambos os lados do inserto é importante para a identificação de uma planta que possui certo evento de inserção. Por exemplo, podem ser planejados iniciadores da PCR que geram um amplicon de PCR ao longo da região de junção do inserto e o genoma do hospedeiro. Este amplicon de PCR pode ser utilizado para identificar um tipo exclusivo ou distinto de evento de inserção.

As definições e os exemplos são fornecidos aqui para ajudar a descrever as modalidades da presente invenção e para guiar os peritos comuns na arte na prática de tais modalidades. A não ser que seja citado de outra maneira, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional pelos peritos comuns na arte relevante. A nomenclatura para bases de DNA como é apresentado em 37 CFR §1.822 é utilizada.

Como utilizado aqui, o termo "progênie" significa a prole de qualquer geração de uma planta parental que compreende o evento de algodão pDAB4468.19.10.3.

Um "evento" transgênico é produzido através da transformação de células vegetais com DNA heterólogo, isto é, uma construção de ácido nucleico que inclui os transgenes de interesse, a regeneração de uma população de plantas resultando da inserção do transgene dentro do genoma da planta e a seleção de uma planta particular caracterizada pela inserção dentro de uma localização no genoma particular. O termo "evento" refere-se ao transformante original e à progênie do transformante que inclui o DNA hete-rólogo. O termo "evento" refere-se ainda à progênie produzida por um cruzamento sexual entre o transformante e outra variedade que inclui o DNA genômico/transgênico. Mesmo após retrocruzamentos repetidos com um parental recorrente, o DNA do transgene inserido e o DNA genômico flan-queador (DNA genômico/transgênico) do parental transformado estão presentes na progênie do cruzamento na mesma localização cromossômica. O termo "evento" refere-se ainda ao DNA do transformante original e progênie do mesmo que compreende o DNA inserido e a sequência genômica flan-queadora imediatamente adjacente ao DNA inserido, que seria esperado que fosse transferido para uma progênie que recebe o DNA inserido incluindo o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e a progênie que resulta do autocruzamento) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido.

Uma "sequência de junção" ou uma "sequência de borda” a-brange o ponto em que o DNA inserido dentro do genoma está ligado ao DNA do genoma nativo do algodão que flanqueia o ponto de inserção, a i-dentificação ou a detecção de uma ou das outras sequências de junção em um material genético de planta sendo suficiente para ser diagnostica para o evento. São incluídas as sequências de DNA que abrangem as inserções nos eventos de algodão descritos aqui e comprimentos similares de DNA flanqueador. Os exemplos específicos de tais sequências de diagnóstico são fornecidos aqui; entretanto, outras sequências que se sobrepõem às junções das inserções ou às junções das inserções e à sequência genômica, são também diagnosticas e poderíam ser utilizadas de acordo com as modalidades da invenção.

As modalidades da invenção referem-se em parte à identificação de eventos utilizando tais sequências flanqueadoras, de junção e de inserto. Os iniciadores e os amplicons da PCR relacionados são incluídos nas modalidades da invenção. De acordo com as modalidades da presente invenção, os métodos de análise de PCR utilizando amplicons que se estendem ao longo do DNA inserido e suas bordas podem ser utilizados para detectar ou identificar variedades de algodão transgênicas comercializadas ou linhagens derivadas das linhagens de algodão transgênicas de propriedade de objetivo.

As sequências flanqueadoras/de junção são diagnosticas para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Com base nestas sequências, foram gerados iniciadores específicos ao evento. A análise de PCR demonstrou que estas linhagens de algodão podem ser identificadas em genótipos de algodão diferentes através da análise dos amplicons de PCR gerados com estes conjuntos de iniciadores específicos ao evento. Assim, estes e outros procedimentos relacionados podem ser utilizados para identificar exclusivamente estas linhagens de algodão. As sequências identificadas aqui são Cínicas.

As técnicas de detecção das modalidades da presente invenção são especialmente úteis em associação ao cruzamento de plantas, para determinar quais plantas da progênie compreendem certo evento, após uma planta parental que compreende um evento de interesse ser cruzada com outra linhagem de planta em um esforço de conferir uma ou mais características de interesse adicionais na progênie. Estes métodos de análise de PCR beneficiam programas de cruzamento de algodão bem como o controle de qualidade, especialmente para sementes de algodão transgênicas comercializadas. Os kits de detecção pela PCR para estas linhagens de algodão transgênicas também podem ser agora produzidos e utilizados. Isto também é benéfico para o registro do produto e para gestão de responsabilidade do produto.

Além disso, sequências flanqueadoras/genômicas de algodão podem ser utilizadas para identificar especificamente a localização genômica de cada inserto. Esta informação pode ser utilizada para produzir sistemas de marcação molecular específicos para cada evento. Estes podem ser utilizados para estratégias de cruzamento aceleradas e para estabelecer dados de ligação.

Ainda adicionalmente, a informação da sequência flanqueadora pode ser utilizada para estudar e para caracterizar os métodos de introgres-são do transgene, características de sítio de integração genômica, classificação dos eventos, estabilidade de transgenes e suas sequências flanquea-doras e expressão gênica (especialmente relacionada ao silenciamento gê-nico, aos padrões de metilação do transgene, aos efeitos de posição e aos elementos relacionados com a expressão tal como MARS [regiões de ligação à matriz] e similares).

Em consideração a toda a presente descrição, deve ser evidente que as modalidades da presente invenção incluem sementes disponíveis sob o No. de Depósito na ATCC identificado no parágrafo [0032]. As modalidades da invenção incluem ainda uma planta de algodão tolerante a herbicida crescida partindo de uma semente depositada com o No. de Depósito na ATCC identificado no parágrafo [0032]. As modalidades da invenção incluem ainda partes da dita planta, tais como folhas, tecido amostras, sementes produzidas pela dita planta, pólen e similares (em que estas partes da planta compreendem aad-12 e pat e SEQ ID NOS:1 e 2).

Ainda adicionalmente, as modalidades da invenção incluem ainda plantas descendentes e/ou de progênie de plantas crescidas partindo da semente depositada, preferencialmente uma planta de algodão resistente a herbicida em que a dita planta possui um genoma que compreende uma sequência de junção/flanqueadora detectável como descrito aqui. Como utilizado aqui, o termo "algodão" significa Gossypium hirsutum e inclui todas as variedades do mesmo que podem ser cruzadas com uma planta de algodão.

Uma planta de algodão tolerante a herbicida de uma modalidade da invenção pode ser cruzada primeiramente através do cruzamento sexual de uma primeira planta de algodão parental que consiste em uma planta de algodão crescida partindo da semente de qualquer uma das linhagens referidas aqui e uma segunda planta de algodão parental, produzindo dessa maneira um grande número de primeiras plantas de progênie; então selecionando uma primeira planta de progênie que é resistente a glufosinato; fazendo autocruzamento da primeira planta de progênie, produzindo dessa maneira um grande número de segundas plantas de progênie; e então sele- cionando das segundas plantas de progênie uma planta que é resistente a glufosinato. Estas etapas podem incluir ainda o retrocruzamento da primeira planta de progênie ou da segunda planta de progênie com a segunda planta de algodão parental ou uma terceira planta de algodão parental. Uma plantação de algodão que compreende sementes de algodão de uma modalidade da invenção ou progênie da mesma, pode ser então obtida.

Também deve ser entendido que duas plantas transgênicas diferentes também podem ser cruzadas produzir prole que contém dois genes exógenos adicionados que se segregam independentemente. O autocruza-mento de progênies apropriadas pode produzir plantas que são homozigotas para ambos os genes exógenos adicionados. O retrocruzamento com uma planta parental e o cruzamento com uma planta não transgênica também são considerados, como é a propagação vegetativa. Outros métodos de cruzamento comumente utilizados para características e plantações diferentes são conhecidos na arte. A produção com retrocruzamento tem sido utilizada para transferir genes para uma característica altamente herdável simplesmente herdada para dentro de um cultivar homozigoto desejável, que é o parental recorrente. A origem da característica que será transferida é chamada de parental doador. É esperado que a planta resultante tenha os atributos do parental recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejada transferida partindo do parental doador. Após o cruzamento inicial, os indivíduos que possuem o fenótipo do parental doador são selecionados e cruzados repetidamente (retrocruzados) com o parental recorrente. É esperado que a planta resultante tenha os atributos do parental recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejável transferida partindo do parental doador.

Similarmente uma planta de algodão tolerante a herbicida de uma modalidade da invenção pode ser transformada com transgenes adicionais utilizando métodos conhecidos na arte. As técnicas de transformação tais como transformação com Agrobacterium, a transformação biolística (isto é, pistola gênica) e transformação mediada por carbureto de silício (isto é, WHISKERS), podem ser utilizadas para introduzir transgene(s) adicional(is) dentro do genoma do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. A seleção e a caracterização de plantas transgênicas que contêm os transgenes recém-inseridos podem ser completadas para identificar plantas que contêm um integrante estável do novo transgene em adição aos genes aad-12 e pat das modalidades da invenção.

As moléculas de D NA das modalidades da presente invenção podem ser utilizadas como marcadores moleculares em um método de cruzamento auxiliado por marcador (MAB). As moléculas de DNA das modalidades da presente invenção podem ser utilizadas nos métodos (tais como, marcadores de AFLP, marcadores de RFLP, marcadores de RAPD, SNPs e SSRs) que identificam características agronomicamente úteis ligadas geneticamente, como é conhecido na arte. As características de tolerância a herbicida podem ser rastreadas na progênie de um cruzamento com uma planta de algodão de modalidades da presente invenção (ou progênie da mesma e qualquer outro cultivar ou variedade de algodão) utilizando os métodos de MAB. As moléculas de DNA são marcadores para esta característica e os métodos de MAB que são bem conhecidos na arte podem ser utilizados para rastrear a(s) característica(s) de tolerância a herbicida nas plantas de algodão em que pelo menos uma linhagem de algodão das modalidades da presente invenção ou progênie da mesma, era um parental ou um ancestral. Os métodos de modalidades da presente invenção podem ser utilizados para identificar qualquer variedade de algodão que possuí o evento de objetivo.

Os métodos das modalidades da presente invenção incluem um método de produção de uma planta de algodão tolerante a herbicida em que o dito método compreende o cruzamento com uma planta de uma modalidade da presente invenção. Mais especificamente, os ditos métodos podem compreender o cruzamento de duas plantas das modalidades da presente invenção ou uma planta de uma modalidade da presente invenção e qualquer outra planta. Os métodos preferidos compreendem ainda a seleção da progênie do dito cruzamento através da análise da dita progênie em relação a um evento detectável de acordo com uma modalidade da presente invenção e desempenho favorável da variedade (por exemplo, rendimento). Por exemplo, as modalidades da presente invenção podem ser utilizadas para rastrear o evento de objetivo através de ciclos de cruzamento com plantas que compreende outras características desejáveis, tais como características agronômicas, tolerância ou resistência a doenças, tolerância ou resistência a nematóides e data de maturidade. As plantas que compreendem o evento de objetivo e a característica desejada podem ser detectadas, identificadas, selecionadas e rapidamente utilizadas em rodadas adicionais de cruzamento, por exemplo. O evento / característica de objetivo também pode ser combinada através do cruzamento e rastreada de acordo com as modalidades da presente invenção, com característica(s) de resistência a insetos adicio-nal(is) e/ou com características de tolerância a herbicidas adicionais. As modalidades das últimas são plantas que compreendem o evento de objetivo combinado com os genes cry1F e crylAc, que conferem resistência a Pseu-doplusia incluemns (lagarta mede-palmo da soja), Anticarsia gemmatalis (Ia-garta-da-soja), Epinotia aporema, Omoides indicatus, Rachiplusia nu, Spo-doptera frugiperda, Spodoptera cosmoides, Spodoptera erídania, Heliothis virescens, Heliocoverpa zea, Spilosoma virginica e Elasmopalpus lignosellus ou com um gene que codifica resistência ao herbicida dícamba.

Assim, as modalidades da presente invenção podem ser combinadas com, por exemplo, características que codificam resistência a glifosa-to (por exemplo, planta resistente ou EPSPS, GOX, GAT bacteriano), resistência a glufosinato (por exemplo, dsm-2, bar), resistência ao herbicida inibidor da acetolactato sintase (ALS) (por exemplo, imidazolinonas [tal como imazetapir], sulfonilureias, triazolopirimidina sulfonanilida, pirmidiniltiobenzo-atos e outros reagentes químicos [Csr1, SurA e outros]), resistência à bro-moxinila (por exemplo, Bxn), resistência a inibidores da enzima HPPD (4-hidroxlfenil-piruvato-díoxigenase), resistência a inibidores de fitoeno dessatu-rase (PDS), resistência a herbicidas que inibem o fotossistema II (por exemplo, psbA), resistência a herbicidas que inibem o fotossistema I, resistência herbicidas que inibem a protoporfirinogênio oxidase IX (PPO) (por exemplo, PPO-1), resistência a herbicidas de fenilureia (por exemplo, CYP76B1), enzimas que degradam dicamba (ver, por exemplo, US 20030135879) e outros poderíam ser acumulados isoladamente ou em várias combinações para fornecer a capacidade de controlar ou prevenir eficientemente alterações de ervas daninhas e/ou resistência a qualquer herbicida das classes mencionadas anteriormente.

Adicionalmente, o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 pode ser combinado com uma ou mais características adicionais de entrada (por exemplo, resistência a insetos, resistência a agentes patogênicos ou tolerância a estresses e outros) ou de saída (por exemplo, maior rendimento, perfil de óleos aprimorado, qualidade aprimorada de fibras e outros). Assim, as modalidades da presente invenção podem ser utilizadas para fornecer uma embalagem agronômica completa de qualidade de planta de cultivo a-primorada com a capacidade de controlar de forma flexível e eficientemente os custos de qualquer número de pragas agronômicas.

Os métodos para integrar uma sequência de polinucleotídeo dentro de um sítio cromossômico específico de uma célula de planta através de recombinação homóloga foram descritos dentro da arte. Por exemplo, a integração específica ao sítio que é descrita na Publicação de Pedido de Patente US No. 2009/0111188 A1, descreve o uso de recombinases ou inte-grases para mediar a introdução de uma sequência de polinucleotídeo doa-dora dentro de um alvo cromossômico. Em adição, o Pedido de Patente Internacional No. WO 2008/021207, descreve a recombinação homóloga mediada por dedos de zinco para integrar uma ou mais sequências de polinucleotídeo doadoras dentro de localizações específicas do genoma. O uso de recombinases tal como FLP/FRT que é descrita na Patente US No. 6,720,475 ou CRE/LOX que é descrita na Patente US No. 5.658.772, pode ser utilizado para integrar uma sequência de polinucleotídeo dentro de um sítio cromossômico específico. Finalmente, o uso de meganucleases para o direcionamento de polinucleotídeos doadores dentro de uma localização cromossômica específica foi descrito em Puchta e outros, PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060.

Outros métodos para integração específica ao sítio dentro de células vegetais são geralmente conhecidos e aplicáveis (Kumar e outros, Trends in Plant Sei. 6(4) (2001) pp. 155-159). Além disso, os sistemas de recombinação específicos ao sítio que foram identificados nos vários organismos procarióticos e eucarióticos inferiores podem ser aplicados para uso em plantas. Os exemplos de tais sistemas incluem, mas não estão limitados a: o sistema de recombinase R/RS do plasmídeo pSR1 da levedura Zygo-saccharomyces rouxii (Araki e outros (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203) e o sistema Gin/gix do fago Mu (Maeser e Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).

Em algumas modalidades da presente invenção, é desejável integrar ou acumular novo(s) transgene(s) em proximidade a um evento trans-gênico existente. O evento transgênico pode ser considerado um lócus ge-nômico preferido que foi selecionado com base em características exclusivas tais como único sítio de inserção, segregação Mendeliana normal e expressão estável e uma combinação de eficácia superior, incluindo tolerância a herbicida e desempenho agronômico em e ao longo de várias localizações ambientais. Os transgenes recém-integrados devem manter as características de expressão transgênica dos transformantes existentes. Além disso, o desenvolvimento de ensaios para a detecção e para a confirmação do evento recém-integrado deve ser superado uma vez que as sequências genômi-cas flanqueadoras e a localização cromossômica do evento recém-integrado já foram identificadas. Finalmente, a integração de um novo transgene dentro de uma localização cromossômica específica que está ligada a um transgene existente promovería a introgressão dos transgenes para dentro de outras estruturas básicas genéticas através de cruzamento sexual utilizando métodos de cruzamento convencionais.

Em algumas modalidades da presente invenção, é desejável cortar sequências de polinucleotídeo de um evento transgênico. Por exemplo, o corte do transgene que é descrito na Publicação de Pedido de Patente US No. 2011/0191877, emprega nucleases de dedo de zinco para remover uma sequência de polinucleotídeo, que consiste em um cassete de expressão gênica, de um evento transgênico integrado no cromossomo. A sequência de polinucleotídeo que é removida pode ser um marcador selecionável.

Após o corte e a remoção de uma sequência de polinucleotídeo o evento transgênico modificado pode ser redirecionado através da inserção de uma sequência de polinucleotídeo. A excisão de uma sequência de polinucleotídeo e o subsequente redirecionamento do evento transgênico modificado fornecem vantagens tal como a reutilização de um marcador selecionável ou a capacidade de superar alterações não pretendidas no transcriptoma da planta que resulta da expressão de genes específicos.

Um sítio específico no cromossomo 3 do subgenoma A dentro do genoma de algodão que é excelente para a inserção de ácidos nucleicos heterólogos é divulgado aqui. Assim, as modalidades da presente invenção fornecem métodos para introduzir ácidos nucleicos heterólogos de interesse dentro deste sítio alvo pré-estabelecido ou na vizinhança deste sítio alvo. As modalidades da presente invenção abrangem ainda uma semente de algodão e/ou uma planta de algodão que compreende qualquer sequência de nucleotídeos heteróloga inserida no sítio alvo divulgado ou dentro da vizinhança geral de tal sítio. Uma opção para realizar tal integração direcionada é cortar e/ou substituir um inserto diferente no lugar do cassete de expressão de pat exemplificado aqui. Sob este aspecto, a recombinação homóloga direcionada, por exemplo, e sem limitação, pode ser utilizada de acordo com as modalidades da presente invenção.

Como utilizado aqui "acúmulo" de genes, eventos ou características refere-se à combinação de características desejadas dentro de uma linhagem transgênica. Os cultivadores de plantas acumulam características transgênicas fazendo cruzamentos entre parentais que cada um possui uma característica desejada e então identificando a prole que possui ambas estas características desejadas. Outra maneira de acumular genes é através da transferência de dois ou mais genes dentro do núcleo da célula de uma planta ao mesmo tempo durante a transformação. Outra maneira de acumular genes é através da retransformação de uma planta transgênica com outro gene de interesse. Por exemplo, o acúmulo gênico pode ser utilizado para combinar duas ou mais características diferentes, incluindo, por exemplo, duas ou mais características de insetos diferentes, característica(s) de resis- tência a insetos e característica(s) de resistência a doenças, duas ou mais características de resistência a herbicida, e/ou característica(s) de resistência a insetos e característica(s) de resistência a herbicida. O uso de um marcador selecionável em adição a um gene de interesse também pode ser considerado acúmulo gênico. "Recombinação homóloga" refere-se a uma reação entre qualquer par de sequências de nucleotídeos que possuem sítios correspondentes que contêm uma sequência de nucleotídeos similar através dos quais as duas sequências de nucleotídeos podem interagir (recombinar) para formar uma nova sequência de DNA recombinante. Os sítios de sequência de nucleotídeos similares são cada um referido aqui como uma "sequência de homologia". Geralmente, a frequência de recombinação homóloga aumenta à medida que o comprimento da sequência de homologia aumenta. Assim, embora a recombinação homóloga possa ocorrer entre duas sequências de nucleotídeos que são menos que idênticas, a frequência (ou eficiência) de recombinação diminui à medida que a divergência entre as duas sequências aumenta. A recombinação pode ser realizada utilizando uma sequência de homologia em cada uma das moléculas doadora e alvo, gerando assim um produto de recombinação de "crossover único". Alternativamente, duas sequências de homologia podem ser colocadas em cada uma das sequências de nucleotídeos alvo e doadora. A recombinação entre duas sequências de homologia na doadora com duas sequências de homologia no alvo gera um produto de recombinação de "crossover duplo". Se as sequências de homologia na molécula doadora flanquear uma sequência que tem que ser manipulada (por exemplo, uma sequência de interesse), a recombinação de crossover duplo com a molécula alvo resultará em um produto de recombinação em que a sequência de interesse substitui uma sequência de DNA que estava originalmente entre as sequências de homologia na molécula alvo. A troca de sequência de DNA entre o alvo e a doadora através de um evento de recombinação de crossover duplo é denominada "reposição de sequência".

Uma planta ou uma semente preferida, das modalidades da presente invenção compreende em seu genoma sequências de nucleotídeos aad-12 e pat operacionais, que são identificadas aqui, junto com pelo menos 20-500 ou mais nucleotídeos flanqueadores contíguos em ambos os lados do inserto, como identificado aqui. A não ser que seja indicado o contrário, a referência às sequências flanqueadoras é feita aquelas identificadas em relação às SEQ ID NOS:1 e 2. Poderia ser esperado que toda ou parte destas sequências flanqueadoras fosse transferida para a progênie que recebe o D NA inserido como um resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o evento.

As modalidades da presente invenção incluem culturas de tecido de células que podem ser regeneradas de uma planta de uma modalidade da presente invenção. É incluída ainda uma planta regenerada de tal cultura de tecido, particularmente quando a dita planta for capaz de expressar todas as propriedades morfológicas e fisiológicas de uma variedade exemplificada. As plantas preferidas de modalidades da presente invenção possuem todas as características fisiológicas e morfológicas de uma planta crescida partindo da semente depositada. As modalidades desta invenção compreendem ainda a progênie de tal semente e semente que possui as características de qualidade de interesse.

Como utilizado aqui, uma "linhagem" é um grupo de plantas que exibe pouca ou nenhuma variação genética entre indivíduos para pelo menos uma característica. Tais linhagens podem ser criadas através de várias gerações de autopolinização e seleção ou propagação vegetativa partindo de um único parental utilizando técnicas de cultura de tecido ou de células.

Como utilizado aqui, os termos "cultivar" e "variedade" são sinônimos e referem-se a uma linhagem que é utilizada para produção comercial. "Estabilidade" ou "estável" significa que em relação a certo componente, o componente é mantido de geração para geração e, preferencialmente, por pelo menos três gerações. "Utilidade Comercial" é definida aqui como possuindo bom vigor da planta e alta fertilidade, de forma que a planta de cultivo possa ser produzida por agricultores utilizando equipamentos agrícolas convencionais e o óleo com os componentes descritos pode ser extraído da semente utilizando equipamento de trituração e extração convencional. "Elite agronômica" significa que a linhagem possui características agronômicas desejáveis tais como rendimento, maturidade, resistência a doenças e similares, em adição à tolerância a herbicida devido ao(s) even-to(s) de objetivo. Qualquer uma e todas estas características agronômicas e pontos de dados podem ser utilizados para identificar tais plantas, na forma de um ponto ou em qualquer uma das extremidades ou ambas as extremidades de uma faixa de características utilizadas para definir tais plantas.

Como um perito na arte irá reconhecer em consideração desta descrição, as modalidades preferidas de kits de detecção, por exemplo, podem incluir sondas e/ou iniciadores direcionados e/ou que compreendem "sequências de junção" ou "sequências de transição" (em que a sequência genômica flanqueadora do algodão encontra a sequência de inserto). Por exemplo, isto inclui polinucleotídeo sondas, iniciadores e/ou amplicons planejados para identificar uma ou ambas as sequências de junção (em que o inserto encontra a sequência flanqueadora). Um planejamento comum é ter um iniciador que se hibridiza na região flanqueadora e um iniciador que se hibridiza no inserto. Tais iniciadores possuem frequentemente cada um a-proximadamente pelo menos -15 resíduos de comprimento. Com esta disposição, os iniciadores podem ser utilizados para gerar/amplificar um ampli-con detectável que indica a presença de um evento de uma modalidade da presente invenção. Estes iniciadores podem ser utilizados para gerar um amplicon que abrange (e inclui) uma sequência de junção que é indicada anteriormente. O "touching down" do(s) iniciador(es) na sequência flanqueadora não é tipicamente planejado para se hibridizar além de aproximadamente 1200 bases ou mais ou menos isso além da junção. Assim, os iniciadores flanqueadores típicos seriam planejados para compreenderem pelo menos 15 resíduos de qualquer filamento dentro de 1200 bases dentro das sequências flanqueadoras desde o início do inserto. Ou seja, os iniciadores que compreendem uma sequência de um tamanho apropriado de (ou que se hi- bridiza a) pares de bases 154 - 1672 da SEQ !D NO:1 e/ou pares de bases 1 - 1369 da SEQ ID NO:2 estão dentro do âmbito das modalidades da presente invenção. Os iniciadores de insertos podem ser similarmerite planejados em qualquer lugar no inserto, mas os pares de bases 1 — 6387 da SEQ ID NO:3, podem ser utilizados, por exemplo, de forma não exclusiva para o planejamento de tal iniciador.

Um perito na arte também reconhecerá que iniciadores e sondas podem ser planejados para se hibridizar, sob uma faixa de hibridização padronizada e/ou condições de PCR em que o iniciador ou a sonda não é per-feitamente complementar com a sequência exemplificada. Ou seja, algum grau de pareamento errado ou degeneração pode ser tolerado. Para um iniciador de aproximadamente 20 nucleotídeos, por exemplo, tipicamente um ou dois ou mais ou menos isso de nucleotídeos não precisam se ligar com o filamento oposto se a base do pareamento errado for interna ou na extremidade do iniciador que é oposto ao amplicon. Várias condições de hibridização apropriadas são fornecidas abaixo. Análogos de nucleotídeos sintéticos, tal como inosina, também podem ser utilizados em sondas. Sondas de ácidos nucleicos peptídicos (PNA), bem como sondas de DNA e RNA, também podem ser utilizadas. O que é importante é que tais sondas e iniciadores são diagnósticos para (capazes de identificar e distinguir exclusivamente) a presença de um evento de uma modalidade da presente invenção.

Deve ser observado que erros na amplificação pela PCR podem ocorrer que poderíam resultar em erros de sequencíamento insignificantes, por exemplo. Ou seja, a não ser que seja indicado de outra maneira, as sequências listadas aqui foram determinadas através da produção de ampli-cons longos partindo dos DNA genômicos de algodão e então da clonagem e do sequencíamento dos amplicons. Não é incomum encontrar ligeiras diferenças e discrepâncias insignificantes nas sequências geradas e determinadas desta maneira, devido às muitas rodadas de amplificação que são necessárias para gerar amplicon suficiente para o sequencíamento partindo de DNAs genômicos. Um perito na arte deve reconhecer e ser informado que quaisquer ajustes necessários devido a estes tipos de erros ou discrepân- cias de sequenciamento comuns estão dentro do âmbito das modalidades da presente invenção.

Deve ser observado que não é incomum que alguma sequência genômica seja deletada, por exemplo, quando uma sequência é inserida du-1 rante a criação de um evento. Assim, algumas diferenças também podem aparecer entre as sequências flanqueadoras e as sequências genômicas de objetivo listadas no GENBANK, por exemplo.

Os componentes do ''inserto" de sequência de DNA são ilustrados nas Figuras e são discutidos em maiores detalhes abaixo nos Exemplos. As sequências de DNA de polinucleotídeo destes componentes ou fragmentos dos mesmos, podem ser utilizadas como iniciadores ou sondas de DNA nos métodos de modalidades da presente invenção.

Em algumas modalidades da invenção, composições e métodos são fornecidos para a detecção da presença da região de inserção do trans-gene/genômica, em plantas e sementes e similares, de uma planta de algodão. São fornecidas sequências de DNA que compreendem a sequência de junção da região de inserção do transgene/genômica a 5’ de objetivo fornecida aqui (entre os pares de bases 1354/1355 da SEQ ID NO:1), segmentos das mesmas e complementos das sequências exemplificadas e quaisquer segmentos das mesmas. São fornecidas sequências de DNA são que compreendem a sequência de junção da região de inserção do transgene/genômica a 3’ de objetivo fornecida aqui (entre os pares de bases 168/169 da SEQ ID NO:2), segmentos da mesma e complementos das sequências exemplificadas e quaisquer segmentos das mesmas. A sequência de junção da região de inserção abrange a junção entre o DNA heterólogo inserido dentro do genoma e o DNA da célula de algodão que flanqueia o sítio de inserção. Tais sequências podem ser diagnosticas para o dado e-vento.

Com base nestas sequências de inserto e de borda, podem ser gerados iniciadores específicos ao evento. A análise de PCR demonstrou que linhagens de algodão das modalidades da presente invenção podem ser identificadas em genótipos diferentes do algodão através da análise dos am- plicons de PCR gerados com estes conjuntos de iniciadores específicos ao evento. Estes e outros procedimentos relacionados podem ser utilizados para identificar exclusivamente estas linhagens de algodão. Assim, amplicons da PCR derivados de tais pares de iniciadores são exclusivos e podem ser utilizados para identificar estas linhagens de algodão.

Em algumas modalidades, as sequências de DNA que compreendem um fragmento contínuo da nova região de inserção de transge-ne/genômica são um aspecto desta invenção. São incluídas sequências de DNA que compreendem um comprimento suficiente de polinucleotídeos de sequência de inserto de transgene e um comprimento suficiente de polinucleotídeos de sequência genômica de algodão de uma ou mais das plantas de algodão mencionadas anteriormente e/ou sequências que são úteis como sequências iniciadoras para a produção de um produto de amplicon diagnóstico para uma ou mais destas plantas de algodão.

Modalidades relacionadas se referem às sequências de DNA que compreendem pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos contíguos de uma porção de transgene de uma sequência de DNA identificada aqui (tal como a SEQ ID NO:1 e segmentos da mesma) ou complementos das mesmas e um comprimento similar do DNA flanqueador da sequência de algodão destas sequências ou complementos das mesmas. Tais sequências são úteis como iniciadores de DNA nos métodos de amplificação de DNA. Os amplicons produzidos utilizando estes iniciadores são diagnósticos para qualquer um dos eventos de algodão referidos aqui. Portanto, as modalidades da invenção incluem ainda os amplicons produzidos portais iniciadores de DNA.

As modalidades desta invenção incluem ainda métodos de detecção da presença de DNA, em uma amostra, que corresponde ao evento de algodão referido aqui. Tais métodos podem compreender: (a) o contato da amostra que compreende DNA com um conjunto de iniciadores que, quando utilizado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com o DNA do evento de algodão, produz um amplicon que é diagnóstico para o(s) dito(s) evento(s); (b) a realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo dessa maneira o amplicon; e (c) a detecção do ampli-con. Métodos adicionais de detecção de modalidades da presente invenção incluem um método de detecção da presença de um DNA, em uma amostra, que corresponde ao dito evento, em que o dito método compreende: (a) o contato da amostra que compreende DNA com uma sonda que se hibridiza sob condições de hibridização estringentes com o DNA do dito e-vento de algodão e que não se hibridiza sob as condições de hibridização estringentes com uma planta de algodão de controle (DNA que não é do e-vento de interesse); (b) submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização estringentes; e (c) a detecção da hibridização da sonda com o DNA.

Ainda em modalidades adicionais, a presente invenção inclui métodos de produção de uma planta de algodão que compreende o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 de uma modalidade da presente invenção, em que o dito método compreende as etapas de: (a) cruzamento sexual de uma primeira linhagem de algodão parental (que compreende um cassete de expressão de uma modalidade da presente invenção, que confere tolerância a 2,4-D e glufosinato às plantas da dita linhagem) e uma segunda linhagem de algodão parental (que não possui estas características de tolerância a herbicida) produzindo dessa maneira um grande número de plantas de pro-gênie; e (b) seleção de uma planta de progênie através do uso de marcadores moleculares. Tais métodos podem compreender opcionalmente a etapa adicional de retrocruzamento da planta de progênie com a segunda linhagem de algodão parental para produzir uma planta de algodão de cruzamento real que compreende as características de tolerância a herbicida.

De acordo com outro aspecto da invenção, são fornecidos métodos de determinação da zigosidade de progênie de um cruzamento com o dito evento. Os ditos métodos podem compreender o contato de uma amostra, que compreende DNA de algodão, com um conjunto de iniciadores de uma modalidade da presente invenção. Os ditos iniciadores, quando utilizados em uma reação de amplificação de ácido nucleico com o DNA genômico do dito evento de algodão, produzem um primeiro amplicon que é diagnósti- co para o dito evento de algodão. Tais métodos compreendem ainda a realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo dessa maneira o primeiro amplicon; a detecção do primeiro amplicon; e o contato da amostra que compreende DNA de algodão com um segundo conjunto de iniciadores (o dito segundo conjunto de iniciadores, quando utilizado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico de plantas de algodão, produz um segundo amplicon que compreende uma sequência en~ dógena do DNA genômico do algodão nativo que não contém a sequência de polinucleotídeo do dito evento); e a realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo dessa maneira o segundo amplicon. Os métodos compreendem ainda a detecção do segundo amplicon e a comparação do primeiro e do segundo amplicons em uma amostra, em que a presença de ambos os amplicons indica a zigosidade da inserção do transgene.

Os kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos utilizando as composições divulgadas aqui e métodos bem conhecidos na arte de detecção de DNA. Os kits são úteis para a identificação do evento do DNA de objetivo de algodão em uma amostra e podem ser aplicados aos métodos para cruzamento de plantas de algodão que contêm este DNA. Os kits contêm sequências de DNA complementares aos amplicons, por exemplo, divulgadas aqui ou às sequências de DNA complementares ao DNA contido nos elementos genéticos do transgene dos eventos de objetivo. Estas sequências de DNA podem ser utilizadas em reações de amplificação de DNA ou como sondas em um método de hibridização de DNA. Os kits também podem conter os reagentes e os materiais necessários para o desempenho do método de detecção.

Uma "sonda" é uma molécula de ácido nucleico isolada à qual é ligada uma marcação detectável convencional ou uma molécula repórter (tal como um isótopo radioativo, um ligante, um agente quimioluminescente ou uma enzima). Tal sonda pode se hibridizar a um filamento de um ácido nucleico alvo, no caso de modalidades da presente invenção, a um filamento de DNA genômico de um dos ditos eventos de algodão, de uma planta de algodão ou de uma amostra que inclui o DNA do evento. As sondas de acor- do com as modalidades da presente invenção incluem não somente ácidos desoxirribonucleicos ou ribonucleicos, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser utilizadas para detectar a presença de tal sequência de DNA alvo. "Iniciadores" são ácidos nucleicos isolados/sintetizados que são anelados a um filamento de DNA alvo através da hibridização de ácido nu-cleico para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA alvo, então estendidos ao longo do filamento de DNA alvo por uma polimerase, por exemplo, uma DNA polimerase. Os pares de iniciadores de modalidades da presente invenção referem-se ao seu uso para a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo, por exemplo, através da reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácidos nucleicos convencionais.

As sondas e os iniciadores possuem geralmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 ou 1000 ou 2000 ou 5000 polinucleotídeos ou mais de comprimento. Tais sondas e iniciadores se hibridizam especificamente a uma sequência alvo sob condições de hibridização estringentes. Preferencialmente, sondas e iniciadores de acordo com modalidades da presente invenção possuem similaridade de sequência completa com a sequência alvo, embora as sondas que diferem da sequência alvo e que mantêm a capacidade de se hibridizar com as sequências alvos possam ser planejadas através de métodos convencionais.

Os métodos para a preparação e para a utilização de sondas e iniciadores são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- ed., vol. 1-3, ed. Sambrook e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Os pares de iniciadores da PCR podem ser derivados de uma sequência conhecida, por exemplo, através da utilização de programas de computador pretendidos para tal finalidade.

Iniciadores e sondas baseados no DNA flanqueador e nas sequências de inserto divulgadas aqui podem ser utilizados para confirmar (e, se necessário, corrigir) as sequências divulgadas através de métodos convencionais, por exemplo, através da reclonagem e do sequenciamento de tais sequências.

As sondas e os iniciadores de ácidos nucleicos das modalidades da presente invenção se hibridizam sob condições estringentes com uma sequência de DNA alvo. Qualquer método de hibridização ou amplificação de ácido nucleico convencional pode ser utilizado para identificar a presença de DNA de um evento transgênico em uma amostra. Moléculas de ácido nucleico ou fragmentos das mesmas são capazes de se hibridizar especificamente com outras moléculas de ácido nucleico sob certas circunstâncias. Como utilizado aqui, é dito que duas moléculas de ácido nucleico são capazes de se hibridizar especificamente uma com a outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucleico de filamento duplo antiparalela. É dito que uma molécula de ácido nucleico é o "complemento" de outra molécula de ácido nucleico se exibirem complementaridade completa. Como utilizado aqui, é dito que as moléculas exibem "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas for complementar a um nucleotídeo da outra. As moléculas que exibem complementaridade completa irão geralmente se hibridizar com outra com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam aneladas à outra sob condições de "alta estringência" convencionais. As condições de alta estringência convencionais são descritas por Sambrook e outros, 1989. É dito que duas moléculas exibem "complementaridade mínima" se estas puderem se hibridizar com outra com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam aneladas com a outra sob pelo menos condições de "baixa estringência" convencionais. As condições de baixa estringência convencionais são descritas por Sambrook e outros, 1989. Com a finalidade de uma molécula de ácido nucleico servir como um iniciador ou uma sonda esta precisa apenas exibir complementaridade mínima de sequência para ser capaz de formar uma estrutura em filamento duplo estável sob as concentrações de solventes e sais particulares empregadas. O termo "condição estringente" ou "condições de estringência" é funcionalmente definido em relação à hibridização de uma sonda de ácido nucleico com um ácido nucleico alvo (isto é, com uma sequência de ácido nucleico particular de interesse) através do procedimento de hibridização específica discutido em Sambrook e outros, 1989, em 9.52-9.55. Ver também, Sambrook e outros, 1989 em 9.47-9.52 e 9.56-9.58.

Dependendo da aplicação prevista, podem ser utilizadas condições variáveis de condições estringentes ou degeneração de sequência de polinucleotídeo de uma sonda ou um iniciador para atingir graus variáveis de seletividade de hibridização em direção à sequência alvo. Para aplicações que requerem alta seletividade, poderão ser tipicamente empregadas condições relativamente estringentes para a hibridização de uma sequência de polinucleotídeo com uma segunda sequência de polinucleotídeo, por exemplo, serão selecionadas condições de sais baixas e/ou de temperaturas altas, tais como fornecidas por aproximadamente 0,02 M até aproximadamente 0,15 M de NaCI a temperaturas de aproximadamente 50° C até aproximadamente 70° C. As condições estringentes, por exemplo, poderíam envolver a lavagem do filtro de hibridização pelo menos duas vezes com tampão de lavagem de alta estringêncía (0,2X SSC, 0,1% de SDS, 65° C). As condições de estringêncía apropriadas que promovem a hibridização de DNA, por e-xemplo, 6,0X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguidas por uma lavagem de 2,0X SSC a 50°C são conhecidas pelos peritos na arte. Por exemplo, a concentração de sais na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma estringêncía baixa de aproximadamente 2,0X SSC a 50°C até uma estringêncía alta de aproximadamente 0,2X SSC a 50°C. Em adição, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de estringêncía baixa à temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, até condições de estringêncía alta a aproximadamente 65°C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados ou a temperatura ou a concentração de sais pode ser mantida constante enquanto que a outra variável é alterada. Tais condições seletivas toleram pouco, se algum, parea-mento errado entre a sonda e o molde ou o filamento alvo. A detecção de sequências de DNA através de hibridização é bem conhecida pelos peritos na arte e os ensinamentos das Patentes U.S. Nos. 4.965.188 e 5.176.995 são exemplos dos métodos de análises por hibridização.

Em uma modalidade particularmente preferida, um ácido nuclei-co de uma modalidade da presente invenção irá especificamente se hibridi-zar com um ou mais dos iniciadores (ou amplicons ou outras sequências) exemplificados ou sugeridos aqui, incluindo complementos e fragmentos dos mesmos, sob condições de estringência alta. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora de uma modalidade da presente invenção possui a sequência de ácido nucleico que é apresentada aqui em uma das sequências ou complementos exemplificados e/ou fragmentos dos mesmos.

Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora de uma modalidade da presente invenção compartilha entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade de sequência com tais sequências de ácido nucleico. Em um aspecto adicional da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora de uma modalidade da presente invenção compartilha entre 95% e 100% de identidade de sequência com tal sequência. Tais sequências podem ser utilizadas como marcadores nos métodos de cruzamento de plantas para identificar a progênie de cruzamentos genéticos. A hibridização da sonda com a molécula de DNA alvo pode ser detectada através de qualquer número de métodos conhecidos pelos peritos na arte; estes podem incluir, mas não estão limitados a marcações fluorescentes, marcações radioativas, marcações baseadas em anticorpos e marcações quimioluminescentes.

Em consideração à amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, por PCR) utilizando um par de iniciadores de amplificação particular, "condições estringentes" são condições que permitem que o par de iniciadores se hibridize apenas com a sequência de ácido nucleico alvo sequência de ácido nucleico à qual um iniciador que possui a sequências do tipo selvagem correspondente (ou seu complemento) se ligaria e preferencialmente para produzir um único produto de amplificação, o amplicon. O termo "específico para (uma sequência alvo)" indica que uma sonda ou um iniciador se hibridiza sob condições de hibridização estringentes apenas com a sequência alvo em uma amostra que compreende a se- quência alvo.

Como utilizado aqui, "DNA amplificado" ou "amplicon" refere-se ao produto de amplificação de ácido nucleico de uma sequência alvo de ácido nucleico que faz parte de um molde de ácido nucleico. Por exemplo, para determinar se a planta de algodão resultante de um cruzamento sexual contém DNA genômico do evento transgênico da planta de algodão de uma modalidade da presente invenção, DNA extraído de uma amostra de tecido da planta de algodão pode ser submetido ao método de amplificação de ácido nucleico utilizando um par de iniciadores que inclui um iniciador derivado da sequência flanqueadora no genoma da planta adjacente ao sítio de inserção do DNA heterólogo inserido e um segundo iniciador derivado do DNA heteró-logo inserido para produzir um amplicon que é diagnóstico em relação à presença do DNA do evento. O amplicon possui um comprimento e possui uma sequência que também é diagnostica para o evento. O amplicon pode variar de comprimento partindo do comprimento combinado dos pares de iniciadores mais um par de bases de nucleotídeo e/ou do comprimento combinado dos pares de iniciadores mais aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ou 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 ou mais pares de bases de nucleotídeos (mais ou menos qualquer um dos incrementos listados anteriormente). Alternativamente, um par de iniciadores pode ser derivado da sequência flanqueadora em ambos os lados do DNA inserido de forma a produzir um amplicon que inclui a sequência de nucleotídeos do inserto inteira. Um membro de um par de iniciadores derivado da sequência genômica da planta pode estar localizado a uma distância da sequência de DNA inserida. Esta distância pode variar de um par de bases de nucleotídeo até aproximadamente vinte mil pares de bases de nucleotídeos. O uso do termo "amplicon" exclui especificamente dímeros de iniciadores que podem ser formados na reação de amplificação térmica do DNA. A amplificação de ácido nucleico pode ser realizada através de qualquer um dos vários métodos de amplificação de ácido nucleico conhecidos na arte, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação é conhecida na arte e é descrita, inter alia, na Patente U.S. No. 4.683.195 e Patente U.S. No. 4.683.202. Os métodos de amplificação pela PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb de DNA genômico. Estes métodos bem como outros métodos conhecidos na arte de amplificação do DNA podem ser utilizados na prática das modalidades da presente invenção. A sequência do inserto de DNA do transgene he-terólogo ou da sequência genômica flanqueadora de um evento de objetivo de algodão pode ser verificada (e corrigida se necessário) através da amplificação de tais sequências do evento utilizando iniciadores derivados das sequências fornecidas aqui seguida pelo sequenciamento de DNA padronizado do amplicon de PCR ou do DNA clonado. O amplicon produzido através destes métodos pode ser detectado através de um grande número de técnicas. A eletroforese em gel de aga-rose e a coloração com brometo de etídeo é um método bem conhecido comum de detecção de amplicons de DNA. Outro tal método é Genetic Bit A-nalysis, em que é planejado um oligonucleotídeo de DNA que se sobrepõe tanto à sequência de DNA genômico flanqueadora adjacente quanto à sequência de DNA inserida. O oligonucleotídeo é imobilizado em poços de uma placa de micropoços. Após a PCR da região de interesse (utilizando um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica flanqueadora adjacentes), um produto de PCR de filamento simples pode ser hibridizado com o oligonucleotídeo imobilizado e serve como um molde para uma reação de extensão de uma única base utilizando uma DNA polimerase e ddNTPs marcados específicos para a base seguinte esperada. A análise de um produto ligado pode ser completada através da quantificação da quantidade de sinal fluorescente. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserto/flanqueadora devido à amplificação, à hibridização e à extensão de uma única base bem sucedidas.

Outro método é a técnica de pirossequenciamento que é descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Neste método é planejado um oligonucleotídeo que se sobrepõe ao DNA genômico adjacente e à junção de DNA do inserto. O oligonucleotídeo é planejado para se hibridizar com o produto da PCR de filamento simples da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica flanqueadora) e incubado na presença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, fosfossulfato de adenosina 5' e luciferina. Os DNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medido. Um sinal luminoso indica a presença do inserto do transge-ne/sequência flanqueadora devido à amplificação, à hibridização e à extensão de uma única base ou várias bem sucedidas. A Polarização de fluorescência é outro método que pode ser utilizado para detectar um amplicon de uma modalidade da presente invenção. Seguindo este método, é planejado um oligonucleotídeo que se sobrepõe com a sequência genômica flanqueadora e a junção de DNA inserida. O oligonucleotídeo é hibridizado com o produto da PCR de filamento simples da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na sequência de DNA genômico flanqueadora) e incubado na presença de uma DNA polimerase e um ddNTP marcado por fluorescência. A extensão de uma única base resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação do ddNTP marcado de forma fluorescente pode ser medida como uma alteração na polarização utilizando um fluorômetro. Uma alteração na polarização indica a presença do inserto do transgene/sequência flanqueadora devido à amplificação, à hibridização e á extensão de uma única base bem sucedidas. TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) é um método de detecção e quantificação da presença de uma sequência de DNA. Sucintamente, é planejada uma sonda de oligonucleotídeo FRET que se sobrepõe à sequência genômica flanqueadora e à junção de DNA do inserto. A sonda FRET e os iniciadores da PCR (um iniciador na sequência de inserto de DNA e um na sequência genômica flanqueadora) são submetidos a ciclos na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Durante a amplificação específica, o mecanismo de correção da Taq DNA polimerase libera o grupamento fluorescente do grupamento de extinção sobre a sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência flanqueado-ra/do transgene de inserto devido à amplificação e à hibridização bem sucedidas.

Beacons Moleculares foram descritos para uso na detecção da sequência de polinucleotídeo. Sucintamente, é planejada uma sonda de oli-gonucleotídeo FRET que se sobrepõe à sequência genômica flanqueadora e à junção de DNA do inserto. A estrutura única da sonda FRET resulta nesta contendo estrutura secundária que mantém os grupamentos fluorescentes e de extinção em grande proximidade. A sonda FRET e os iniciadores da PCR (um iniciador na sequência de inserto de DNA e um na sequência genômica flanqueadora) são submetidos a ciclos na presença de uma polimerase ter-moestável e dNTPs. Após a amplificação pela PCR bem sucedida, a hibridi-zação da sonda FRET com a sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e na separação espacial dos grupamentos fluorescentes e de extinção. É produzido um sinal fluorescente. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência genômica flanqueadora/de transgene de inserto devido à amplificação e à hibridização bem sucedidas.

Tendo divulgado uma localização no genoma de algodão que é excelente para uma inserção, as modalidades da presente invenção compreendem ainda uma semente de algodão e/ou uma planta de algodão que compreende pelo menos um inserto sem ser do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 na vizinhança geral desta localização genômica. Uma opção é substituir um inserto diferente no lugar daquele do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 exemplificado aqui. Em geral, a recombinação homóloga direcionada, por exemplo, é empregada em modalidades particulares. Este tipo de tecnologia é o objetivo, por exemplo, da WO 03/080809 A2 e do pedido de patente U.S. publicado correspondente (US 20030232410). Assim, as modalidades da presente invenção incluem plantas e células vegetais que compreendem um inserto heterólogo (no lugar de ou com várias cópias dos genes aad-12 ou pat), flanqueado por toda ou uma parte que pode ser reconhecida das sequências flanqueadoras identificadas aqui (pb 1 -1354 da SEQ ID NO:1 e bp 169 - 2898 da SEQ ID NO:2). Uma cópia adicional (ou cópias adicionais) de um gene aad-12 ou pat também pode ser direcionada para inserção desta/destas maneira(s).

Os exemplos a seguir são incluídos para ilustrar os procedimentos para a prática das modalidades da invenção e para demonstrar certas modalidades preferidas da invenção. Estes exemplos não devem ser interpretados como iimitantes. Deve ser considerado pelos peritos na arte que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam abordagens específicas utilizadas para ilustrar os modos preferidos para sua prática. Entretanto, os peritos na arte devem, em consideração à presente descrição, considerar que muitas alterações podem ser feitas nestas modalidades específicas obtendo-se ainda resultados iguais ou similares sem se afastar do espírito e do âmbito da invenção. A não ser que seja indicado de outra maneira, todas as porcentagens estão em peso e todas as proporções de misturas de solventes estão em volume a não ser que seja citado de outra maneira.

As abreviações a seguir são utilizadas a não ser que seja indicado de outra maneira. pb par de bases °C graus Celsius DNA ácido desoxirribonucleico EDTA ácido etilenodiaminatetraacético kb quilobase pg micrograma pL microlitro ml_ mililitro M massa molar PCR reação em cadeia da polimerase PTU unidade de transcrição da planta ou cassete de expressão SDS dodecil sulfato de sódio SSC uma solução tamponante contendo uma mistura de cloreto de sódio e citrato de sódio, pH 7,0 TBE uma solução tamponante contendo uma mistura de base Tris, ácido bórico e EDTA, pH 8,3 EXEMPLOS

Exemplo 1: Transformação e Seleção do Evento de algodão ODAB4468.19.10.3 com aad-12 e pat Algodão transgênico (Gossypium hirsutum) contendo o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foi gerado através de transformação mediada por Agrobacterium e selecionado utilizando meio contendo glufosinato. A cepa desarmada de Agrobacterium EHA101 (Hood e outros, 1993), que carrega o vetor binário pDAB4468 (Figura 1) que contém o marcador selecioná-vel, pat e o gene de interesse, aad-12, dentro da região de DNA de filamento T, foi utilizada para iniciar a transformação da variedade de planta de algodão, Coker 310. A sequência do filamento T do DNA para pDAB4468 é fornecida na SEQ ID NO:3 e é anotada abaixo na Tabela 1.

Tabela 1: Elementos qênicos localizados em pDAB4468.

Exemolo 2: Caracterização da Proteína AAD-12 do Evento de algodão PDAB4468.19.10.3 As propriedades bioquímicas da proteína AAD-12 recombinante derivada do evento de algodão transgênico pDAB4468.19.10.3 foram caracterizadas. O ensaio imunoabsorvente ligado à enzima quantitativo (ELISA) foi utilizado para caracterizar as propriedades bioquímicas da proteína e confirmar a expressão da proteína AAD-12.

Os níveis da proteína AAD-12 foram determinados no evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Amostras de tecido foliar de algodão foram isoladas das plantas de teste e preparadas para a análise de expressão. A proteína AAD-12 foi extraída dos tecidos da planta de algodão com uma solução de Tris-HCI contendo o detergente Brij-56™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). O tecido da planta foi centrifugado; o sobrenadante aquoso foi coletado, diluído com tampão apropriado quando necessário e analisado utilizando um kit de ELISA para AAD-12 (Beacon Diagnostics, East Falmouth, MA) em um formato de sanduíche. O kit foi utilizado seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante.

Uma análise de detecção foi realizada para investigar a estabilidade de expressão e a capacidade de herança tanto verticalmente (entre gerações) quanto horizontalmente (entre linhagens da mesma geração) no evento de algodão pDAB4468.19.10.3. A expressão da proteína AAD-12 do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 era estável (não segregante) e coerente ao longo de todas as linhagens.

Os níveis de expressão da proteína AAD-12 que são comparados verticalmente (entre gerações) foram determinados para as plantas crescidas em estufa com o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Os níveis de expressão eram coerentes e estáveis ao longo das gerações T3-T4 com níveis de expressão médios de aproximadamente 110-125 ng/cm2 de proteína AAD-12 isolada.

Os níveis de expressão da proteína AAD-12 que são comparados verticalmente (entre linhagens da mesma geração) foram determinados em relação às plantas crescidas no campo com o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Estudos dos níveis de expressão no campo foram realizados em várias plantas com o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 que compreendiam a geração T4. Os níveis médios de expressão de proteína eram coerentes e estáveis em aproximadamente 50-150 ng/cm2 de proteína AAD-12 isolada.

Exemplo 3: Clonagem e Caracterização de Regiões de Borda Flangueado-ras Genômicas do Evento de algodão pDAB4468.19.10.3 As regiões de borda flanqueadoras genômicas que ficam adjacentes ao inserto do filamento T do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foram isoladas, clonadas e caracterizadas. Para caracterizar as regiões de borda e descrever o sítio genômico de inserção, as regiões flanqueadoras genômicas do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foram isoladas, compreendendo 1.354 bp da sequência de borda flanqueadora genômica a 5' (SEQ ID NO:1) e 2.730 bp da sequência de borda flanqueadora genômica a 3' (SEQ ID NO:2). Foi descoberto que a sequência de borda flanqueadora genômica a 5' contém sequência altamente repetitiva o que produzia dificuldades técnicas quando era confirmado a sequência genômica da sequência de borda flanqueadora genômica a 5'. A sequência de borda a 3' foi confirmada utilizando iniciadores específicos para o transgene e iniciadores genômicos.

As sequências de borda flanqueadoras genômicas do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foram submetidas a BLAST contra o banco de dados de nucleotídeos de NCBI para confirmar que estas regiões tinham origem do algodão. Um BLAST da borda flanqueadora a 3' indicava que a sequência se alinhava parcialmente a um único clone BAC (Gossypium hir-sutum MX008C17). Além disso, a busca com BLAST indicava que o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 estava localizado dentro do genoma de algodão no cromossomo 3 do subgenoma A. De forma geral, a caracterização da sequência de borda flanqueadora genômica do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 indicava que uma cópia do filamento T do pDAB4468 estava presente dentro do genoma de algodão.

Exemplo 3.1: Confirmação de Sequências Genômicas de Algodão Para confirmar a sequência do sítio genõmico de inserção do evento de algodão pDAB4468.19.10.3, uma Reação em Cadeia da Polime-rase (PCR) foi realizada com pares diferentes de iniciadores (Figura 2 e Tabela 2 e Tabela 3). O DNA genõmico do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 e outras linhagens de controle transgênicas ou não transgênicas de algodão foram utilizados como um molde. O kit LA Taq P-CR® foi utilizado para as reações (TaKaRa, Japão).

Tabela 2: Iniciadores da PCR e sequências utilizadas para analisar o Evento de Algodão pDAB4468.19.10.3 ________________________ Tabela 3: Condições de PCR e mistura de reação para a amplificação de regiões de borda e sequências específicas ao evento no evento de algodão pDAB4468.19.103.

As sequências de borda flanqueadoras genômicas a 5' foram amplificadas por PCR e sequenciadas. Estas reações utilizaram os iniciado-res específicos do cassete de expressão de aad-12, (por exemplo, 5endT1, 5endT2 e 5endT3) e iniciadores planejados de acordo com a sequência de borda na extremidade a 5’ clonada obtida do genoma de algodão (por exemplo, 5endG1 e 5end G2 e 5endG3) para a amplificação de um segmento de DNA genômico que abrange o gene aad-12 e a sequência de borda flanque-adora genômica da extremidade a 5’. Similarmente, para a confirmação da sequência de borda flanqueadora genômica a 3’ clonada, iniciadores específicos ao cassete de pat, (por exemplo, 3endT1, 3endT2 e 3endT3) e iniciadores planejados de acordo com a sequência de borda da extremidade e 3’ clonada (por exemplo, 3endG1, 3endG2 e 3endG3) foram utilizados para amplificar um segmento de DNA genômico que abrange o gene pat e a sequência de borda flanqueadora genômica na extremidade a 3’. Os fragmentos de DNA de tamanho esperado foram amplificados partindo do DNA genômico do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 com cada par de iniciado-res (um iniciador localizado na borda flanqueadora do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 e um iniciador específico ao transgene). As amostras de controle (outras linhagens de algodão transgênicas ou de algodão que não são transgênicas, controle Coker 310) não produziram amplicons de PCR utilizando estes iniciadores. Os amplicons de PCR foram subclonados dentro de plasmídeos e sequenciados. Estes dados foram utilizados para determinar as sequências de borda flanqueadoras genômicas a 5' e a 3' localizadas adjacentes ao inserto do filamento T do evento de algodão pDAB4468.19.10.3.

Exemplo 4: Caracterização por Southern Blot do Evento de algodão ODAB4468.19.10,3 A análise de Southern blot foi utilizada para estabelecer o padrão de integração do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Estes experimentos geraram dados que demonstraram a integração e a integridade dos transgenes aad-12 e pat dentro do genoma de algodão. O evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foi caracterizado como um evento de integração simples de comprimento completo contendo uma única cópia do cassete de expressão de aad-12 e pat do plasmideo pDAB4468.

Os dados de Southern blot sugeriram que um fragmento de filamento T se inseriu dentro do genoma do evento de algodão pDAB4468. Uma análise de Southern blot detalhada foi realizada utilizando uma sonda específica para os genes aad-12 e pat, contidos no sitio de integração do filamento T do pDAB4468 e enzimas de restrição descritivas que possuem sítios de divagem localizados dentro do plasmideo e produzem fragmentos de hibridização internos ao plasmideo ou fragmentos que abrangem a junção do plasmideo e do DNA genômico do algodão (fragmentos de borda). Os pesos moleculares indicados partindo da hibridização por Southern para a combinação das enzimas de restrição e as sondas eram únicos para o e-vento e estabeleceram seu padrão de identificação. Estas análises também mostraram que o fragmento do filamento T do pDAB4468 tinha sido inserido dentro do DNA genômico do algodão sem rearranjos dos cassetes de expressão de aad-12 ou pat.

Exemplo 4.1: Coleta de Amostra de Folha de Algodão e Isolamento do DNA Genômico O DNA genômico foi extraído do tecido foliar coletado de plantas de algodão individuais contendo o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Em adição, o gDNA foi isolado partindo de uma planta de algodão convencional, Coker 310, que contém a estrutura fundamental genética que é representativa da linhagem de algodão utilizada para a transformação e não contém os genes aad-12 e pat- O DNA genômico individual foi extraído do tecido foliar liofilizado seguindo um protocolo do fabricante modificado utilizando o QIAGEN DNEASY® Mini Prep DNA Extraction Kit® (Qiagen, CA). Após a extração, o DNA foi quantificado de forma espectrofluorométrica utilizando o reagente Pico Green® (Invitrogen, Carlsbad, CA) e utilizando a instrumentação NANODROP® (Invitrogen). O DNA foi então visualizado sobre um gel de agarose para confirmar os valores da análise de Pico Green® e para determinar a qualidade do DNA.

Exemplo 4 2: Digestão e Separação do gDNA

Para a caracterização do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 por Southern blot, dez microgramas (10 pg) de DNA genômico foram digeridos. O DNA genômico do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 e da linhagem de algodão que não é transgênica, Coker 310, foi digerido através da adição de aproximadamente 10 unidades de enzima de restrição selecionada por pg de DNA e o tampão de reação correspondente para cada amostra de DNA. Cada amostra foi incubada a aproximadamente 37°C durante a noite. As enzimas de restrição Nsil, Ncol, Sbfll, Swal e Ndel foram utilizadas individualmente para as reações de digestão (New England Biolabs, Ipswich, MA). Em adição, uma amostra de controle de hibridização positivo foi preparada através da combinação do plasmídeo DNA, pDAB4468, com o DNA genômico da variedade de algodão não transgênica, Coker 310. O coquetel de DNA plasmideal / DNA genômico foi digerido utilizando os mesmos procedimentos e a enzima de restrição como as amostras de teste. Após as digestões terem sido incubadas durante a noite, foi adicionado NaCI até uma concentração final de 0,1 M para interromper a reação de digestão da enzima de restrição. As amostras de DNA digeridas foram precipitadas com iso-propanol. A pelota de DNA precipitada foi ressuspensa em 15 pL de 3X tampão de carga (0,01% de azul de bromofenol, 10,0 mM de EDTA, 5,0% de glicerol, 1,0 mM de Tris pH 7,5). As amostras de DNA e o marcador de tamanho molecular foram então submetidos à eletroforese através de géis de agarose a 0,85% com 0,4X tampão TAE (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) a 45 volts durante aproximadamente 18-22 horas para conseguir a separação dos fragmentos. Os géis foram corados com brometo de etídeo (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o DNA foi visualizado sob luz ultravioleta (UV).

Exemplo 4.3: Transferência de Southern e Tratamento da Membrana A análise de Southern blot foi realizada essencialmente como descrito por Memelink, J., Swords, K., Harry J., Hoge, C., (1994) Southern, Northern and Western Blot Analysís. Plant Mol. Biol. Manual F1:1-23. Sucintamente, após a separação por eletroforese e a visualização dos fragmentos de DNA, os géis foram desnaturados com 1X Solução de Desnaturação (1,5 M de NaOH, 20 mM de EDTA) durante exatamente 20 minutos e então lavada com 1X Solução de Neutralização (1,5 M de NaP04, pFH 7,8) durante pelo menos 20 minutos. A transferência de Southern foi realizada durante a noite sobre membranas de nylon utilizando um sistema de capilaridade com 1X solução de Transferência (0,25 M de Pirofosfato de Sódio, pH 10). Após a transferência o DNA foi ligado à membrana através de aquecimento a 65°C durante 1 hora ou através de reticulação por UV seguida pela breve lavagem da membrana com 1X solução de Transferência. Este método produziu membranas de Southern blot prontas para hibridização.

Exemplo 4.4: Marcação e Flibridização da Sonda de DNA

Os fragmentos de DNA ligados à membrana de nylon foram detectados utilizando uma sonda marcada radioativamente com P32. As sondas foram geradas através de um método baseado na PCR utilizando iniciadores específicos para os elementos gênicos e seguindo o procedimento padronizado do fabricante com a HOTSTAR® Taq polimerase (Qiagen, CA). 50 ng de sonda de DNA específica para cada elemento gênico e 25 ng de 1Kb plus ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram marcados com P32 utilizando READY TO GO LABELING BEADS® (Amersham, Piscataway, NJ) seguindo as instruções do fabricante. As sondas foram purificadas utilizando a coluna de centrífuga Nucleotide G-50® da Amersham seguindo o protocolo do fabricante.

Antes da adição da sonda marcada radioativamente com P32, os blots na membrana de nylon contendo o DNA fixo foram bloqueados com tampão de bloqueio: (2% de SDS, 0,5% de BSA, 1mM de EDTA, 1 mM de ortofenantrolina) durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente em um agitador e foram então pré-hibridizados com 10 mL de Perfect HYB Plus Buf-fer® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 65°C durante pelo menos 1 hora em um forno de hibridização. As sondas marcadas purificadas foram desnatura-das em um banho de água em ebulição durante 5 minutos e colocadas em gelo durante 5 minutos e então adicionadas nas membranas bloqueadas e pré-hibridizadas e colocadas durante a noite a 65°C em um forno de híbridi-zação.

Após a hibridização da sonda, a solução da sonda foi descartada dentro do lixo radioativo. Os blots da membrana foram lavados duas vezes em seu tubo de hibridização original com 1 X Ribowash™: (200 mM de Fosfato de sódio, 50 mM de Pirofosfato de sódio, 10 mM de EDTA, 2% de SDS, pH até 7,8) tampão de lavagem durante 15 minutos cada lavagem em um forno de hibridização a 65°C. Cada lavagem foi descartada dentro do lixo para líquido radioativo seguindo os procedimentos de operação padronizados. As membranas foram removidas do tubo e colocadas em uma bandeja de lavagem limpa e lavadas mais uma vez em uma incubadora com agitação a 65°C durante 15 minutos adicionais. As membranas foram embrulhadas em plástico para embalagem, colocadas dentro de um cassete de filme e expostas a uma tela formadora de imagem de fósforo durante 1 até 3 dias.

As imagens foram obtidas utilizando o BioRad Personal FX Fosfor Imager® seguindo os manuais do equipamento e do software.

As sondas utilizadas para a hibridização são descritas na Tabela 4. O 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi utilizado para determinar o tamanho do fragmento de hibridização sobre os Southern blots. Tabela 4: Comprimento das sondas utilizadas na análise de Southern e do evento de algodão pDAB4468.19.10.3__________________________________ Exemplo 4.5: Resultados do Southern Blot Os tamanhos de fragmentos esperados e observados com um produto de digestão e uma sonda particulares, com base nos sítios conhecidos da enzima de restrição do cassete de expressão gênica de aad-12 e pat, são fornecidos na Tabela 5. Os tamanhos de fragmentos esperados se baseiam no mapa plasmideal de pDAB4468 e os tamanhos de fragmentos observados são resultados apropriados provenientes destas análises e se baseiam na correspondência da banda com os tamanhos indicados do 1 Kb Plus DNA Ladder.

Dois tipos de fragmentos foram identificados partindo destes produtos da digestão e das hibridizações: fragmentos internos em que sítios de enzimas flanqueiam a região da sonda e estão completamente contidos dentro da região de inserção do cassete de expressão de aad-12 e fragmentos de borda em que um sítio de enzima conhecido fica localizado em uma extremidade da região da sonda e um segundo sítio são esperados no ge-noma de algodão. Os tamanhos dos fragmentos de borda variam por evento, porque, na maioria dos casos, os sítios de integração do fragmento de DNA são exclusivos para cada evento. Os fragmentos de borda fornecem um meio de localizar um sítio de enzima de restrição em relação ao DNA inte- grado e de avaíiar o número de inserções do DNA. As análises de Southern blot completadas em várias gerações de linhagens de algodão contendo o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 produziram dados que sugeriram que um cassete de expressão de aad-12 intacto com baixo número de cópias proveniente do pDAB4468 foi inserido dentro do genoma de algodão resultando assim no evento de algodão pDAB4468.19.10.3.

As enzimas de restrição Nsil e Swal se ligam e clívam sítios de restrição únicos dentro do plasmídeo pDAB4468. Subsequentemente, estas enzimas foram selecionadas para caracterizar o inserto do gene aad-12 no evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Foi previsto que os fragmentos de borda maiores que 6,3 Kb ou maiores que 4,3 Kb se hibridizaram com a sonda após as digestões, respectivamente (Tabela 5). Bandas de hibridiza-ção de aad-12 isoladas de aproximadamente 7,0 Kb e aproximadamente 5,5 Kb foram observadas quando Nsil e Swal foram utilizadas, respectivamente. Em adição, a enzima de restrição Ncol foi selecionada para caracterizar o inserto do gene aad-12. O plasmídeo utilizado para produzir o evento de algodão pDAB4468.19.10.3, pDAB4468, continha um único sítio de restrição de Ncol no cassete de expressão do plasmídeo pDAB4468 e dois sítios adicionais na área "estrutural" do plasmídeo pDAB4468. Foi previsto que um fragmento de borda maior que 2,8 Kb se hibridizaria com a sonda após as digestões (Tabela 5). Uma única banda de hibrídização de aad-12 de aproximadamente 9,75 Kb foi observada. A hibrídização da sonda com as bandas deste tamanho sugere a presença de um único sítio de inserção para o gene aad-12 no genoma de algodão do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Três combinações de enzimas de restrição, Nde, Nsi-l+Ncol e Nsil+Sbfl, foram selecionadas para liberar um fragmento que contém várias regiões do cassete de expressão de aad-12 e do cassete de expressão de pat (Tabela 5). A enzima de restrição Ndel inclui os elementos do cassete de expressão de aad-12 provenientes do Promotor Ubi10 até o terminador AtuORF23 UTR. Um fragmento previsto de 3,5 Kb foi observado nos blots tratados com sonda com a sonda de aad-12 após a digestão com Ndel. A digestão dupla com Nsil e Ncol inclui os elementos dos cassetes de expressão de aad-12 e de pat. Um fragmento previsto de 3,5 Kb foi observado nos blots tratados com sonda com a sonda de aad-12 após a digestão dupla com enzimas. (Tabela 5). A digestão dupla com Nsil e Sbfl contém ambos os elementos dos cassetes de expressão de aad-12 e pat. Um fragmento previsto de 4,8 Kb foi observado nos blots tratados com sonda com aad-12 após a digestão dupla com enzimas. (Tabela 5).

Em adição, foram observadas bandas de hibridização nos blots que foram tratados com sonda com uma sonda de pat e digeridos com as enzimas de restrição descritas anteriormente (Nsil, Ncol, Swal, Ndel, Nsi-l+Ncol e Nsil+Sbfl). Os blots resultantes produziram fragmentos que indicam que o cassete de expressão de pat estava presente no evento de algodão pDAB4468.19.10.3. A Tabela 5 lista os tamanhos de fragmentos esperados que se baseiam no mapa plasmideal de pDAB4468, em adição aos tamanhos de fragmentos observados que resultam dos Southern blots tratados com sonda de pat Estes resultados obtidos para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 indicam que um cassete de expressão de aad-12 intacto e o cassete de expressão de pat do plasmideo pDAB4468 foram inseridos dentro do genoma de algodão do evento de algodão pDAB446S. 19.10.3. Exemplo 4,6: Ausência de Sequências Estruturais A análise de Southern blot também foi realizada para verificar a ausência do gene de resistência à espectinomicina (specR), elemento Ori Rep e proteína de início da replicação trfA (elemento trf A) no evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Após a digestão com Nsil e a hibridização com uma sonda específica a specR, uma banda do tamanho esperado de aproximadamente 12 Kb foi observada na amostra de controle positivo (pDAB4468 mais Coker 310), mas ausente das amostras do controle negativo e do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Similarmente, uma banda do tamanho esperado de aproximadamente 7,25 Kb foi detectada na amostra de controle positivo (pDAB4468 mas Coker 310), mas ausente das amostras do controle negativo e do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 após a digestão com Ncol e a hibridização com uma mistura de sonda específica para OriRep e sonda específica para trfA. Estes dados indicam a ausência do ge- ne de resistência à espectinomicina, do elemento Ori Rep e da proteína de início da replicação trfA no evento de algodão pDAB4468.19.10.3.

Tabela 5: Fragmentos de Hibridização Previstos e Observados na Análise de Southern Blot. 1. Os tamanhos de fragmentos esperados se baseiam no mapa plasmideal de pDAB4468. 2. Os tamanhos de fragmentos observados são considerados aproximadamente daquelas análises e se baseiam nos tamanhos indicados dos fragmentos de Peso Molecular de DNA marcados com P32.

Exemplo 5: Tolerância a 2,4-D nos Testes de Campo A tolerância do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 a aplicações pós-emergência do herbicida de ácido fenoxiacético, 2,4-D, foi estudada em testes de campo durante a estação de cultivo de 2010. A tolerância a herbicida foi avaliada após uma única aplicação pós-emergência de 2,4-D realizada no evento de algodão pDAB4468.19.10.3 de 2-4 folhas. A aplicação de 2,4-D sobre plantas de algodão neste estágio de desenvolvimento representa um momento de aplicação de herbicida tipicamente utilizado para atingir o controle satisfatório de ervas daninhas pelos cultivadores de algodão. A tolerância a 2,4-D foi medida através da avaliação das plantas de algodão em relação a danos no dia 0-1 após a aplicação (DAA), 7-8 DAA, 12-16 DAA e 24-32 DAA. As medidas para o incremento de tempo do dia 0-1 foram obtidas partindo de 6-24 horas após a aplicação. Os danos foram avaliados através da atribuição de uma classificação percentual de danos visuais utilizando uma escala de porcentagem linear (1-100%) em que 0% repre- senta nenhum dano causado por herbicida visível e 100% representa morte celular. As classificações eram um escore compósito para qualquer sintomatologia causada pelo herbicida incluindo epinastia, clorose, necrose da folha e morte da planta. A sintomatologia a herbicida presente em 0-1 DAA era primariamente epinastia e sintomas em avaliações posteriores eram primariamente clorose e necrose.

Os testes de campo foram conduzidos em onze localizações ao longo dos Estados Unidos da América em áreas típicas de produção de algodão do Alabama, Arkansas, Califórnia, Geórgia, Louistana, Mississippi, Carolina do Norte, Carolina do Sul e Tennessee. Os testes foram planejados com quatro réplicas por tratamento. Cada réplica foi separada por uma passagem de solo nu de 10-15 pés (3,04 rn até 4,57 m) de largura. O tamanho do lote para tratamentos individuais era de 2 fileiras por 20 pés (6,09 m) de comprimento com fileiras tipicamente espaçadas por 36-40 polegadas (91,44 cm até 101,6 cm) separadas. Os tratamentos experimentais consistiam do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 borrifado com 2,4-D amina (Weedar 64™, NuFarm, Burr Ridge, IL) a 0, 1120, 2240 ou 4480 gramas de equivalente ácido por hectare (g ae/ha) aplicados em 15 galões (56,78 litros) por acre de solução de spray final. Um tratamento comparador de algodão não transformado não foi incluído nestes experimentos uma vez que é sabido que o tratamento com 2,4-D a taxas muito menores que a taxa mais baixa testada (1120 g ae/ha) resulta na morte da planta. A Tabela 6 apresenta os meios de tratamento para danos visuais resultantes da aplicação pós-emergência de 2,4-D. Com a exceção da epinastia transitória 0-1 DAA, nenhum dano causado por herbicida agrono-micamente significativo foi notado nestes experimentos. O tratamento com 2,4-D a 4480 g ae/ha (que representa uma taxa antecipada como sendo de >4X que era requerida para o controle de ervas daninhas de amplo espectro) resultava em poucos danos da planta de cultivo além do intervalo de avaliação de 7-8 DAA e demonstra a tolerância robusta do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 a 2,4-D.

Tabela 6: Porcentagem de danos visuais para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 após a aplicação pós-emergência de 2,4-D._____________ Exemplo 6: Tolerância ao Glufosinato em Testes de Campo A tolerância de evento de algodão pDAB4468.19.10.3 às aplicações pós-emergência de glufosinato foi estudada em testes de campo durante a estação de cultivo de 2010. A tolerância a herbicida foi avaliada após uma única aplicação pós-emergência de glufosinato realizada no evento de algodão pDAB4468.19.10.3 de 6-8 folhas, que representa um momento de aplicação de herbicida tipicamente utilizado com glufosinato para atingir o controle satisfatório de ervas daninhas. A tolerância ao glufosinato foi medida através da avaliação das plantas de algodão em relação a danos nos 2-4 dias após a aplicação (DA-A), 7-9 DAA, 13-19 DAA e 22-29 DAA. Os danos foram avaliados através da atribuição de uma classificação percentual de danos visuais utilizando uma escala de porcentagem linear (1-100) em que 0% representa nenhum dano visível causado pelo herbicida e 100% representa a morte da planta. As classificações eram um escore compósito para qualquer sintomatologia do herbicida incluindo clorose, necrose da folha, atrofia e morte da planta. A sintomatologia do herbicida (quando presente) era primariamente clorose e necrose.

Os testes de campo foram conduzidos em onze localizações ao longo dos Estados Unidos da América em áreas típicas produtoras de algodão do Alabama, Arkansas, Califórnia, Geórgia, Louisiana, Mississippi, Caro-lina do Norte, Carolina do Sul e Tennessee. Os testes foram planejados com quatro réplicas por tratamento. Cada réplica foi separada por uma área de solo nu de 10-15 pés (3,04 m até 4,57 m) de largura. O tamanho do lote para tratamentos individuais era de 2 fileiras por 20 pés (6,09 m) de comprimento com fileiras tipicamente espaçadas em 36-40 polegadas (91,44 cm até 101,6 cm) das outras. Os tratamentos experimentais consistiam do evento de al- godão pDAB4468.19.10.3 borrifado com amônio glufosinato (Ignite 280 SL™, Bayer, Research Triangle, NC) a 0, 542, 1084 ou 2168 gramas de e-quivalente ácido por hectare (g ae/ha) aplicados em 15 galões (56,78 litros) por acre de solução final de spray. Um tratamento de comparação com algodão não transformado não foi incluído nestes experimentos uma vez que seria esperado que o tratamento com glufosinato em taxas muito menores que a taxa mais baixa testada (542 g ae/ha) resultaria na morte da planta. A Tabela 7 apresenta os meios de tratamento para danos visuais resultantes da aplicação pós-emergência de glufosinato. Com a exceção da clorose transitória nos lotes tratados com 2168 g ae/ha (>4X a taxa típica de uso) a 2-4 & 7-9 DAA, nenhum dano causado pelo herbicida agronomicamente significativo foi notado nestes experimentos. O tratamento com glufosinato 2168 g ae/ha (que representa uma taxa antecipada como sendo >4X daquela requerida para o controle de ervas daninhas de amplo espectro) resultou em poucos danos na planta de cultivo além do intervalo de avaliação de 7-9 DAA e demonstra a tolerância robusta do evento de algodão pDAB4468.19.10.3.

Tabela 7: Porcentagem de danos visuais para o evento de algodão 3DADB4468.19.10.3 após a aplicação pós-emergência de glufosinato.

Exemplo 7: Tolerância a Triclopir e Fluroxipir em Testes de Estufa A tolerância do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 a aplicações pós-emergência dos herbicidas de ácido piridiloxiacético, triclopir e fluroxipir, foi estudada em testes de estufa. A tolerância a herbicida foi avaliada após uma única aplicação pós-emergência de triclopir ou fluroxipir.

As sementes do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foram tratadas termicamente em um banho de água a 82,5°C durante 1 minuto e então plantadas em meio metro mix 360 e crescidas em estufa. As temperaturas na estufa tinham em média 27°C e o fotoperíodo foi ajustado em 16 horas de luz e oito horas de escuridão, com intensidade de luz máxima. Foi permitido que as plantas crescessem até o estágio de desenvolvimento de 3 folhas e um estudo não aleatório foi conduzido com três réplicas e três tratamentos para cada herbicida. As plantas foram borrifadas em um borrifador em bandeja calibrado para fornecer 187 L/ha das formulações comerciais de triclopir (Garlon 4™, Dow AgroSciences, Indianapolis, IN) e fíuroxipir (Stara-ne™, Dow AgroSciences, Indianapolis, IN). Uma variedade de algodão Co-ker 310 não transformada foi utilizada como um controle negativo. A avaliação visual de danos foi obtida 3 DAA (dias após a aplicação) e 11 DAA comparando cada taxa de herbicida. Os danos foram avaliados visualmente como a porcentagem de folhagem de planta de algodão epinástica utilizando uma escala de porcentagem linear (1-100%) em que 0% representa nenhum dano causado por herbicida visível e 100% representa a morte da planta. O evento de algodão pDAB4468.19.10.3 fornece tolerância aos níveis de fíuroxipir de até 280 g ae/ha até 3 DAA (Tabela 8). Em adição, o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 fornece tolerância a triclopir (Tabela 8). Em 3 DAA as plantas do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 demonstravam níveis moderados de tolerância a triclopir, mais em 11 DAA as plantas tinham se recuperado da resposta de epinastia inicial e forneciam tolerância robusta comparada com o controle não transformado. O estudo resultante demonstra que o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 fornece tolerância aos herbicidas de ácido piridiloxiacético, triclopir e fíuroxipir.

Tabela 8: Porcentagem de danos visuais após a aplicação pós-emergência Hos. herbicidas triclonír e fluroxioir. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente (P=,05, Student -Newman-Keuls).

Exemplo 8: Caracterização Agronômica do Evento de Algodão PDAB4468.19.10.3 As características agronômicas do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foram quantificadas nos testes de campo conduzidos ao longo de localizações geograficamente diferentes ao longo de todo o cinturão de algodão em 2010. Estes estudos comparavam o desempenho agronômico do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 (com e sem aplicações dos herbicidas 2,4-D e glufosinato) com o controle de isolinhagem próxima não transgênica, Coker 310. Nenhuma diferença não pretendida agronomíca-mente significativas foi observada entre o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 e as plantas de controle Coker 310. Os resultados destes testes de campo demonstravam que o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 era agronomicamente equivalente às plantas de controle Coker 310 e que a presença do inserto do filamento T de pDAB4468 não alterava o desempenho agronômico esperado do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Adicionalmente, o desempenho agronômico do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 não foi alterado como um resultado da aplicação dos herbicidas, 2,4-D e glufosinato, quando comparado com as plantas do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 que não foram borrifadas com os tratamentos com herbicidas.

As avaliações das características agronômicas foram feitas em relação ao vigor de mudas, à % de emergência da planta, ao início de flor, aos nós após a flor branca (NAWF) e à determinação de rendimento utilizando os critérios indicados na Tabela 9. A fibra coletada foi enviada para o Fiber and Biopolimer Research Institute em Lubbock, Texas para a avaliação da fibra utilizando o Instrumento de Alto Volume (HVI).

Tahela 9: Características aaronômicas avaliadas nos testes de rendimento.

As sementes do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 e as sementes da linhagem de controle de isolinhagem próxima, Coker 310, foram plantadas a uma taxa de 80 sementes por 20 pés de fileira com um espaçamento de fileiras de 34-38 polegadas (86,36 cm - 96,52 cm). Este planejamento de plantio foi replicado quatro vezes em cada local. Cada local foi dis- posto em um planejamento de blocos aleatório completo (CRBD) que consiste em 3 blocos não borrifados e 4 blocos borrifados para cada réplica. As plantas foram borrifadas com os herbicidas 2,4-D e glufosinato utilizando taxas de aplicação no campo padronizadas e métodos que são descritos anteriormente. As duas fileiras do centro (fileiras 2 e 3) foram utilizados para medir as características agronômicas e avaliar as plantas. As características agronômicas medidas eram equivalentes para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 quando comparado com as plantas de controle de isoli-nhagem próxima Coker 310 em relação a todas as características agronômicas medidas e analisadas estatisticamente. Uma exceção foi identificada para os resultados de "% de emergência da planta" dentro dos lotes borrifados com herbicida do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Entretanto, os dados de "% de emergência da planta" eram tirados antes da aplicação de qualquer herbicida e a variabilidade nesta medida é atribuída a fatores ambientais. Nenhuma diferença não pretendida agronomicamente significativa foi observada entre o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 e as plantas de controle Coker 310. Estes testes de campo demonstraram que o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 era agronomicamente equivalente às plantas de controle Coker 310 e que a presença do inserto do filamento T de pDAB4468 não alterava o desempenho agronômico esperado do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Adicionalmente, o desempenho agronômico de evento de algodão pDAB4468.19.10.3 não foi alterado como um resultado da aplicação dos herbicidas, 2,4-D e glufosinato, quando comparado com as plantas do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 que não foram borrifadas com os tratamentos com herbicidas.

Tabela 10: Os dados estatísticos para eventos tratados (borrifados com herbicida) e não tratados (não borrifados com herbicida) quando comparados com a planta de algodão de controle de isolinhagem próxima.

Exemplo 9: Sequência de Comprimento Completo do Evento de algodão PDAB4468.19.10.3 A SEQ ID NO:21 fornece a sequência de evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Esta sequência contém a sequência genômica flanque-adora a 5', o inserto do filamento T de pDAB4468 e as sequências genômi-cas flanqueadoras a 3'. Em relação à SEQ ID NO:21, os resíduos 1 — 1.354 são a sequência genômica flanqueadora a 5', os resíduos 1.355 - 7.741 são resíduos do inserto do filamento T depDAB4468 e os resíduos 7.742 — 10.471 são a sequência flanqueadora a 3'. A sequência de junção ou transição em relação à extremidade a 5' do inserto ocorre assim nos resíduos 1.354 / 1.355 da SEQ ID NO:21. A sequência de junção ou transição em relação à extremidade a 3’ do inserto ocorre assim nos resíduos 7.741 / 7.742 da SEQ ID NO:21.

Deve ser observado que a sequência real do inserto do filamento T do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 pode se desviar ligeiramente da SEQ ID NO:21 em gerações subsequentes de plantas que são derivadas do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Durante o método de introgressão, não é incomum que algumas deleções ou outras alterações do inserto ocorram. Os peritos na arte esperariam encontrar ligeiras diferenças e menores discrepâncias nas sequências de gerações subsequentes de plantas que são derivadas do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Assim, o segmento relevante da sequência plasmideal fornecida aqui podería compreender algumas pequenas variações nas gerações subsequentes de plantas que são derivadas do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Consequentemente, uma planta que compreende um polinucleotídeo que possui alguma faixa de identidade com a sequência de objetivo do inserto está dentro do âmbito das modalidades da presente invenção. Uma sequência de polinucleotídeo que possui pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO:21 está dentro do âmbito das modalidades da presente invenção. A sequência das sequências flanqueadoras mais a sequência de inserto pode ser confirmada com referência à semente depositada. Assim, algumas diferenças entre a SEQ ID NO:21 e o inserto do filamento T real de gerações de plantas subsequentes que são derivadas do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 podem ser identificadas e estão dentro do âmbito das modalidades da presente invenção.

Exemplo 10: Tolerância a ácidos butanóicos de Tríclopire Fluroxipir em Teste de Estufa A tolerância do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 a aplicações pós-emergência de herbicidas que compreendem um grupamento de ácido butanóico, triclopir-B e fluroxipir-B, foi estudada em testes de estufa. A tolerância a herbicida foi avaliada após uma única aplicação pós-emergência das duas moléculas.

As sementes do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foram tratadas termicamente em um banho de água a 82,5°C durante 1 minuto e então plantadas em meio metro mix 360 e crescidas em um estufa. As temperaturas na estufa tinham em média 27°C e o fotoperíodo foi ajustado em 16 horas de luz e oito horas de escuridão, com intensidade de luz máxima. Foi permitido que as plantas crescessem até o estágio de desenvolvimento de 2-3 folhas e um estudo não aleatório foi realizado com quatro réplicas e três tratamentos para cada herbicida. Os herbicidas de ácido piridiloxiacético que compreendem um grupamento de ácido butanoico adicional, fluroxipir-B e triclopir-B, foram adquiridos e aplicados nas plantas de algodão. Os ingredientes ativos foram cada um formulados em uma solução de 97% de aceto-na e 3% de DMSO. Em adição, um concentrado de óleo de planta de cultivo foi adicionado até uma concentração final de 1,25%. As plantas foram borri-fadas em um borrifador em bandeja calibrado para fornecer 187 L/ha do material técnico formulado. Uma variedade de algodão Coker 310 não transformada foi utilizada como um controle negativo. A avaliação de danos visuais foi obtida 6 HAA (horas após a aplicação), 1 DAA (dias após a aplicação), 3DAA, 6DAA e 14 DAA comparando cada taxa de herbicida. Os danos foram avaliados visualmente como uma porcentagem de folhagem de planta de algodão que sofre epinastia utilizando uma escala de porcentagem linear (1-100%) em que 0% representa nenhum dano visível causado pelo herbicida e 100% representa a morte da planta. O evento de algodão pDAB4468.19.10.3 fornece tolerância a concentrações variáveis de fluroxipir-b e triclopir-b (Tabela 11 e Tabela 12). Em 6 HAA as plantas do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 demonstravam níveis moderados de tolerância a triclopir-b e fluroxipir-b, mas em 14 DAA as plantas tinham se recuperado da resposta epinástica inicial e forneciam tolerância robusta comparada com o controle não transformado. O estudo resultante demonstra que o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 fornece tolerância às formas butanóicas dos herbicidas de ácido piridiloxiacéti-co, triclopir-b e fluroxipir-b. 03 “O Ο Ια α3 -£= E ο ο tf) ο ~σ δ .α ο C tf) ο Χ3 .5 ra L_ -+-1 Ο 103 C= 00 tu ε ^ X ra -o -r-j ^ ·— Cl -¼ F "F F Jn ω σ Xi'm. CT3 <— _C CZ d O = O o w .Í2 O <D 32 ό CO ±= _ω t: o o j= jQ C. ·—· 0 <Λ O Ο ω « ^ o JÇ ,nj — XJ uí o o J2 c. w Φ 0) > Τ3 Φ Φ 2 Έ 03 03 CL· Q 55 03 O o c: •43 =3 £ E

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Claims (21)

1. Semente de algodão que compreende em seu genoma uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em resíduos 1329 -1380 da SEQ ID NO:1; resíduos 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; resíduos 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; resíduos 1154 - 1555 da SEQ ID NO:1; resíduos 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; resíduos 143 - 194 da SEQ ID NO:2; resíduos 118 - 219 da SEQ ID NO:2; resíduos 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e resíduos 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos dos mesmos.

2. Semente de algodão que compreende em seu genoma AAD-12/PAT o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 e que possui semente de algodão representativa depositada na American Type Culture Collection sob o No. de Acesso PTA-12457.

3. Planta de algodão produzida por crescimento da semente como definido na reivindicação 1 ou 2.

4. Semente de algodão produzida por uma planta como definido na reivindicação 3, em que a dita semente compreende em seu genoma AAD-12/PAT o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 que está presente em uma semente de algodão depositada na American Type Culture Collection sob o No. de Acesso PTA-12457.

5. Parte da planta de algodão como definido na reivindicação 3, em que a dita parte é selecionada do grupo que consiste em pólen, óvulo, flores, cápsulas, brotos, raízes e folhas e a dita parte compreende o dito e-vento.

6. Composição derivada da planta de algodão como definido na reivindicação 3 ou a parte como definido na reivindicação 5, em que a dita composição é um produto de consumo selecionado do grupo que consiste em uma farinha grossa de algodão, uma fibra de algodão e um óleo de algodão.

7. Progênie da planta de algodão da planta como definido na reivindicação 3, em que a dita planta exibe tolerância ao ácido fenoxiacético, ao ácido piridiloxiacético e a herbicidas de glufosinato e a dita tolerância é devida à expressão de uma proteína codificada no dito evento ou no dito genoma.

8. Planta de algodão de acordo com a reivindicação 3, em que a dita planta de algodão compreende uma sequência de DNA que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com os resíduos 1.355 - 7.741 da SEQ ID NO:21.

9. Semente de algodão que compreende um genoma que compreende uma sequência de DNA que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO;21.

10. Planta produzida por crescimento de uma semente como definido na reivindicação 9.

11. Planta de algodão transgênica ou parte da mesma que compreende o evento de algodão pDAB4468.19.10.3, em que as sementes de algodão representativas que compreendem o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foram depositadas na American Type Culture Collection sob o No. de Acesso PTA-12457.

12. Sequência de DNA isolada que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bpp 1329 - 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254- 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 - 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2.

13. Método de cruzamento de uma planta de algodão que compreende: o cruzamento de uma primeira planta com uma segunda planta de algodão para produzir uma terceira planta de algodão, a dita primeira planta compreendendo DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1329 - 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 -1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118-219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos dos mesmos; e a análise da dita terceira planta de algodão em relação à pre- sença do DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1329 — 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 — 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 - 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos dos mesmos.

14. Molécula de DNA isolada que compreende uma sequência de junção que compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 1329 - 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 — 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254- 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154-1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2 e complementos dos mesmos.

15. Método de controle de ervas daninhas em uma plantação de algodão que compreende a aplicação do herbicida ácido fenoxiacético à plantação de algodão, a dita plantação de algodão compreendendo plantas de algodão que compreendem DNA que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 1329 - 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 -1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118-219 da SEQ ID NO:2; bp 68-269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o dito herbicida de ácido fenoxiacético é 2,4-D.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o dito herbicida de ácido fenoxiacético é MCPA.

18. Método de controle de ervas daninhas em uma plantação de algodão que compreende a aplicação do herbicida ácido piridiloxiacético à plantação de algodão, a dita plantação de algodão compreendendo plantas de algodão que compreendem DNA que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 1329 — 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 - 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254 - 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154 - 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o dito herbicida de ácido piridiloxiacético é triclopir.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o dito herbicida de ácido piridiloxiacético é fluroxipir.

21. Método de controle de ervas daninhas em uma plantação de algodão que compreende a aplicação de herbicida de glufonisato à plantação de algodão, a dita plantação de algodão compreendendo plantas de algodão que compreendem D NA que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 1329 — 1380 da SEQ ID NO:1; bp 1304 — 1405 da SEQ ID NO:1; bp 1254- 1455 da SEQ ID NO:1; bp 1154- 1555 da SEQ ID NO:1; bp 1054 - 1655 da SEQ ID NO:1; bp 143 - 194 da SEQ ID NO:2; bp 118 - 219 da SEQ ID NO:2; bp 68 - 269 da SEQ ID NO:2; e bp 1 - 369 da SEQ ID NO:2.