ES2714432T3 - Evento de soja 9582.814.19.1 resistente a insectos y tolerante a herbicidas - Google Patents
Evento de soja 9582.814.19.1 resistente a insectos y tolerante a herbicidas Download PDFInfo
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Abstract
Un método para controlar insectos que comprende exponer insectos a plantas de soja resistentes a insectos, comprendiendo dichas plantas de soja un segmento polinucleotídico que tiene al menos una identidad de 95% con SEQ ID NO: 14, que comprende el evento de soja 9582.814.19.1, en donde una semilla de soja representativa ha sido depositada en la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC) con el número de acceso PTA-12006.
Description
DESCRIPCION
Evento de soja 9582.814.19.1 resistente a insectos ytolerante a herbicidas
Antecedentes de la invencion
Los genes que codifican Cry1F y Cry1Ac synpro (Cry1Ac) son capaces de conferir resistencia a los insectos, p. ej. resistencia a insectos lepidopteros, a las plantas transgenicas; y el gen que codifica PAT (fosfinotricina acetiltransferasa) es capaz de conferir tolerancia al herbicida fosfinotricina (glufosinato) a las plantas transgenicas. PAT se ha expresado satisfactoriamente en soja para utilizarla como un marcador seleccionable en la produccion de cultivos transgenicos resistentes a insectos, y para conferir niveles comerciales de tolerancia al herbicida glufosinato en cultivos transgenicos.
Se sabe que la expresion de genes foraneos en las plantas esta influenciada por su ubicacion en el genoma de la planta, tal vez debido a la estructura de la cromatina (p. ej., la heterocromatina) o a la proximidad de elementos reguladores de la transcripcion (p. ej., potenciadores) cerca del sitio de integracion (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Al mismo tiempo, la presencia del transgen en diferentes ubicaciones en el genoma influira en el fenotipo general de la planta de diferentes maneras. Por esta razon, a menudo es necesario escrutar un gran numero de eventos para identificar un evento caracterizado por la expresion optima de un gen de interes introducido. Por ejemplo, se ha observado en plantas y en otros organismos que puede haber una amplia variacion en los niveles de expresion de un gen introducido entre eventos. Tambien pueden existir diferencias en los patrones de expresion espaciales o temporales, por ejemplo, diferencias en la expresion relativa de un transgen en diversos tejidos vegetales, que pueden no corresponder a los patrones esperados de los elementos reguladores de la transcripcion presentes en la construccion genica introducida. Por esta razon, es comun producir de cientos a miles de eventos diferentes y escrutar esos eventos para determinar un evento unico que tenga los niveles y patrones de expresion transgenica deseados para fines comerciales. Un evento que tiene niveles o patrones deseados de expresion transgenica es util para la introgresion del transgen en otros fondos geneticos mediante exocruzamiento sexual utilizando metodos de reproduccion convencionales. La progenie de tales cruces mantiene las caractensticas de la expresion transgenica del transformante original. Esta estrategia se utiliza para garantizar una expresion genica confiable en una serie de variedades que estan bien adaptadas a las condiciones locales de crecimiento.
Es deseable poder detectar la presencia de un evento particular para determinar si la progenie de un cruzamiento sexual contiene un transgen o un grupo de transgenes de interes. Ademas, un metodo para detectar un evento en particular sena util para cumplir con las regulaciones que requieren la aprobacion y el etiquetado previos a la comercializacion de alimentos derivados de plantas de cultivos recombinantes, por ejemplo, o para su uso en el control ambiental, el control de rasgos en cultivos en el campo, o el control de los productos derivados de una cosecha de cultivos, asf como para utilizarlos para asegurar el cumplimiento de las partes sujetas a terminos reguladores o contractuales.
Es posible detectar la presencia de un evento transgenico mediante cualquier metodo de deteccion de acido nucleico conocido en la tecnica, incluyendo, pero no limitado a, la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridacion de ADN utilizando sondas de acido nucleico. Estos metodos de deteccion generalmente se centran en elementos geneticos utilizados frecuentemente, tales como promotores, terminadores, genes marcadores, etc., debido a que para muchas construcciones de ADN, la region codificante es intercambiable. Como resultado, tales metodos pueden no ser utiles para discriminar entre diferentes eventos, particularmente aquellos producidos utilizando la misma construccion de ADN o construcciones muy similares, a menos que se conozca la secuencia de ADN del ADN flanqueante adyacente al ADN heterologo insertado. Por ejemplo, un ensayo de PCR espedfico de evento se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 2006/0070139 para el evento de mafz DAS-59122-7. Sena deseable contar con un metodo simple y discriminativo para la identificacion del evento de soja 9582.814.19.1. Breve exposicion de la invencion
La presente invencion se refiere a un nuevo evento de transformacion de soja transgenica resistente a insectos y tolerante a herbicidas, denominado evento de soja 9582.814.19.1, que comprende crylF, crylAc y pat, como se describe en la presente memoria, insertados en un sitio espedfico dentro del genoma de una celula de soja. La semilla de soja representativa se ha depositado en la Coleccion de Cultivos Tipo Americana (ATCC) con el Numero de Acceso identificado en el parrafo [0021]. El ADN de las plantas de soja que contienen este evento incluye las secuencias de union/flanqueantes descritas en la presente memoria que caracterizan la ubicacion del ADN insertado dentro del genoma de la soja. SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 tienen caracter diagnostico para el evento de soja 9582.814.19.1. Mas concretamente, las secuencias que rodean las uniones en los pb 1400/1401, y los pb 1536/1537 de SEQ ID NO: 1, y los pb 152/153 de SEQ iD NO: 2 tienen caracter diagnostico para el evento de soja 9582.814.19.1. El parrafo [00012] a continuacion describe ejemplos de secuencias que comprenden estas uniones que son caractensticas del ADN de la soja que contiene el evento de soja 9582.814.19.1.
En una realizacion, la invencion proporciona un metodo para controlar insectos que comprende exponer insectos a plantas de soja resistentes a insectos, comprendiendo dichas plantas de soja un segmento de polinucleotidos que tiene al menos una identidad de 95% con SEQ ID NO: 14, que comprende el evento de soja 9582.814.19.1, en
donde una semilla de soja representativa se ha depositado en la Coleccion de Cultivos Tipo Americana (ATCC) con el numero de acceso PTA-12006. La presencia de los genes crylF v3 (crylF) y crylAc synpro (crylAc) en el evento de soja 9582.814.19.1 confiere resistencia, por ejemplo, a Pseudoplusia includens (gusano medidor de la soja), Anticarsia gemmatalis (oruga de las leguminosas), Epinotia aporema, Omoides indicatus, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Spodoptera cosmoides, Spodoptera eridania, Heliothis virescens, Heliocoverpa zea, Spilosoma virginica y Elasmopalpus lignosellus.
En otra realizacion, la invencion proporciona una secuencia de ADN aislada que comprende una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en los pb 1350-1450 de SEQ ID NO: 1; los pb 1300-1500 de SEQ ID NO: 1; los pb 1200-1600 de SEQ ID NO: 1; los pb 137-168 de SEQ ID NO: 2; los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2; y los pb 3 303 de SEQ ID NO: 2.
En una realizacion, la invencion proporciona una planta de soja, o parte de la misma que comprende una secuencia de ADN que tiene al menos una identidad de secuencia de 95% con SEQ ID NO: 14, que comprende el evento de soja 9582.814.19.1, en donde una semilla de soja representativa se ha depositado en la Coleccion de Cultivos Tipo Americana (ATCC) con el numero de acceso PTA-12006, que es resistente a Pseudoplusia includens (gusano medidor de la soja) y comprende ADN que tiene al menos una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en los pb 1385-1415 de SEQ ID NO: 1; los pb 1350-1450 de SEQ ID NO: 1; los pb 1300-1500 de SEQ ID NO: 1; los pb 1200-1600 de SEQ ID NO: 1; los pb 137-168 de SEQ ID NO: 2; los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2; y los pb 3-303 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos, en donde las partes de la planta de soja se seleccionan del grupo que consiste en polen, ovulo, flores, brotes, rafces, hojas, nucleos de celulas vegetativas, polen, celulas, semillas, y celulas huevo.
En otra realizacion, la invencion proporciona una planta de soja que comprende una secuencia de ADN que tiene al menos una identidad de secuencia de 95% con SEQ ID NO: 14, preparada al cruzar una primera planta de soja que comprende una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en 1385-1415 de SEQ ID NO: 1, los pb 1350-1450 de SEQ ID NO: 1, los pb 1300-1500 de SEQ ID NO: 1, los pb 1200-1600 de SEQ ID NO: 1, los pb 137 168 de SEQ ID NO: 2, los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2, y los pb 3-303 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos con una segunda planta de soja y el analisis de la planta de soja producida para determinar la presencia de ADN que comprende una o mas secuencias seleccionadas de la grupo que consiste en los pb 1385-1415 de SEQ ID NO: 1, los pb 1350-1450 de SEQ ID NO: 1, los pb 1300-1500 de SEQ ID NO: 1, los pb 1200-1600 de SEQ ID NO: 1, los pb 137-168 de SEQ ID NO: 2, los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2, los pb 3-303 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos. En otra realizacion, la invencion proporciona como planta de soja, o parte de la misma, que comprende una secuencia de ADN que tiene al menos una identidad de secuencia de 95% con SEQ ID NO: 14, que comprende el evento de soja 9582.814.19.1, en donde las semillas representativas de dicha planta de soja se han depositado en la Coleccion de Cultivos Tipo Americana con el numero de acceso PTA-12006.
En otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para controlar las plagas en grano, semilla, semola o harina de soja que comprende incluir el evento de soja 9582.814.19.1, en donde una semilla de soja representativa se ha depositado en la Coleccion de Cultivos Tipo Americana (ATCC) con el numero de acceso PTA-12006, que comprende una secuencia de ADN que tiene al menos una identidad de secuencia de 95% con SEQ ID NO: 14 en dicho grano, semilla, semola o harina, como lo demuestran dichos grano, semilla, semola o harina que comprenden una o mas secuencias de ADN seleccionadas del grupo que consiste en los pb 1385-1415 de SEQ ID NO: 1, los pb 1350-1450 de SEQ ID NO: 1, los pb 1300-1500 de SEQ ID NO: 1, los pb 1200-1600 de SEQ ID NO: 1, los pb 137 168 de SEQ ID NO: 2, los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2, los pb 3-303 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos.
La invencion tambien incluye celulas de plantas de soja y partes de plantas que incluyen, pero no se limitan a, polen, ovulos, flores, brotes, rafces y hojas, y nucleos de celulas vegetativas, celulas de polen, semilla y semola de semilla y celulas huevo, que contienen el evento de soja 9582.814.19.1.
En algunas realizaciones, el evento de soja 9582.814.19.1 se puede combinar con otros rasgos, que incluyen, por ejemplo, otros genes de tolerancia a los herbicidas y/o protemas inhibidoras de insectos y secuencias reguladoras de la transcripcion (es decir, ARN de interferencia, ARNdh, factores de transcripcion, etc.). Los rasgos adicionales se pueden agrupar en el genoma de la planta mediante el mejoramiento vegetal, la re-transformacion de la planta transgenica que contiene el evento de soja 9582.814.19.1, o la adicion de nuevos rasgos mediante la integracion dirigida a traves de la recombinacion homologa.
En un ejemplo, la invencion describe semillas de tales plantas. En otro ejemplo, la invencion describe un metodo para controlar las malas hierbas en un cultivo de soja que comprende aplicar herbicida glufosinato al cultivo de soja, comprendiendo dicho cultivo de soja plantas de soja que tienen un genoma que contiene una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en los pb 1385 1415 de SEQ ID NO: 1; los pb 1350-1450 de SEQ ID NO: 1; los pb 1300-1500 de SEQ ID NO: 1; los pb 1200-1600 de SEQ ID NO: 1; los pb 137-168 de SEQ ID NO: 2; los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2; y los pb 3-303 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos, que tiene caracter diagnostico de la presencia del evento de soja 9582.814.19.1. La presencia del gen pat v6 (pat) en el evento de soja 9582.814.19.1 confiere tolerancia al herbicida glufosinato.
En otro ejemplo, la invencion describe un metodo para detectar un evento de soja 9582.814.19.1 en una muestra que comprende ADN de soja, comprendiendo dicho metodo:
(a) poner en contacto dicha muestra con un primer cebador de al menos 10 pb de longitud que se une selectivamente a una secuencia flanqueante dentro de los pb 1-1400 de SEQ ID NO: 1 o su complemento, y un segundo cebador de al menos 10 pb de longitud que se une selectivamente a una secuencia de insercion dentro de los pb 1401-1836 de SEQ ID NO: 1 o su complemento; y someter a ensayo para determinar un amplicon generado entre dichos cebadores; o
(b) poner en contacto dicha muestra con un primer cebador de al menos 10 pb de longitud que se une selectivamente a una secuencia del inserto dentro de los pb 1-152 de SEQ ID NO: 2 o su complemento, y un segundo cebador de al menos 10 pb de longitud que se une selectivamente a la secuencia flanqueante dentro de los pb 153-1550 de SEQ iD NO: 2 o su complemento; y
(c) someter a ensayo para determinar un amplicon generado entre dichos cebadores.
En otro ejemplo, la invencion describe un metodo para detectar el evento de soja 9582.814.19.1 que comprende:
(a) poner en contacto dicha muestra con un primer cebador que se une selectivamente a una secuencia flanqueante seleccionada del grupo que consiste en los pb 1-1400 de SEQ ID NO: 1 y los pb 153-1550 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos; y un segundo cebador que se une selectivamente a SEQ ID NO: 3, o su complemento;
(b) someter dicha muestra a reaccion en cadena de la polimerasa; y
(c) someter a ensayo para determinar un amplicon generado entre dichos cebadores.
En otro ejemplo, la invencion describe un metodo para cultivar una planta de soja que comprende: cruzar una primera planta con una segunda planta de soja para producir una tercera planta de soja, comprendiendo dicha primera planta ADN que comprende una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en los pb 1385 1415 de SEQ ID NO: 1; los pb 1350-1450 de SEQ ID NO: 1; los pb 1300-1500 de SEQ ID NO: 1; los pb 1200-1600 de SEQ ID NO: 1; los pb 137-168 de SEQ ID NO: 2; los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2; y los pb 3-303 de SEQ ID NO:
2, y sus complementos; y someter a ensayo dicha tercera planta de soja para determinar la presencia de ADN que comprende una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en los pb 1385-1415 de SEQ ID NO: 1; los pb 1350-1450 de SEQ ID NO: 1; los pb 1300-1500 de SEQ ID NO: 1; los pb 1200-1600 de SEQ ID NO: 1; los 137 168 de SEQ ID NO: 2; los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2; y los pb 3-303 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos.
En otro ejemplo, la invencion describe una molecula de ADN aislada que tiene caracter diagnostico del evento de soja 9582.814.19.1. Dichas moleculas incluyen, ademas de SEQ ID NO: 1 y 2, moleculas de al menos 25 pb de longitud que comprenden los pb 1400-1401 de SEQ ID NO: 1 y al menos 10 pb de SEQ ID NO: 1 en cada direccion desde la union de los pb 1400/1401; amplicones de al menos 25 pb de longitud que comprenden 152 - 153 de SEQ
ID NO: 2 y al menos 10 pb de SEQ ID NO: 2 en cada direccion desde la union de los pb 152/153. Los ejemplos son los pb 1385-1415 de SEQ ID NO: 1; los pb 1350-1450 de SEQ ID NO: 1; los pb 1300-1500 de SEQ ID NO: 1; los pb 1200-1600 de SEQ ID NO: 1; los pb 137-168 de SEQ ID NO: 2; los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2; y los pb 3-303 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos.
Otros ejemplos incluyen la escision de secuencias de polinucleotidos que comprenden el evento de soja 9582.814.19.1, que incluyen, por ejemplo, el casete de expresion del gen pat. Tras la escision de una secuencia de polinucleotidos, el evento modificado puede ser redirigido a un sitio cromosomico espedfico en donde las secuencias de polinucleotidos adicionales se agrupan con el evento de soja 9582.814.19.1. En un ejemplo, la presente invencion describe un sitio diana cromosomico de soja ubicado en el cromosoma 02 entre las secuencias flanqueantes expuestas en SEQ ID NO: 1 y 2. En un ejemplo, la presente invencion describe un metodo para preparar una planta de soja transgenica que comprende insertar un acido nucleico heterologo en una posicion en el cromosoma 02 entre las secuencias genomicas expuestas en SEQ ID NO: 1 y 2, es decir, entre los pb 1-1400 de SEQ ID NO: 1 y los pb 153-1550 de SEQ ID NO: 2.
Ademas, la presente invencion describe ensayos para detectar la presencia del evento en cuestion en una muestra (por ejemplo, de soja). Los ensayos se pueden basar en la secuencia de ADN de la construccion recombinante, insertada en el genoma de la soja, y en las secuencias genomicas que flanquean el sitio de insercion. Tambien se describen los kits y las condiciones utiles para realizar los ensayos.
La presente invencion se refiere en parte a la clonacion y analisis de las secuencias de ADN de las regiones limftrofes resultantes de la insercion de ADN-T de pDAB9582 en lmeas de soja transgenicas. Estas secuencias son unicas. Basandose en las secuencias de insercion y union, se pueden generar y se han generado cebadores espedficos de eventos. El analisis por PCR demostro que estos eventos se pueden identificar mediante el analisis de los amplicones de PCR generados con estos conjuntos de cebadores espedficos de eventos. Por lo tanto, estos y otros procedimientos relacionados se pueden utilizar para identificar de forma unica las lmeas de soja que comprenden el evento de la presente invencion.
Deposito de semillas
Como parte de esta descripcion, al menos 2.500 semillas de una lrnea de soja que comprendfa el evento de soja 9582.814.19.1 se depositaron en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCc ), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. El deposito, Denominacion de Deposito de Patente a Tc C, PTA-12006, fue recibido por la ATCC el 21 de julio de 2011. Este deposito se realizo y se mantendra de acuerdo con y bajo los terminos del Tratado de Budapest con respecto a los depositos de semillas para los fines del procedimiento de patentes. Este deposito se realizo y se mantendra de acuerdo con y bajo los terminos del Tratado de Budapest con respecto a los depositos de semillas para los fines del procedimiento de patentes.
Breve descripcion de las secuencias
SEQ ID NO: 1 es la secuencia limftrofe que flanquea el ADN 5' para el evento de soja 9582.814.19.1. Los nucleotidos 1-1400 son la secuencia genomica. Los nucleotidos 1401-1535 son una secuencia reordenada de pDAB9582. Los nucleotidos 1536-1836 son secuencias de insercion.
SEQ ID NO: 2 es la secuencia limftrofe que flanquea el ADN 3' para el evento de soja 9582.814.19.1. Los nucleotidos 1-152 son secuencias de insercion. Los nucleotidos 153-1550 son la secuencia genomica.
SEQ ID NO: 3 es la secuencia de ADN de pDAB9582, que se anota a continuacion en la Tabla 1.
SEQ ID NO: 4 es el cebador oligonucleotfdico 81419_FW3 para la confirmacion del ADN genomico limftrofe 5'. SEQ ID NO: 5 es el cebador oligonucleotfdico 81419_RV1 para la confirmacion del ADN genomico limftrofe 3'. SEQ ID NO: 6 es el cebador oligonucleotfdico 81419_RV2 para la confirmacion del ADN genomico limftrofe 3'. SEQ ID NO: 7 es el cebador oligonucleotfdico 81419_RV3 para la confirmacion del ADN genomico limftrofe 3'. SEQ ID NO: 8 es el cebador oligonucleotfdico 5'IREnd-01 para la confirmacion del ADN genomico limftrofe 5'.
SEQ ID NO: 9 es el cebador oligonucleotfdico 5'IREnd-02 para la confirmacion del ADN genomico limftrofe 5'.
SEQ ID NO: 10 es el cebador oligonucleotfdico AtUbi10RV1 para la confirmacion del ADN genomico limftrofe 5'. SEQ ID NO: 11 es el cebador oligonucleotfdico AtUbi10RV2 para la confirmacion del ADN genomico limftrofe 5'. SEQ ID NO: 12 es el cebador oligonucleotfdico 3'PATEnd05 para la confirmacion del ADN genomico limftrofe 3'. SEQ ID NO: 13 es el cebador oligonucleotfdico 3'PATEnd06 para la confirmacion del ADN genomico limftrofe 3'. SEQ ID NO: 14 Es la secuencia confirmada del evento de soja 9582.814.19.1. Incluyendo la secuencia flanqueante genomica 5', el inserto de la hebra T pDAB9582 y la secuencia flanqueante genomica 3'.
Breve descripcion de las figuras
La Fig. 1 es un mapa de plasmido de pDAB9582 que contiene los casetes de expresion crylF, crylAc y pat.
La Fig. 2 representa las ubicaciones de los cebadores para confirmar la secuencia limftrofe 5' y 3' del evento de soja pDAB9582.814.19.1.
La Fig. 3 representa la disposicion de la secuencia genomica en el evento de soja pDAB9582.814.19.1 Descripcion detallada de la invencion
Ambos extremos de la insercion del evento de soja 9582.814.19.1 han sido secuenciados y caracterizados. Se desarrollaron ensayos espedficos del evento. Tambien se ha mapeado en el genoma de la soja (cromosoma de soja 02). El evento puede ser sometido a introgresion en lrneas de elite adicionales.
Como se menciono anteriormente en la seccion Antecedentes, la introduccion e integracion de un transgen en el genoma de una planta implica algunos eventos aleatorios (de ah el nombre de "evento" para una insercion dada que es expresada). Es decir, con muchas tecnicas de transformacion tales como la transformacion con Agrobacterium, la transformacion bioftstica (es decir, pistola genica) y la transformacion mediada por carburo de silicio (es decir, WHISKERS), resulta impredecible en que el lugar se insertara un transgen en el genoma. Por lo tanto, la identificacion del ADN genomico de la planta flanqueante en ambos lados del inserto puede ser importante para identificar una planta que tenga un evento de insercion determinado. Por ejemplo, se pueden disenar cebadores de PCR que generen un amplicon de PCR a traves de la region de union del inserto y el genoma del anfitrion. Este amplicon de PCR se puede utilizar para identificar un tipo unico o distinto de evento de insercion.
Las definiciones y los ejemplos se proporcionan en la presente memoria para ayudar a describir la presente
invencion y para guiar a los expertos en la tecnica en la practica de la invencion. A menos que se indique lo contrario, los terminos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la tecnica relevante. Se utiliza la nomenclature para las bases de ADN segun lo establecido en 37 CFR §1.822.
Como se emplea en la presente memoria, el termino "progenie" denota la descendencia de cualquier generacion de una planta progenitora que comprenda el evento de soja 9582.814.19.1.
Un "evento" transgenico se produce por transformacion de celulas vegetales con ADN heterologo, es dedr, una construccion de acido nucleico que incluye los transgenes de interes, la regeneracion de una poblacion de plantas resultante de la insercion del transgen en el genoma de la planta y la seleccion de una planta particular caracterizada por la insercion en una ubicacion particular del genoma. El termino "evento" se refiere al transformante original y la progenie del transformante que incluyen el ADN heterologo. El termino "evento" tambien se refiere a la progenie producida por un exocruzamiento sexual entre el transformante y otra variedad que incluye el ADN genomico/transgenico. Incluso despues de un retrocruzamiento repetido con un progenitor recurrente, el ADN transgenico insertado y el ADN genomico flanqueante (ADN genomico/transgenico) del progenitor transformado esta presente en la progenie del cruce en la misma ubicacion cromosomica. El termino "evento" tambien se refiere al ADN del transformante original y de su progenie que comprende el ADN insertado y a la secuencia genomica flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado que se esperana que se transfiriera a una progenie que reciba el ADN insertado que incluya el transgen de interes como resultado del cruce sexual de una lmea parental que incluye el ADN insertado (p. ej., el transformante original y la progenie resultante de la autofertilizacion) y una lmea parental que no contiene el a Dn insertado.
Una "secuencia de union" o "secuencia limttrofe" abarca el punto en el que el ADN insertado en el genoma se une al ADN del genoma nativo de soja que flanquea el punto de insercion, la identificacion o deteccion de una u otra secuencias de union en el material genetico de una planta que son suficientes para tener un caracter diagnostico para el evento. Se incluyen las secuencias de ADN que abarcan las inserciones en eventos de soja descritos en la presente memoria y longitudes similares de ADN flanqueante. En la presente memoria se proporcionan ejemplos espedficos de tales secuencias de diagnostico; sin embargo, otras secuencias que se solapan con las uniones de las inserciones, o las uniones de las inserciones y la secuencia genomica, tambien tienen un caracter diagnostico y podnan utilizarse de acuerdo con la presente invencion.
La presente invencion se refiere en parte a la identificacion de eventos utilizando tales secuencias flanqueantes, de union e insercion. Los cebadores de PCR relacionados y los amplicones se incluyen en la invencion. De acuerdo con la presente invencion, los metodos de analisis de PCR que utilizan amplicones que se extienden a traves del ADN insertado y sus lfmites se pueden utilizar para detectar o identificar variedades o lmeas de soja transgenicas comercializadas derivadas de las lmeas de soja transgenicas patentadas.
Las secuencias flanqueantes/de union tienen caracter diagnostico para el evento de soja 9582.814.19.1. Basandose en estas secuencias, se generaron cebadores espedficos del evento. El analisis de PCR demostro que estas lmeas de soja se pueden identificar en diferentes genotipos de soja mediante el analisis de los amplicones de PCR generados con estos conjuntos de cebadores espedficos del evento. Por lo tanto, estos y otros procedimientos relacionados se pueden utilizar para identificar de forma unica estas lmeas de soja. Las secuencias identificadas en la presente memoria son unicas.
Las tecnicas de deteccion de la presente invencion son especialmente utiles junto con el mejoramiento vegetal, para determinar que plantas de la progenie comprenden un evento dado, despues de que una planta parental que comprende un evento de interes se cruce con otra lmea de plantas en un esfuerzo por conferir uno o mas rasgos adicionales de interes a la progenie. Estos metodos de analisis de PCR benefician los programas de mejoramiento de la soja y el control de calidad, especialmente para las semillas de soja transgenicas comercializadas. Tambien se pueden elaborar y utilizar kits de deteccion de PCR para estas lmeas de soja transgenicas. Esto tambien puede beneficiar el registro del producto y la administracion del producto.
Ademas, las secuencias de soja/genomicas flanqueantes se pueden utilizar para identificar espedficamente la ubicacion genomica de cada inserto. Esta informacion se puede utilizar para elaborar sistemas de marcadores moleculares espedficos para cada evento. Estos se pueden utilizar para estrategias de reproduccion acelerada y para establecer datos de vinculacion.
Aun mas, la informacion de la secuencia flanqueante se puede utilizar para estudiar y caracterizar los procedimientos de integracion transgenica, las caractensticas del sitio de integracion genomica, la clasificacion de eventos, la estabilidad de los transgenes y sus secuencias flanqueantes y la expresion de genes (especialmente en relacion con el silenciamiento de genes, los patrones de metilacion del transgen, los efectos de la ubicacion y los elementos potenciales relacionados con la expresion, tales como MARS [regiones de anclaje a la matriz], y similares).
A la luz de toda la presente descripcion, debe quedar claro que la invencion en cuestion incluye semillas disponibles bajo el numero de deposito ATCC identificado en el parrafo [0021]. La presente invencion tambien incluye una planta de soja tolerante a herbicida cultivada a partir de una semilla depositada con el numero de deposito ATCC
identificado en el parrafo [0021]. El objeto de la invencion incluye adicionalmente partes de dicha planta, tales como hojas, muestras de tejidos, semillas producidas por dicha planta, polen y similares (en donde comprenden crylF, crylAc, pat, y SEQ ID NO: 1 y 2).
Aun mas, la presente invencion incluye plantas descendientes y/o de la progenie de plantas cultivadas a partir de la semilla depositada, preferiblemente una planta de soja resistente a herbicida en donde dicha planta tiene un genoma que comprende una secuencia de union de tipo salvaje detectable como se describe en la presente memoria. Como se emplea en la presente memoria, el termino "soja" significa Glycine max e incluye todas las variedades de la misma que puedan ser criadas con una planta de soja.
Esta invencion incluye adicionalmente procedimientos para realizar cruces utilizando una planta de la presente invencion como al menos un progenitor. Por ejemplo, la presente invencion incluye una planta hnbrida Fi que tiene como uno o ambos progenitores cualesquiera de las plantas ilustradas en la presente memoria. Tambien se encuentra dentro de la presente invencion la semilla producida por tales hnbridos Fi de la presente invencion. Esta invencion incluye un metodo para producir una semilla tnbrida Fi cruzando una planta ilustrada con una planta diferente (p. ej., progenitor endogamico) y cosechando la semilla hnbrida resultante. La presente invencion incluye una planta ilustrada que es un progenitor hembra o un progenitor macho. Las caractensticas de las plantas resultantes se pueden mejorar mediante una cuidadosa consideracion de las plantas progenitoras.
Una planta de soja resistente a los insectos/tolerante al glufosinato de la presente invencion se puede criar primero cruzando sexualmente una primera planta progenitora de soja que consiste en una planta de soja cultivada a partir de semillas de cualquiera de las lmeas mencionadas en la presente memoria, y una segunda planta progenitora de soja, produciendo asf una pluralidad de plantas de primera progenie; seleccionando a continuacion una planta de la primera progenie que sea resistente al glufosinato; autofertilizando la planta de la primera progenie, produciendo asf una pluralidad de plantas de la segunda progenie; y seleccionando a continuacion de las plantas de la segunda progenie una planta que sea resistente al glufosinato. Estas etapas pueden incluir adicionalmente el retrocruzamiento de la planta de la primera progenie o la planta de la segunda progenie con una segunda planta progenitora de soja o una tercera planta progenitora de soja. Despues se puede plantar un cultivo de soja que comprende semillas de soja de la presente invencion, o su progenie.
Tambien se debe entender que dos plantas transgenicas diferentes tambien se pueden aparear para producir descendientes que contengan dos genes exogenos, agregados que se segregan independientemente. La autofecundacion de la progenie apropiada puede producir plantas homocigotas para ambos genes exogenos agregados. Tambien se contemplan el retrocruzamiento con una planta progenitora y el exocruzamiento con una planta no transgenica, al igual que la propagacion vegetativa. Otros metodos de mejoramiento comunmente utilizados para diferentes rasgos y cultivos son conocidos en la tecnica. La reproduccion por retrocruzamiento se ha utilizado para transferir genes para un rasgo hereditario simple y altamente heredable a un cultivar o lmea endogamicos homocigoticos deseables, que es el progenitor recurrente. El origen del rasgo que se va a transferir se denomina progenitor donador. Se espera que la planta resultante tenga los atributos del progenitor recurrente (p. ej., cultivar) y el rasgo deseable transferido desde el progenitor donador. Despues del cruce inicial, los individuos que poseen el fenotipo del progenitor donador se seleccionan y se cruzan repetidamente (retrocruzamiento) con el progenitor recurrente. Se espera que el progenitor resultante tenga los atributos del progenitor recurrente (p. ej., cultivar) y el rasgo deseable transferido del progenitor donador.
Del mismo modo, una planta de soja resistente a insectos/tolerante al glufosinato de la presente invencion se puede transformar con transgenes adicionales utilizando metodos conocidos en la tecnica. Los mecanismos de transformacion tales como la transformacion con Agrobacterium, la transformacion biolfstica (es decir, pistola genica), y la transformacion mediada por carburo de silicio (es decir, WHISKERS), se pueden utilizar para introducir uno o varios transgenes adicionales en el genoma del evento de soja 9582.814.19.1. La seleccion y caracterizacion de plantas transgenicas que contienen los transgenes recien insertados se pueden completar para identificar plantas que contienen un integrante estable del nuevo transgen ademas de los genes crylF, crylAc, pat de la presente invencion.
Las moleculas de ADN de la presente invencion se pueden utilizar como marcadores moleculares en un metodo de reproduccion asistida por marcadores (MAB). Las moleculas de ADN de la presente invencion se pueden utilizar en metodos (tales como, marcadores AFLP, marcadores RFLP, marcadores rAp D, SNP y SSR) que identifican rasgos agronomicamente utiles geneticamente ligados, como se conoce en la tecnica. Los rasgos de resistencia a los insectos y tolerancia a los herbicidas se pueden rastrear en la progenie de un cruce con una planta de soja de la presente invencion (o su progenie y cualquier otro cultivar o variedad de soja) utilizando los metodos mAb . Las moleculas de ADN son marcadores para este rasgo, y los metodos MAB que son bien conocidos en la tecnica se pueden utilizar para rastrear uno o varios rasgos de resistencia a herbicidas en plantas de soja donde al menos una imea de soja de la presente invencion, o su progenie, fue progenitora o predecesora. Los metodos de la presente invencion se pueden utilizar para identificar cualquier variedad de soja que tenga el evento en cuestion.
Los metodos de la presente invencion incluyen un metodo para producir una planta de soja resistente a los insectos/tolerante a los herbicidas, en donde dicho metodo comprende la reproduccion con una planta de la presente invencion. Mas espedficamente, dichos metodos pueden comprender el cruzamiento de dos plantas de la presente
invencion, o una planta de la presente invencion y cualquier otra planta. Los metodos preferidos comprenden adicionalmente la seleccion de la progenie de dicho cruce analizando dicha progenie para detectar un evento detectable de acuerdo con la presente invencion y un resultado varietal favorable (p. ej., rendimiento). Por ejemplo, la presente invencion se puede utilizar para rastrear el evento en cuestion a traves de ciclos de reproduccion con plantas que comprenden otros rasgos deseables, tales como rasgos agronomicos, tolerancia o resistencia a una enfermedad, tolerancia o resistencia a los nematodos y fecha de madurez. Las plantas que comprenden el evento y el rasgo deseado en cuestion se pueden detectar, identificar, seleccionar y utilizar rapidamente en rondas adicionales de reproduccion, por ejemplo. El evento/rasgo del sujeto tambien se puede combinar a traves de la reproduccion, y se puede rastrear de acuerdo con la presente invencion, con uno o varios rasgos de resistencia a insectos adicionales y/o rasgos de tolerancia a herbicidas adicionales. Las realizaciones de este ultimo son plantas que comprenden el evento en cuestion combinado con el gen aad-12, que confiere tolerancia a los herbicidas acido 2,4-diclorofenoxiacetico y piridiloxiacetato, o con un gen que codifica resistencia al herbicida dicamba.
Por lo tanto, la presente invencion se puede combinar, por ejemplo, con rasgos que codifican la resistencia al glifosato. (p. ej., planta resistente o EPSPS, GOX, GAT bacterianas), resistencia al glufosinato (p. ej., pat, bar), resistencia a los herbicidas inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS) (p. ej., imidazolinonas [tales como imazetapir], sulfonilureas, triazolopirimidin sulfonanilida, benzoatos de pirimidinilo, y otros compuestos qmmicos [Csr1, SurA, et al.]), resistencia al bromoxinilo (p. ej., Bxn), resistencia a los inhibidores de la enzima HPPD (4-hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa), resistencia a los inhibidores de la fitoeno desaturasa (PDS), resistencia a los herbicidas inhibidores del fotosistema II (p. ej., psbA), resistencia a los herbicidas inhibidores del fotosistema I, resistencia a los herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa IX (PPO) (p. ej., PPO-1), resistencia a los herbicidas de fenilurea (p. ej., CYP76B1), enzimas que degradan dicamba (vease, p. ej., el documento US 20030135879), y otros podnan agruparse solos o en multiples combinaciones para proporcionar la capacidad de controlar o prevenir efectivamente los cambios poblaciones de malas hierbas y/o la resistencia a cualquier herbicida de las clases mencionadas anteriormente.
Adicionalmente, el evento de soja 9582.814.19.1 se puede combinar con uno o mas rasgos de entrada adicionales (p. ej., resistencia a insectos, resistencia a patogenos o tolerancia al estres, et al.) o salida (p. ej., mayor rendimiento, mejor perfil de aceite, mejor calidad de fibra, et al.). Por lo tanto, la presente invencion se puede utilizar para proporcionar un paquete agronomico completo de calidad de cultivo mejorada con la capacidad de controlar de forma flexible y rentable cualquier numero de plagas agronomicas.
Los metodos para integrar una secuencia de polinucleotidos dentro de un sitio cromosomico espedfico de una celula vegetal mediante recombinacion homologa se han descrito en la tecnica. Por ejemplo, la integracion espedfica del sitio como se describe en la Publicacion de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Num. 2009/0111188 A1, describe el uso de recombinasas o integrasas para mediar en la introduccion de una secuencia de polinucleotidos donadora en una diana cromosomica. Ademas, la Solicitud de Patente Internacional num. WO 2008/021207, describe la recombinacion homologa mediada por dedos de zinc para integrar una o mas secuencias de polinucleotidos donadoras en ubicaciones espedficas del genoma. El uso de recombinasas tales como FLP/FRT como se describe en la Patente de Estados Unidos Num. 6720475, o CRE/LOX como se describe en la Patente de Estados Unidos Num. 5658772, se puede utilizar para integrar una secuencia de polinucleotidos en un sitio cromosomico espedfico. Finalmente, el uso de meganucleasas para dirigir los polinucleotidos donadores a una ubicacion cromosomica espedfica fue descrito por Puchta et al., p Na S USA 93 (1996) pag. 5055-5060).
Otros metodos para la integracion espedfica del sitio dentro de las celulas vegetales son generalmente conocidos y aplicables (Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6 (4) (2001) pag. 155-159). Ademas, los sistemas de recombinacion espedficos del sitio que se han identificado en varios organismos procarioticos y eucarioticos inferiores se pueden aplicar para su uso en plantas. Los ejemplos de tales sistemas incluyen, pero no estan limitados a; el sistema de recombinasa R/RS del plasmido pSR1 de la levadura Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203), y el sistema Gin/gix del fago Mu (Maeser y Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).
En algunas realizaciones de la presente invencion, puede ser deseable integrar o agruparr uno o varios nuevos transgenes en la proximidad de un evento transgenico existente. El evento transgenico se puede considerar como un locus genomico preferido que se selecciono en funcion de caractensticas unicas tales como el sitio de insercion unica, la segregacion mendeliana normal y la expresion estable, y una combinacion superior de eficacia, incluyendo la tolerancia a los herbicidas y el rendimiento agronomico en y a traves de multiples ubicaciones ambientales. Los transgenes recien integrados deben mantener las caractensticas de expresion transgenica de los transformantes existentes. Ademas, el desarrollo de ensayos para la deteccion y confirmacion del evento recien integrado se superana, ya que las secuencias flanqueantes genomicas y la ubicacion cromosomica del evento recien integrado ya estan identificadas. Finalmente, la integracion de un nuevo transgen en una ubicacion cromosomica espedfica que esta vinculada a un transgen existente acelerana la introgresion de los transgenes en otros fondos geneticos mediante el exocruzamiento sexual utilizando metodos de reproduccion convencionales.
En algunas realizaciones de la presente invencion, puede ser deseable escindir secuencias de polinucleotidos de un evento transgenico. Por ejemplo, la escision del transgen como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Provisional Num. 61/297.628, describe el uso de nucleasas de dedos de zinc para eliminar una secuencia de polinucleotidos, que consiste en un casete de expresion genica, de un evento transgenico cromosomicamente
integrado. La secuencia de polinucleotidos que se elimina puede ser un marcador seleccionable. Tras la escision y eliminacion de una secuencia de polinucleotidos, el evento transgenico modificado se puede redireccionar mediante la insercion de una secuencia de polinucleotidos. La escision de una secuencia de polinucleotidos y el posterior redireccionamiento del evento transgenico modificado proporcionan ventajas tales como la reutilizacion de un marcador seleccionable o la capacidad de superar cambios no intencionados en el transcriptoma de la planta que resultan de la expresion de genes espedficos.
La presente invencion describe en la presente memoria un sitio espedfico en el cromosoma 02 en el genoma de la soja que es excelente para la insercion de acidos nucleicos heterologos. Por lo tanto, la presente invencion proporciona metodos para introducir acidos nucleicos heterologos de interes en este sitio diana preestablecido o en las proximidades de este sitio diana. La presente invencion tambien abarca una semilla de soja y/o una planta de soja que comprenden cualquier secuencia de nucleotidos heterologa insertada en el sitio diana descrito o en las proximidades de dicho sitio. Una opcion para lograr tal integracion espedfica consiste en escindir y/o sustituir un inserto diferente en lugar del casete de expresion de pat ilustrado en la presente memoria. En este aspecto general, se puede utilizar la recombinacion homologa dirigida, por ejemplo y sin limitacion, de acuerdo con la presente invencion.
Como se emplea en la presente memoria, el "agrupamiento" de genes, eventos o rasgos es la combinacion de rasgos deseados en una lmea transgenica. Los expertos en mejoramiento vegetal agrupan rasgos transgenicos realizando cruzamientos entre los progenitores que tienen cada uno con un rasgo deseado e identificando despues la descendencia que tiene ambos rasgos deseados. Otra forma de agrupar genes es mediante la transferencia de dos o mas genes al nucleo celular de una planta al mismo tiempo durante la transformacion. Otra forma de agrupar genes es mediante la re-transformacion de una planta transgenica con otro gen de interes. Por ejemplo, el agrupamiento de genes se puede utilizar para combinar dos o mas rasgos diferentes, incluyendo, por ejemplo, dos o mas rasgos de insectos diferentes, rasgos de resistencia a insectos y rasgos de resistencia a enfermedades, dos o mas rasgos de resistencia a herbicidas, y/o rasgos de resistencia a insectos y rasgos de resistencia a herbicidas. El uso de un marcador seleccionable ademas de un gen de interes tambien se puede considerar agrupamiento de genes.
"Recombinacion homologa" se refiere a una reaccion entre cualquier par de secuencias de nucleotidos que tienen sitios correspondientes que contienen una secuencia de nucleotidos similar a traves de la cual las dos secuencias de nucleotidos pueden interactuar (recombinarse) para formar una nueva secuencia de ADN recombinante. Los sitios de secuencias de nucleotidos similares se denominan en la presente memoria "secuencia de homologfa". En general, la frecuencia de recombinacion homologa aumenta a medida que aumenta la longitud de la secuencia de homologfa. Asf, mientras que la recombinacion homologa puede ocurrir entre dos secuencias de nucleotidos que son menos que identicas, la frecuencia (o eficacia) de la recombinacion disminuye a medida que aumenta la divergencia entre las dos secuencias. La recombinacion se puede lograr utilizando una secuencia de homologfa en cada una de las moleculas donadora y diana, generando de ese modo un producto de recombinacion de "entrecruzamiento unico". Alternativamente, se pueden colocar dos secuencias de homologfa en cada una de las secuencias de nucleotidos diana y donadora. La recombinacion entre dos secuencias de homologfa en el donador con dos secuencias de homologfa en la diana genera un producto de recombinacion de "doble entrecruzamiento". Si las secuencias de homologfa en la molecula donadora flanquean una secuencia que se va a manipular (p. ej., una secuencia de interes), la recombinacion de doble entrecruzamiento con la molecula diana dara como resultado un producto de recombinacion en donde la secuencia de interes reemplaza una secuencia de ADN que originalmente estaba entre las secuencias de homologfa en la molecula diana. El intercambio de secuencia de ADN entre la diana y el donador a traves de un evento de recombinacion de doble entrecruzamiento se denomina "reemplazo de secuencia".
Una planta preferida, o una semilla, de la presente invencion comprende en su genoma secuencias de nucleotidos de crylF v3, crylAc synpro y pat V6 operativas, como se identifica en la presente memoria, junto con al menos 20 500 o mas nucleotidos flanqueantes contiguos a ambos lados del inserto, como se identifica en la presente memoria. A menos que se indique lo contrario, la referencia a las secuencias flanqueantes se refiere a aquellas identificadas con respecto a SEQ ID NO: 1 y 2. Se podna esperar que todas o parte de estas secuencias flanqueantes se transfirieran a la progenie que recibe el ADN insertado como resultado de un cruzamiento sexual de una lmea parental que incluya el evento.
La presente invencion incluye cultivos de tejidos de celulas regenerables de una planta de la presente invencion. Tambien se incluye una planta regenerada a partir de dicho cultivo de tejidos, particularmente cuando dicha planta es capaz de expresar todas las propiedades morfologicas y fisiologicas de una variedad ilustrada. Las plantas preferidas de la presente invencion tienen todas las caractensticas fisiologicas y morfologicas de una planta cultivada a partir de la semilla depositada. Esta invencion comprende adicionalmente la progenie de tales semillas y las semillas que poseen los rasgos de calidad de interes.
Como se emplea en la presente memoria, una "lmea" es un grupo de plantas que muestra poca o ninguna variacion genetica entre individuos para al menos un rasgo. Tales lmeas pueden ser creadas por varias generaciones de autopolinizacion y seleccion, o propagacion vegetativa de un solo progenitor utilizando tecnicas de cultivo de tejidos o celulas.
Como se emplean en la presente memoria, los terminos "cultivar" y "variedad" son sinonimos y se refieren a una lmea que se utiliza para la produccion comercial.
"Estabilidad" o "estable" significa que con respecto al componente dado, el componente se mantiene de generacion en generacion y, preferiblemente, al menos tres generaciones.
"Utilidad comercial" se define por tener un buen vigor de la planta y una alta fertilidad, de manera que el cultivo puede ser producido por los agricultores que utilizan equipos de cultivo convencionales, y el aceite con los componentes descritos se puede extraer de la semilla utilizando equipos convencionales de trituracion y extraccion. "Elite agronomica" significa que una lmea tiene caractensticas agronomicas deseables, tales como rendimiento, madurez, resistencia a enfermedades y similares, ademas de la resistencia a insectos y la tolerancia a herbicidas debidas a uno o varios eventos en cuestion. Cualquiera y todas estas caractensticas agronomicas y puntos de datos se pueden utilizar para identificar tales plantas, ya sea como un punto o en un extremo o en ambos extremos de un intervalo de caractensticas utilizadas para definir tales plantas.
Como reconocera un experto en la tecnica a la luz de esta descripcion, las realizaciones preferidas de los kits de deteccion, por ejemplo, pueden incluir sondas y/o cebadores dirigidos a y/o que comprenden "secuencias de union" o "secuencias de transicion" (donde la secuencia flanqueante genomica de soja satisface la secuencia de insercion). Por ejemplo, esto incluye sondas polinucleotfdicas, cebadores y/o amplicones disenados para identificar una o ambas secuencias de union (donde el inserto satisface la secuencia flanqueante), como se indica en la Tabla anterior. Un diseno comun consiste en la posesion de un cebador que hibride en la region flanqueante y un cebador que hibride en el inserto. Tales cebadores suelen tener cada uno una longitud de aproximadamente al menos ~15 residuos. Con esta disposicion, los cebadores se pueden utilizar para generar/amplificar un amplicon detectable que indica la presencia de un evento de la presente invencion. Estos cebadores se pueden utilizar para generar un amplicon que abarca (e incluye) una secuencia de union como se indico anteriormente.
El cebador o los cebadores que "se tocan" en la secuencia flanqueante no estan disenados para hibridar mas alla de aproximadamente 1.200 bases o mas alla de la union. Por lo tanto, los cebadores flanqueantes tfpicos se disenaran para que comprendan al menos 15 residuos de cada hebra dentro de 1.200 bases en las secuencias flanqueantes desde el comienzo del inserto. Es decir, los cebadores que comprenden una secuencia de un tamano apropiado (o hibridan con) los pares de bases 800 a 1.400 de SEQ ID NO: 14 y/o los pares de bases 13.897 a 14.497 de SEQ ID NO: 14 estan dentro del alcance de la presente invencion. Los cebadores de insercion tambien se pueden disenar en cualquier parte, salvo los pares de bases 1.400 a 2.000 de SEQ ID NO: 14 y/o los pares de bases 13.297 a 13.896 de SEQ iD NO: 14, y se pueden utilizar, por ejemplo, no exclusivamente para tal diseno de cebadores.
Un experto en la tecnica tambien reconocera que los cebadores y las sondas se pueden disenar para hibridar, en un intervalo de condiciones de hibridacion y/o PCR convencionales en donde el cebador o la sonda no son perfectamente complementarios a la secuencia ilustrada. Es decir, se puede tolerar cierto grado de emparejamientos erroneos. Para un cebador de aproximadamente 20 nucleotidos, por ejemplo, tfpicamente no es necesario que uno o dos o mas nucleotidos se unan con la hebra opuesta si la base emparejada erroneamente es interna o esta en el extremo del cebador que es opuesto al amplicon. A continuacion se proporcionan varias condiciones de hibridacion apropiadas. Los analogos de nucleotidos sinteticos, tales como la inosina, tambien se pueden utilizar en las sondas. Tambien se pueden utilizar sondas de acido peptido nucleico (PNA), asf como sondas de ADN y ARN. Lo importante es que tales sondas y cebadores tengan caracter diagnostico (sean capaces de identificar y distinguir de manera unica) para determinar la presencia de un evento de la presente invencion.
Se debe tener en cuenta que, por ejemplo, se pueden producir errores en la amplificacion por PCR, lo que podna dar lugar a errores menores de secuenciacion. Es decir, a menos que se indique lo contrario, las secuencias enumeradas en la presente memoria se determinaron mediante la generacion de amplicones largos a partir de ADN genomicos de soja, y despues clonacion y secuenciacion de los amplicones. No es inusual encontrar ligeras diferencias y pequenas discrepancias en las secuencias generadas y determinadas de esta manera, debido a las numerosas rondas de amplificacion que son necesarias para generar suficiente amplicon para la secuenciacion a partir de ADN genomicos. Un experto en la tecnica debe reconocer y advertir que cualquier ajuste necesario debido a estos tipos de errores o discrepancias comunes de secuenciacion esta dentro del alcance de la presente invencion.
Tambien se debe tener en cuenta que no es raro que alguna secuencia genomica se elimine, por ejemplo, cuando se inserta una secuencia durante la creacion de un evento. Por lo tanto, tambien pueden aparecer algunas diferencias entre las secuencias flanqueantes en cuestion y las secuencias genomicas enumeradas en GENBANK, por ejemplo.
Los componentes del "inserto" de la secuencia de ADN se ilustran en las Figuras y se explican con mas detalle a continuacion en los Ejemplos. Las secuencias de polinucleotidos de ADN de estos componentes, o fragmentos de los mismos, se pueden utilizar como cebadores o sondas de ADN en los metodos de la presente invencion.
En algunas realizaciones de la invencion, se proporcionan composiciones y metodos para detectar la presencia de la region de insercion transgenica/genomica, en plantas y semillas y similares, de una planta de soja. Se proporcionan
secuencias de ADN que comprenden la secuencia de union de la region de insercion transgenica/genomica 5' en cuestion proporcionada en la presente memoria (entre los pares de bases 800 a 1.400 de SEQ ID NO: 14), segmentos de la misma, y complemented de las secuencias ilustradas y cualquiera de sus segmented. Se proporcionan secuencias de a Dn que comprenden la secuencia de union de la region de insercion transgenica/genomica 3' en cuestion proporcionada en la presente memoria (entre los pares de bases 13.897 a 14.497 de SEQ ID NO: 14), segmentos de la misma, y complementos de las secuencias ilustradas y cualquiera de sus segmentos. La secuencia de union de la region de insercion abarca la union entre el ADN heterologo insertado en el genoma y el ADN de la celula de soja que flanquea el sitio de insercion. Tales secuencias pueden tener caracter diagnostico para el evento dado.
Basandose en estas secuencias de insercion y limftrofes, se pueden generar cebadores espedficos del evento. El analisis por PCR demostro que las lmeas de soja de la presente invencion se pueden identificar en diferentes genotipos de soja mediante el analisis de los amplicones de PCR generados con estos conjuntos de cebadores espedficos de eventos. Estos y otros procedimientos relacionados se pueden utilizar para identificar de forma unica estas lmeas de soja. Por lo tanto, los amplicones de PCR derivados de tales pares de cebadores son unicos y se pueden utilizar para identificar estas lmeas de soja.
En algunas realizaciones, las secuencias de ADN que comprenden un fragmento contiguo de la nueva region de insercion transgenica/genomica son un aspecto de esta invencion. Se incluyen las secuencias de ADN que comprenden una longitud suficiente de polinucleotidos de la secuencia del inserto transgenico y una longitud suficiente de polinucleotidos de secuencia genomica de soja de una o mas de las tres plantas de soja mencionadas anteriormente y/o secuencias que son utiles como secuencias de cebador para la produccion de un diagnostico de producto de amplicon para una o mas de estas plantas de soja.
Las realizaciones relacionadas se refieren a secuencias de ADN que comprenden al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o mas nucleotidos contiguos de una porcion transgenica de una secuencia de ADN identificada en la presente memoria (tal como SEQ ID NO: 1 y sus segmentos), o sus complementos, y una longitud similar de la secuencia de ADN de soja flanqueante de estas secuencias, o sus complementos. Tales secuencias son utiles como cebadores de ADN en los metodos de amplificacion de ADN. Los amplicones producidos utilizando estos cebadores tienen caracter diagnostico para cualquiera de los eventos de soja mencionados en la presente memoria. Por lo tanto, la invencion tambien incluye los amplicones producidos por tales cebadores de ADN y cebadores homologos.
Esta invencion tambien incluye metodos para detectar la presencia de ADN, en una muestra, que corresponde al evento de soja al que se hace referencia en la presente memoria. Tales metodos pueden comprender: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con un conjunto de cebadores que, cuando se utiliza en una reaccion de amplificacion de acido nucleico con ADN de al menos uno de estos eventos de soja, produce un amplicon que tiene caracter diagnostico para dichos uno o mas eventos; (b) realizar una reaccion de amplificacion de acido nucleico, produciendo de ese modo el amplicon; y (c) detectar el amplicon.
Otros metodos de deteccion de la presente invencion incluyen un metodo para detectar la presencia de un ADN, en una muestra, correspondiente a dicho evento, en donde dicho metodo comprende: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que hibrida en condiciones de hibridacion rigurosas con ADN de al menos uno de dichos eventos de soja y que no hibrida en las condiciones de hibridacion rigurosas con una planta de soja de control (ADN sin evento de interes); (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridacion rigurosas; y (c) detectar la hibridacion de la sonda con el ADN.
En otras realizaciones adicionales, la presente invencion incluye metodos para producir una planta de soja que comprende el evento de soja 9582.814.19.1 de la presente invencion, en donde dicho metodo comprende las etapas de: (a) cruzar sexualmente una primera lmea progenitora de soja (que comprende un casete de expresion de la presente invencion, que confiere tolerancia al glufosinato a las plantas de dicha lmea) y una segunda lmea progenitora de soja (que carece de este rasgo de tolerancia al herbicida) produciendo de ese modo una pluralidad de plantas de progenie; y (b) seleccionar una planta de la progenie mediante el uso de marcadores moleculares. Tales metodos pueden comprender opcionalmente la etapa adicional de retro-cruzar la planta de la progenie con la segunda lmea progenitora de soja para producir una planta de soja de lmea geneticamente pura que comprenda el rasgo de resistencia a insectos y de tolerancia a glufosinato.
De acuerdo con otro aspecto de la invencion, se proporcionan metodos para determinar la cigosidad de la progenie de un cruce con dicho evento. Dichos metodos pueden comprender poner en contacto una muestra, que comprende ADN de soja, con un conjunto de cebadores de la presente invencion. Dichos cebadores, cuando se utilizan en una reaccion de amplificacion de acido nucleico con ADN genomico de al menos uno de dichos eventos de soja, producen un primer amplicon que tiene caracter diagnostico para al menos uno de dichos eventos de soja. Tales metodos comprenden adicionalmente llevar a cabo una reaccion de amplificacion de acido nucleico, produciendo de ese modo el primer amplicon; detectar el primer amplicon; y poner en contacto la muestra que comprende ADN de soja con un segundo conjunto de cebadores (dicho segundo conjunto de cebadores, cuando se utiliza en una reaccion de amplificacion de acido nucleico con ADN genomico de plantas de soja, produce un segundo amplicon que comprende el ADN genomico de soja nativo homologo a la region genomica de soja); y llevar a cabo una
reaccion de amplificacion de acido nucleico, produciendo de ese modo el segundo amplicon. Los metodos comprenden adicionalmente la deteccion del segundo amplicon y la comparacion del primer y segundo amplicones en una muestra, en donde la presencia de ambos amplicones indica que la muestra es heterocigotica para la insercion del transgen.
Se pueden desarrollar kits de deteccion de ADN utilizando las composiciones descritas en la presente memoria y metodos bien conocidos en la tecnica de deteccion de ADN. Los kits son utiles para la identificacion del ADN del evento de soja en cuestion en una muestra y se pueden aplicar a metodos para la cna de plantas de soja que contienen este ADN. Los kits contienen secuencias de ADN homologas o complementarias a los amplicones, por ejemplo, descritas en la presente memoria, o a secuencias de ADN homologas o complementarias al ADN contenido en los elementos geneticos transgenicos de los eventos en cuestion. Estas secuencias de ADN se pueden utilizar en reacciones de amplificacion de ADN o como sondas en un metodo de hibridacion de ADN. Los kits tambien pueden contener los reactivos y materiales necesarios para la ejecucion del metodo de deteccion.
Una "sonda" es una molecula de acido nucleico aislada a la que se une una marca detectable convencional o una molecula informadora (tal como un isotopo radiactivo, un ligando, un agente quimioluminiscente o una enzima). Tal sonda es complementaria a una hebra de un acido nucleico diana, en el caso de la presente invencion, a una hebra de ADN genomico de uno de dichos eventos de soja, ya sea de una planta de soja o de una muestra que incluye ADN del evento. Las sondas de acuerdo con la presente invencion incluyen no solo acidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos, sino tambien poliamidas y otros materiales de sondas que se unen espedficamente a una secuencia de ADN diana y se pueden utilizar para detectar la presencia de esa secuencia de ADN diana.
Los "cebadores" son acidos nucleicos aislados/sintetizados que son reasociados a una hebra de ADN diana complementaria por hibridacion de acido nucleico para formar un Idbrido entre el cebador y la hebra de ADN diana, a continuacion se extienden a lo largo de la hebra de ADN diana por medio de una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Los pares de cebadores de la presente invencion se refieren a su uso para la amplificacion de una secuencia de acido nucleico diana, p. ej., mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) u otros metodos convencionales de amplificacion de acido nucleico.
Las sondas y los cebadores tienen generalmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 91, 92, 93 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 , 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134.
135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157.
158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226 227, 228, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 267, 268, 269, 270, 271, 272 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 283, 283, 284, 286, 287, 288, 289, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 383, 383, 384, 386, 387, 388 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434 435, 436, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 456, 457, 458, 459 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 483, 484, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 o 1.000, o 2.000, o 5.000 polinucleotidos o mas de longitud. Tales sondas y cebadores hibridan espedficamente con una secuencia diana en condiciones de hibridacion de alta rigurosidad. Preferiblemente, las sondas y los cebadores de acuerdo con la presente invencion tienen una similitud de secuencia completa con la secuencia diana, aunque las sondas que difieren de la secuencia diana y que conservan la capacidad de hibridar con secuencias diana se pueden disenar mediante metodos convencionales.
Los metodos para preparar y utilizar sondas y cebadores se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Los pares de cebadores de PCR se pueden obtenerr de una secuencia conocida, por ejemplo, mediante el uso de programas informaticos destinados a tal fin.
Los cebadores y las sondas basados en el ADN flanqueante y las secuencias de insercion descritas en la presente memoria se pueden utilizar para confirmar (y, si es necesario, para corregir) las secuencias descritas por metodos convencionales, p. ej., mediante re-clonacion y secuenciacion de tales secuencias.
Las sondas de acido nucleico y los cebadores de la presente invencion hibridan en condiciones rigurosas con una secuencia de ADN diana. Se puede utilizar cualquier metodo convencional de hibridacion o amplificacion de acidos
nucleicos para identificar la presencia de ADN de un evento transgenico en una muestra. Las moleculas de acido nucleico o sus fragmented pueden hibridar espedficamente con otras moleculas de acido nucleico bajo ciertas circunstancias. Como se emplea en la presente memoria, se dice que dos moleculas de acido nucleico son capaces de hibridar espedficamente entre sf si las dos moleculas son capaces de formar una estructura de acido nucleico de doble hebra antiparalela. Se dice que una molecula de acido nucleico es el "complemento" de otra molecula de acido nucleico si presentan una complementariedad completa. Como se emplea en la presente memoria, se dice que las moleculas muestran una "complementariedad completa" cuando cada nucleotido de una de las moleculas es complementario a un nucleotido de la otra. Se dice que dos moleculas son "mmimamente complementarias" si se pueden hibridar entre sf con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan reasociadas entre sf en al menos condiciones convencionales de "baja rigurosidad". De manera similar, se dice que las moleculas son "complementarias" si pueden hibridar entre sf con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan reasociadas entre sf en condiciones convencionales de "alta rigurosidad". Las condiciones de rigurosidad convencionales estan descritas por Sambrook. et al. 1989. Por lo tanto, se permiten desviaciones de la complementariedad completa, siempre que tales desviaciones no impidan completamente la capacidad de las moleculas para formar una estructura de doble hebra. Para que una molecula de acido nucleico sirva como cebador o sonda, solo es necesario que tenga una secuencia lo suficientemente complementaria como para poder formar una estructura estable de doble hebra en el disolvente concreto y las concentraciones de sal empleados.
Como se emplea en la presente memoria, una secuencia sustancialmente homologa es una secuencia de acido nucleico que hibridara espedficamente con el complemento de la secuencia de acido nucleico con la que se esta comparando en condiciones de alta rigurosidad. El termino "condiciones rigurosas" se define funcionalmente con respecto a la hibridacion de una sonda de acido nucleico con un acido nucleico diana (es decir, con una secuencia de acido nucleico de interes concreta) mediante el procedimiento de hibridacion espedfico discutido por Sambrook et al. 1989, en 9.52-9.55. Vease tambien, Sambrook et al. 1989 en 9.47-9.52 y 9.56-9.58. Por consiguiente, las secuencias de nucleotidos de la invencion se pueden utilizar por su capacidad para formar selectivamente moleculas duplex con tramos complementarios de fragmentos de ADN.
Dependiendo de la aplicacion prevista, se pueden utilizar condiciones variables de hibridacion para lograr grados variables de selectividad de la sonda hacia la secuencia diana. Para aplicaciones que requieren una alta selectividad, se emplearan tipicamente condiciones relativamente rigurosas para formar los hteridos, p. ej., se seleccionaran condiciones de concentracion de sal relativamente bajas y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por NaCl de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M a temperaturas de aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°C. Las condiciones rigurosas, por ejemplo, podnan implicar el lavado del filtro de hibridacion al menos dos veces con un tampon de lavado de alta rigurosidad (0,2X SSC, SDS al 0,1%, 65°C). Las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridacion de ADN, por ejemplo, 6,0X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de un lavado con 2,0X SSC a 50°C son conocidas por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, la concentracion de sal en la etapa de lavado se puede seleccionar desde una rigurosidad baja de aproximadamente 2,0X SSC a 50°C hasta una rigurosidad alta de aproximadamente 0,2X SSC a 50°C. Ademas, la temperatura en la etapa de lavado se puede incrementar desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, hasta condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65°C. Tanto la temperatura como la concentracion de sal pueden variar, o bien la temperatura o la concentracion de sal se pueden mantener constantes mientras que la otra variable se cambia. Tales condiciones selectivas toleran pocos o ningun emparejamiento erroneo entre la sonda y el molde o la hebra diana. La deteccion de secuencias de ADN mediante hibridacion es bien conocida por los expertos en la tecnica, y las ensenanzas de las Patentes de estados Unidos Num. 4.965.188 y 5.176.995 son ilustrativas de los metodos de analisis de hibridacion.
En una realizacion particularmente preferida, un acido nucleico de la presente invencion hibridara espedficamente con uno o mas de los cebadores (o amplicones u otras secuencias) ilustrados o sugeridos en la presente memoria, incluyendo los complementos y fragmentos de los mismos, en condiciones de alta rigurosidad. En un aspecto de la presente invencion, una molecula de acido nucleico marcadora de la presente invencion tiene la secuencia de acido nucleico que se expone en la presente memoria en una de las secuencias ilustradas, o complementos y/o fragmentos de las mismas.
En otro aspecto de la presente invencion, una molecula de acido nucleico marcadora de la presente invencion comparte entre 80% y 100% o 90% y 100% de identidad de secuencia con tales secuencias de acido nucleico. En un aspecto adicional de la presente invencion, una molecula de acido nucleico marcadora de la presente invencion comparte entre 95% y 100% de identidad de secuencia con semejante secuencia. Tales secuencias se pueden utilizar como marcadores en los metodos de mejoramiento vegetal para identificar la progenie de los cruces geneticos. La hibridacion de la sonda con la molecula de ADN diana se puede detectar mediante cualquiera de los numerosos metodos conocidos por los expertos en la tecnica, que pueden incluir, pero no se limitan a, etiquetas fluorescentes, etiquetas radiactivas, etiquetas basadas en anticuerpos y etiquetas quimioluminiscentes.
Respecto a la amplificacion de una secuencia de acido nucleico diana (p.ej., por PCR) utilizando un par de cebadores de amplificacion concreto, las "condiciones rigurosas" son condiciones que permiten que el par de cebadores hibride solo con la secuencia de acido nucleico diana a la que se unina un cebador que tenga la secuencia de tipo salvaje correspondiente (o su complemento) y preferiblemente de lugar a un producto de
amplificacion unico, el amplicon.
El termino "espedfico para (una secuencia diana)" indica que una sonda o cebador hibridan en condiciones de hibridacion rigurosas solo con la secuencia diana en una muestra que comprende la secuencia diana.
Como se emplea en la presente memoria, "ADN amplificado" o "amplicon" se refiere al producto de la amplificacion de acido nucleico de una secuencia de acido nucleico diana que forma parte de un molde de acido nucleico. Por ejemplo, para determinar si la planta de soja resultante de un cruce sexual contiene ADN genomico de un evento transgenico de la planta de soja de la presente invencion, el ADN extrafdo de una muestra de tejido de planta de soja se puede someter a un metodo de amplificacion de acido nucleico utilizando un par de cebadores que incluye un cebador derivado de la secuencia flanqueante en el genoma de la planta adyacente al sitio de insercion del ADN heterologo insertado, y un segundo cebador derivado del ADN heterologo insertado para producir un amplicon que tiene caracter diagnostico para la presencia de ADN del evento. El amplicon tiene una longitud y una secuencia que tambien tienen caracter diagnostico para el evento. La longitud del amplicon puede variar desde la longitud combinada de los pares de cebadores mas un par de bases de nucleotidos, y/o la longitud combinada de los pares de cebadores mas aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, , 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 377, 378, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 477, 477, 479, 479, 480, 481, 483, 484, 485, 486, 487, 488 489, , 492 493 494 , 499 o 500, 750, 1.000, 1.250l, 1.500, 1.750, 2.000 o mas pares de bases de nucleotidos (mas o menos cualquiera de los incrementos mencionados anteriormente). Alternativamente, un par de cebadores puede derivar de la secuencia flanqueante en ambos lados del ADN insertado para producir un amplicon que incluya la secuencia de nucleotidos del inserto completa. Un miembro de un par de cebadores derivado de la secuencia genomica de la planta se puede ubicar a una distancia de la secuencia de ADN insertada. Esta distancia puede variar desde un par de bases de nucleotidos hasta aproximadamente veinte mil pares de bases de nucleotidos. El uso del termino "amplicon" excluye espedficamente los dfmeros de cebadores que se pueden formar en la reaccion de amplificacion termica del ADN.
La amplificacion de acidos nucleicos se puede lograr mediante cualquiera de los diversos metodos de amplificacion de acidos nucleicos conocidos en la tecnica, incluyendo la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Se conoce en la tecnica una variedad de metodos de amplificacion y se describen, entre otros, en la Patente de Estados Unidos Num. 4.683.195 y la Patente de Estados Unidos Num. 4.683.202. Se han desarrollado metodos de amplificacion por PCR para amplificar hasta 22 kb de ADN genomico. Estos metodos, asf como otros metodos conocidos en la tecnica de amplificacion de ADN, se pueden utilizar en la practica de la presente invencion. La secuencia del inserto de ADN transgenico heterogeneo o la secuencia genomica flanqueante de un evento de soja en cuestion se pueden verificar (y corregir si fuera necesario) amplificando tales secuencias del evento utilizando cebadores derivados de las secuencias proporcionadas en la presente memoria seguido de la secuenciacion de ADN convencional del amplicon de PCR o del ADN clonado.
El amplicon producido por estos metodos puede ser detectado por una pluralidad de tecnicas. La electroforesis en gel de agarosa y la tincion con bromuro de etidio son metodos comunes bien conocidos para detectar amplicones de ADN. Otro de tales metodos es el Genetic Bit Analysis, en el que se disena un oligonucleotido de ADN que se solapa tanto con la secuencia de ADN genomico flanqueante adyacente como con la secuencia de ADN insertada. El oligonucleotido se inmoviliza en pocillos de una placa de micropocillos. Tras la PCR de la region de interes (utilizando un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genomica flanqueante adyacente), se puede hibridar un producto de PCR de hebra sencilla con el oligonucleotido inmovilizado y servir como molde para una reaccion de extension de una sola base utilizando una ADN polimerasa y ddNTP marcados espedficos para la siguiente base esperada. La lectura puede ser fluorescente o basada en ELISA. Una senal indica la presencia del inserto/secuencia flanqueante debido a una amplificacion, hibridacion y extension de una sola base satisfactorias.
Otro metodo es la tecnica de Pirosecuenciacion como describe Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). En
este metodo, se disena un oligonucleotido que se solapa con la union del ADN genomico adyacente y el ADN del inserto. El oligonucleotido hibrida con un producto de pCr de hebra sencilla de la region de interes (un cebador en la secuencia insertada y otro en la secuencia genomica flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Los DNTp se agregan individualmente y la incorporacion da como resultado una senal luminosa que se mide. La senal luminosa indica la presencia del inserto del transgen/secuencia flanqueante debido a una amplificacion, hibridacion y extension de una o varias bases satisfactorias.
La polarizacion de fluorescencia es otro metodo que se puede utilizar para detectar un amplicon de la presente invencion. Siguiendo este metodo, se disena un oligonucleotido que solapa con la union del ADN flanqueante genomico y el insertado. El oligonucleotido se hibrida con un producto de PCR de hebra sencilla de la region de interes (un cebador en el ADN insertado y otro en la secuencia de ADN genomico flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa y un ddNTP marcado con fluorescencia. La extension de una sola base da como resultado la incorporacion del ddNTP. La incorporacion se puede medir como un cambio en la polarizacion utilizando un fluorometro. Un cambio en la polarizacion indica la presencia del inserto del transgen/secuencia flanqueante debido a una amplificacion, hibridacion y extension de una sola base satisfactorias.
TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, California) es un metodo para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de ADN. Brevemente, se disena una sonda oligonucleotfdica FRET que se solapa con la union del ADN flanqueante genomico y el insertado. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN del inserto y otro en la secuencia genomica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Durante la amplificacion espedfica, la ADN polimerasa Taq limpia y libera el radical fluorescente del radical de extincion en la sonda FRET. Una senal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueante/inserto transgenico debido a una amplificacion e hibridacion satisfactorias.
Las Balizas Moleculares se han descrito para su uso en la deteccion de secuencias. Brevemente, se disena una sonda oligonucleotfdica FRET que se solapa con la union del ADN flanqueante genomico y el insertado. La estructura unica de la sonda FRET hace que contenga una estructura secundaria que mantiene los radicales fluorescentes y de extincion muy cerca. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN del inserto y otro en la secuencia genomica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Tras la amplificacion por PCR satisfactoria, la hibridacion de la sonda FRET con la secuencia diana da como resultado la eliminacion de la estructura secundaria de la sonda y la separacion espacial de los radicales fluorescentes y de extincion. Se produce una senal fluorescente. La senal fluorescente indica la presencia de la secuencia genomica flanqueante/inserto del transgen debido a una amplificacion e hibridacion satisfactorias. Habiendo descrito una ubicacion en el genoma de la soja que es excelente para una insercion, la presente invencion tambien comprende una semilla de soja y/o una planta de soja que comprenden al menos un inserto del evento 9582.814.19.1 no de soja en las proximidades de esta ubicacion genomica. Una opcion consiste en sustituir un inserto diferente en lugar del evento de soja pDAB9582.814.19.1 ilustrado en la presente memoria. En estos aspectos generales, se puede utilizar la recombinacion homologa dirigida, por ejemplo, de acuerdo con la presente invencion. Este tipo de tecnologfa es objeto, por ejemplo, del documento WO 03/080809 A2 y la correspondiente solicitud de Estados Unidos publicada (US 20030232410). Por lo tanto, la presente invencion incluye plantas y celulas vegetales que comprenden un inserto heterologo (en lugar de o con copias multiples de los genes crylF, crylAc, o pat), flanqueado por todas o una parte reconocible de las secuencias flanqueantes identificadas en la presente memoria (pb 1-1.400 de SEQ ID NO: 1 y pb 153-1.550 de SEQ ID NO: 2). Tambien se podna elegir como diana una copia adicional (o copias adicionales) de crylF, crylAc, o pat para la insercion de esta manera.
Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar los procedimientos para poner en practica la invencion y para demostrar ciertas realizaciones preferidas de la invencion. Estos ejemplos no se deben considerar limitantes. Los expertos en la tecnica debenan apreciar que las tecnicas descritas en los siguientes ejemplos representan enfoques espedficos utilizados para ilustrar las realizaciones preferidas para su puesta en practica. Sin embargo, los expertos en la tecnica debenan, a la luz de la presente descripcion, apreciar que se pueden realizar muchos cambios en estas realizaciones espedficas a la vez que se obtienen resultados parecidos o similares sin apartarse del alcance de la invencion. A menos que se indique lo contrario, todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de las mezclas de disolventes son en volumen, a menos que se indique lo contrario.
A menos que se indique lo contrario, se utilizan las siguientes abreviaturas.
pb par de bases
°C grados centfgrados
ADN acido desoxirribonucleico
EDTA acido etilendiaminotetraacetico
kb kilobase
|jg microgramo
|jL microlitro
mL mililitro
M masa molar
PCR reaccion en cadena de la polimerasa
PTU unidad de transcripcion de plantas
SDS dodecil sulfato de sodio
SSC una solucion tampon que contiene una mezcla de cloruro de sodio y citrato de sodio, pH 7,0
TBE una solucion tampon que contiene una mezcla de base Tris, acido borico y EDTA, pH 8,3
Las realizaciones de la presente invencion se definen adicionalmente en los siguientes ejemplos. Se debe entender que estos Ejemplos se proporcionan solamente a modo de ilustracion. A partir de la discusion anterior y de estos Ejemplos, un experto en la tecnica puede determinar las caractensticas esenciales de esta invencion, y sin apartarse del alcance de la misma, puede realizar varios cambios y modificaciones de las realizaciones de la invencion para adaptarla a diversos usos y condiciones. Por lo tanto, diversas modificaciones de las realizaciones de la invencion, ademas de las mostradas y descritas en la presente memoria, seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la descripcion anterior. Tambien se pretende que tales modificaciones entren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Transformacion yseleccion del evento de soja CrylF yCrylAc pDAB9582.814.19.1
Se genero soja transgenica (Glycine max) que contema el evento de soja pDAB9582.814.19.1 a traves de transformacion mediada por Agrobacterium de explantes de nodulos de cotiledones de soja. La cepa de Agrobacterium desarmada EHA101 (Hood et al., 1993), que porta el vector binario pDAB9582 (Fig. 1) que contiene el marcador seleccionable, pat v6, y los genes de interes, cry1F v3 y cry1Ac synpro, dentro de la region del ADN de la hebra en T, se utilizo para iniciar la transformacion. La secuencia de ADN para pDAB9582 se proporciona en SEQ ID NO: 3, que se anota a continuacion en Tabla 1.
Tabla 1. Elementos geneticos ubicados en pDAB9582.
pb (SEQ ID NO: 3) Elemento de construccion Referencia
272- 1593 Promotor de AtUbi10 Callis, et al., (1990) J. Biol Chem., 265: 12486-12493
1602-5048 Cry1F Referido anteriormente
5151 - 5607 ORF23 UTR 3' Patente de Estados Unidos Num. 5.428147
5671 -6187 Promotor de CsVMV Verdagueretal., (1996) Plant Mol. Biol., 31: 1129-1139
6197-9667 Cry 1AC Referido anteriormente
9701 - 10157 ORF23 UTR 3' Patente de Estados Unidos Num. 5.428.147
10272-10788 Promotor de CsVMV Verdagueretal., (1996) Plant Mol. Biol., 31: 1129-1139
10796-11347 PAT Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37
11450-12153 ORF1 UTR 3' Huang et al., (1990) J. Bacteriol. 172: 1814-1822
La transformacion mediada por Agrobacterium se llevo a cabo utilizando un procedimiento modificado de Zeng et al. (2004). Brevemente, se hicieron germinar semillas de soja (cv Maverick) en medios basales y los nodulos de los cotiledones se aislaron e infectaron con Agrobacterium. El inicio de los brotes, el alargamiento de los brotes y los medios de enraizamiento se complementaron con cefotaxima, timentina y vancomicina para la eliminacion de Agrobacterium. La seleccion de glufosinato se empleo para inhibir el crecimiento de los brotes no transformados. Los
brotes seleccionados se transfirieron a un medio de enraizamiento para el desarrollo de la râ z y despues se transfirieron a una mezcla de suelo para la aclimatacion de las plantulas.
Los foliolos terminales de las plantulas seleccionadas fueron pintados con glufosinato para escrutar los posibles transformantes. Las plantulas escrutadas se transfirieron al invernadero, se dejo que se aclimataran y despues se pintaron las hojas con glufosinato para reconfirmar la tolerancia y se consideraron posibles transformantes. Se tomaron muestras de las plantas escrutadas y se llevaron a cabo analisis moleculares para confirmar el gen marcador seleccionable y/o el gen de interes. Se permitio que las plantas de la To se autofecundaran en el invernadero para dar lugar a semillas Ti.
Este evento, el evento de soja pDAB9582.814.19.1, se genero a partir de un producto aislado transformado independiente. Las plantas de la Ti se retrocruzaron y se sometieron a introgresion en variedades de elite durante las generaciones posteriores. El evento se selecciono en funcion de sus caractensticas unicas, tales como el sitio de insercion unico, la segregacion mendeliana normal, la expresion estable y una combinacion superior de eficacia, incluyendo la tolerancia a los herbicidas y el rendimiento agronomico. Los siguientes ejemplos contienen los datos que se utilizaron para caracterizar el evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Ejemplo 2: Caracterizacion de la expresion de protenas en el evento de soja pDAB9582.814.19.1
Se caracterizaron las propiedades bioquímicas de las protemas recombinantes Cry1F, Cry1Acy PAT expresadas en el evento de soja 9582.814.19.1. El ensayo de inmunoabsorbente con enzima ligada cuantitativo (ELISA) es un ensayo bioqmmico conocido en la tecnica que se puede utilizar para caracterizar las propiedades bioquímicas de las protemas y confirmar la expresion de estas protemas en el evento de soja 9582.814.19.1.
Ejemplo 2.1: Expresion de las protemas PAT, C ryIFy CrylAc en tejidos vegetales
Se aislaron muestras de tejidos de soja de las plantas de prueba y se prepararon para el analisis de expresion. La protema PAT se extrajo de tejidos de plantas de soja con solucion salina tamponada con fosfato que contema el detergente Tween-20 (PBST) que contema albumina de suero bovino (BSA) al 0,5%. El tejido de las plantas se centrifugo; el sobrenadante acuoso se recogio, se diluyo con el tampon apropiado segun fue necesario y se analizo con un kit ELISA para PAT en un formato sandwich. El kit se utilizo siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante (Envirologix, Portland, ME). Este ensayo mide la protema PAT expresada.
La protema Cry1F se extrajo de tejidos de las plantas de soja con solucion salina tamponada con fosfato que contema el detergente Tween-20 (PBST). El tejido de las plantas se centrifugo; el sobrenadante acuoso se recogio, se diluyo con el tampon apropiado segun fue necesario y se analizo utilizando un kit ELISA para Cry1F en un formato sandwich. El kit se utilizo siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante (Strategic Diagnostics Inc., Newark, DE). Este ensayo mide la protema Cry1F expresada.
La protema Cry1Ac se extrajo de tejidos de las plantas de soja con solucion salina tamponada con fosfato que contema el detergente Tween-20 (PBST) que contema albumina de suero bovino (BSA) al 0,5%. El tejido de las plantas se centrifugo; el sobrenadante acuoso se recogio, se diluyo con el tampon apropiado segun fue necesario y se analizo utilizando un kit ELISA para Cry1Ac en un formato sandwich. El kit se utilizo siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante (Strategic Diagnostics Inc., Newark, DE). Este ensayo mide la protema Cry1Ac.
Se realizo un analisis de deteccion para investigar la estabilidad de la expresion y la heredabilidad tanto vertical (entre generaciones) como horizontal (entre linajes dentro de una generacion) en el evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Ejemplo 2.2: Expresion de las protenas PAT, C ryIFy CrylAc en tejidos vegetales
Se determinaron los niveles de las protemas Cry1F, Cry1Ac y PAT en el evento de soja 9582.814.19.1. Las protemas solubles extrafbles se midieron utilizando un metodo de ensayo de inmunoabsorcion cuantitativo con enzima ligada (ELISA) a partir de tejido de hoja de soja. A partir de las generaciones T2 a T6 en los Eventos de Soja 9582.814.19.1, la expresion era estable (no se segregaba) y uniforme en todos los linajes. La Tabla 2 enumera el nivel medio de expresion de las protemas transgenicas en el evento de soja 9582.814.19.1.
Tabla 2. Nivel medio de expresion de diferentes protemas transgenicas en el evento de soja pDAB9582.814.19.1. Nivel de expresion de diferentes protemas (ng/cm)2)
Evento Cry1F Cry1 Ac PAT Evento de soja pDAB9582.814.19.1 133 17,4 12
Ejemplo 3: Clonacion y caracterizacion de la secuencia de ADN en el inserto y las regiones limftrofes flanqueantes del evento de soja pDAB9582.814.19.1
Para caracterizar y describir el sitio de insertion genomica, se determino la secuencia de las regiones limritrofes de ADN-T genomicas flanqueantes del evento de soja pDAB9582.814.19.1. Se confirmo la secuencia genomica del evento de soja pDAB9582.814.19.1, que comprendia 1.400 pb de la secuencia limrtrofe flanqueante 5' (SEQ ID NO: 1) y 1.398 pb de la secuencia limritrofe flanqueante 3' (SEQ ID NO: 2). La amplification por PCR basada en las secuencias limritrofes del evento de soja pDAB9582.814.19.1 valido que las regiones limrtrofes teman su origen en la soja y que las regiones de union eran secuencias unicas para el evento de soja pDAB9582.814.19.1. Las regiones de union se podrian utilizar para la identification espetifica del evento del evento de soja pDAB9582.814.19.1. Ademas, el sitio de insercion de la hebra T se caracterizo por la amplificacion de un fragmento genomico correspondiente a la region de las secuencias limritrofes flanqueantes identificadas del genoma de la soja sin transformar. La comparacion del evento de soja pDAB9582.814.19.1 con la secuencia genomica no transformada revelo que se hada producido una deletion de aproximadamente 57 pb del locus original durante la integration de la hebra T. En general, la caracterizacion del inserto y la secuencia limftrofe del evento de soja pDAB9582.814.19.1 indico que una copia intacta de la hebra T de pDAB9582 estaba presente en el genoma de la soja.
Tabla 3. Lista de cebadores y sus secuencias utilizados en la confirmation del ADN genomico de la soja en el evento de soja pDAB9582.814.19.1
Nombre
SEQ ID Tamano
NO: del Secuencia (5' a 3') Proposito (pb)
cebador
SEQ ID 30 TTTCTCCTATCCGTC confirmacion del ADN genomico rimite 5', utilizado NO: 4 81419_FW3 con AtUbi10RV1 o RV2; con 5'IREnd-01 o
AAATAAATCTGCTCC 5'IREnd-02
SEQ ID 81419_RV1 27 GGGTGATTTGGTGCC confirmacion del ADN genomico rimite 3', utilizado NO: 5 AAAAGTTATGTT con 3'PATEnd05 o 3'PATEnd06
SEQ ID 81419_RV2 24 T GGAGGGT CAT ATCG confirmacion del ADN genomico rimite 3', utilizado NO: 6 CAAAAGACT con 3'PATEnd05 o 3'PATEnd06
SEQ ID 81419_RV3 24 GTTCTGCGTCGTGGA confirmacion del ADN genomico rimite 3', utilizado NO: 7 GGGTCATAT con 3'PATEnd05 o 3'P ATEnd06
SEQ ID 5'IREnd-01 29 CGAGCTTTCTAATTT confirmacion del ADN genomico rimite 5', utilizado NO: 8 CAAACTATTCGGGC con 81419_ FW3
SEQ ID 5'IREnd-02 30 TCCTAGATCATCAGT confirmacion del ADN genomico rimite 5', utilizado NO: 9 TCATACAAACCTCCA con 81419 FW3
SEQ ID AtUbi10RV1 29 CGGTCCTAGATCATC confirmacion del ADN genomico rimite 5', utilizado NO: 10 AGTTCATACAAACC con 81419_ FW3
SEQ ID AtUbi10RV2 28 C ACTCGT GTT C AGT C confirmacion del ADN genomico rimite 5', utilizado NO: 11 CAATGACCAATAA con 81419_ FW3
SEQ ID 3'PATEnd05 20 GCTCCT CC AAGGCC A confirmacion de ADN genomico rimite 3', utilizado NO: 12 GTT AG con 81419_RV1, RV2 o RV3
SEQ ID 3'PATEnd06 20 CC AGTT AGGCC AGTT confirmacion de ADN genomico rimite 3', utilizado NO: 13 ACCCA con 81419_RV1, RV2 o RV3
Tabla 4. Condiciones para la amplificacion por PCR convencional de las regiones limftrofes y secuencias espedficas del evento en el evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Secuencia
Conjunto de Mezcla
Pre- Extension Extension Diana
Cebadores de
desnaturalizacion Desnaturalizacion final
PCR
(°C/min) (°C/seg.) (°C/min:
seg) (°C/min) 95/3 98/10 68/4:00 72/10 ftmite 5' 81419_FW3/AtUbi10RV1 D
32 ciclos
98/10 68/4:00 72/10 ftmite 5' 81419_FW3/5'IREn d-01 D 95/3
32 ciclos
98/10 68/4:00 72/10 ftmite 3' 3'PATEnd05/81419_RV2 D 95/3
35 ciclos
98/10 68/4:00 72/10 ftmite 3' 3'PATEnd05/81419_RV3 D 95/3
35 ciclos
98/10 68/4:00 72/10 ftmite 3' 3'PATEnd06/81419_RV2 D 95/3
35 ciclos
98/10 68/4:00 72/10 ftmite 3' 3'PATEnd06/81419_RV3 D 95/3
32 ciclos
A traves del 98/10 68/4:00 72/10 locus de 81419_FW3/81419_RV3 D 95/3
insercion 32 ciclos
Tabla 5 Mezcla de PCR para la amplificacion por PCR convencional de las regiones limftrofes y secuencias espedficas del evento en el evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Mezcla de PCR A Mezcla de PCR B
Reactivo 1 x reaccion (j L) Reactivo 1 x reaccion (j L) H20 0,8 H20 14,6 ACCPRIME PFX SUPERMIX 20 10X TAMPON LATAQ 2
MgCl2 (25 mM) 0,6
dNTP (2,5 uM) 1,6 Cebador 10 uM 0,2 Cebador10 uM 0,1
Digestion de ADNg 1 Digestion ADNg 1
LA TAQ (5U/ul) 0,1
rxn vol: 22 rxn vol: 20
Mezcla de PCR C Mezcla de PCR D
Reactivo 1 x reaccion ( j L ) Reactivo 1 x reaccion ( j L )
H20 28 H20 11,6
10X tampon II PCR (Mg-plus) 5 10X tampon II PCR (Mg-plus) 2
MgCl2 [25 mM] 1,5 MgCl2 [25 mM] 0,6
dNTP [2,5 mM] 8 dNTP [2,5 mM] 3,2
Cebador adaptador PCR (10 j M ) 1 Cebador 1 (10 j M ) 0,4
Cebador anidado GOI (10 j M ) 1 Cebador 2(10 j M ) 0,4
Esferas de ADN unidas 5 Molde de ADN 0,2
LA TAQ (5 U/ul) 0,5 LA TAQ (5 U/ul) 1,6
rxn vol: 50 rxn vol: 20
Ejemplo 3.1: Confirmacion de secuencias genomicas de soja
Los ftmites flanqueantes 5' y 3' se alinearon con una secuencia de pistola genica del genoma completo del cromosoma 02 de Glycine max, que indicaba que el transgen del evento pDAB9582.814.19.1 de la soja se habfa insertado en el cromosoma 02 del genoma de la soja. Para confirmar el sitio de insercion del evento de soja pDAB9582.814.19.1 del genoma de soja, se llevo a cabo la PCR con diferentes pares de cebadores (Fig. 2, Tabla 3, Tabla 4, y Tabla 5). El ADN genomico del evento de soja pDAB9582.814.19.1 y otras lmeas de soja transgenicas o no transgenicas se utilizaron como molde.
Para confirmar que las secuencias limftrofes 5' son correctas, se utilizaron un cebador disenado para unirse al elemento del gen promotor At Ubi10, por ejemplo, AtUbi10RV1, y un cebador disenado para unirse al ftmite del extremo 5' clonado en el cromosoma 02 del genoma de soja, cebador denominado 81419_FW3, para amplificar el segmento de ADN que abarca el elemento del gen promotor At Ubi10 hasta la secuencia limftrofe del extremo 5'. Del mismo modo, para la confirmacion de la secuencia limftrofe 3' clonada se utilizaron un cebador espedfico de pat, por ejemplo 3'PATEnd05, y tres cebadores disenados de acuerdo con la secuencia limftrofe del extremo 3' clonada, denominados 81419_RV1, 81419_RV2 y 81419_RV3, para amplificar segmentos de ADN que abarcan el gen pat hasta la secuencia limftrofe 3'. Los fragmentos de ADN con los tamanos esperados se amplificaron solo a partir del ADN genomico del evento de soja pDAB9582.814.19.1 con cada par de cebadores, pero no a partir de las muestras de ADN de otras lmeas de soja transgenicas o del control no transgenico. Los resultados indican que las secuencias limftrofes 5' y 3' clonadas son las secuencias limftrofes flanqueantes del inserto de la hebra T para el evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Para confirmar adicionalmente la insercion de ADN en el genoma de soja, se completo una amplificacion por PCR que abarcaba las secuencias limftrofes de la soja en el ADN genomico que no contema el inserto de la hebra T para el evento de soja pDAB9582.814.19.1. El cebador 81419_FW3, disenado de acuerdo con la secuencia limftrofe del extremo 5', y un cebador 81419-RV3, disenado para la secuencia limftrofe del extremo 3', se utilizaron para amplificar segmentos de ADN que conteman el locus donde se integro la hebra T pDAB9582. Como se esperaba, la amplificacion por PCR completada con el par de cebadores 81419_FW3 y 81419_RV3 produjo un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5 kb de todas las demas lmeas de control de soja, pero no de pDAB9582.814.19.1. El alineamiento de las secuencias limftrofes 5' y 3' identificadas del evento de soja pDAB9582.814.19.1 con una secuencia de pistola genica del genoma completo del cromosoma 02 de Glycine max cromosoma revelo una delecion de aproximadamente 57 pb del locus original. (Fig. 3). Estos resultados demostraron que el transgen del evento de soja pDAB8294 se habfa insertado en el sitio del cromosoma 02 del genoma de soja.
Ejemplo 4: Caracterizacion del evento de soja pDAB9582.814.19.1 a traves de Transferencia Southern
Se utilizo el analisis de transferencia Southern para establecer el patron de integracion del evento de soja pDAB9582.814.19.1. Estos experimentos generaron datos que demostraron la integracion y la integridad de los transgenes cry1Ac y cry1F dentro del genoma de la soja. El evento de soja pDAB9582.814.19.1 se caracterizo como un evento de integracion simple de longitud completa que contiene una sola copia de la unidad de transcripcion de la planta (PTU) cry1Ac y cry1F del plasmido pDAB9582.
Los datos de la transferencia de Southern sugirieron que un fragmento de la hebra T se insertaba en el genoma del
evento de soja pDAB9582.814.19.1. Se llevo a cabo un analisis de transferencia Southern detallado utilizando sondas espedficas para el gen crylAc y crylF, contenido en la region de integracion de la hebra T de pDAB9582.814.19.1, y enzimas de restriccion descriptivas que tienen sitios de escision localizados dentro del plasmido y producen fragmentos de hibridacion internos al plasmido o fragmentos que abarcan la union del plasmido con el ADN genomico de la soja (fragmentos lfmite). Los pesos moleculares indicados a partir de la hibridacion de Southern para la combinacion de la enzima de restriccion y la sonda fueron unicos para el evento y establecieron sus patrones de identificacion. Estos analisis tambien mostraron que el fragmento del plasmido se habfa insertado en el ADN genomico de la soja sin reordenamientos de la PTU de crylAc y crylF.
Ejemplo 4.1: Recogida de muestras de hoja de soja y aislamiento de ADN genomico (ADNg)
El ADN genomico se extrajo del tejido de las hojas extrafdo de plantas de soja individuales que conteman el evento de soja pDAB9582.814.19.1. Ademas, se aislo el ADNg de una planta de soja convencional, Maverick, que contiene el fondo genetico que es representativo de la lmea de sustancia, a falta de los genes cry1Ac y cry1F. Se extrajo ADN genomico individual de tejido de hoja liofilizado siguiendo el metodo CTAB convencional (Sambrook et al (1989)). Despues de la extraccion, el ADN se cuantifico espectrofluorometricamente utilizando el reactivo PICO GREEN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Despues se visualizo el ADN sobre un gel de agarosa para confirmar los valores del analisis PICO GREEN y para determinar la calidad del ADN.
Ejemplo 4.2: Digestion y separacion de ADN
Para la caracterizacion molecular por transferencia Southern del evento de soja pDAB9582.814.19.1, se digirieron diez microgramos (10 |jg) de ADN genomico. El ADN genomico del evento de soja pDAB9582.814.19.1 y la lmea de soja no transgenica Maverick se digirieron agregando aproximadamente cinco unidades de enzima de restriccion seleccionada por jg de ADN y el correspondiente tampon de reaccion a cada muestra de ADN. Cada muestra se incubo a aproximadamente 37°C durante la noche. Las enzimas de restriccion. Asal, Hindlll, Nsil, y Ndel se utilizaron individualmente para los productos digeridos individuales (New England Biolabs, Ipswich, MA). Las enzimas de restriccion Notl y ApaLI se utilizaron juntas para una doble digestion (New England Biolabs, Ipswich, MA). Ademas, se preparo una muestra de control de hibridacion positiva combinando ADN plasirndico, pDAB9582 con ADN genomico de la variedad de soja no transgenica, Maverick. El coctel de ADN plasirndico/ADN genomico se digirio utilizando los mismos procedimientos y enzima de restriccion que las muestras de prueba.
Despues de incubar las digestiones durante la noche, se agregaron 25 j l de QUICK-PRECIP PLUS SOLUTION (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) y las muestras de ADN digeridas se precipitaron con isopropanol. El sedimento de ADN precipitado se resuspendio en 15 j l de 1X tampon de carga (azul de bromofenol al 0,01%, EDTA 10,0 mM, glicerol al 10,0%, Tris 1,0 mM pH 7,5). Las muestras de ADN y los marcadores de tamano molecular se sometieron a continuacion a electroforesis a traves de geles de agarosa al 0,85% con tampon 0,4X TAE (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) a 35 voltios durante aproximadamente 18-22 horas para lograr la separacion de fragmentos. Los geles se tineron con bromuro de etidio (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el ADN se visualizo bajo luz ultravioleta (UV).
Ejemplo 4.3: Transferencia Southern y tratamiento de membrana
El analisis de transferencia Southern se realizo esencialmente como describen Memelink, et al. (1994). Brevemente, despues de la separacion electroforetica y la visualizacion de los fragmentos de ADN, los geles se despurinaron con HCl 0,25 M durante aproximadamente 20 minutos y despues se expusieron a una solucion desnaturalizante (NaOH 0,4 M, NaCl 1,5 M) durante aproximadamente 30 minutos, seguido de una solucion neutralizante (NaCl 1,5 M, Tris 0,5 M pH 7,5) durante al menos 30 minutos. La transferencia Southern se realizo durante la noche sobre membranas de nailon utilizando un sistema de absorcion con 10X SSC. Despues de la transferencia, el ADN se unio a la membrana mediante entrecruzamiento UV y a continuacion se lavo brevemente la membrana con una solucion 2X SSC. Este procedimiento produjo membranas de transferencia Southern listas para la hibridacion.
Ejemplo 4.4: Marcaje e hibridacion de sondas de ADN
Los fragmentos de ADN unidos a la membrana de nailon se detectaron utilizando una sonda marcada (Tabla 6). Las sondas se generaron mediante una incorporacion basada en PCR de un nucleotido marcado con digoxigenina (DIG), [DIG-11]-dUTP, en el fragmento de ADN amplificado del plasmido pDAB9582 utilizando cebadores espedficos para elementos genicos. La generacion de sondas de ADN por smtesis de PCR se llevo a cabo utilizando un PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante.
Las sondas marcadas se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa para determinar su calidad y cantidad. A continuacion se utilizo una cantidad deseada de sonda marcada para la hibridacion con el ADN diana sobre las membranas de nailon para la deteccion de los fragmentos espedficos utilizando los procedimientos esencialmente descritos para DIG EASY HYB SOLUTION (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Brevemente, las transferencias de la membrana de nailon que conteman ADN fijado se lavaron brevemente con 2X SSC y se prehibridaron con 20-25 mL de DIG eAsY HYB SOLUTION precalentada en botellas de hibridacion a aproximadamente 45-55°C durante aproximadamente 2 horas en un horno de hibridacion. La solucion de prehibridacion se decanto y se reemplazo por ~15 mL de DIG EASY HYB SOLUTION precalentada que contema una cantidad deseada de sondas espedficas desnaturalizadas hirviendolas en un bano de agua durante aproximadamente cinco minutos. La etapa de hibridacion se realizo a aproximadamente 45-55°C durante la noche en el horno de hibridacion.
Al final de la hibridacion de la sonda, se decantaron las DIG EASY HYB SOLUTIONS que conteman las sondas en tubos limpios y se almacenaron a aproximadamente -20°C. Estas sondas se podnan reutilizar hasta dos veces de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante. Las transferencias de membrana se enjuagaron brevemente y se lavaron dos veces en recipientes de plastico limpios con tampon de lavado de baja rigurosidad (2X SSC, SDS al 0,1%) durante aproximadamente cinco minutos a temperatura ambiente, seguido de lavado dos veces con tampon de lavado de alta rigurosidad (0,1X SSC, SDS al 0,1%) durante 15 minutos cada uno a aproximadamente 65°C. Las transferencias de membrana se lavaron brevemente con 1X tampon de acido maleico del DIG WASH AND BLOCK BUFFER SET (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) durante aproximadamente 5 minutos. Esto estuvo seguido por un bloqueo en un 1X tampon de bloqueo durante 2 horas y una incubacion con anticuerpo anti-DIG-AP (fosfatasa alcalina) (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) en un 1X tampon de bloqueo tambien durante un mmimo de 30 minutos. Despues de 2-3 lavados con 1X tampon de lavado, las sondas de ADN espedficas permanedan unidas a las transferencias de membrana y los patrones de ADN marcados con DIG se visualizaron utilizando el CDP-STAR CHEMILUMINESCENT NUCLEIC ACID DETECTION SYSTEM (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las transferencias se expusieron a una peftcula quimioluminiscente durante uno o mas puntos temporales para detectar fragmentos de hibridacion y visualizar los patrones de tamano molecular. Las peftculas se revelaron con un revelador de peftcula ALL-PRO 100 PLUS (Konica Minolta, Osaka, Japon) y se escanearon las imagenes. El numero y el tamano de las bandas detectadas se documentaron para cada sonda. Se utilizaron DIG-LABELED DNA MOLECULAR WEIGHT MARKER II (DIG MWM II) y DIG-LABELED DNA MOLECULAR WEIGHT MARKER VII (DIG MWM VII), visibles despues de la deteccion DIG como se ha descrito, para determinar el tamano del fragmento de hibridacion en las transferencias Southern.
Tabla 6 Ubicacion y longitud de las sondas utilizadas en el analisis Southern
Nombre de la sonda Elemento genetico Longitud (pb) Cry1Ac cry1Ac 1720
Cry1F cry1F 1746
specR Gen de resistencia a espectinomicina 750
OriRep Ori Rep 852
trfA Protê na de inicio de la replicacion trfA 1119
Ejemplo 4.5: Resultados de la transferencia Southern
En la Tabla 7, se proporcionan los tamanos de fragmentos esperados y observados con un producto digerido y una sonda particulares, en funcion de los sitios de enzimas de restriccion conocidos de las PTU cry1Ac y cry1F. Se identificaron dos tipos de fragmentos a partir de estos productos digeridos e hibridaciones: fragmentos internos donde los sitios de enzimas conocidos flanquean la region de la sonda y estan completamente contenidos dentro de la region de insercion de la PTU de cry1Ac y cry1F y fragmentos limftrofes donde un sitio de enzima conocido esta ubicado en un extremo de la region de la sonda y se espera un segundo sitio en el genoma de la soja. Los tamanos de los fragmentos llimitrofes vanan segun el evento porque, en la mayona de los casos, los sitios de integracion de fragmentos de ADN son unicos para cada evento. Los fragmentos limftrofes proporcionan un medio para ubicar un sitio de enzimas de restriccion en relacion con el ADN integrado y evaluar el numero de inserciones de ADN. Los analisis de transferencia Southern completados en multiples generaciones de soja que conteman el evento de soja pDAB9582.814.19.1 produjeron datos que sugirieron que se habfa insertado una PTU de cry1Ac y cry1F intacta, con un bajo numero de copias del plasmido pDAB9582 en el genoma de la soja del evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Tabla 7 Fragmentos de hibridacion pronosticados y observados en el analisis de transferencia Southern. 1. Los tamanos de fragmentos esperados se basan en el mapa plasirndico de pDAB9582. 2. Los tamanos de los fragmentos observados se consideran aproximadamente a partir de estos analisis y se basan en los tamanos indicados de los fragmentos DIG-LABELED DNA MOLECULAR WEIGHT MARKER II y MARK VII
Sondade Enzimas de Muestras Tamanos de fragmentos Tamano del fragmento ADN restriccion esperados (pb)1 observado (pb)2
pDAB9582 13476 >14000
Asal Maverick ninguno Ninguno
Evento de soja
pDAB9582.814.19.1 >7286 -7400
pDAB9582 15326 >15000
CrylAc Nsil Maverick Ninguno ninguno
Evento de soja
pDAB9582.814.19.1 >9479 >10000
pDAB9582 4550 -4500
No I ApaLI Maverick ninguno Ninguno
Evento de soja
pDAB9582.814.19.1 4550 -4500
pDAB9582 8071 -8000
Ndel Maverick Ninguno ninguno
Evento de soja
pDAB9582.814.19.1 5569 -7500
pDAB9582 11044 11000
CrylF Nsil Maverick ninguno Ninguno
Evento de soja
pDAB9582.814.19.1 >9479 >10000
pDAB9582 7732 -7700
Hind Ill Maverick ninguno ninguno
Evento de soja
pDAB9582.814.19.1 7732 -7700
pDAB9582 15320 -15000
EspecR Nsil Maverick ninguno ninguno
Evento de soja
pDAB9582.814.19.1 ninguno ninguno
pDAB9582 15320 -15000
trfA NsiI Maverick ninguno ninguno
Evento de soja
pDAB9582.814.19.1 ninguno ninguno
pDAB9582 5239 -5000
oriREP Ndel
Maverick ninguno ninguno
Evento de soja
pDAB9582.814.19.1 ninguno ninguno
Las enzimas de restriccion Asal y Nsil se unen y escinden sitios de restriccion unicos en el plasmido pDAB9582. Posteriormente, estas enzimas fueron seleccionadas para caracterizar el inserto del gen crylAc en el evento de soja pDAB9582.814.19.1. Se pronostico que los fragmented limftrofes de >7.286 pb o >9.479 pb hibridanan con la sonda despues de los productos digeridos con Asal y Nsil, respectivamente (Tabla 7). Se observaron bandas de hibridacion de crylAc unicas de aproximadamente 7.400 y >10.000 pb cuando se utilizaron productos digeridos con Asal y Nsil, respectivamente. La hibridacion de la sonda con bandas de este tamano sugiere la presencia de un unico sitio de insercion para el gen crylAc en el genoma de soja del evento de soja pDAB9582.814.19.1. Se seleccionaron las enzimas de restriccion Notl y ApaLl para realizar una doble digestion y para liberar un fragmento que contema la unidad de transcripcion de la planta crylAc (PTU; promotor/gen/terminador) (Tabla 7). Los fragmentos de 4.550 pb pronosticados se observaron con la sonda despues de la digestion con Notl y ApaLl. Los resultados obtenidos con la digestion enzimatica de las muestras de pDAB9582.814.19.1 seguida de hibridacion de la sonda indicaron que una PTU crylAc intacta del plasmido pDAB9582 se habfa insertado en el genoma de soja del evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Las enzimas de restriccion Ndel y Nsil se unen y escinden los sitios de restriccion en el plasmido pDAB9582. Posteriormente, estas enzimas fueron seleccionadas para caracterizar el inserto del gen crylF en el evento de soja pDAB9582.814.19.1. Se pronostico que los fragmentos lfmite de >5.569 y >9.479 pb hibridanan con la sonda despues de los productos digeridos con Ndel y Nsil, respectivamente (Tabla 7). Se observaron bandas de hibridacion de crylF unicas de -7.500 pb y> 10.000 pb cuando se utilizaban Ndel y Nsil, respectivamente. La hibridacion de la sonda con bandas de este tamano sugiere la presencia de un unico sitio de insercion para el gen crylF en el genoma de soja del evento de soja pDAB9582.814.l9.1. Se selecciono la enzima de restriccion, Hindlll, para liberar un fragmento que contema la unidad de transcripcion de la planta crylF (PTU; promotor/gen/terminador) (Tabla 7). El fragmento pronosticado de 7.732 pb se observo con la sonda despues de las digestiones con Hindlll. Los resultados obtenidos con la digestion enzimatica de las muestras de pDAB9582.814.19.1 seguida de la hibridacion de la sonda indicaron que una PTU crylF intacta del plasmido pDAB9582 se habfa insertado en el genoma de la soja del evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Ejemplo 4.6: Ausencia de secuencias de la cadena principal
Tambien se realizo un analisis de transferencia Southern para verificar la ausencia del gen de resistencia a espectinomicina (specR), el elemento Ori Rep y la protema de inicio de la replicacion trfA (elemento trf A) en el evento de soja pDAB9582.814.19.1. No se esperaba una hibridacion espedfica con la resistencia a espectinomicina, el elemento Ori Rep o el elemento trf A cuando se inclrnan controles positivos (pDAB9582 anadido a ADN genomico Maverick) y negativos (ADN genomico Maverick) apropiados para el analisis Southern. Despues de la digestion con Nsil y la hibridacion con la sonda espedfica de specR, se observo una banda de tamano esperado de 15.320 pb en la muestra de control positivo (pDAB9582 anadido al ADN genomico Maverick). La sonda specR no hibrido con las muestras del control negativo y el evento de soja pDAB9582.814.19.1. De manera similar, se detecto una banda de tamano esperado de 15.320 pb en la muestra de control positivo (pDAB9582 mas Maverick) pero ausente en las muestras del control negativo y el evento de soja pDAB9582.814.19.1 despues de la digestion con Nsil y la hibridacion con la sonda trfA. Se detecto otra banda de tamano esperado de 5.329 pb en la muestra de control positivo (pDAB9582 anadido al ADN genomico Maverick) pero ausente en las muestras del control negativo y el evento de soja pDAB9582.814.19.1 despues de la digestion con Ndel y la hibridacion con la sonda espedfica de OriRep. Estos datos indican la ausencia del gen de resistencia a la espectinomicina, el elemento Ori Rep y la protema de inicio de la replicacion trfA en el evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Ejemplo 5: Prueba agronomica y de rendimiento en el campo y tolerancia a herbicidas
Para someter a prueba las caractensticas agronomicas y la eficacia del evento de soja pDAB9582.814.19.1, el evento se planto en una prueba de eficacia en Santa Isabel, Puerto Rico, en octubre de 2010 y febrero de 2011. El cultivar Maverick, que se habfa transformado originalmente para producir el evento pDAB9582.814.19.1, se planto en cada vivero y se incluyo como control en los experimentos. La semilla para el vivero T3 se obtuvo de selecciones de una sola planta en la fase T2 y la semilla para el vivero T4 se obtuvo de selecciones de una sola planta en la fase T3. Se sometieron a prueba cuatro linajes del evento en cada generacion. Cada linaje se planto en una parcela de 4 filas de ancho y 228,6 cm (7,5 pies) de largo. El espacio entre filas fue de 76,2 cm (30 pulgadas). Las parcelas se cultivaron con iluminacion durante aproximadamente 2,5 semanas para compensar la corta duracion del dfa en Puerto Rico. Cada vivero se pulverizo con glufosinato a una tasa de 411 g ea/ha. Una parcela de las plantas de control, Maverick, se pulverizo con la misma tasa de glufosinato y una segunda parcela no se pulverizo y se utilizo como comparacion de control para el evento.
Se recopilaron datos sobre la emergencia, el aspecto general, el vigor, la altura, el encamado y la madurez. La tolerancia a los herbicidas se evaluo mediante la observacion visual de clorosis, necrosis de las hojas y muerte de las plantas (Tabla 8).
Para las comparaciones del evento de soja pDAB9582.814.19.1 con Maverick, solamente se utilizaron los datos del bloque no pulverizado de Maverick. Para la comparacion de los tratamientos pulverizados y no pulverizados, los datos del bloque del evento de soja pDAB9582.814.19.1 pulverizado con un tratamiento dado se compararon con los datos del bloque no rociado de control Maverick. El evento de soja pDAB9582.814.19.1 mostro tolerancia a la
aplicacion del herbicida glufosinato. En contraste, ninguna de las plantas Maverick fue tolerante a los tratamientos con herbicidas.
Tabla 8 Comparacion del evento de soja pDAB9582.814.19.1 con Maverick. Los valores son promedios de viveros T3 y T4. Cada vivero del evento de soja pDAB9582.814.19.1 se pulverizo con glufosinato en la fase V3 a una tasa de 411 g ea/ha.
Evento Emergencia Apariencia (1 = mala Vigor (1 = escaso Altura Encamado Madurez (%) a 9 = buena) a 9 = bueno) (cm) (%) (dia) pDAB9582.
814.19.1 90 8 8 69 1 91 Maverick 82 8 8 64 1 91
Ejemplo 6: Caracterizacion de la actividad insecticida para el evento de soja 9582.814.19.1
Se realizaron evaluaciones de campo e invernadero para caracterizar la actividad de CrylAc y CrylF en el evento de soja pDAB9582.814.19.1 contra plagas de soja criadas en laboratorio, que inclman Anticarsia gemmatalis (oruga de las legumbres), Pseudoplusia inclusive (gusano medidor de soja) y Spodoptera frugiperda (gusano cogollero). El evento de soja pDAB9582.814.19.1 se comparo con la variedad de soja no transformada Maverick, para determinar el nivel de proteccion de las plantas proporcionado por las protemas CrylF y Cry1 Ac.
Las pruebas de invernadero se realizaron en plantas de aproximadamente cuatro semanas de edad. Se utilizaron quince plantas para evaluar el evento de soja pDAB9582.814.19.1 y el control Maverick. Para cada especie de insecto sometida a prueba (Anticarsia gemmatalis, Pseudoplusia incluye, y Spodoptera frugiperda) se troquelaron 3 discos de hojas de cada planta para un total de 45 discos de hojas/plantas/insectos. Los discos de hojas de 1,4 cm de diametro (o 1,54 cm2) se colocaron en una arena de prueba encima de agar agua al 2%, se infestaron con una larva neonatal y se sellaron con una tapa de plastico perforada. La mortalidad y el consumo de hojas se clasificaron 4 dfas despues de la infestacion. Las larvas que no respondfan al sondeo suave se consideraron muertas. El dano de la hoja se evaluo visualmente puntuando el porcentaje de disco de la hoja consumido por el insecto.
Las evaluaciones de campo se realizaron mediante la recoleccion de muestras de hojas de parcelas de vivero con aumento de semillas en Santa Isabel, Puerto Rico y el envfo de estas hojas a Indianapolis, In para su analisis. La parcela de vivero para el evento de soja pDAB9582.814.19.1 se sembro en febrero de 2011 y consistio en aproximadamente 180 plantas dispuestas en cuatro filas. Cada fila tema 2,3 m de largo y una separacion de 76,2 cm; las plantas individuales se espaciaron 5,1 cm dentro de cada fila. En marzo de 2011, se corto una hoja trifoliada principal, completamente expandida, ubicada aproximadamente cuatro nudos por debajo del meristema de 10 plantas con evento de soja pDAB9582.814.19.1 y 10 plantas 'Maverick'. Las hojas se colocaron en bolsas de plastico etiquetadas (una por bolsa) y se sellaron. Las hojas embolsadas fueron embaladas y trasladadas al laboratorio. En el laboratorio, se troquelaron uno o dos discos de hojas de 3,33 cm (1,31 pulgadas) de diametro de cada hoja trifoliada para proporcionar un total de 16 discos de hojas. Cada disco de hoja se coloco en una arena de prueba sobre agar al 2%, se infesto con una larva neonata de S. frugiperda, y se sello con una tapa de plastico perforada. Los discos foliares se mantuvieron en una camara climatica controlada durante 7 dfas, momento en el que se clasificaron la mortalidad y el consumo de hoja. Las larvas que no respondfan al sondeo suave se consideraron muertas. El dano de la hoja se evaluo visualmente anotando el porcentaje de disco de la hoja consumido por el insecto.
Los resultados obtenidos de estos experimentos replicados indicaron que el evento de soja pDAB9582.814.19.1 sufrio un dano significativamente menor que las plantas de control Maverick para todos los insectos sometidos a prueba. Por lo tanto, el evento de soja pDAB9582.814.19.1 tiene actividad insecticida en esta amplia gama de anfitriones.
Ejemplo 7: Secuencia del evento de soja pDAB9582.814.19.1
SEQ ID NO: 14 proporciona la secuencia del evento de soja pDAB9582.814.19.1. Esta secuencia contiene la secuencia flanqueante genomica 5', el inserto de la hebra T de pDAB9582 y las secuencias flanqueantes genomicas 3'. Con respecto a SEQ ID NO: 14, los residuos 1-1.400 son secuencias flanqueantes genomicas 5', los residuos 1.401 - 1.536 son residuos de un reordenamiento del plasmido pDAB9582 y 1.537 - 13.896 son residuos del inserto de la hebra T de pDAB9582, y los residuos 13.897 - 15.294 son la secuencia flanqueante 3'. La secuencia de union o transicion con respecto al extremo 5' del inserto se produce, por lo tanto, en los residuos 1.400-1.401 de SEQ ID NO: 14. La secuencia de union o transicion con respecto al extremo 3' del inserto se produce, por lo tanto, en los residuos 13.896 -13.897 de SEQ ID NO: 14.
Cabe senalar que la progenie del evento de soja pDAB9582.814.19.1 puede tener secuencias que se desvfan ligeramente de SEQ ID NO: 14. Durante el procedimiento de introgresion y reproduccion de la introduccion del
Claims (9)
1. Un metodo para controlar insectos que comprende exponer insectos a plantas de soja resistentes a insectos, comprendiendo dichas plantas de soja un segmento polinucleotidico que tiene al menos una identidad de 95% con SEQ ID NO: 14, que comprende el evento de soja 9582.814.19.1, en donde una semilla de soja representativa ha sido depositada en la Coleccion de Cultivos Tipo Americana (ATCC) con el numero de acceso pTA-12006.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dichos insectos son Pseudoplusia includens (gusano medidor de la soja).
3. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dichos insectos son Anticarsia gemmatalis (oruga de las leguminosas).
4. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dichos insectos son Spodoptera frugiperda (gusano cogollero).
5. Una secuencia de ADN aislada que comprende una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en los pb 1.385-1.415 de SEQ ID NO: 1, los pb 1.350-1.450 de SEQ ID NO: 1, los pb 1.300-1.500 de SEQ ID NO: 1, los pb 1.200-1.600 de SEQ ID NO: 1, los pb 137-168 de SEQ ID NO: 2, los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2, y los pb 3-303 de SEQ ID NO: 2.
6. Una planta de soja, o una parte de la misma que comprende una secuencia de ADN que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 14, que comprende el evento de soja 9582.814.19.1, en donde una semilla de soja representativa ha sido depositada en la Coleccion de Cultivos Tipo Americana (ATCC) con el numero de acceso PTA-12006, que es resistente a Pseudoplusia includens (gusano medidor de la soja) y comprende ADN que tiene al menos una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en los pb 1385-1415 de SEQ ID NO: 1, los pb 1350-1450 de SEQ ID NO: 1, los pb 1300-1500 de SEQ ID NO: 1, los pb 1200-1600 de SEQ ID NO: 1, los pb 137-168 de SEQ ID NO: 2, los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2, los pb 3-303 de SEQ ID NO: 2, y complementos de los mismos, en donde las partes de la planta de soja se seleccionan del grupo que consiste en polen, ovulo, flores, brotes, rafces, hojas, nucleos de celulas vegetativas, celulas de polen, semillas, y celulas huevo.
7. Una planta de soja segun la reivindicacion 6 que comprende una secuencia de ADN que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:14, elaborada cruzando una primera planta de soja que comprende una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en los pb 1385-1415 de SEQ ID NO: 1, los pb 1350-1450 de SEQ ID NO: 1, los pb 1300-1500 de SEQ ID NO: 1, los pb 1200-1600 de SEQ ID NO: 1, los pb 137-168 de SEQ ID NO: 2, los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2, y los pb 3-303 de SEQ ID NO:2, y complementos de las mismas con una segunda planta de soja y analizar la planta de soja producida para determinar la presencia de ADN que comprende una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en los pb 1385-1415 de SEQ ID NO: 1, los pb 1350 1450 de SEQ ID NO: 1, los pb 1300-1500 de SEQ ID NO: 1, los pb 1200-1600 de SEQ ID NO: 1, los pb 137-168 de SEQ ID NO: 2, los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2, los pb 3-303 de SEQ ID NO: 2, y complementos de las mismas.
8. La planta de soja, o parte de la misma, de la reivindicacion 6 que comprende una secuencia de ADN que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 14, que comprende el evento de soja 9582.814.19.1, en donde semillas representativas de dicha planta de soja han sido depositadas en la Coleccion de Cultivos Tipo Americana con el Num. de Acceso PTA-12006.
9. Un metodo de control de plagas en los granos, semillas, semola, o harina de soja que comprende incluir el evento de soja 9582.814.19.1, en donde una semilla de soja representativa ha sido depositada en la Coleccion de Cultivos Tipo Americana (ATCC) con el numero de acceso PTA-12006, que comprende una secuencia de ADN que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 14 en dicho grano, semilla, semola o harina como se demuestra porque dicho grano, semilla, semola, o harina comprenden una o mas secuencias de ADN seleccionadas del grupo que consiste en los pb 1385-1415 de SEQ ID NO: 1, los pb 1350-1450 de SEQ ID NO: 1, los pb 1300-1500 de SEQ ID NO: 1, los pb 1200-1600 de SEQ ID NO: 1, los pb 137-168 de SEQ ID NO: 2, los pb 103-203 de SEQ ID NO: 2, los pb 3-303 de SEQ ID NO: 2, y complementos de las mismas.
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