KR20140051362A - 대두 이벤트 ｐＤＡＢ９５８２.８１４.１９.１ 및 ｐＤＡＢ４４６８.０４.１６.１의 곤충 저항성 및 제초제 내성 육종 스택 - Google Patents

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Abstract

대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1과 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1의 육종 스택은 신규 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1을 생성하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1은 AAD-12, Cry1F, Cry1Ac (synpro), 및 PAT를 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 이벤트를 함유하는 대두 농작물에 곤충 저항성 및 제초제 내성을 제공하고, 농작물 보호 및 저장품의 보호를 위한 방법을 가능하게 한다.

Description

대두 이벤트 ｐＤＡＢ９５８２.８１４.１９.１ 및 ｐＤＡＢ４４６８.０４.１６.１의 곤충 저항성 및 제초제 내성 육종 스택{INSECT RESISTANT AND HERBICIDE TOLERANT BREEDING STACK OF SOYBEAN EVENT pDAB9582.814.19.1 AND pDAB4468.04.16.1}
Cry1F 및 Cry1Ac synpro (Cry1Ac)를 코딩하는 유전자는 트랜스제닉 (transgenic) 식물에 곤충 저항성, 예를 들어 나비목 곤충에 대한 저항성을 부여할 수 있고, PAT (포스피노드리신 아세틸기전이효소)를 코딩하는 유전자는 트랜스제닉 식물에 제초제 포스피노트리신 (글루포시네이트)에 대한 내성을 부여할 수 있다. PAT는, 곤충 저항성 트랜스제닉 농작물 생산에서의 선별성 마커로서, 또한 트랜스제닉 농작물에서 제초제 글루포시네이트에 대한 상업적 수준의 내성을 부여하는데 사용하기 위해 대두에서 성공적으로 발현되어 왔다. AAD-12 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나아제-12)를 코딩하는 유전자는, 트랜스제닉 식물에서 발현되는 경우, 페녹시아세트산 제초제인 2,4-D 및 MCPA, 및 피리딜옥시아세트산 제초제인 트리클로피르 및 플루록시피르에 대한 상업적 수준의 내성을 부여할 수 있다.
식물에서의 외래 유전자의 발현은, 아마도 크로마틴 구조 (예를 들어, 헤테로크로마틴), 또는 통합 부위에 가까운 전사 조절 요소 (예를 들어, 인핸서)의 근접성에 기인하여 식물 게놈에서의 외래 유전자의 위치에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988]). 동시에, 게놈에서의 상이한 위치에서의 트랜스진 (transgene)의 존재는 상이한 방식으로 식물의 전체적인 표현형에 영향을 줄 것이다. 이러한 이유로, 도입된 관심 유전자의 최적의 발현을 특징으로 하는 이벤트를 확인하기 위하여 종종 다수의 이벤트를 스크리닝할 필요가 있다. 예를 들어, 식물 및 기타 유기체 내에서 이벤트들 중 도입된 유전자의 발현 수준에 광범위한 편차가 있을 수 있다는 것이 관찰되었다. 또한, 발현의 공간적 또는 시기적 패턴에서의 차이, 예를 들어 여러 식물 조직에서 트랜스진의 상대적인 발현에서의 차이가 있을 수 있으며, 이러한 차이는 도입된 유전자 구축물 내에 존재하는 전사 조절 요소로부터 예상되는 패턴에 상응하지 않을 수 있다. 이러한 이유로, 수백 개 내지 수천 개의 상이한 이벤트를 생성하고, 이러한 이벤트들을 상업적인 목적을 위해 원하는 트랜스진 발현 수준 및 패턴이 있는 단일 이벤트에 대해 스크리닝하는 것이 통상적이다. 원하는 수준 또는 패턴의 트랜스진 발현이 있는 이벤트는 통상적인 육종법을 사용하여 유성 이종교배 (outcross)에 의해 트랜스진을 다른 유전학적 배경 내로 유전자이입 (introgressing)시키는데 유용하다. 이같은 교배의 자손은 원래의 형질전환체의 트랜스진 발현 특성을 유지한다. 이러한 전략은 지역적인 성장 조건에 대해 잘 적응한 다수의 품종에서의 신뢰할 수 있는 유전자 발현을 확실하게 하는데 사용된다.
유성 교배의 자손이 관심 트랜스진 또는 트랜스진 군을 함유하는지를 결정하기 위하여 특정 이벤트 또는 다수의 이벤트의 존재를 검출할 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 특정 이벤트 또는 다수의 이벤트를 검출하는 방법은, 예를 들어 재조합 농작물로부터 유래된 식품의 시판전 승인 및 표지를 필요로 하는 규정을 따르거나, 또는 환경 모니터링, 필드에서의 농작물의 형질 모니터링, 또는 농작물 수확으로부터 유래된 제품의 모니터링에서의 이용에 도움이 될 뿐만 아니라, 해당 당사자가 규제 또는 계약 조건을 확실히 준수하도록 이용하는 데에도 도움이 될 수 있다.
핵산 프로브를 사용하는 DNA 혼성화 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 포함하나 이에 제한되지 않는 당 업계에 공지된 임의 핵산 검출 방법에 의해 하나 이상의 트랜스제닉 이벤트의 존재를 검출하는 것이 가능하다. 일반적으로, 다수의 DNA 구축물의 경우, 코딩 영역이 상호교환가능하기 때문에 이들 검출 방법은 흔히 사용되는 유전적 요소, 예컨대 프로모터, 종결제, 마커 유전자 등에 집중된다. 그 결과, 상기 방법은 상이한 이벤트들 간의 구별에 유용하지 않을 수 있는데, 특히 삽입된 이종성 DNA에 인접한 플랭킹 (flanking) DNA의 DNA 서열이 알려져 있지 않은 경우, 동일한 DNA 구축물 또는 매우 유사한 구축물을 사용하여 제조되는 것들이 그러하다. 예를 들어, 이벤트-특이적 PCR 검정법이 옥수수 이벤트 DAS-59122-7에 대해 미국 특허 출원 2006/0070139에 기재되어 있다. 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 확인을 위한 단순하고 차별적인 방법을 갖는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1로 지정된, 신규한 곤충 저항성 및 제초제 내성 트랜스제닉 대두 육종 스택 이벤트에 관한 것이다. 상기 육종 스택은 본원에 기재된 바와 같은 cry1F, cry1Ac 및 pat, 및 대두 세포 게놈 내의 특정 부위 내로 삽입된, 본원 및 국제 특허 출원 제WO/2012/075426호에 기재된 바와 같은 aad-12 및 pat를 포함한다. 대표적인 대두 종자는 단락 <36>에서 확인되는 기탁번호를 갖는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection) (ATCC)에 기탁되었다. 이러한 이벤트를 함유하는 대두 식물의 DNA는 대두 게놈 내로 삽입된 DNA의 위치를 특징으로 하는, 본원에 기재된 접합부/플랭킹 서열을 포함한다. 서열 1, 서열 2, 및 서열 15는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 특징이다. 보다 특히, 서열 1의 bp 1400/1401, bp 1536/1537, 서열 2의 bp 152/153, 서열 15의 bp 2730/2731, 및 서열 15의 bp 9121/9122에서의 접합부를 둘러싸는 서열은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 특징이다. 하기 단락 [00012]는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1을 함유하는 대두의 DNA의 특징인 이들 접합부를 포함하는 서열의 예를 기재한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 대두 식물, 또는 그의 일부를 제공하고, 이는 슈도플루시아 인클루덴스 (Pseudoplusia includens) (대두 자벌레)에 대해 저항성이 있으며, 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 및 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물을 포함하는 게놈을 갖는다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 식물의 종자를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 곤충 저항성 대두 식물에 곤충을 노출시킴으로써 곤충을 방제하는 것을 포함하는 곤충 방제 방법을 제공하고, 상기 대두 식물은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 존재의 특징인 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 및 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물을 포함하는 게놈을 갖는다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 내의 cry1F v3 (cry1F) 및 cry1Ac synpro (cry1Ac) 유전자의 존재는, 예를 들어 슈도플루시아 인클루덴스 (대두 자벌레), 안티카르시아 겜마탈리스 (Anticarsia gemmatalis) (벨벳빈 (velvetbean) 애벌레), 에피노티아 아포레마 (Epinotia aporema), 오모이데스 인디카투스 (Omoides indicatus), 라치플루시아 누 (Rachiplusia nu), 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda), 스포도프테라 코스모이데스 (Spodoptera cosmoides), 스포도프테라 에리다니아 (Spodoptera eridania), 헬리오씨스 바이레신스 (Heliothis virescens), 헬리오코베르파 지아 (Heliocoverpa zea), 스필로소마 비르기니카 (Spilosoma virginica) 및 엘라스모팔푸스 리노셀루스 (Elasmopalpus lignosellus)에 대한 저항성을 부여한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 2,4-D 및 MCPA와 같은 페녹시아세트산 제초제에 대해 내성이 있는 대두 식물, 또는 그의 일부를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 트리클로피르 및 플루록시피르와 같은 피리딜옥시아세트산 제초제에 대해 내성이 있는 대두 식물, 또는 그의 일부를 제공한다. 이러한 실시양태에서, 대두 식물은 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물을 포함하는 게놈을 갖는다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 식물의 종자를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 2,4-D 및 MCPA와 같은 페녹시아세트산 제초제를 적용하는 것을 포함하는 대두 농작물에서의 잡초 방제 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 트리클로피르 및 플루록시피르와 같은 피리딜옥시아세트산 제초제를 대두 농작물에 적용하는 것을 포함하는, 대두 농작물에서의 잡초 방제 방법을 제공하며, 상기 대두 농작물은 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물을 포함하는 게놈을 갖는 대두 식물을 포함한다. 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 내의 aad-12 유전자의 존재는 페녹시아세트산 제초제 및 피리딜옥시아세트산 제초제에 대한 내성을 부여한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 대두 농작물에 글루포시네이트 제초제를 적용하는 것을 포함하는, 대두 농작물에서의 잡초 방제 방법을 제공하며, 상기 대두 농작물은 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 서열 2의 bp 3-303으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물을 포함하는 게놈을 갖는 대두 식물을 포함하고, 이들은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 존재의 특징이다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 내의 pat v6 (pat) 유전자의 존재는 글루포시네이트 제초제에 대한 내성을 부여한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 대두 DNA를 포함하는 샘플 내의 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1을 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
(a) 상기 샘플을, 서열 1의 bp 1-1400 내의 플랭킹 서열 또는 그의 상보물과 선택적으로 결합하는 길이가 10 bp 이상인 제1 프라이머, 및 서열 1의 bp 1401-1836 내의 삽입 서열 또는 그의 상보물과 선택적으로 결합하는 길이가 10 bp 이상인 제2 프라이머와 접촉시키고; 상기 프라이머들 간에 생성된 앰플리콘 (amplicon)에 대해 분석하는 단계; 또는
(b) 상기 샘플을, 서열 2의 bp 1-152 내의 삽입 서열 또는 그의 상보물과 선택적으로 결합하는 길이가 10 bp 이상인 제1 프라이머, 및 서열 2의 bp 153-1550 내의 플랭킹 서열 또는 그의 상보물과 선택적으로 결합하는 길이가 10 bp 이상인 제2 프라이머와 접촉시키는 단계; 또는
(c) 상기 샘플을, 서열 15의 bp 2731-9121 내의 삽입 서열 또는 그의 상보물과 선택적으로 결합하는 길이가 10 bp 이상인 제1 프라이머, 및 서열 15의 bp 1-2730 내의 플랭킹 서열 또는 그의 상보물과 선택적으로 결합하는 길이가 10 bp 이상인 제2 프라이머와 접촉시키는 단계; 또는
(d) 상기 샘플을, 서열 15의 bp 2731-9121 내의 삽입 서열 또는 그의 상보물과 선택적으로 결합하는 길이가 10 bp 이상인 제1 프라이머, 및 서열 15의 bp 9122-10,198 내의 플랭킹 서열 또는 그의 상보물과 선택적으로 결합하는 길이가 10 bp 이상인 제2 프라이머와 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 프라이머들 간에 생성된 앰플리콘에 대해 분석하는 단계
를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은
(a) 상기 샘플을, 서열 1의 bp 1-1400 및 서열 2의 bp 153-1550으로 이루어지는 군으로부터 선택된 플랭킹 서열, 및 그의 상보물과 선택적으로 결합하는 제1 프라이머; 및 서열 3 또는 그의 상보물과 선택적으로 결합하는 제2 프라이머; 및 서열 15의 bp 1-2730 및 서열 15의 bp 9122-10,198의 플랭킹 서열, 및 그의 상보물과 선택적으로 결합하는 제3 프라이머; 및 서열 15의 bp 2731-9121의 삽입 서열, 및 그의 상보물과 선택적으로 결합하는 제4 프라이머와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 샘플을 중합효소 연쇄 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 프라이머들 간에 생성된 앰플리콘에 대해 분석하는 단계
를 포함하는, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1을 검출하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은, 제1 식물을 제2 대두 식물과 교배시켜 제3 대두 식물을 생산하며, 상기 제1 식물은 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 및 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물을 포함하는 DNA를 포함하는 단계; 및 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 서열 2의 bp 3-303; 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물을 포함하는 DNA의 존재에 대해 상기 제3 대두 식물을 분석하는 단계를 포함하는, 대두 식물의 육종법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 특징인 단리된 DNA 분자를 제공한다. 상기 분자는, 서열 1, 서열 2, 및 서열 15에 이외에, 서열 1의 bp 1400-1401 및 bp 1400/1401 접합부로부터 각 방향으로 서열 1의 10 bp 이상을 포함하는 길이가 25 bp 이상인 분자; 서열 2의 bp 152-153 및 bp 152/153 접합부로부터 각 방향으로 서열 2의 10 bp 이상을 포함하는 길이가 25 bp 이상인 앰플리콘; 서열 15의 bp 2730-2731 및 bp 2730/2731 접합부로부터 각 방향으로 서열 15의 10 bp 이상을 포함하는 길이가 25 bp 이상인 앰플리콘; 서열 15의 bp 9121-9122 및 bp 9121/9122 접합부로부터 각 방향으로 서열 15의 10 bp 이상을 포함하는 길이가 25 bp 이상인 앰플리콘을 포함한다. 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 및 서열 2의 bp 3-303; 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321, 및 그의 상보물을 예로 들 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 대두 낟알, 종자, 또는 종자 밀(meal)에서의 해충 방제 방법을 제공하며, 이 방법은 대두 낟알, 종자, 또는 종자 밀 내에 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1을 포함시키는 것을 포함하며, 이는 상기 낟알, 종자, 또는 종자 밀이 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 및 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물을 포함하는 DNA를 포함하는 것에 의해 입증된다.
본 발명은 또한 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1을 함유하는, 꽃가루, 배주, 꽃, 출아물 (shoot), 뿌리 및 잎, 및 식물 세포의 핵, 꽃가루 세포, 종자 및 종자 밀, 및 난세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 대두 식물 세포 및 식물 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1은, 예를 들어 다른 제초제 내성 유전자(들) 및/또는 곤충-방지 단백질 및 전사 조절 서열 (즉, RNA 간섭, dsRNA, 전사 인자 등)을 비롯한 다른 형질과 조합될 수 있다. 추가의 형질은 식물 육종, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1을 함유하는 트랜스제닉 식물의 재형질전환, 또는 표적화 통합을 통한 새로운 형질의 추가를 통해, 식물 게놈에 스태킹될 수 있다.
다른 실시양태는, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, pat 유전자 발현 카세트 포함)의 제거 (excision)를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열의 제거 시, 변형된 이벤트는, 추가의 폴리뉴클레오티드 서열이 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1와 스태킹되는 특정 염색체 부위에서 재표적화될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명은 서열 1 및 서열 2에 제시된 플랭킹 서열들 사이의 염색체 02에 위치하는 대두 염색체 표적 부위를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 서열 15에 제시된 플랭킹 서열들 사이의 염색체 04에 위치하는 대두 염색체 표적 부위를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 서열 1 및 서열 2에 제시된 게놈 서열들 사이, 즉 서열 1의 bp 1-1400과 서열 2의 bp 153-1550 사이의 염색체 02의 위치에 이종 핵산을 삽입하는 것을 포함하는 트랜스제닉 대두 식물의 생산 방법을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 서열 15에 제시된 게놈 서열들 사이, 즉 서열 15의 bp 1-2730과 서열 15의 bp 9122-10,198 사이의 염색체 04의 위치에 이종 핵산을 삽입하는 것을 포함하는 트랜스제닉 대두 식물의 생산 방법을 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 대두) 내의 본 발명의 이벤트의 존재를 검출하기 위한 검정법을 제공한다. 이러한 검정법은 대두 게놈 내로 삽입된 재조합 구축물의 DNA 서열, 및 삽입 부위에 플랭킹된 게놈 서열을 기초로 할 수 있다. 이러한 검정법을 수행하는데 유용한 키트 및 조건이 또한 제공된다.
본 발명은, 부분적으로, 트랜스제닉 대두 계통 내의 pDAB9582 및 pDAB4468로부터의 T-DNA의 삽입으로부터 유도되는 경계 영역의 DNA 서열의 클로닝 및 분석에 관한 것이다. 이러한 서열들은 독특하다. 이러한 삽입물 및 접합부 서열을 기초로, 이벤트-특이적 프라이머들이 존재할 수 있고 생성되었다. 이러한 이벤트-특이적 프라이머 세트를 이용한 생성된 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 이들 이벤트를 확인할 수 있다는 것이 PCR 분석에서 실연되었다. 따라서, 이러한 절차 및 기타 관련 절차를 사용하여 본 발명의 이벤트를 포함하는 대두 계통을 독특하게 확인할 수 있다.
종자 기탁
본 개시내용의 일부로서, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1을 포함하는 대두 계통의 2500개 이상의 종자 및 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1을 포함하는 대두 계통의 2500개의 종자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (우편번호 20110 미국 버지니아주 머내서스 불러바드 유니버시티 10801)에 기탁되었고, 일반인이 제한 없이 (그러나 특허권에 따라) 이를 입수할 수 있다. ATCC 기탁 번호 PTA-10442 (pDAB4468.04.16.1) 및 ATCC 기탁 번호 PTA-12006 (pDAB9582.814.19.1)으로 지정된 기탁물은 각각 2009년 10월 22일 및 및 2011년 7월 21일에 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 (Dow AgroSciences LLC)에 의해 기탁되었다. 이러한 기탁은 특허 절차를 위한 종자 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 이러한 조약의 조항 하에 이루어졌고 유지될 것이다.
서열의 간단한 설명
서열 1은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1에 대한 5' DNA 플랭킹 경계 서열이다. 뉴클레오티드 1-1400은 게놈 서열이다. 뉴클레오티드 1401-1535는 pDAB9582로부터 재배열된 서열이다. 뉴클레오티드 1536-1836은 삽입 서열이다.
서열 2는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1에 대한 3' 플랭킹 경계 서열이다. 뉴클레오티드 1-152는 삽입 서열이다. 뉴클레오티드 153-1550은 게놈 서열이다.
서열 3은 하기 표 1에서 주석을 붙인 pDAB9582의 DNA 서열이다.
서열 4는 5' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 81419_FW3이다.
서열 5는 3' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 81419_RV1이다.
서열 6은 3' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 81419_RV2이다.
서열 7은 3' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 81419_RV3이다.
서열 8은 5' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'IREnd-01이다.
서열 9는 5' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'IREnd-02이다.
서열 10은 5' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 AtUbi10RV1이다.
서열 11은 5' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 AtUbi10RV2이다.
서열 12는 3' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 3'PATEnd05이다.
서열 13은 3' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 3'PATEnd06이다.
서열 14는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 확인된 서열이다. 5' 게놈 플랭킹 서열, pDAB9582 T-스트랜드 삽입물, 및 3' 게놈 플랭킹 서열을 포함한다.
서열 15는 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1의 확인된 서열이다. 5' 게놈 플랭킹 서열, pDAB4468 T-스트랜드 삽입물, 및 3' 게놈 플랭킹 서열을 포함한다.
도 1은 cry1F, cry1Ac 및 pat 발현 카세트를 함유하는 pDAB9582의 플라스미드 지도이다.
도 2는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 5' 및 3' 경계 서열을 확인하기 위한 프라이머 위치를 도시한다.
도 3은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 중의 게놈 서열 배열을 도시한다.
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 삽입물의 플랭킹 서열이 시퀀싱되고 분석되었다. 이벤트 특이적 검정법이 개발되었다. 이는 또한 대두 게놈 (대두 염색체 02 및 04) 상에 맵핑되었다. 상기 이벤트들은 추가의 우량 계통에 함께 유전자이입될 수 있다.
상기 배경기술 부분에서 암시된 바와 같이, 식물 게놈 내로의 트랜스진의 도입 및 통합은 일부 무작위 이벤트를 수반한다 (따라서 발현되는 소정의 삽입에 대한 명칭 "이벤트"). 즉, 다수의 형질전환 기술 예컨대 아그로박테리움 (Agrobacterium) 형질전환, 바이올리스틱 (biolistic) 형질전환 (즉, 유전자 총), 및 탄화규소 매개 형질전환 (즉, 위스커스 (WHISKERS)™)로는, 게놈 내의 어느 곳에 트랜스진이 삽입될지가 예측불가능하다. 따라서, 삽입물의 양쪽 측면 상의 플랭킹된 식물 게놈 DNA를 확인하는 것이 소정의 삽입 이벤트가 있는 식물을 확인하는데 중요할 수 있다. 예를 들어, 삽입물과 숙주 게놈의 접합부 영역에 걸쳐 PCR 앰플리콘을 생성시키는 PCR 프라이머들을 디자인할 수 있다. 이러한 PCR 앰플리콘을 독특하거나 명료한 유형의 삽입 이벤트를 확인하는데 사용할 수 있다.
본 발명을 기술하는 것을 돕고 본 발명을 실행하도록 통상의 기술자에게 지침이 되기 위해 정의 및 예가 본원에서 제공된다. 달리 언급되지 않는 한, 용어들은 관련 분야의 통상의 기술자에 의한 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다. 37 CFR §1.822에 기재된 바와 같은 DNA 염기에 대한 명명법이 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "자손"은 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1을 포함하는 부모 식물의 임의 세대의 후손을 의미한다.
트랜스제닉 "이벤트"는 이종성 DNA, 즉 관심 트랜스진을 포함하는 핵산 구축물에 의한 식물 세포의 형질전환, 식물 게놈 내로의 트랜스진의 삽입으로부터 초래되는 식물 집단의 재생, 및 특정 게놈 위치 내로의 삽입을 특징으로 하는 특정 식물의 선별에 의해 생산된다. 용어 "이벤트"는 이러한 이종성 DNA를 포함하는 본래의 형질전환체 및 형질전환체의 자손을 지칭한다. 용어 "이벤트"는 이러한 게놈/트랜스진 DNA를 포함하는 또 다른 품종과 형질전환체 간의 유성 이종교배에 의해 생산된 자손을 또한 지칭한다. 반복친 (recurrent parent)으로의 반복된 역교배 후에도, 형질전환된 부모로부터의 삽입된 트랜스진 DNA 및 플랭킹 게놈 DNA (게놈/트랜스진 DNA)가 동일한 염색체 위치에서 교배 자손 내에 존재한다. 용어 "이벤트"는 삽입된 DNA를 포함하는 한 부모 계통 (예를 들어, 본래의 형질전환체 및 자가생식 (selfing)으로부터 초래된 자손)과 삽입된 DNA를 함유하지 않는 부모 계통의 유성 교배의 결과로서 관심 트랜스진을 포함하는 삽입된 DNA를 받는 자손으로 전달될 것으로 예상되는, 삽입된 DNA에 바로 인접하는 플랭킹 게놈 서열 및 삽입된 DNA를 포함하는 본래의 형질전환체 및 이의 자손으로부터의 DNA를 또한 지칭한다.
"접합부 서열" 또는 "경계 서열"은 게놈 내로 삽입된 DNA가 삽입 지점에 플랭킹된 대두 천연 게놈으로부터의 DNA에 연결되는 지점에 스패닝되고, 식물의 유전 물질 내의 한 접합부 또는 다른 접합부 서열의 확인 또는 검출은 이벤트의 특징이기에 충분하다. 본원에 기술된 대두 이벤트에서의 삽입물 및 유사한 길이의 플랭킹 DNA에 스패닝되는 DNA 서열이 포함된다. 이같은 특징적 서열의 구체적인 예가 본원에서 제공된다; 그러나, 삽입물의 접합부, 또는 게놈 서열 및 삽입물의 접합부에 중첩되는 기타 서열이 또한 특징적이고, 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명은 부분적으로 이같은 플랭킹 서열, 접합부 서열 및 삽입물 서열의 확인에 관한 것이다. 관련된 PCR 프라이머 및 앰플리콘이 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따라, 삽입된 DNA 및 이의 경계에 걸쳐 스패닝되는 앰플리콘을 사용하는 PCR 분석 방법이 본 발명의 독점 트랜스제닉 대두 계통으로부터 유래된 상업화된 트랜스제닉 대두 품종 또는 계통을 검출 또는 확인하는데 사용될 수 있다.
플랭킹/접합부 서열은 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 특징이다. 이들 서열을 기초로, 이벤트-특이적 프라이머가 생성되었다. 이러한 이벤트-특이적 프라이머 세트로 생성된 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 이러한 대두 계통들이 상이한 대두 유전자형들로 확인될 수 있다는 것이 PCR 분석에서 실연되었다. 따라서, 이러한 절차 및 기타 관련 절차를 사용하여 이러한 대두 계통을 독특하게 확인할 수 있다. 본원에서 확인된 서열들은 독특하다.
본 발명의 검출 기술은, 식물 육종과 관련하여, 관심 이벤트를 포함하는 부모 식물이 하나 이상의 추가적인 관심 형질을 자손 내에 부여하기 위한 시도로 또 다른 식물 계통과 교배된 후에 어떤 자손 식물이 소정의 이벤트를 포함하는지 여부를 결정하는데 특히 유용하다. 이러한 PCR 분석 방법은, 특히 상업화된 트랜스제닉 대두 종자에 대해, 대두 육종 프로그램, 뿐만 아니라 품질 제어에 이롭다. 이러한 트랜스제닉 대두 계통에 대한 PCR 검출 키트가 또한 이제 제조 및 사용될 수 있다. 이는 제품 등록 및 제품 책임관리에 또한 이로울 수 있다.
추가로, 플랭킹 대두/게놈 서열을 각각의 삽입물의 게놈 위치를 구체적으로 확인하는데 사용할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 각각의 이벤트에 대해 특이적인 분자 마커 시스템을 제조할 수 있다. 이는 가속 육종 전략에, 그리고 연관 데이터를 확립하는데 사용될 수 있다.
추가로, 플랭킹 서열 정보를 트랜스진 통합 프로세스, 게놈 통합 부위 특성, 이벤트 분류, 트랜스진 및 이의 플랭킹 서열의 안정성, 및 유전자 발현 (특히, 유전자 침묵, 트랜스진 메틸화 패턴, 위치 효과, 및 잠재적인 발현-관련 요소 예컨대 MARS [매트릭스 부착 영역] 등과 관련됨)을 연구 및 분석하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 모든 개시내용의 견지에서, 본 발명이 단락 <36>에서 확인되는 ATCC 기탁 번호 하에 입수가능한 종자를 포함한다는 것이 명백할 것이다. 단락 <36>에서 확인되는 ATCC 기탁 번호 하에 기탁된 종자로부터 성장한 제초제-내성 대두 식물을 또한 포함한다. 본 발명은 상기 식물의 일부, 예컨대, 잎, 조직 샘플, 상기 식물에 의해 생산된 종자, 꽃가루 등 (이들은 aad-12, pat 및 서열 15 외에 cry1F, cry1Ac, pat, 및 서열 1 및 서열 2를 포함함)을 추가로 포함한다.
추가로, 본 발명은 기탁된 종자로부터 성장한 식물의 후손 및/또는 자손 식물, 바람직하게는 제초제-저항성 대두 식물을 포함하고, 이때 상기 식물에는 본원에 기술된 바와 같은 검출가능한 야생형 접합부 서열을 포함하는 게놈이 있다. 본원에서 사용된 용어 "대두"는 글리신 맥스를 의미하고, 대두 식물과 육종될 수 있는 이의 모든 품종을 포함한다.
추가로 본 발명은 본 발명의 식물을 하나 이상의 부모로 사용하여 교배물을 제조하는 방법을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명은, 부모 중 한쪽이 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1을 포함하고 부모 중 다른 쪽이 pDAB4468.04.16.1을 포함하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는, 본원에 예시된 식물들 중 임의의 것이 부모 중 하나 또는 양쪽 부모인 F1 잡종 식물을 포함한다. 이같은 본 발명의 F1 잡종에 의해 생산된 종자가 본 발명에 또한 속한다. 본 발명은 예시된 식물을 상이한 (예를 들어, 근교배 (in-bred) 부모) 식물과 교배시키고, 생성된 잡종 종자를 수확함으로써 F1 잡종 종자를 생산하는 방법을 포함한다. 본 발명은 모친 또는 부친인 예시된 식물을 포함한다. 생성된 식물의 특성이 부모 식물들의 신중한 고려에 의해 개선될 수 있다.
먼저 본원에서 언급된 계통들 중 임의의 하나의 종자로부터 성장한 대두 식물로 구성되는 제1 부모 대두 식물과 제2 부모 대두 식물을 유성 교배시킴으로써 다수의 제1 자손 식물을 생산하는 단계; 그 후, 글리포시네이트 및/또는 2,4-D에 대해 저항성인 제1 자손 식물을 선별하는 단계; 제1 자손 식물을 자가생식시킴으로써 다수의 제2 자손 식물을 생산하는 단계; 그 후, 제2 자손 식물로부터 글리포시네이트 및/또는 2,4-D에 대해 저항성인 식물을 선별하는 단계에 의해 본 발명의 곤충 저항성/2,4-D-내성/글리포시네이트-내성 대두 식물이 육종될 수 있다. 이러한 단계들은 제1 자손 식물 또는 제2 자손 식물의 제2 부모 대두 식물 또는 제3 부모 대두 식물로의 역교배를 추가로 포함할 수 있다. 그 후, 본 발명의 대두 종자를 포함하는 대두 농작물, 또는 이의 자손을 재식할 수 있다.
독립적으로 분리되는 2개의 첨가된 외인성 유전자를 함유하는 후손을 생산하도록 2개의 상이한 트랜스제닉 식물이 또한 짝짓기될 수 있음을 또한 이해할 것이다. 적합한 자손의 자가생식으로 첨가된 양쪽 외인성 유전자에 대해 동종접합성인 식물이 생산될 수 있다. 부모 식물로의 역교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종-교배가 또한 구상되고, 무성 번식이 또한 구상된다. 상이한 형질 및 농작물에 통상적으로 사용되는 기타 육종 방법들이 당 업계에 공지되어 있다. 역교배 육종은 단순하게 유전되는 고도로 유전성인 형질에 대한 유전자를 반복친인 바람직한 동종 접합성 재배종 또는 근교배 계통 내로 전달하는데 사용되었다. 전달되는 형질의 공급원은 도너 (donor) 부모로 칭해진다. 생성된 식물은 반복친 (예를 들어, 재배종)의 속성 및 도너 부모로부터 전달된 원하는 형질을 지닐 것으로 예상된다. 초기 교배 후, 도너 부모의 표현형을 보유하는 개체를 선별하고, 반복적으로 반복친에 교배 (역교배)시킨다. 생성된 부모는 반복친 (예를 들어, 재배종)의 속성 및 도너 부모로부터 전달된 원하는 형질을 지닐 것으로 예상된다.
마찬가지로, 본 발명의 곤충 저항성/2,4 D-내성/글루포시네이트-내성 대두 식물은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 추가의 트랜스진으로 형질전환될 수 있다. 아그로박테리움 형질전환, 바이올리스틱 형질전환 (즉, 유전자 총), 및 탄화규소 매개 형질전환 (즉, 위스커스)과 같은 형질전환 기술을 사용하여 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 게놈에 추가의 트랜스진(들)을 도입할 수 있다. 새로 삽입된 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 식물의 선별 및 분석은 본 발명의 aad-12, cry1F, cry1Ac, pat 유전자 외에 신규 트랜스진의 안정한 구성요소를 함유하는 식물을 확인하도록 완료될 수 있다.
마커 보조 육종 (MAB) 방법에서 본 발명의 DNA 분자가 분자 마커로서 사용될 수 있다. 당 업계에 공지된 바와 같은, 유전적으로 연관된 농학적으로 유용한 형질들을 확인하는 방법 (예컨대, AFLP 마커, RFLP 마커, RAPD 마커, SNP, 및 SSR)에서 본 발명의 DNA 분자가 사용될 수 있다. MAB 방법을 사용하여 본 발명의 대두 식물과의 교배의 자손 (또는 이의 자손 및 임의의 기타 대두 재배종 또는 품종)에서 곤충-저항성 및 제초제-내성 형질을 추적할 수 있다. DNA 분자가 이러한 형질에 대한 마커이고, 당 업계에 주지되어 있는 MAB 방법을 사용하여 하나 이상의 본 발명의 대두 계통, 또는 이의 자손이 부모 또는 선조인 대두 식물에서 제초제-저항성 형질(들)을 추적할 수 있다. 본 발명의 이벤트가 있는 임의의 대두 품종을 확인하는데 본 발명의 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 본 발명의 식물로 육종하는 것을 포함하는 곤충 저항성/제초제-내성 대두 식물을 생산하는 방법을 포함한다. 더욱 구체적으로, 상기 방법은 2개의 본 발명의 식물, 또는 1개의 본 발명의 식물과 임의의 다른 식물을 교배시키는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 방법은 본 발명에 따라 검출가능한 이벤트 및 유리한 품종 성능 (예컨대, 수율)에 대해 자손을 분석함으로써 상기 교배의 자손을 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 다른 바람직한 형질, 예컨대 작물학적 형질, 질병 내성 또는 저항성, 선충 내성 또는 저항성 및 성숙기 (maturity date)를 포함하는 식물과의 육종 사이클 동안 본 발명의 이벤트를 추적하는데 본 발명이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이벤트 및 원하는 형질을 포함하는 식물을 검출하고, 확인하고, 선별하여, 추가적인 육종 라운드에서 신속하게 사용할 수 있다. 본 발명의 이벤트/형질이 또한 육종 동안 추가적인 곤충 저항성 형질(들) 및/또는 추가적인 제초제 내성 형질과 조합될 수 있고, 이와 함께 본 발명에 따라 추적될 수 있다. 후자의 실시양태는 제초제 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는 글리포세이트 내성 유전자와 조합된 본 발명의 이벤트를 포함하는 식물이다.
따라서, 본 발명이, 예를 들어, 글리포세이트 저항성 (예를 들어, 저항성 식물 또는 박테리아 EPSPS, GOX, GAT), 글루포시네이트 저항성 (예를 들어, pat, bar), 아세토락테이트 신테이스 (synthase) (ALS)-억제 제초제 저항성 (예를 들어, 이미다졸리논 [예컨대 이마제타피르], 술포닐우레아, 트리아졸로피리미딘 술폰아닐리드, 피리미디닐티오벤조에이트, 및 기타 화학물질 [Csr1, SurA 등]), 브로목시닐 저항성 (예를 들어, Bxn), HPPD (4-히드록시페닐-피루베이트-다이옥시저네이스 (dioxygenase)) 효소의 억제제에 대한 저항성, 파이토엔 디새튜레이스 (desaturase) (PDS)의 억제제에 대한 저항성, 광화학계 II 억제 제초제에 대한 저항성 (예를 들어, psbA), 광화학계 I 억제 제초제에 대한 저항성, 프로토포르피리노겐 옥시데이스 (oxidase) IX (PPO)-억제 제초제에 대한 저항성 (예를 들어, PPO-1), 페닐우레아 제초제에 대한 저항성 (예를 들어, CYP76B1), 다캄바-분해 효소 (예를 들어, US 20030135879 참조)을 코딩하는 추가의 형질과 조합될 수 있으며, 다른 것들은 단독으로 또는 다수의 조합으로 스태킹되어, 잡초 전환을 효과적으로 방제 또는 방해하는 능력 및/또는 상기 언급된 클래스의 임의의 제초제에 대한 저항성을 제공할 수 있다.
추가로, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1은 하나 이상의 추가의 입력 (예를 들어, 곤충 저항성, 병원체 저항성, 또는 스트레스 내성 등) 또는 출력 (예를 들어, 수율 증가, 오일 프로파일 개선, 섬유질 개선 등) 형질과 조합될 수 있다. 따라서, 본 발명을 이용하여 임의의 수의 농작물 해충을 유연하게 비용 효율적으로 방제하는 능력과 함께 개선된 농작물 품질의 완전한 작물학적 패키지를 제공할 수 있다.
상동 재조합을 통해 폴리뉴클레오티드 서열을 식물 세포의 특정 염색체 부위 내로 통합시키는 방법들이 당 업계에 개시되어 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2009/0111188 A1호에 기술된 바와 같은 부위 특이적 통합은 염색체 표적 내로의 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 도입을 매개하기 위한 재조합효소 (recombinase) 또는 통합효소 (integrase)의 사용을 기술한다. 또한, 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 제WO2008/021207호에는 하나 이상의 도너 폴리뉴클레오티드 서열을 게놈의 특정 위치 내로 통합시키기 위한 아연 손가락 매개-상동 재조합이 기술되어 있다. 재조합효소 예컨대 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제6720475호에 기술된 바와 같은 FLP/FRT 또는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5658772호에 기술된 바와 같은 CRE/LOX의 사용이 폴리뉴클레오티드 서열을 특정 염색체 부위 내로 통합시키는데 이용될 수 있다. 마지막으로, 도너 폴리뉴클레오티드를 특정 염색체 위치 내로 표적화하기 위한 메가뉴클리에이스 (meganuclease)의 용도가 문헌 [Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060]에서 기술되었다.
식물 세포 내에서의 부위 특이적 통합을 위한 기타 방법들이 일반적으로 공지되어 있고 이용가능하다 (문헌 [Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159]). 또한, 여러 원핵생물 및 저급 진핵생물에서 확인된 부위-특이적 재조합 시스템이 식물에서의 사용에 적용될 수 있다. 이같은 시스템의 예로는 효모 자이고사카로마이세스 로욱시이 (Zygosaccharomyces rouxii)의 pSR1 플라스미드로부터의 R/RS 재조합효소 시스템 (문헌 [Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203]), 및 파지 뮤 (Mu)의 Gin/gix 시스템 (문헌 [Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176])이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 신규 트랜스진(들)을 기존의 트랜스제닉 이벤트에 근접하게 통합시키거나 스태킹하는 것이 바람직할 수 있다. 독특한 특성 예컨대 단일 삽입 부위, 정상적인 멘델 분리 및 안정적인 발현, 및 여러 환경학적 위치에 걸친 작물학적 성능 및 제초제 내성이 포함되는 효능의 우수한 조합을 기초로 선택된 트랜스제닉 이벤트가 바람직한 게놈 유전자좌로 고려될 수 있다. 새롭게 통합된 트랜스진은 기존의 형질전환체의 트랜스진 발현 특성을 유지할 것이다. 또한, 새롭게 통합된 이벤트의 게놈 플랭킹 서열 및 염색체 위치가 이미 확인되어 있기 때문에 새롭게 통합된 이벤트의 검출 및 확인을 위한 검정법의 개발이 극복될 것이다. 마지막으로, 기존의 트랜스진에 연결된 특정 염색체 위치 내로의 새로운 트랜스진의 통합은 통상적인 육종 방법을 사용하는 유성 이종교배에 의한 다른 유전학적 배경 내로의 트랜스진들의 유전자이입을 촉진할 것이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열을 트랜스제닉 이벤트로부터 절제하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 가특허 출원 제61/297,628호에 기술된 바와 같은 트랜스진 절제는 염색체에 통합된 트랜스제닉 이벤트로부터 유전자 발현 카세트로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열을 제거하기 위한 아연 핑거 뉴클리에이스 (nuclease)의 사용을 기술한다. 제거되는 폴리뉴클레오티드 서열은 선별성 마커일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 절제 및 제거 시, 변형된 트랜스제닉 이벤트가 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입에 의해 재표적화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 절제 및 변형된 트랜스제닉 이벤트의 이어지는 재표적화는 선별성 마커의 재사용 또는 특정 유전자의 발현으로부터 초래되는 식물 트랜스크립톰 (transcriptome)에 대한 의도하지 않은 변화를 극복하는 능력과 같은 장점을 제공한다.
본 발명은 이종성 핵산의 삽입용으로 우수한 대두 게놈 내의 염색체 02 상의 특정 부위를 본원에서 개시한다. 따라서, 본 발명은 관심이 있는 이종성 핵산을 이러한 미리 확립된 표적 부위 내로 또는 이러한 표적 부위에 근접하게 도입하는 방법을 제공한다. 본 발명은 개시된 표적 부위에 또는 이같은 부위에 일반적으로 근접하게 삽입된 임의의 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 대두 종자 및/또는 대두 식물을 또한 포함한다. 이같은 표적화된 통합을 달성하기 위한 한 선택권은 본원에 예시된 pat 발현 카세트를 절제하고/하거나 이러한 카세트 대신에 상이한 삽입물로 치환하는 것이다. 일반적으로 이와 관련하여, 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 표적화된 상동 재조합이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유전자, 이벤트 또는 형질 "스태킹"은 원하는 형질을 하나의 트랜스제닉 계통 내로 조합하는 것이다. 식물 육종자들은 원하는 형질을 각각 지니는 부모들을 교배시킨 후 이러한 원하는 형질들 양쪽 모두를 지니는 후손을 확인함으로써 트랜스제닉 형질들을 스태킹시킨다. 유전자들을 스태킹시키는 또 다른 방식은 2개 이상의 유전자를 형질전환 동안 동시에 식물의 세포핵 내로 전달하는 것에 의한 것이다. 유전자들을 스태킹시키는 또 다른 방식은 트랜스제닉 식물을 또 다른 관심 유전자로 재형질전환시키는 것에 의한 것이다. 예를 들어, 2개 이상의 상이한 곤충 형질, 곤충 저항성 형질(들) 및 질병 저항성 형질(들), 2개 이상의 제초제 저항성 형질, 및/또는 곤충 저항성 형질(들) 및 제초제 저항성 형질(들)이 예를 들어 포함되는 2개 이상의 상이한 형질을 조합하는데 유전자 스태킹이 사용될 수 있다. 관심 유전자에 더하여 선별성 마커를 사용하는 것이 또한 유전자 스태킹으로 간주될 수 있다.
"상동 재조합"은 새로운 재조합 DNA 서열을 형성하도록 2개의 뉴클레오티드 서열이 이를 통하여 상호작용할 수 있는 (재조합될 수 있는), 유사한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 상응하는 부위들이 있는 임의의 뉴클레오티드 서열 쌍 간의 반응을 지칭한다. 유사한 뉴클레오티드 서열의 부위들은 각각 본원에서 "상동성 서열"로 지칭된다. 일반적으로, 상동성 서열의 길이가 증가함에 따라 상동 재조합의 빈도가 증가한다. 따라서, 동일하다고는 할 수 없는 2개의 뉴클레오티드 서열 간에 상동 재조합이 발생할 수 있지만, 2개의 서열 간의 차이가 증가함에 따라 재조합 빈도 (또는 효율)가 감소한다. 도너 및 표적 분자 각각 상의 1개의 상동성 서열을 사용하여 재조합이 달성될 수 있고, 이에 의해 "단일 교차" 재조합 생성물이 생성된다. 별법적으로, 2개의 상동성 서열이 표적 및 도너 뉴클레오티드 서열 각각 상에 놓일 수 있다. 도너 상의 2개의 상동성 서열과 표적 상의 2개의 상동성 서열 간의 재조합으로 "이중 교차" 재조합 생성물이 생성된다. 도너 분자 상의 상동성 서열들이 조작하려는 서열 (예를 들어, 관심 서열)에 플랭킹되면, 표적 분자와의 이중 교차 재조합은 표적 분자 상의 상동성 서열들 사이에 원래 있었던 DNA 서열을 관심 서열이 교체한 재조합 생성물을 초래할 것이다. 이중 교차 재조합 이벤트를 통한 표적과 도너 간의 DNA 서열 교환은 "서열 교체"로 명명된다.
본 발명의 바람직한 식물 또는 종자는 본원에서 확인된 활성 (operative) aad-12, cry1F v3, cry1Ac synpro 및 pat v6 뉴클레오티드 서열을, 본원에서 확인된 삽입물 양측의 적어도 20 내지 500개 이상의 연속 플랭킹 뉴클레오티드와 함께 게놈에 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 플랭킹 서열에 대한 언급은 서열 1, 2 및 15에 관련해 확인된 것들을 지칭한다. 상기 플랭킹 서열의 전부 또는 일부는 이벤트를 포함하는 부모 계통의 삽입물의 유성 교배의 결과로 삽입된 DNA를 수용하는 자손에게로 전달된다고 예상할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양물을 포함한다. 이같은 조직 배양물로부터 재생된 식물이, 특히 상기 식물이 예시된 품종의 모든 형태학적 및 생리학적 성질을 나타낼 수 있는 경우에, 또한 포함된다. 바람직한 본 발명의 식물은 기탁된 종자로부터 성장한 식물의 모든 생리학적 및 형태학적 특성을 지닌다. 본 발명은 관심 대상인 품질 형질을 보유하는 이같은 종자 및 종자의 자손을 추가로 포함한다.
본원에서 사용된 "계통"은 하나 이상의 형질에 대해 개체들 간에 유전적 변이를 거의 나타내지 않거나 나타내지 않는 일군의 식물이다. 이같은 계통은 여러 세대의 자가-수분 및 선별, 또는 조직 또는 세포 배양 기술을 사용한 편친 (single parent)으로부터의 무성 번식에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "재배종" 및 "품종"은 동의어이고, 상업적인 생산에 사용되는 계통을 지칭한다.
"안정성" 또는 "안정적"은 소정의 성분과 관련하여, 이러한 성분이 세대에서 세대로, 바람직하게는 3대 이상 동안 유지되는 것을 의미한다.
"상업적 유용성"은 양호한 식물 활력 및 높은 번식력이 있어서, 통상적인 농업 설비를 사용하여 농부가 농작물을 생산할 수 있고, 기술된 성분들이 있는 오일이 통상적인 분쇄 및 추출 설비를 사용하여 종자로부터 추출될 수 있는 것으로 정의된다.
"작물학적으로 우량한 (elite)"은 계통이, 본 발명의 이벤트(들)에 기인하는 곤충 저항성 및 제초제 내성에 더하여, 바람직한 작물학적 특성 예컨대 수율, 성숙기, 질병 저항성 등을 지니는 것을 의미한다. 임의의 및 모든 이러한 작물학적 특성 및 데이터 포인트가 포인트로서, 또는 이같은 식물을 정의하는데 사용되는 특성 범위의 어느 한 말단 또는 양 말단에서, 이같은 식물을 확인하는데 사용될 수 있다.
통상의 기술자가 본 개시내용의 견지에서 인지할 바와 같이, 검출 키트의 바람직한 실시양태는, 예를 들어, "접합부 서열" 또는 "전이 서열" (대두 게놈 플랭킹 서열이 삽입물 서열과 만나는 곳)에 대해 지시되고/되거나 이를 포함하는 프로브 및/또는 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이는 상기 표에서 지시된 바와 같은 접합부 서열 (삽입물이 플랭킹 서열을 만나는 곳) 중 하나 또는 양쪽을 확인하도록 디자인된 폴리뉴클레오티드 프로브, 프라이머 및/또는 앰플리콘을 포함한다. 한 통상적인 디자인은 플랭킹 영역에서 혼성화하는 1개의 프라이머, 및 삽입물에서 혼성화하는 1개의 프라이머가 있는 것이다. 종종 이같은 프라이머들은 각각 잔기 약 15개 이상의 길이이다. 이러한 배열 내에서, 프라이머들이 본 발명의 이벤트의 존재를 지시하는 검출가능한 앰플리콘을 생성/증폭시키는데 사용될 수 있다. 상기 지시된 바와 같은 접합부 서열에 스패닝되는 (그리고 이를 포함하는) 앰플리콘을 생성시키는데 이러한 프라이머들이 사용될 수 있다.
플랭킹 서열에 "터치다운"한 프라이머(들)은, 전형적으로, 염기 약 1200개를 넘어서 또는 접합부를 넘어서 혼성화하도록 디자인되지 않는다. 따라서, 전형적인 플랭킹 프라이머는 삽입물 시작부로부터 플랭킹 서열 내로의 염기 1200개 이내의 어느 한 쪽 가닥의 15개 이상의 잔기를 포함하도록 디자인될 것이다. 즉, 서열 1의 염기쌍 800 내지 1400 및/또는 서열 2의 염기쌍 153 내지 753 및/또는 서열 15의 염기쌍 2130 내지 2730 및/또는 서열 15의 염기쌍 9122 내지 9722로부터의 (또는 그에 혼성화하는) 적합한 크기의 서열을 포함하는 프라이머가 본 발명의 범주 내에 속한다. 삽입물 프라이머가 서열 3의 삽입물 상의 임의의 장소 또는 서열 15의 염기쌍 2731 내지 9121 사이의 임의의 장소에서 유사하게 디자인될 수 있고, 예를 들어, 이같은 프라이머 디자인에 비-배타적으로 사용될 수 있다.
통상의 기술자는 프라이머 및 프로브가 광범위한 표준 혼성화 및/또는 PCR 조건 하에 혼성화하도록 디자인될 수 있고, 이때 프라이머 또는 프로브가 예시된 서열에 대해 완벽하게 상보적이지 않다는 것을 또한 인지할 것이다. 즉, 어느 정도의 미스매치 (mismatch)가 허용될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 약 20개의 프라이머에 대해, 앰플리콘을 마주 보는 프라이머의 내부 또는 끝부분에 미스매치 염기가 있는 경우 전형적으로 1개 또는 2개 정도의 뉴클레오티드가 반대 가닥과 결합할 필요가 없다. 다양한 적합한 혼성화 조건이 하기에서 제공된다. 합성 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 이노신이 또한 프로브에서 사용될 수 있다. DNA 및 RNA 프로브뿐만 아니라, 펩티드 핵산 (PNA) 프로브가 또한 사용될 수 있다. 중요한 것은 이같은 프로브 및 프라이머가 본 발명의 이벤트의 존재의 특징이다 (이를 독특하게 확인 및 구별할 수 있다)는 것이다.
PCR 증폭에서의 오류가 발생할 수 있고, 이는 예를 들어 미미한 시퀀싱 오류를 초래할 수 있다는 것을 주지할 것이다. 즉, 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 열거된 서열은 대두 게놈 DNA로부터 긴 앰플리콘을 생성시킨 후 이러한 앰플리콘을 클로닝하고 시퀀싱함으로써 결정되었다. 게놈 DNA로부터 시퀀싱을 위한 충분한 앰플리콘을 생성시키기 위해 필요한 다수의 증폭 라운드를 고려하여, 이러한 방식으로 생성 및 결정된 서열들에서 약간의 차이 및 미미한 불일치를 발견하는 것은 드물지 않다. 통상의 기술자는 이러한 유형의 통상적인 시퀀싱 오류 또는 불일치로 인해 필요한 임의의 보정이 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 인지할 것이고 이에 주의할 것이다.
일부 게놈 서열이, 예를 들어, 서열이 이벤트 생성 동안 삽입될 때, 결실되는 것이 드물지 않다는 것을 또한 주지할 것이다. 따라서, 예를 들어, 진뱅크 (GENBANK)에 열거된 게놈 서열과 본 발명의 플랭킹 서열 간에 약간의 차이가 또한 나타날 수 있다.
DNA 서열 "삽입물"의 성분들이 도면에서 도해되고, 하기 실시예에서 더욱 상세하게 논의된다. 이러한 성분들의 DNA 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 절편이 본 발명의 방법에서 DNA 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 대두 식물로부터, 식물 및 종자 등 내의 트랜스진/게놈 삽입 영역의 존재를 검출하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본원에서 제공된 본 발명의 5' 트랜스진/게놈 삽입 영역 접합부 서열 (서열 1 및 서열 3의 염기쌍 800 내지 1400), 그의 절편, 및 예시된 서열의 상보물 및 그의 임의의 절편을 포함하는 DNA 서열이 제공된다. 본원에서 제공된 본 발명의 3' 트랜스진/게놈 삽입 영역 접합부 서열 (서열 2 및 서열 3의 염기쌍 153 내지 753), 그의 절편, 및 예시된 서열의 상보물 및 그의 임의의 절편을 포함하는 DNA 서열이 제공된다. 본원에서 제공된 본 발명의 3' 트랜스진/게놈 삽입 영역 접합부 서열 (서열 15의 염기쌍 1 내지 2730 및 서열 15의 2731 내지 9121), 그의 절편, 및 예시된 서열의 상보물 및 그의 임의의 절편을 포함하는 DNA 서열이 제공된다. 본원에서 제공된 본 발명의 3' 트랜스진/게놈 삽입 영역 접합부 서열 (서열 15의 염기쌍 9122 내지 10,198 및 서열 15의 2731 내지 9121), 그의 절편, 및 예시된 서열의 상보물 및 그의 임의의 절편을 포함하는 DNA 서열이 제공된다. 삽입 영역 접합부 서열은 게놈 내로 삽입된 이종성 DNA와 삽입 부위에 플랭킹된 대두 세포로부터의 DNA 사이의 접합부에 스패닝된다. 이같은 서열은 주어진 이벤트의 특징일 수 있다.
삽입물 및 경계 서열을 기초로, 이벤트-특이적 프라이머가 생성될 수 있다. 이러한 이벤트-특이적 프라이머 세트로 생성된 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 본 발명의 대두 계통들이 상이한 대두 유전자형들에서 확인될 수 있다는 것이 PCR 분석에서 입증되었다. 이러한 절차 및 기타 관련 절차를 사용하여 이러한 대두 계통을 독특하게 확인할 수 있다. 따라서, 이같은 프라이머 쌍으로부터 유래된 PCR 앰플리콘이 독특하고, 이러한 대두 계통을 확인하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 신규 트랜스진/게놈 삽입 영역의 연속적인 절편을 포함하는 DNA 서열이 본 발명의 측면이다. 트랜스진 삽입물 서열의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드 및 상기 언급된 3종의 대두 식물들 중 하나 이상으로부터의 대두 게놈 서열의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열, 및/또는 이러한 대두 식물들 중 하나 이상에서 특징적인 앰플리콘 생성물의 생산을 위한 프라이머 서열로서 유용한 서열이 포함된다.
관련된 실시양태는 본원에서 확인된 DNA 서열 (예컨대 서열 1 및 그의 절편)의 트랜스진 부분의 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 개 또는 이를 초과하는 개수의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열 또는 이의 상보물 및 이들 서열들로부터의 유사한 길이의 플랭킹 대두 DNA 서열 또는 이의 상보물에 관한 것이다. DNA 증폭 방법에서 이러한 서열은 DNA 프라이머로서 유용하다. 이들 프라이머를 사용하여 생산된 앰플리콘은 본원에서 언급된 임의의 대두 이벤트의 특징이다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 DNA 프라이머 및 상동성 프라이머에 의해 생산된 앰플리콘을 포함한다.
본 발명은 또한 샘플 내의 본원에서 언급된 대두 이벤트에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을, 이들 대두 이벤트 중 하나 이상으로부터의 DNA와 핵산 증폭 반응에 사용되는 경우 상기 이벤트(들)에서 특징적인 앰플리콘을 생산하는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; (b) 핵산 증폭 반응을 수행하고, 이로써 앰플리콘을 생산하는 단계; 및 (c) 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가적인 검출 방법은, (a) DNA를 포함하는 샘플을 엄격한 혼성화 조건 하에 상기 대두 이벤트 중 하나 이상으로부터의 DNA와 혼성화하고, 엄격한 혼성화 조건 하에 대조군 대두 식물 (비-관심 이벤트 DNA)과 혼성화하지 않는 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용하는 단계; 및 (c) DNA에 대한 프로브의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 상기 이벤트에 상응하는 DNA의 존재의 검출 방법을 포함한다.
또한 추가의 실시양태에서, 본 발명은 (a) 제1 부모 대두 계통 (글루포시네이트 내성을 상기 계통의 식물에 부여하는 본 발명의 발현 카세트를 포함) 및 제2 부모 대두 계통 (상기 제초제 내성 형질이 없음)을 유성 교배시켜, 다수의 자손 식물을 생산하는 단계; 및 (b) 분자 마커를 사용하여 자손 식물을 선별하는 단계를 포함하는, 본 발명의 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1을 포함하는 대두 식물의 생산 방법을 포함한다. 이러한 방법은 자손 식물을 제2 부모 대두 계통에 역교배시켜 곤충 저항성, 2,4-D, 및 글리포시네이트 내성 형질을 포함하는 순계 (true-breeding) 대두 식물을 생산하는 추가의 단계를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 이벤트와의 교배의 자손의 접합성을 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대두 DNA를 포함하는 샘플을 본 발명의 프라이머 세트와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 프라이머는, 상기 대두 이벤트 중 하나 이상으로부터의 게놈 DNA와 핵산 증폭 반응에 사용되는 경우, 상기 대두 이벤트 중 하나 이상에서 특징적인 제1 앰플리콘을 생산한다. 이러한 방법은, 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 제1 앰플리콘을 생산하는 단계; 제1 앰플리콘을 검출하는 단계; 및 대두 DNA를 포함하는 샘플을 제2 프라이머 세트와 접촉시키는 단계 (상기 제2 프라미어 세트는 대두 식물로부터의 게놈 DNA와 핵산 증폭 반응에서 사용되는 경우 대두 게놈 영역에 상동성인 천연 대두 게놈 DNA를 포함하는 제2 앰플리콘을 생산함); 및 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 제2 앰플리콘을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 방법은 제2 앰플리콘을 검출하는 단계 및 샘플 내의 제1 및 제2 앰플리콘을 비교하고, 이때 양쪽 앰플리콘의 존재는 샘플이 트랜스진 삽입에 대해 이종접합성이라는 것을 가리키는 단계를 추가로 포함한다.
본원에서 개시된 조성물 및 DNA 검출 분야에 주지된 방법을 사용하여 DNA 검출 키트가 개발될 수 있다. 키트는 샘플 내의 본 발명의 대두 이벤트 DNA의 확인에 유용하고, 이러한 DNA를 함유하는 대두 식물을 육종하는 방법에 적용될 수 있다. 키트는 예컨대 본원에 개시된 앰플리콘에 상동적이거나 상보적인 DNA 서열 또는 본 발명의 이벤트의 트랜스진 유전 요소 내에 함유된 DNA에 상동성이거나 상보적인 DNA 서열을 함유한다. 이들 DNA 서열은 DNA 증폭 반응에서 또는 DNA 혼성화 방법에서 프로브로서 사용될 수 있다. 키트는 또한 검출 방법의 수행에 필요한 시약 및 물질을 함유할 수 있다.
"프로브"는 통상적인 검출가능한 표지 또는 리포터 분자 (예컨대 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제 또는 효소)에 부착된 단리된 핵산 분자이다. 이러한 프로브는 표적 핵산 스트랜드에 상보적이고, 본 발명의 경우에는, 대두 식물로부터 유래되거나 또는 이벤트로부터의 DNA를 포함하는 샘플로부터 유래되는 상기 대두 이벤트 중 하나로부터의 게놈 DNA 스트랜드에 상보적이다. 본 발명에 따른 프로브는 디옥시리보핵산 또는 리보핵산 뿐만 아니라, 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하고 그 표적 DNA 서열의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 폴리아미드 및 기타 프로브 물질을 포함한다.
"프라이머"는 상보적인 표적 DNA 스트랜드에 핵산 혼성화에 의해 어닐링하여 프라이머와 표적 DNA 스트랜드 간에 잡종을 형성하고, 이어서 중합효소, 예를 들어 DNA 중합효소에 의해 표적 DNA 스트랜드를 따라 연장되는 단리된/합성된 핵산이다. 본 발명의 프라이머 쌍은, 표적 핵산 서열의 증폭, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 기타 통상적인 핵산 증폭 방법에 대한 그들의 사용을 지칭한다.
프로브 및 프라이머는 일반적으로 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 또는 1000, 또는 2000, 또는 5000 개 또는 이를 초과하는 개수의 폴리뉴클레오티드의 길이이다. 이러한 프로브 및 프라이머는 고-엄격성 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열과의 완전한 서열 유사성을 가지지만, 표적 서열과 상이하고 표적 서열에 혼성화하는 능력을 유지하는 프로브가 통상적 방법에 의해 설계될 수도 있다.
프로브 및 프라이머의 제조 및 사용 방법이, 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기술되어 있다. PCR-프라이머 쌍이, 예를 들어 그러한 목적으로 의도된 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 공지된 서열로부터 유래될 수 있다.
본원에서 개시된 플랭킹 DNA 및 삽입 서열에 기초한 프라이머 및 프로브가 통상적인 방법, 예를 들어 이러한 서열의 재클로닝 및 시퀀싱에 의해 개시된 서열을 확인하는데 (그리고, 필요하다면 수정하는데) 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산 프로브 및 프라이머는 엄격한 조건 하에 표적 DNA 서열에 혼성화한다. 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법이 샘플 내의 트랜스진 이벤트로부터 DNA의 존재를 확인하는데 사용될 수 있다. 핵산 분자 또는 이의 절편은 특정 환경 하에 다른 핵산 분자에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 두 개의 핵산 분자가 역-평행, 이중 스트랜드 핵산 구조를 형성할 수 있으면, 두 개의 핵산 분자는 서로간에 특이적으로 혼성화할 수 있는 것으로 언급된다. 핵산 분자는, 그들이 완전한 상보성을 나타낸다면, 또 다른 핵산 분자의 "상보물"인 것으로 언급된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 분자들 중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 것의 뉴클레오티드에 상보적인 경우, 분자들은 "완전한 상보성"을 나타내는 것으로 언급된다. 두 개의 분자는, 그들이 적어도 통상적인 "저-엄격성" 조건 하에서 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 허용하는 충분한 안정성으로 서로 간에 혼성화할 수 있다면, "최소로 상보적"인 것으로 언급된다. 유사하게, 분자들은, 그들이 통상적인 "고-엄격성" 조건 하에서 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 허용하는 충분한 안정성으로 서로 간에 혼성화할 수 있다면, "상보적"인 것으로 언급된다. 통상적인 엄격성 조건은 문헌[Sambrook et al., 1989]에 기술되어 있다. 따라서 완전한 상보성으로부터 벗어나는 것은 이러한 벗어남이 분자가 이중 스트랜드 구조를 형성하는 능력을 완전히 방해하지 않는 한 허용된다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로서의 역할을 하기 위해, 사용된 특정 용매 및 염 농도 하에서 안정적인 이중 스트랜드 구조를 형성할 수 있도록 서열 면에서 충분하게 상보적인 것만이 필요하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 실질적으로 상동성인 서열은, 고-엄격성 조건 하에서 비교되는, 핵산 서열의 상보물에 특이적으로 혼성화할 핵산 서열이다. 용어 "엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., 1989]의 9.52-9.55에 논의된 특이적 혼성화 절차에 의해 표적 핵산 (즉, 관심이 있는 특정 핵산 서열)에 대한 핵산 프로브의 혼성화와 관련하여 기능적으로 정의된다. 문헌 [Sambrook et al., 1989]의 9.47-9.52 및 9.56-9.58을 또한 참조한다. 따라서, DNA 절편의 상보적인 신장물과 선택적으로 이중 분자를 형성하는 능력에 대해 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다.
구상되는 용도에 따라, 표적 서열을 향한 프로브의 다양한 선택도를 달성하기 위해 다양한 혼성화 조건을 사용할 수 있다. 높은 선택도를 필요로 하는 용도에 대해, 잡종을 형성하기 위해 비교적 엄격한 조건이 통상 선택될 것이고, 예를 들어, 비교적 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건, 예컨대 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02 M 내지 약 0.15 M NaCl이 선택될 것이다. 엄격한 조건은, 예를 들어 혼성화 필터를 고-엄격성 세정 완충제 (0.2X SSC, 0.1％ SDS, 65℃)로 2 회 이상 세정하는 것을 수반할 수 있다. DNA 혼성화를 촉진하는 적합한 엄격성 조건, 예를 들어 약 45℃에서 6.0X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)에 이어서 50℃에서 2.0X SSC로의 세정이 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 세정 단계에서의 염 농도는 50℃에서 약 2.0X SSC의 저-엄격성 내지 50℃에서 약 0.2X SSC의 고-엄격성으로 선택될 수 있다. 또한, 세정 단계에서의 온도가 실온, 약 22℃의 저-엄격성 조건에서 약 65℃의 고-엄격성 조건으로 증가될 수 있다. 온도 및 염 농도 모두가 변할 수 있거나, 다른 변수는 변화시키면서 온도 또는 염 농도 중 하나가 일정하게 유지될 수 있다. 이러한 선택적 조건은 프로브와 주형 또는 표적 스트랜드 사이의 불일치 (존재하는 경우)를 거의 허용하지 않는다. 혼성화를 통한 DNA 서열의 검출은 통상의 기술자에게 주지되어 있고, 미국 특허 제 4,965,188호 및 제 5,176,995호의 교시는 혼성화 분석 방법을 예시한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 고-엄격성 조건 하에서, 본원에서 예시되거나 제안된 프라이머 (또는 앰플리콘 또는 기타 서열), 이의 상보물 및 절편 중 하나 이상에 특이적으로 혼성화할 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 예시된 서열 중 하나에서 본원에서 제시된 핵산 서열 또는 이의 상보물 및/또는 절편을 가진다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 이러한 핵산 서열과 80％ 내지 100％ 또는 90％ 내지 100％ 서열 동일성을 공유한다. 본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 이러한 서열과 95％ 내지 100％ 서열 동일성을 공유한다. 이러한 서열은 유전 교차의 자손을 확인하기 위해 식물 육종 방법에서 마커로서 사용될 수 있다. 표적 DNA 분자에 대한 프로브의 혼성화는 통상의 기술자에게 공지된 다수의 방법에 의해 검출될 수 있고, 이들은 비제한적으로, 형광 태그, 방사성 태그, 항체 기반 태그 및 화학발광 태그를 포함할 수 있다.
특정 증폭 프라이머 쌍을 사용하는 표적 핵산 서열의 (예를 들어, PCR에 의한) 증폭에 관련하여, "엄격한 조건"은 프라이머 쌍이, 상응하는 야생형 서열 (또는 이의 상보물)을 가진 프라이머가 결합할 표적 핵산 서열에만 혼성화하게 하여, 바람직하게는 독특한 증폭 생성물인 앰플리콘을 생산하게 하는 조건이다.
용어 " (표적 서열)에 대해 특이적인"은 엄격한 혼성화 조건 하에서 프로브 또는 프라이머가 표적 서열을 포함하는 샘플 내의 표적 서열에만 오직 혼성화하는 것을 가리킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, "증폭된 DNA" 또는 "앰플리콘"은 핵산 주형의 일부인 표적 핵산 서열의 핵산 증폭 생성물을 지칭한다. 예를 들어, 유성 교배로부터 생성된 대두 식물이 본 발명의 대두 식물로부터의 트랜스진 이벤트 게놈 DNA를 함유하는지를 결정하기 위해, 이벤트 DNA의 존재에서 특징적인 앰플리콘을 생산하도록, 대두 식물 조직 샘플로부터 추출된 DNA를, 삽입된 이종성 DNA의 삽입 부위에 인접한 식물의 게놈 내의 플랭킹 서열로부터 유래된 프라이머 및 삽입된 이종성 DNA로부터 유래한 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 핵산 증폭 방법에 적용할 수 있다. 앰플리콘은 또한 이벤트에서 특징적인 길이 및 서열을 가진다. 앰플리콘은 프라이머 쌍 + 1 개의 뉴클레오티드 염기 쌍의 결합 길이 및/또는 프라이머 쌍 + 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, or 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 개 또는 이를 초과하는 개수의 뉴클레오티드 염기 쌍 (±임의의 상기 열거된 증분)의 결합 길이의 범위에 있을 수 있다. 다르게는, 프라이머 쌍은 삽입된 DNA의 양쪽 측면 상의 플랭킹 서열로부터 유래되어, 전체 삽입 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앰플리콘이 생산될 수 있다. 식물 게놈 서열로부터 유래된 프라이머 쌍의 구성원은 삽입 DNA 서열로부터 거리를 두고 위치할 수 있다. 이러한 거리는 1 개의 뉴클레오티드 염기 쌍 내지 약 20000 개의 뉴클레오티드 염기 쌍 범위일 수 있다. 용어 "앰플리콘"의 사용은 DNA 열 증폭 반응에서 형성될 수 있는 프라이머 이량체를 명확하게 배제한다.
핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 포함하여, 당 업계에 공지된 다양한 핵산 증폭 방법의 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 다양한 증폭 방법이 당 업계에 공지되어 있고, 특히, 미국 특허 제 4,683,195호 및 제 4,683,202호에 기술되어 있다. 최대 22 kb의 게놈 DNA를 증폭하도록 PCR 증폭 방법이 개발되어 왔다. 이들 방법 뿐만 아니라 DNA 증폭 분야에 공지된 기타 방법이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 본 발명의 대두 이벤트로부터의 이종성 트랜스진 DNA 삽입물의 서열 또는 플랭킹 게놈 서열은, 본원에서 제공된 서열로부터 유래된 프라이머를 사용하여 이벤트로부터 이러한 서열을 증폭시키고 이어서 PCR 앰플리콘 또는 클로닝된 DNA의 표준 DNA 시퀀싱하여 확인될 수 있다 (그리고 필요하다면 수정될 수 있다).
이들 방법에 의해 생산된 앰플리콘은 다수의 기술에 의해 검출할 수 있다. 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드로에 의한 염색은 통상적인 주지된 DNA 앰플리콘 검출 방법이다. 또 다른 이러한 방법은, DNA 올리고뉴클레오티드가 인접한 플랭킹 게놈 DNA 서열 및 삽입된 DNA 서열 모두에 중첩되도록 디자인되는 제네틱 비트 분석 (Genetic Bit Analysis)이다. 올리고뉴클레오티드는 마이크로웰 플레이트의 웰에 고정된다. 관심 영역의 PCR 후 (삽입된 서열에서 1 개의 프라이머 및 인접한 플랭킹 게놈 서열에서 1 개를 사용하여), 단일 스트랜드 PCR 생성물이 고정된 올리고뉴클레오티드에 혼성화되고, DNA 중합효소 및 예상되는 다음 염기에 대해 특이적인 표지된 ddNTP를 사용한 단일 염기 연장 반응에 대한 주형으로서 역할을 할 수 있다. 판독은 형광 또는 ELISA-기반일 수 있다. 신호는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 염기 연장에 의한 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 가리킨다.
또 다른 방법은 문헌 [Winge, Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000]에 기술된 바와 같은 파이로시퀀싱 (Pyrosequencing) 기술이다. 상기 방법에서 올리고뉴클레오티드가 인접한 게놈 DNA와 삽입물 DNA 접합부에 중첩되도록 설계된다. 올리고뉴클레오티드는 관심 영역의 단일 스트랜드 PCR 생성물 (삽입된 서열에서의 1 개의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서의 1 개)에 혼성화되고, DNA 중합효소, ATP, 술푸릴라아제, 루시페라아제, 아피라아제, 아데노신 5' 포스포술페이트 및 루시페린의 존재 중에 인큐베이션된다. DNTP는 개별적으로 첨가되고, 그 혼입은 측정되는 광 신호를 초래한다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 또는 다중-염기 연장에 의한 트랜스진 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 가리킨다.
형광 편광은 본 발명의 앰플리콘을 검출하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법이다. 상기 방법을 따라서, 올리고뉴클레오티드는 게놈 플랭킹 및 삽입된 DNA 접합부에 중첩되도록 설계된다. 올리고뉴클레오티드는 관심 영역으로부터의 단일 스트랜드 PCR 생성물 (삽입된 DNA에서 1 개의 프라이머 및 플랭킹 게놈 DNA 서열에서 1 개)에 혼성화되고, DNA 중합효소 및 형광-표지 ddNTP의 존재 중에 혼입된다. 단일 염기 연장은 ddNTP의 혼입을 초래한다. 혼입은 형광계를 사용하여 편광에서의 변화로서 측정될 수 있다. 편광에서의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 염기 연장에 의한 트랜스진 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 가리킨다.
TAQMAN® (PE 어플라이드 바이오시스템즈 (PE Applied Biosystems), 포스터 시티, 캘리포니아)은 DNA 서열의 존재를 검출 및 정량하는 방법이다. 간략하면, FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 게놈 플랭킹 및 삽입물 DNA 접합부에 중첩되도록 설계된다. FRET 프로프와 PCR 프라이머 (삽입물 DNA 서열에서 1 개의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서 1 개)는 열안정적인 중합효소 및 dNTP의 존재 중에 사이클링된다. 특이적인 증폭 동안, Taq DNA 중합효소는 FRET 프로브 상의 켄칭 잔기로부터 형광 잔기를 제거하고 방출시킨다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 의한 플랭킹/트랜스진 삽입물 서열의 존재를 가리킨다.
서열 검출에서 사용하는 분자 비콘 (Molecular Beacon)이 기술되었다. 간략하면, FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 플랭킹 게놈 및 삽입물 DNA 접합부에 중첩되도록 설계된다. FRET 프로브의 독특한 구조는 형광 잔기와 켄칭 잔기를 근접하게 유지시키는 2차 구조를 함유하는 것을 초래한다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입물 DNA 서열 내에 1 개의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서 1 개)가 열안정적 중합효소 및 dNTP의 존재 중에 사이클링된다. 성공적인 PCR 중폭에 이어서, 표적 서열에 대한 FRET 프로브의 혼성화는 프로브 2차 구조의 제거 및 형광 잔기와 켄칭 잔기의 공간적 분리를 초래한다. 형광 신호가 초래된다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 의한 플랭킹 게놈/트랜스진 삽입물 서열의 존재를 가리킨다.
삽입에 우수한 대두 게놈 내의 위치가 개시되었고, 본 발명은 또한 상기 게놈 위치에 일반적인 근접부에 하나 이상의 비-대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 삽입물을 포함하는 대두 종자 및/또는 대두 식물을 포함한다. 하나의 선택은 본원에서 예시된 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1로부터의 것 대신에 상이한 삽입물로 치환하는 것이다. 일반적으로 이와 관련하여, 예를 들어 표적화된 상동 재조합이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 상기 유형의 기술은 예를 들어, WO 03/080809 A2 및 상응하는 미국 출원 공보 (미국 20030232410)의 주제이다. 따라서, 본 발명은 본원에서 확인되는 플랭킹 서열 (서열 1의 bp 1-1400 및 서열 2의 bp 153-1550 및 서열 15의 bp 1-2730 및 서열 15의 bp 9122-10,198)의 모든 부분 또는 인식가능한 부분에 의해 플랭킹된 이종성 삽입물 (aad-12, cry1F, cry1Ac, 또는 pat 유전자의 다중-카피 (multi-copy) 대신 또는 다중-카피와 함께)을 포함하는 식물 및 식물 세포를 포함한다. aad-12, cry1F, cry1Ac, 또는 pat의 추가의 카피 (또는 추가의 카피들)가 또한 이러한 방식(들)으로 삽입에 표적화될 수 있다.
본원에서 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 간행물은, 본 명세서의 명백한 교시와 상반되지 않을 정도로 전문이 참조로서 도입된다.
본 발명의 실시를 위한 절차를 예시하고, 본 발명의 특정 바람직한 실시양태를 설명하기 위해 하기의 실시예가 포함된다. 이들 실시예는 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다. 하기의 실시예에서 개시된 기술은 이의 실시를 위해 바람직한 방식을 예시하기 위해 사용된 특정한 접근법을 나타낸다는 것이 통상의 기술자에게 이해되어야 한다. 그러나 통상의 기술자는 본 개시물의 견지에서, 본 발명의 취지 및 범주에서 벗어나지 않고, 많은 변화가 이들 특정한 실시양태에서 가능하며 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 달리 지시되지 않는 한, 모든 백분율은 중량 기준이고, 모든 용매 혼합물 비율은 달리 언급되지 않는 한 부피 기준이다.
달리 지시되지 않는 한 하기의 약어가 사용된다.
bp 염기 쌍
℃ 섭씨
DNA 디옥시리보핵산
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
kb 킬로베이스
㎍ 마이크로그램
㎕ 마이크로리터
㎖ 밀리리터
M 몰 질량
PCR 중합효소 연쇄 반응
PTU 식물 전사 유닛
SDS 소듐 도데실 술페이트
SSC 염화나트륨 및 시트르산나트륨의 혼합물을 함유하는 완충제 용액 (pH 7.0)
TBE 트리스 염기, 붕산 및 EDTA의 혼합물을 함유하는 완충제 용액 (pH 8.3)
본 발명의 실시양태는 하기 실시예에서 더 정의된다. 이러한 실시예는 단지 예시로서 제공되는 것임을 이해할 것이다. 상기 논의 및 이러한 실시예들로부터, 통상의 기술자라면 본 발명의 필수적인 특징을 확인할 수 있으며, 그의 취지 및 범주에서 벗어나지 않으면서 본 발명의 실시양태의 다양한 변화 및 변형을 이루어 다양한 사용 및 조건에 본 발명을 적용할 수 있다. 따라서, 상기 기재로부터, 본원에 나타내고 기재된 것뿐 아니라 본 발명의 실시양태의 다양한 변형이 통상의 기술자에게는 자명할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구항의 범주 내에 있도록 의도된다.
본원에 기재된 각 참고문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: Cry1F 및 Cry1Ac 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 형질전환 및 선별
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1을 함유하는 트랜스제닉 대두 (글리신 맥스)를 대두 자엽절 외식편의 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 생성하였다. T-스트랜드 DNA 영역 내에 선별성 마커, pat v6 및 관심 유전자, cry1F v3 및 cry1Ac synpro를 함유한 이원성 벡터 pDAB9582 (도 1)를 보유하는, 무장해제 (disarmed) 아그로박테리움 균주 EHA101 (문헌 [Hood et al., 1993])을 사용하여 형질전환을 개시하였다. pDAB9582에 대한 DNA 서열은, 하기 표 1에 주석을 붙여놓은 바와 같이, 서열 3에 제공된다.
Figure pct00001
아그로박테리움-매개 형질전환을 문헌 [Zeng et al. (2004)]의 변형된 절차를 이용하여 행하였다. 간략하면, 대두 종자 (cv 매버릭 (Maverick))를 기본 배지 상에서 발아시키고, 자엽절을 단리하고, 아그로박테리움으로 감염시켰다. 출아 개시, 출아물 신장 및 발근 배지에 아그로박테리움의 제거를 위해 세포탁심, 티멘틴 및 반코마이신을 보충하였다. 글루포시네이트 선별을 이용하여 형질전환되지 않은 출아물의 성장을 억제하였다. 선별된 출아물을 뿌리 발달을 위해 발근 배지로 옮기고, 이어서 묘목의 순응을 위해 토양 혼합물로 옮겼다.
추정 형질전환체를 스크리닝하기 위해, 선별된 묘목의 말단 소엽에 글루포시네이트를 칠하였다. 스크리닝된 묘목을 온실로 옮기고, 순응시킨 후, 글루포시네이트를 잎에 칠하여 내성을 재확인하고, 추정 형질전환체로 간주하였다. 스크리닝된 식물의 샘플을 취하고, 선별성 마커 유전자 및/또는 관심 유전자의 확인을 위해 분자 분석을 행하였다. T0 식물을 온실에서 자가 수정시켜 T1 종자를 생성시켰다.
상기 이벤트인 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1이 개별적 형질전환된 단리체로부터 생성되었다. T1 식물을 다음 세대의 우량 변종 내로 역교배 및 유전자이입시켰다. 이벤트를 그의 독특한 특성, 예컨대 단일 삽입 부위, 정상적 멘델 분리, 안정적 발현, 및 제초제 내성 및 작물학적 성능을 포함하는 효능의 우수한 조합을 기초로 선별하였다. 하기의 실시예는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1을 분석하는데 사용된 데이터를 포함한다.
실시예 2: 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1에서 단백질 발현의 분석
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1에서 발현된 재조합 Cry1F, Cry1Ac 및 PAT 단백질의 생화학적 성질을 분석하였다. 정량적 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)은, 단백질의 생화학적 성질을 분석하고, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1에서의 이들 단백질의 발현을 확인하기 위해 사용될 수 있는 당 업계에 공지된 생화학적 검정법이다.
실시예 2.1: 식물 조직에서 PAT, Cry1F, 및 Cry1Ac 단백질 발현
대두 조직의 샘플을 시험 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 준비하였다. 0.5％ 소혈청 알부민 (BSA)을 함유한 계면활성제 트윈-20 (PBST)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 PAT 단백질을 추출하였다. 식물 조직을 원심분리하고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 샌드위치 형식으로 PAT ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 키트를 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다 (엔비롤로직스 (Envirologix), 포틀랜드, 메인주). 이러한 검정법은 발현된 PAT 단백질을 측정하였다.
계면활성제 트윈-20 (PBST)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 Cry1F 단백질을 추출하였다. 식물 조직을 원심분리하고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 샌드위치 형식으로 Cry1F ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 키트를 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다 (스트라티직 다이아그노스틱스 인크. (Strategic Diagnostics Inc.), 뉴어크, 델라웨어주). 이러한 검정법은 발현된 Cry1F 단백질을 측정하였다.
0.5％ 소혈청 알부민 (BSA)을 함유한 계면활성제 트윈-20 (PBST)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 Cry1Ac 단백질을 추출하였다. 식물 조직을 원심분리하고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 샌드위치 형식으로 Cry1Ac ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 키트를 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다 (스트라티직 다이아그노스틱스 인크., 뉴어크, 델라웨어주). 이러한 검정법은 Cry1Ac 단백질을 측정하였다.
검출 분석을 수행하여, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 내의 발현 안정성 및 수직 (세대 간의) 및 수평 (세대 내의 혈통 간의) 모두의 유전성을 조사하였다.
실시예 2.2: 식물 조직에서 PAT, Cry1F, 및 Cry1Ac 단백질의 발현
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 내의 Cry1F, Cry1Ac 및 PAT 단백질의 수준을 측정하였다. 가용성의 추출 가능한 단백질을 대두 잎 조직으로부터 정량적 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 측정하였다. T2 에서 T6 유전자 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1로, 발현은 안정하였고 (분리되지 않고), 모든 혈통에 걸쳐 일정하였다. 표 2는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 내의 트랜스제닉 단백질의 평균 발현 수준을 열거한다.
Figure pct00002
실시예 3: 클로닝 및 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 삽입 및 플랭킹 경계 영역에서 DNA 서열의 분석
게놈 삽입 부위를 분석하고 기술하기 위해, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 플랭킹 게놈 T-DNA 경계 영역의 서열을 결정하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 게놈 서열을 확인하였고, 이는 5' 플랭킹 경계 서열 (서열 1) 1400 bp, 및 3' 플랭킹 경계 서열 (서열 2) 1398 bp를 포함한다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 경계 서열에 기초한 PCR 증폭은, 경계 영역이 대두 기원의 것이고 접합부 영역이 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1에 대해 독특한 서열임을 입증하였다. 접합부 영역은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 이벤트-특이적 확인을 위해 사용될 수 있었다. 또한, T-스트랜드 삽입 부위는, 형질변환되지 않은 대두의 게놈으로부터 확인된 플랭킹 경계 서열의 영역에 상응하는 게놈 절편을 증폭하여 분석되었다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 형질변환되지 않은 게놈 서열과의 비교는 원래의 위치로부터 약 57 bp 결실을 나타내었고, 이는 T-스트랜드 통합 동안 생성된 것이다. 전체적으로, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 삽입 및 경계 서열의 분석은 pDAB9582로부터의 T-스트랜드의 무손상 카피가 대두 게놈 내에 존재함을 나타내었다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 3.1: 대두 게놈 서열의 확인
5' 및 3' 플랭킹 경계는 염색체 02로부터 글리신 맥스 전체 게놈 숏건 서열과 정렬되었고, 이는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 트랜스진이 대두 게놈 염색체 02에 삽입되었음을 나타내었다. 대두 게놈으로부터 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 삽입 부위를 확인하기 위해, PCR을 상이한 프라이머 쌍을 사용하여 행하였다 (도 2, 표 3, 표 4, 및 표 5). 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 기타 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 대두 계통으로부터의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. 5' 경계 서열이 맞는지 확인하기 위해, At Ubi10 프로모터 유전자 요소에 결합하도록 설계된 프라이머, 예를 들어 AtUbi10RV1, 및 대두 게놈 염색체 02 상의 클로닝된 5' 말단 경계에 결합하도록 설계된 프라이머인 81419_FW3으로 지명된 프라이머를 사용하여 At Ubi10 프로모터 유전자 요소로부터 5' 말단 경계 서열에 걸쳐 있는 DNA 절편을 증폭하는데 사용하였다. 유사하게, 클로닝된 3' 경계 서열의 확인을 위해, pat 특이적 프라이머, 예를 들어 3'PATEnd05, 및 클로닝된 3' 말단 경계 서열에 따라 설계된 3 개의 프라이머인 81419_RV1, 81419_RV2 및 81419_RV3으로 지명된 것을 pat 유전자로부터 3' 경계 서열에 걸쳐있는 DNA 절편을 증폭하는데 사용하였다. 예측된 크기를 가진 DNA 절편을, 다른 트랜스제닉 대두 계통 또는 비-트랜스제닉 대조군으로부터의 DNA 샘플로부터가 아닌 오직 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 게놈 DNA로부터 각각의 프라이머 쌍을 가지고 증폭하였다. 그 결과는 클로닝된 5' 및 3' 경계 서열이 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1에 대한 T-스트랜드 삽입물의 플랭킹 경계 서열임을 나타낸다.
대두 게놈 내의 DNA 삽입을 추가로 확인하기 위해, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1에 대한 T-스트랜드 삽입물을 함유하지 않은 게놈 DNA 상에서 대두 경계 서열에 걸쳐 PCR 증폭을 완료하였다. 5' 말단 경계 서열에 따라 설계된 프라이머 81419_FW3, 및 3' 말단 경계 서열을 위해 설계된 하나의 프라이머 81419-RV3을 사용하여 pDAB9582 T-스트랜드가 통합된 유전자좌를 함유하는 DNA 절편을 증폭하였다. 예상된 바와 같이, 81419_FW3 및 81419_RV3의 프라이머 쌍에 의해 완료된 PCR 증폭은 pDAB9582.814.19.1이 아닌 모든 기타 대두 대조군 계통으로부터 약 1.5 kb DNA 절편을 증폭하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 확인된 5' 및 3' 경계 서열을 염색체 02로부터의 글리신 맥스 전체 게놈 숏건 서열과 정렬하는 것은 원래의 유전자좌로부터 약 57 bp 결실을 나타내었다 (도 3). 이러한 결과는 대두 이벤트 pDAB8294의 트랜스진이 대두 게놈 염색체 02의 부위 내로 삽입되었다는 것을 증명한다.
실시예 4: 서던 블롯 (Southern Blot)을 통한 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 분석
서던 블롯 분석을 이용하여 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 통합 패턴을 확립하였다. 이들 실험은 대두 게놈 내에 cry1Ac 및 cry1F 트랜스진의 통합 및 완전성을 증명하는 데이터를 생성하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1은 플라스미드 pDAB9582로부터 cry1Ac 및 cry1F 식물 전사 유닛 (PTU)의 단일 카피를 포함하는 전장 단일 통합 이벤트로서 분석되었다.
서던 블롯 데이터는 T-스트랜드 절편이 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 게놈 내에 삽입되었음을 시사하였다. 자세한 서던 블롯 분석을 cry1Ac 및 cry1F 유전자에 특이적인, pDAB9582.814.19.1의 T-스트랜드 통합 영역 내에 포함된 프로브, 및 플라스미드 내에 위치한 절단 부위를 가지고, 플라스미드 또는 플라스미드와 대두 게놈 DNA의 접합부에 걸쳐 있는 절편 (경계 절편)에 대해 내부인 혼성화 절편을 생산하는 서술적 제한 효소를 사용하여 행하였다. 제한 효소와 프로브의 조합에 대해 서던 혼성화로부터 나타난 분자량은 이벤트에 대해 독특하였고, 그것의 확인 패턴을 확립하였다. 이들 분석은 또한 플라스미드 절편이 cry1Ac 및 cry1F PTU의 재배열 없이 대두 게놈 DNA 내로 삽입되었음을 나타내었다.
실시예 4.1: 대두 잎 샘플 수집 및 게놈 DNA (gDNA) 단리
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1을 함유한 각 대두 식물로부터 수확된 잎 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 또한, cry1Ac 및 cry1F 유전자가 없는 물질 계통을 나타내는 유전적 배경을 포함하는, 통상적인 대두 식물, 매버릭으로부터 gDNA를 단리하였다. 동결건조된 입 조직으로부터 표준 CTAB 방법 (문헌 [Sambrook et al (1989)]에 따라 개별적인 게놈 DNA를 추출하였다. 추출 후에, 피코 그린 (PICO GREEN) 시약 (인비트로젠 (Invitrogen), 칼스배드, 캘리포니아주)을 사용하여 형광분석법으로 DNA를 정량하였다. 이어서 DNA를 아가로스 겔 상에서 가시화하여, 피코 그린 분석으로부터의 값을 확인하고 DNA 품질을 결정하였다.
실시예 4.2: DNA 소화 및 분리
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 서던 블롯 분자 분석을 위해, 게놈 DNA 10 마이크로그램 (10 ㎍)을 소화시켰다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 비-트랜스제닉 대두 계통 매버릭으로부터의 게놈 DNA를 DNA ㎍ 당 약 5 유닛의 선택된 제한 효소 및 상응하는 반응 완충제를 각 DNA 샘플에 첨가하여 소화시켰다. 각 샘플을 약 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 제한 효소 AseI, HindIII, NsiI, 및 NdeI를 개별적으로 단일 소화에 사용하였다 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs), 입스위치, 매사추세츠주). 제한 효소 NotI 및 ApaLI를 이중 소화에 함께 사용하였다 (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 입스위치, 매사추세츠주). 또한, 플라스미드 DNA, pDAB9582를 비-트랜스제닉 대두 품종, 매버릭으로부터의 게놈 DNA와 결합함으로써 양성 혼성화 대조군 샘플을 제조하였다. 플라스미드 DNA / 게놈 DNA 칵테일을 시험 샘플과 동일한 절차 및 제한 효소를 사용하여 소화시켰다.
소화물을 밤새 인큐베이션한 후, 25 ㎕ 퀵-프리시프 플러스 솔루션 (QUICK-PRECIP PLUS SOLUTION; 엣지 바이오시스템즈 (Edge Biosystems), 게이더스버그, 메릴랜드주)을 첨가하고, 소화된 DNA 샘플을 이소프로판올로 침전시켰다. 침전된 DNA 펠릿을 15 ㎕의 1X 로딩 완충제 (0.01％ 브로모페놀 블루, 10.0 mM EDTA, 10.0％ 글리세롤, 1.0 mM 트리스 pH 7.5) 중에 재현탁시켰다. 이어서 DNA 샘플과 분자 크기 마커를 35 볼트에서 약 18 내지 22 시간 동안 0.4X TAE 완충제 (피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific), 피츠버그, 펜실베니아주)를 사용하여 0.85％ 아가로스 겔을 통해 전기영동하여, 절편 분리를 행하였다. 겔을 에티듐 브로마이드 (인비트로젠, 칼스배드, 캘리포니아주)로 염색하고, 자외선 (UV) 하에서 DNA를 가시화하였다.
실시예 4.3: 서던 전달 및 막 처리
서던 블롯 분석을 실질적으로 문헌 [Memelink, et al. (1994)]에 기재된 바와 같이 행하였다. 간략하면, DNA 절편의 전기영동 분리 및 시각화에 이어, 겔을 0.25 M HCl로 약 20 분 동안 퓨린제거하고 (depurinate), 이어서 약 30 분 동안 변성 용액 (0.4 M NaOH, 1.5 M NaCl)에 노출시키고, 이어서 30 분 이상 동안 중화 용액 (1.5 M NaCl, 0.5 M 트리스 pH 7.5)에 노출시켰다. 서던 전달을 10X SSC와 함께 위킹 (wicking) 시스템을 사용하여 나일론 막 상으로 밤새 행하였다. 전달 후, UV 가교에 이어서 짧게 2X SSC 용액으로 막을 세정하여, DNA를 막에 결합시켰다. 상기 공정은 혼성화에 대해 준비된 서던 블롯 막을 생산하였다.
실시예 4.4: DNA 프로브 표지 및 혼성화
나일론 막에 결합된 DNA 절편을 표지된 프로브를 사용하여 검출하였다 (표 6). 프로브는 디곡시제닌 (DIG) 표지된 뉴클레오티드, [DIG-11]-dUTP를, 유전자 요소에 특이적인 프라이머를 사용하여 플라스미드 pDAB9582로부터 증폭된 DNA 절편 내에 PCR 기반 혼입을 통해 생성되었다. PCR 합성에 의한 DNA 프로브의 생성은 PCR DIG 프로브 신세시스 키트 (Probe Synthesis Kit) (로슈 다이아그노스틱스 (Roche Diagnostics), 인디애나폴리스, 인디애나)를 사용하여 제조자가 추천한 절차를 따라서 행하였다.
표지된 프로브를 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여, 그들의 품질을 결정하고 정량하였다. 이어서 원하는 양의 표지된 프로브를 특정 절편의 검출을 위해 DIG 이지 히브 솔루션 (Easy Hyb Solution) (로슈 다이아그노스틱스, 인디애나폴리스, 인디애나)에 대해 기술된 바와 실질적으로 같은 절차를 사용하여 나일론 막 상의 표적 DNA에 대한 혼성화를 위해 사용하였다. 간략하면, 고정된 DNA를 함유한 나일론 막 블롯을 짧게 2× SSC로 세척하고 혼성화 용기 내 예열된 DIG 이지 히브 용액 20-25 ㎖로 약 45-55℃로 약 2 시간 동안 혼성화 오븐에서 예비-혼성화시켰다. 이어서 예비-혼성화 용액을 기울여 따라내고, 수조에서 약 5 분 간 끓여서 변성시킨, 원하는 양의 특이적 프로브를 함유한 예열된 DIG 이지 히브 용액 약 15 ㎖로 교체하였다. 이어서 혼성화 단계를 혼성화 오븐에서 밤새 약 45-55℃에서 행하였다.
프로브 혼성화의 마지막에, 프로브를 함유한 DIG 이지 히브 용액을 깨끗한 튜브 내로 기울여서 따라내고, 약 -20℃에서 보관하였다. 이들 프로브는 제조사가 제안한 절차에 따라서 2 번까지 재사용할 수 있었다. 막 블롯을 짧게 세정하고, 실온에서 약 5 분 동안 저-엄격성 세척 완충액 (2×SSC, 0.1％ SDS)로 깨끗한 플라스틱 용기 내에서 2 회 세척하였고, 이어서 약 65℃에서 각각 15 분 동안 고-엄격성 세척 완충액 (0.1×SSC, 0.1％ SDS)로 2 회 세척하였다. 막 블롯을 짧게 약 5 분 동안 DIG 워시 및 블럭 버퍼 세트 (Wash and Block Buffer Set) (로슈 다이아그노스틱스, 인디애나폴리스, 인디애나)로부터의 1×말레산 완충액으로 세척하였다. 이어서 2 시간 동안 1×블로킹 완충액 내에서 블로킹하고, 또한 최소 30 분 동안 1×블로킹 완충액 내에서 안티-DIG-AP (알칼리성 포스파타아제) 항체 (로슈 다이아그노스틱스, 인디애나폴리스, 인디애나)와 함께 인큐베이션하였다. 1×세척 완충제로 2-3 회 세척한 후, 특이적 DNA 프로브는 막 블롯에 결합된 채로 남고, CDP-스타 화학발광 핵산 검출 시스템 (CDP-Star Chemiluminescent Nucleic Acid Detection System) (로슈 다이아그노스틱스, 인디애나폴리스, 인디애나)를 사용하여 제조자의 권고에 따라 DIG-표지된 DNA 표준을 시각화하였다. 블롯을 하나 이상의 시점 동안 화학발광 필름에 노출시켜서 혼성화 절편을 검출하고 분자 크기 표준을 시각화하였다. 필름을 올-프로 100 플러스 (All-Pro 100 Plus) 필름 현상기 (코니카 미놀타 (Konica Minolta), 오사카, 일본)으로 현상하고, 영상을 스캔하였다. 검출된 밴드의 수 및 크기를 각 프로브에 대해 기록하였다. 기술된 바와 같은 DIG 검출 후에 보이는, DIG-표지된 DNA 분자량 마커 II (DIG MWM II) 및 DIG-표지된 DNA 분자량 마커 VII (DIG MWM VII)를 사용하여 서던 블롯 상의 혼성화 절편 크기를 측정하였다.
Figure pct00006
실시예 4.5: 서던 블롯 결과
cry1Ac 및 cry1F PTU의 공지된 제한 효소 부위를 기초로 하는, 특정 소화물 및 프로브의 예상 절편 크기 및 관찰된 절편 크기가 표 7에 제공된다. 2 가지 유형의 절편이 이들 소화물 및 혼성화로부터 확인되었다: 공지된 효소 부위가 프로브 영역을 플랭킹하고 cry1Ac 및 cry1F PTU의 삽입 영역 내에 완전히 함유되는 내부 절편 및 공지된 효소 부위가 프로브 영역의 한 말단에 위치하고, 제2 부위가 대두 게놈 내에 예상되는 경계 절편. 대부분의 경우, DNA 절편 통합 부위가 각 이벤트에 대해 독특하기 때문에, 경계 절편 크기는 이벤트에 따라 다르다. 경계 절편은, 제한 효소 부위를 통합된 DNA에 대해서 위치시키고 DNA 삽입물의 개수를 평가하기 위한 수단을 제공한다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1을 함유하는 대두의 복수의 세대에 대해 완료된 서던 블롯 분석은, 플라스미드 pDAB9582로부터의 낮은 카피, 무손상 cry1Ac 및 cry1F PTU가 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 대두 게놈 내로 삽입되었음을 시사하는 데이터를 생성하였다.
Figure pct00007
제한 효소 AseI 및 NsiI는 플라스미드 pDAB9582 내에 독특한 제한 부위에 결합하고 절단한다. 이어서, 이들 효소는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 내의 cry1Ac 유전자 삽입물의 분석에 선택되었다. 7286 bp보다 크거나 9479 bp보다 큰 경계 절편이 각각 AseI 및 NsiI 소화 후 프로브와 혼성화할 것으로 예상되었다 (표 7). AseI 및 NsiI 소화가 각각 사용될 때, 약 7400 bp 및 >10000 bp의 단일 cry1Ac 혼성화 밴드가 관찰되었다. 상기 크기의 밴드에 대한 프로브의 혼성화는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 대두 게놈 내에 cry1Ac 유전자에 대한 단일 삽입 부위의 존재를 시사한다. 이중 소화를 수행하고 cry1Ac 식물 전사 유닛 (PTU; 프로모터/유전자/종결인자)을 함유한 절편을 방출하기 위해 제한 효소 NotI 및 ApaLI를 선택하였다 (표 7). 예상된 4550 bp 절편이 NotI 및 ApaLI 이중 소화 후 프로브로 관찰되었다. pDAB9582.814.19.1 샘플의 효소 소화에 이은 프로브 혼성화를 통해 수득된 결과는, 플라스미드 pDAB9582로부터의 무손상 cry1Ac PTU가 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 대두 게놈 내로 삽입되었음을 나타내었다.
제한 효소 NdeI 및 NsiI는 플라스미드 pDAB9582 내에 제한 부위에 결합하고 절단한다. 이어서, 이들 효소는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 내의 Cry1F 유전자 삽입물의 분석에 선택되었다. 5569 bp보다 크고 9479 bp보다 큰 경계 절편이 각각 NdeI 및 NsiI 소화 후 프로브와 혼성화할 것으로 예상되었다 (표 7). NdeI 및 NsiI이 각각 사용될 때, 약 7500 bp 및 10000 bp보다 큰 단일 Cry1F 혼성화 밴드가 관찰되었다. 상기 크기의 밴드에 대한 프로브의 혼성화는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 대두 게놈 내에 cry1F 유전자에 대한 단일 삽입 부위의 존재를 시사한다. cry1F 식물 전사 유닛 (PTU; 프로모터/유전자/종결인자)을 함유한 절편을 방출하기 위해 제한 효소 HindIII를 선택하였다 (표 7). 예상된 7732 bp 절편이 HindIII 소화 후 프로브로 관찰되었다. pDAB9582.814.19.1 샘플의 효소 소화에 이은 프로브 혼성화를 통해 수득된 결과는, 플라스미드 pDAB9582로부터의 무손상 cry1F PTU가 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 대두 게놈 내로 삽입되었음을 나타내었다.
실시예 4.6: 골격 서열의 부재
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 내에 스펙티노마이신 저항성 유전자 (specR), Ori Rep 요소 및 복제 개시 단백질 trfA (trf A 요소)의 부재를 검증하기 위해 서던 블롯 분석을 또한 행하였다. 적합한 양성 (매버릭 게놈 DNA에 첨가된 pDAB9582) 및 음성 (매버릭 게놈 DNA) 대조군이 서던 분석을 위해 포함될 경우, 스펙티노마이신 저항성, Ori Rep 요소 또는 trf A 요소에 대한 특이적인 혼성화는 예상되지 않는다. NsiI 소화 및 specR 특이적 프로브와의 혼성화에 이어, 하나의 예상되는 15320 bp 크기의 밴드가 양성 대조군 샘플 매버릭 게놈 DNA에 첨가된 pDAB9582)에서 관찰되었다. specR 프로브는 음성 대조군 및 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 샘플에는 혼성화하지 않았다. 유사하게, NsiI 소화 및 trfA 프로브와 혼성화 후, 하나의 예상되는 15320 bp의 크기의 밴드가 양성 대조군 샘플 (pDAB9582 + 매버릭)에서는 검출되었으나, 음성 대조군 및 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 샘플로부터는 부재였다. NdeI 소화 및 OriRep 특이적 프로브와 혼성화 후, 또 하나의 예상되는 5329 bp의 크기의 밴드가 양성 대조군 샘플 (매버릭 게놈 DNA에 첨가된 pDAB9582)에서는 검출되었으나, 음성 대조군 및 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 샘플로부터는 부재였다. 이들 데이터는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 내에서 스펙티노마이신 저항성 유전자, Ori Rep 요소 및 복제 개시 단백질 trfA의 부재를 나타낸다.
실시예 5: 작물학 및 수율 필드 시험 및 제초제 내성
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 작물학적 특성 및 효능을 시험하기 위해, 상기 이벤트를 2010년 10월 및 2011년 2월 푸에르토리코 산타 이사벨에 있는 효능 시험에서 심었다. 이벤트 pDAB9582.814.19.1을 생산하도록 본래 형질전환된 재배종 매버릭을 각 모밭에 심고 대조군으로서 실험에 포함시켰다. T3 모밭을 위한 종자는 T2 단계에서 단일 식물 선별로부터 유도되었고, T4 모밭을 위한 종자는 T3 단계에서 단일 식물 선별로부터 유도되었다. 4 개 계통의 이벤트를 각 세대별로 시험하였다. 각 계통을 4 열 너비 및 7.5 피트 길이의 밭에 심었다. 열 간격은 30 인치였다. 밭을 약 2.5 주 동안 조명 하에 재배하여 푸에르토리코의 짧은 광주기를 보완하였다. 각 모밭에 글루포시네이트를 411 g ae/ha의 비율로 분무하였다. 대조군 식물 매버릭의 한 밭에는 동일 비율의 글리포시네이트를 분무하였고, 두번째 밭에는 분무하지 않고 이벤트의 대조군 비교로서 사용하였다.
발아, 일반적 외관, 활력 (vigor), 키, 도복 (lodging) 및 성숙기에 대한 데이터를 수집하였다. 제초제 내성은 백화, 잎 괴사 및 식물 사멸을 육안으로 조사하여 평가하였다 (표 8).
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1와 매버릭의 비교를 위해서는, 분무하지 않은 매버릭 블럭으로부터의 데이터만을 사용하였다. 분무 및 비분무 처리의 비교를 위해서는, 주어진 처리제가 분무된 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 블럭으로부터의 데이터를 매버릭 대조군 비분무 블럭으로부터의 데이터와 비교하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1은 글리코시네이트 제초제 적용에 내성을 나타냈다. 대조적으로, 매버릭 식물 중 어느 것도 제초제 처리에 내성이 있지 않았다.
Figure pct00008
실시예 6: 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 글루포시네이트에 대한 살충 활성의 분석
안티카르시아 겜마탈리스 (벨벳빈 애벌레), 슈도플루시아 인클루덴스 (대두 자벌레), 및 스포도프테라 프루기페르다 (가을 거염벌레)를 포함하는, 실험실에서 배양된 대두 해충에 대한 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 Cry1Ac 및 Cry1F의 활성을 분석하기 위해 필드 및 온실 평가를 행하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1을 형질전환되지 않은 대두 품종 매버릭에 대해 비교하여 Cry1F 및 Cry1 Ac 단백질에 의해 제공되는 식물 보호 수준을 측정하였다.
온실 시험은 약 4 주령 식물에 대해 행하였다. 15 그루의 식물을 사용하여 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 매버릭 대조군을 평가하였다. 시험된 각 곤충 종 (안티카르시아 겜마탈리스, 슈도플루시아 인클루덴스, 및 스포도프테라 프루기페르다)에 대해, 각 식물로부터 3개의 잎 펀치 (leaf punch)를 제조하여, 총 45 개의 잎 디스크/식물/곤충 종으로 하였다. 1.4 cm 직경 (또는 1.54 ㎠) 잎 펀치를 1 마리의 신생 유충이 침입한 2％ 물 아가의 상부의 시험장 내에 두고, 천공된 플라스틱 뚜껑으로 밀봉하였다. 침입 후 4 일에 사멸률 및 잎 소비를 평가하였다. 약하게 건드려 반응하지 않는 유충은 죽은 것으로 간주하였다. 곤충에 의해 소비된 잎 펀치의 백분율을 육안으로 등급을 매겨 잎 피해를 평가하였다.
필드 평가는 푸에르토리코 산타 이사벨에 있는 종자 증식 모밭으로부터의 잎 샘플을 수집하고, 이 잎들을 시험을 위해 미국 인디애나주 인디애나폴리스로 보내어 행하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1을 위한 모밭은 2011년 2월에 심었고, 4 열로 배열된 약 180 그루의 식물로 이루어졌다. 각 열은 2.3 m 길이에 76.2 cm 이격되었고, 각 식물은 각 열 내에서 5.1 cm 이격되었다. 2011년 3월에 분열조직으로부터 약 4 마디 밑에 위치한 하나의 완전히 펼쳐진 원줄기 삼출엽을 10 그루의 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 식물 및 10 그루의 '매버릭' 식물로부터 잘라내었다. 그 잎을 라벨을 붙인 플라스틱 주머니에 넣고 (주머니 당 1개) 밀봉하였다. 주머니에 든 잎을 포장하여 실험실로 옮겼다. 실험실에서는, 1 또는 2 개의 3.33 cm (1.31 in) 직경의 잎 디스크를 각 삼출엽으로부터 펀칭하여 총 16 개의 잎 디스크를 준비하였다. 각 잎 디스크를 신생 에스. 프루기페르다 유충이 침입한 2％ 아가 상부의 시험장 내에 두고, 천공된 플라스틱 뚜껑으로 밀봉하였다. 잎 디스크를 조절된 환경 챔버에 7일 동안 유지하고, 그때의 사멸률 및 잎 소비를 평가하였다. 약하게 건드려 반응하지 않는 유충은 죽은 것으로 간주하였다. 곤충에 의해 소비된 잎 펀치의 백분율을 육안으로 등급을 매겨 잎 피해를 평가하였다.
이들 복제 실험으로부터 얻어진 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1이 모든 시험 곤충에 대해 매버릭 대조군 식물보다 현저히 더 낮은 피해를 유지하였음을 나타내었다. 따라서, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1은 이렇게 넓은 숙주 범위에 걸쳐 살충 활성을 갖는다.
실시예 7: 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 서열
서열 14는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 서열을 제공한다. 이 서열은 5' 게놈 플랭킹 서열, pDAB9582의 T-스트랜드 삽입물 및 3' 게놈 플랭킹 서열을 함유한다. 서열 14에 있어서, 잔기 1-1400은 5' 게놈 플랭킹 서열이고, 잔기 1401-1536은 pDAB9582 플라스미드로부터 재배열의 잔기이고, 1537-13896은 pDAB9582 T-스트랜드 삽입물의 잔기이고, 잔기 13897-15294는 3' 플랭킹 서열이다. 따라서, 삽입물의 5' 말단에 대한 접합부 서열 또는 전이는 서열 14의 잔기 1400-1401에 존재한다. 따라서, 삽입물의 3' 말단에 대한 접합부 서열 또는 전이는 서열 14의 잔기 13896-13897에 존재한다.
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1로부터의 자손은 서열 14로부터 약간 일탈하는 서열을 가질 수 있음을 알 것이다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1을 식물 세포의 게놈에 도입하는 유전자이입 및 육종 과정 동안, 삽입물의 일부 결실 또는 다른 변경이 일어나는 것은 드물지 않다. 또한, PCR 증폭에서 오류가 발생할 수 있고, 이는 미미한 시퀀싱 오류를 초래할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 열거된 플랭킹 서열은 대두 게놈 DNA로부터 앰플리콘을 생성시킨 후, 이 앰플리콘을 클로닝하고 시퀀싱함으로써 결정되었다. 게놈 DNA로부터 시퀀싱을 위한 충분한 앰플리콘을 생성시키기 위해 필요한 다수의 증폭 라운드를 고려하면, 이러한 방식으로 생성 및 결정된 서열들에서 약간의 차이 및 미미한 불일치를 발견하는 것은 드물지 않다. 통상의 기술자는 이러한 유형의 통상적인 시퀀싱 오류 또는 불일치로 인해 필요한 임의의 보정이 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 인지할 것이고 이에 주의할 것이다. 따라서, 본원에 제공된 플라스미드 서열의 관련 절편은 일부 미미한 변이를 포함할 수 있다. 따라서, 본 삽입물 서열과 일부 범위의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물은 본 발명의 범위 내에 속한다. 서열 14의 서열에 대한 동일성은 본원에 예시 또는 기재된 서열과 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 따라서, 서열 14와 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 자손 식물 간의 일부 차이가 확인될 수 있으나 본 발명의 범위에 속한다.
실시예 8: 육종 스택 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1 및 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1
실시예 8.1: 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1와 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 유성 교배
국제 특허 출원 제WO/2012/075426호에 기재된 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1을 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1과 유성 교배시켰다. 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1의 꽃가루를 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 암술머리에 손으로 문지름으로써, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1을 수정시켰다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1 모두로부터의 통합 이벤트를 함유한 생성된 F1 자손을 2,4-D 및 글루포시네이트 제초제에 대한 내성에 대해 스크리닝하여 통합 이벤트 모두를 모두 함유한 자손 식물을 확인하였다.
실시예 8.2: 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 육종 스택에서의 단백질 발현의 분석
육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1에서 발현된 재조합 Cry1F, Cry 1Ac, AAD12 및 PAT 단백질의 생화학적 특성을 분석하였다. 미국 가특허 출원 제61/511658호 및 국제 특허 출원 제WO/2011/066360호에 각각 개시된 것을 기초로 한 검정법을 사용한 이벤트 특이적 TAQMAN® 검정에 의해, 총 51 그루의 F1 식물이 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 모두를 함유한 것으로 확인되었다. 다음으로, 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 PAT 및 AAD12의 발현을 정량하였고, Cry1Ac 및 Cry1F 단백질은 메소-스케일 디스커버리 (Meso-Scale Discovery; MSD)로부터의 전기화학발광 기술을 이용한 다중 면역검정법으로 정량하였다. 총괄하여, 이들 검정은 이들 단백질의 생화학적 특성을 분석하고 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 내에서 이들 단백질의 발현을 확인하기 위해 사용되었다.
식물 조직에서 PAT 단백질의 발현
육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1에서 PAT 단백질의 수준을 측정하였다. 가용성의 추출 가능한 PAT 단백질을 대두 잎 조직을 시험하기 위한 정량 효소-결합 면역흡착 검정법을 사용하여 측정하였다 (엔비롤로직스, 미국 메인주 포틀랜드).
이벤트 특이적 TAQMAN® 검정에 의해 총 51 그루의 F1 식물이 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 모두를 함유한 것으로 확인되었다. 대두 잎 조직의 샘플을 이들 온실에서 재배한 V3 내지 V4 성장 단계의 시험 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 준비하였다. 계면활성제 트윈-20 (PBST) 및 1％ 폴리비닐피롤리돈 40 (PVP-40)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 PAT 단백질을 추출하였다. 이어서, 제노그라인더 (GENOGRINDER)™를 5 분 동안 1500 rpm에서 사용하여 샘플을 추출하였다. 식물 추출물을 원심분리하였고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 샌드위치 형식으로 PAT ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 키트는 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다. 이 검정법은 잎 조직 내의 발현된 PAT 단백질을 측정하였다.
검출 분석을 수행하여, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1에서의 발현 유전율을 조사하였다. F1 세대에서, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 식물은 PAT를 발현하였다 (표 9).
Figure pct00009
식물 조직에서 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질의 발현
육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1에서 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질의 수준을 측정하였다. 가용성의 추출 가능한 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질을 대두 잎 조직을 시험하기 위해 다중 MSD 검정 (메소-스케일 디스커버리, 미국 메인주 게이더스버그)을 사용하여 측정하였다.
이벤트 특이적 TAQMAN® 검정에 의해 총 51 그루의 F1 식물이 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 모두를 함유한 것으로 확인되었다. 대두 잎 조직의 샘플을 이들 온실에서 재배한 V3 내지 V4 성장 단계의 시험 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 준비하였다. PBST 및 1％ PVP40을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질을 추출하였다. 이어서, 제노그라인더™를 5 분 동안 1500 rpm에서 사용하여 샘플을 추출하였다. 식물 추출물을 원심분리하였고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 메소-스케일 디스커버리로부터 Cry1F/Cry1Ac 다중 MSD 검정법을 사용하여 분석하였다. 이 검정법은 잎 조직 내의 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질을 측정하였다.
검출 분석을 수행하여, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1에서의 발현 유전율을 조사하였다. F1 세대에서, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 식물은 Cry1F 및 Cry1Ac를 발현하였다 (표 10).
Figure pct00010
식물 조직에서 AAD12 단백질의 발현
육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1에서 AAD12 단백질의 수준을 측정하였다. 가용성의 추출 가능한 AAD12 단백질을 대두 잎 조직을 시험하기 위한 정량 효소 결합 면역흡착 검정법을 사용하여 측정하였다 (아카디아 바이오사이언스, 미국 메인주 포틀랜드).
이벤트 특이적 TAQMAN® 검정에 의해 총 51 그루의 F1 식물이 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 모두를 함유한 것으로 확인되었다. 대두 잎 조직의 샘플을 이들 온실에서 재배한 V3 내지 V4 성장 단계의 시험 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 준비하였다. 계면활성제 트윈-20 (PBST) 및 0.5％ 소혈청 알부민 (BSA)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 AAD12 단백질을 추출하였다. 이어서, 제노그라인더™를 5 분 동안 1500 rpm에서 사용하여 샘플을 추출하였다. 식물 추출물을 원심분리하였고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 샌드위치 형식으로 AAD12 ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 키트는 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다 (아카디아, 미국 메인주 포틀랜드). 이 검정법은 잎 조직 내의 발현된 AAD12 단백질을 측정하였다.
검출 분석을 수행하여, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1에서의 발현 유전율을 조사하였다. F1 세대에서, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 식물은 AAD12를 발현하였다 (표 11).
Figure pct00011
실시예 8.3: 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 제초제 내성
육종 스택인 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 제초제 내성을 온실 연구에서 분석하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 종자를 화분에 심고, 성숙기까지 재배하였다. 53 그루의 성숙한 F1 식물에 V3 내지 V4 성장 단계 (단엽 및 처음 3~4개의 삼출엽이 완전히 발달한 것을 특징으로 함)에서 840 g ae/ha의 2,4-D로 구성된 단일 제초제 적용으로 분무하였다. 생존한 식물의 수를 세어서 이들 제초제에 대한 결과적 내성을 측정하였다. 53 그루의 식물 모두 제초제 적용에 대해 내성이 있는 것으로 밝혀졌다. 비교를 위해, aad-12 유전자를 함유하지 않고 2,4-D 제초제의 적용에 민감할 것으로 예상되었던 대조군 식물도 연구에 포함되었다.
요약하면, 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1 부모 계통 내에 존재하였던 aad-12 유전자는 2,4-D 제초제에 대한 내성을 부여하였다. 이 형질은 대두 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 내로 전달 및 유전됨으로써, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1에 제초제 내성을 제공하였다. 이에 비해, aad-12 유전자를 함유하지 않았던 대조군 식물은 2,4-D 제초제의 적용에 민감하였다.
실시예 8.4: 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 살충 활성의 분석
안티카르시아 겜마탈리스 (벨벳빈 애벌레) 및 슈도플루시아 인클루덴스 (대두 자벌레)를 포함하는, 실험실에서 배양된 대두 해충에 대한, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1에서의 Cry1Ac 및 Cry1F의 활성을 분석하기 위해 온실 평가를 행하였다. 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1을 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1, 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1, 및 형질전환되지 않은 대두 품종 매버릭과 비교하여, Cry1F 및 Cry1Ac 단백질에 의해 제공된 식물 보호의 수준이 스태킹되었을 때 변하는지 여부를 결정하였다. 또한, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 및 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1에, 840 g ae/ha의 2,4-D를 함유하는 단일 제초제 적용으로 분무한 후 곤충 생물검정을 행하여, 곤충에 대해 제초제로부터의 부정적 생물학적 효과가 없음을 확인하였다.
온실 시험을 약 3 주령 식물에 대해 행하였다. 5 내지 10 그루의 식물을 각각 사용하여, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 음성 대조군, 즉, 분무된 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1 및 매버릭을 평가하였다. 각 시험된 곤충 종 (안티카르시아 겜마탈리스 및 슈도플루시아 인클루덴스)에 대해, 각 식물로부터 3개의 잎 펀치를 제조하였다. 1.4 cm 직경 (또는 1.54 ㎠) 잎 펀치를 1 마리의 신생 유충이 침입한 1.5％ 물 아가의 상부의 시험장 내에 두고, 천공된 플라스틱 뚜껑으로 밀봉하였다. 침입 후 4 일에 사멸률 및 잎 소비를 평가하였다. 약하게 건드려 반응하지 않는 유충은 죽은 것으로 간주하였다. 곤충에 의해 소비된 잎 펀치의 백분율을 육안으로 등급을 매겨 잎 피해를 평가하였다.
이들 반복된 실험으로부터 얻은 결과 (표 12)는 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1이 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1과 일치하고, 대두 자벌레 및 벨벳빈 애벌레에 대해, 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1 (94-99％) 및 매버릭 (96-97％) 대조군보다 현저히 더 낮은 잎 조직 피해 (0.6-0.8％)를 유지하였음을 보여준다. 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 및 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 모두에서 높은 사멸률 (100％)이 기록된 반면, 대두 이벤트 pDAB4468.04.16.1 및 매버릭은 낮은 사멸률을 나타내었고 (0％), 이들 대조군 식물 상에 위치한 모든 곤충은 생존하였다. 따라서, 육종 스택 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1에 상당하는 살충 활성을 갖는다.
Figure pct00012
본 발명의 원리를 예시 및 설명하였으나 본 발명은 그 원리로부터 벗어남 없이 배열 및 세부 내용이 변형될 수 있음은 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 본 출원인은 첨부한 청구항의 취지 및 범주 내에 있는 모든 변형을 청구한다.
본 명세서에 인용된 모든 출판물 및 공개 특허 문헌은, 각각의 개별 출판물 및 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 본원에 참조로 포함된다고 기재된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
ATCC PTA-10442 20091022 ATCC PTA-12006 20110721
SEQUENCE LISTING <110> Dow Agrosciences LLC <120> INSECT RESISTANT AND HERBICIDE TOLERANT BREEDING STACK OF SOYBEAN EVENT pDAB9582.814.19.1 AND pDAB4468.04.16.1 <130> 72638 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1836 <212> DNA <213> Glycine max <400> 1 ttaacaatga ccaagattta tgctatatag aagacttgga gggcttaagg ctatgatata 60 ttatggatga tatggttctg atttgtgtag tttcgaagga tcaaatcaac catttgttgg 120 tacaatggga agaaaaaatg ttttcatcat tccactctat tgaaaaagat ccaacaattg 180 taacaccccg acgaatcaca ccggaaagag aagaatccaa agattgtgta ggtatgagac 240 tgtatagttg atgaaaactt aaaaaaatta attggtacta cttataccaa caagatgcat 300 atatttttcg atagcctatc acataagaac ttcatagtta agggtgctta acttggagta 360 gttatgaaat gagtgacctt ttaaaataat tattgtctta ggttattgta tgaaaataaa 420 aaataataat aaatatacat aaaaaataat aattttataa aattaacctt atattatcat 480 taatttattt ttagattttg ttattcatta ttaatatatg aggtataaat gaaaaatata 540 attaatgtca cattaaaaaa ttaaaatgat aattattttg aaacaaatta tttattttta 600 tacgacaatt ataatagaaa tttgagagta 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atgtgactga 9660 ctatcacatc gatcgcgttt ccaaccttgt tgagtgcctc tctgatgagt tctgtttgga 9720 tgagaagaag gagttgtccg agaaggtcaa acatgctaag cgacttagtg atgagcggaa 9780 cttgcttcaa gatcccaact ttcgcgggat caacaggcaa ctagatcgtg gatggagggg 9840 aagtacggac atcaccattc aaggaggtga tgatgtgttc aaggagaact atgttacgct 9900 cttgggtacc tttgatgagt gctatccaac atacctgtac cagaagatag atgaatcgaa 9960 actcaaagcc tacacaagat accagttgag aggttacatc gaggacagtc aagaccttga 10020 gatctacctc atcagataca acgccaaaca tgagacagtc aatgtgcctg ggacgggttc 10080 actctggcca ctttcagccc caagtcccat cggcaagtgt gcccatcact cacaccactt 10140 ctccttggac atagacgttg gctgtaccga cctgaacgaa gacctcggtg tgtgggtgat 10200 cttcaagatc aagactcaag atggccatgc caggctaggc aatctggagt ttctagaaga 10260 gaaaccactt gttggagaag ccctcgctag agtgaagagg gctgagaaga agtggaggga 10320 caagagagag aagttggaat gggaaacaaa cattgtgtac aaagaagcca aagaaagcgt 10380 tgacgctctg tttgtgaact ctcagtatga taggctccaa gctgatacca acatagctat 10440 gattcatgct gcagacaaac gcgttcatag cattcgggaa gcttaccttc ctgaacttag 10500 cgtgattccg ggtgtcaatg ctgctatctt tgaagagtta gaagggcgca tcttcactgc 10560 attctccttg tatgatgcga ggaatgtcat caagaatggt gacttcaaca atggcctatc 10620 ctgctggaat gtgaaagggc acgtagatgt agaagaacag aacaatcacc gctctgtcct 10680 tgttgttcct gagtgggaag cagaagtttc acaagaagtt cgtgtctgtc ctggtcgtgg 10740 ctacattctt cgtgttaccg cgtacaaaga aggatacgga gaaggttgcg tcaccataca 10800 cgagattgag aacaacaccg acgagctgaa gttcagcaac tgcgtcgagg aggaagtcta 10860 cccaaacaac accgtaactt gcaatgacta cactgcgact caagaggagt atgagggtac 10920 ttacacttct cgcaatcgag gatacgatgg agcctatgag agcaactctt ctgtacccgc 10980 tgactatgca tcagcctatg aggagaaggc ttacaccgat ggacgtaggg acaatccttg 11040 cgaatctaac agaggctatg gggactacac accgttacca gccggctatg tcaccaaaga 11100 gttagagtac tttccagaaa ccgacaaggt ttggattgag attggagaaa cggaaggaac 11160 attcattgtt gatagcgtgg agttacttct gatggaggaa tgagtagtta gcttaatcac 11220 ctagagctcg gttacctatc aaaatctatt tagaaataca caatattttg ttgcaggctt 11280 gctggagaat cgatctgcta tcataaaaat tacaaaaaaa ttttatttgc ctcaattatt 11340 ttaggattgg tattaaggac gcttaaatta tttgtcgggt cactacgcat cattgtgatt 11400 gagaagatca gcgatacgaa atattcgtag tactatcgat aatttatttg aaaattcata 11460 agaaaagcaa acgttacatg aattgatgaa acaatacaaa gacagataaa gccacgcaca 11520 tttaggatat tggccgagat tactgaatat tgagtaagat cacggaattt ctgacaggag 11580 catgtcttca attcagccca aatggcagtt gaaatactca aaccgcccca tatgcaggag 11640 cggatcattc attgtttgtt tggttgcctt tgccaacatg ggagtccaag gttgcggccg 11700 cgcgccgacc cagctttctt gtacaaagtg gttgcggccg cttaattaaa tttaaatgcc 11760 cgggcgttta aacgcggccg cttaattaag gccggcctgc agcaaaccca gaaggtaatt 11820 atccaagatg tagcatcaag aatccaatgt ttacgggaaa aactatggaa gtattatgta 11880 agctcagcaa gaagcagatc aatatgcggc acatatgcaa cctatgttca aaaatgaaga 11940 atgtacagat acaagatcct atactgccag aatacgaaga agaatacgta gaaattgaaa 12000 aagaagaacc aggcgaagaa aagaatcttg aagacgtaag cactgacgac aacaatgaaa 12060 agaagaagat aaggtcggtg attgtgaaag agacatagag gacacatgta aggtggaaaa 12120 tgtaagggcg gaaagtaacc ttatcacaaa ggaatcttat cccccactac ttatcctttt 12180 atatttttcc gtgtcatttt tgcccttgag ttttcctata taaggaacca agttcggcat 12240 ttgtgaaaac aagaaaaaat ttggtgtaag ctattttctt tgaagtactg aggatacaac 12300 ttcagagaaa tttgtaagtt tgtagatctc catgtctccg gagaggagac cagttgagat 12360 taggccagct acagcagctg atatggccgc ggtttgtgat atcgttaacc attacattga 12420 gacgtctaca gtgaacttta ggacagagcc acaaacacca caagagtgga ttgatgatct 12480 agagaggttg caagatagat acccttggtt ggttgctgag gttgagggtg ttgtggctgg 12540 tattgcttac gctgggccct ggaaggctag gaacgcttac gattggacag ttgagagtac 12600 tgtttacgtg tcacataggc atcaaaggtt gggcctagga tccacattgt acacacattt 12660 gcttaagtct atggaggcgc aaggttttaa gtctgtggtt gctgttatag gccttccaaa 12720 cgatccatct gttaggttgc atgaggcttt gggatacaca gcccggggta cattgcgcgc 12780 agctggatac aagcatggtg gatggcatga tgttggtttt tggcaaaggg attttgagtt 12840 gccagctcct ccaaggccag ttaggccagt tacccagatc tgaggtaccc tgagcttgag 12900 cttatgagct tatgagctta gagctcggat ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa 12960 ttcgcccttg 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tttttatgca tagatgcact cgaaatcagc caattttaga caagtatcaa acggatgtga 13860 cttcagtaca ttaaaaacgt ccgcaatatg atattcatta attttatatt atctaaaaga 13920 gttaaaagag aaaaaagaaa tatgacaatt tttttctttc acatcttcta acctaaaagt 13980 atgactctat ggaggctaag tttagaaaaa gatacggatc tagggtgtgg aaacatcaat 14040 ggtcaactcc ttttatattt caatcaattg ggttttgctt tatctttaca ttttctcctt 14100 ttattttcca cgtctattca aatctacttg ttagcgggtg attactcttt tttcttttat 14160 agatgccaat tatttctctc ctatgtatta aattagagta tattgtcttg aaagtgactt 14220 agtattttag tttatagtct cttaaagaac gacacctttt attcttaact ctctttatca 14280 agttttaatt taaaattatt ttaaattaag tatgcataca tatcttaata tttttcttaa 14340 ttatttttaa attccctaaa tttaatgttt tcatacaatg taagagatat acatattaat 14400 tatatttaaa gataaaactt actttcctgc aataaaataa agaaaaggac agtcatacaa 14460 ttatataatt aatccagaat atttatagct tttaaacatt tattttctat caattaagta 14520 ataactttaa ataaaattaa gagtactttt ttatactcca aagaatttat ttattttcaa 14580 caaaatcgtc tgactgtttc aattgatcat tatcagccta gcataaccta aatttcattt 14640 tcaaacataa cttttggcac caaatcaccc ggcattgcaa aaaagtcttt tgcgatatga 14700 ccctccacga cgcagaacca ctgttattca ttaccatcac ttttaatcct aatttcccat 14760 acacttaccc tttccatgac atcttcaaag cctttatttt gcttttcttg tttaagctgt 14820 tttaacctaa tttcatgcat ataaacaaag agtaaagcaa aggcaaatat ttgtacgtat 14880 agtttttaga cagaaaagga aagtaaatta tagagataat gaagtttgct cttttaaatt 14940 cgtcgtgatg ttatccatca tatctaaatg cttattcctg tttttgtctt ttttctcttt 15000 taccggagtt tattttatat aattaattaa agttagtaga tctatattct ttttcataga 15060 taatccatct tctttggagg cacatcgatc attaatcata gagttttgag aagcattatc 15120 actaaagctt caattaatta tatccaataa acggtattgg tgtatgatgt tatgatagca 15180 aatagataat ctaatctata cgagccacaa aaggggcatg aactctatct cgaagaaatt 15240 ggagatgaag ggattgagat tggcaccttg tgctattatt gcccactaat catt 15294 <210> 15 <211> 10212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of soybean event pDAB4468.04.16.1. Including the 5' genomic flanking sequence, pDAB4468 T-strand insert, and 3' genomic flanking sequence. <400> 15 ctgtcgttgg attcacagaa cattgacgcc agttttcact tcgttatctt tgaattcatt 60 aaaatcgaat ctctcaccta taccccccca tttttctaat ccatcataat caaaattcat 120 aaatgaatca gttaccatta ccataatacc tttttgaaaa tgagtttgaa taatcagtat 180 ctttagaaaa ctaattaaga aattaaataa aaaatattta tcatgaagat gagtgtaaga 240 aaaattatga aaagtataac tttatacatt tctataaaat tattttttct tttaatttct 300 taattaatat cctaagtaaa tgagttaata tttatctttc aaaaattctt atagtcgcca 360 attaattttc ccatgcaatg acaacttgtc cgtattctac gtggtaggtt aggctacctg 420 ccgagacaaa ttgccttgag acaaattcaa tagagaaccc ttccaaggga ccattataaa 480 tagagaactt tcattaaccg ataagccaca ccctttcaat caaacacaaa cacttgaagt 540 actaagttag tgtgtttgag caaattaact atggcttcgt tttgttctag attgacaatt 600 tgtttggctc tgtttgtcct catatggggg agtgccaatg cacaactttc tacaaacttt 660 tactaccatt catgtccaaa cctcttctcc tctgtgaaat ccacagtgca atctgccata 720 tctaaggaga cccgcatggg tgcttctctc cttcgcttgt tcttccacga ttgctttgtc 780 aatgtaattt atttgcacct tctcccactt acatacaaat atgctaagct tacatatagc 840 tcctctttct accacttgca tgcatcatct aattttgttt gaaacaacac ttgttccttt 900 tattatacac atcatctttg ataaaatttt gtcgtgtgca actttttttt agtgtgttaa 960 tcagttctat gatgatacta ttagttaaga aattttaatg cacttaataa accattttaa 1020 gtactttaac cgttcaatga tattatatat ttaaagataa taaatatttc tgcttttgtt 1080 tctatattag tgtagttaag aaccttctta cttcttagct agctaaatat taatgagtaa 1140 acattaacaa atgcagggat gtgatggttc aattctattg gatgacacat caagcttcac 1200 cggagagaag aacgcaaacc ccaacaggaa ctctgctcgt ggattcgagg ttattgacaa 1260 cattaaatca gccgtggaga aagtgtgtcc aggagttgtt tcctgcgcag atatccttgc 1320 catcgctgcc agagactctg ttcagattgt aagtggtcaa acaaccaaca aaaacacatt 1380 aaactaaatc attaaattgt acatatcaaa attaattacc aatttagtac cacacatgca 1440 attaaagaga acattttgtt gattttgatc aatatagctt ggaggcccta catggaatgt 1500 taaacttgga agaagagacg ctagaactgc tagccaatct gctgctaaca atggcatccc 1560 tgcacccact tcaaacctta accaactcat ctcaagattt agcgctcttg gactttccac 1620 caaggacttg gtcgccttgt ccggtacaaa acatatatca cataattttc caattaatta 1680 catttcaatc atatagtaaa atttctcaat taattaggaa catgagaaac ttatagtcac 1740 acgttctttt gttgaggaat attgcatggt ttaattttgc tttcattagg tggtcacaca 1800 attggacaag caaggtgcac aaacttcaga gcccgcatct acaacgagac caacatagaa 1860 accgcatttg caaggactag gcagcaaagc tgccctagaa catcagggtc aggggacaac 1920 aatctggcac cacttgatct tcaaactcca accagctttg acaactacta cttcaagaac 1980 ctcgttcaga agaagggtct cctccactct gatcagcaac tgttcaacgg tgggtccacc 2040 gactccattg tgcgtggcta cagcaccaac ccgggcacct tctcctctga tttcgccgcc 2100 gccatgatca agatgggaga cattagtcct ctcactggct ccaatggaga aatcaggaag 2160 aattgtagaa ggattaacta atttgattca gtcttgaata ttaagggtcc tacacatacg 2220 caagcaattt aattgtgttt aataagttgt taaaacatgt tttggttgta ttttggattc 2280 ctagtgtagt ttcggtgatc aatgccgtct actttagtgt gttctacttc cctttatttt 2340 tgtttctttt ttactttttc cttaactata ttgtaggaaa aaaaaaatcc tttatcaagc 2400 atttatcaag aacggagttt gctttttaat tttcccttca taacattcca tcagaattca 2460 gttttgcttt tgcttctaaa ttacgttcaa atcagggatg ataatcggtt aggtaatata 2520 tacagtaccc cttgcatagt cacgtttgaa aaatataatc atacttagtt cggtaacaat 2580 ttaaattatc attctcgtaa tcattagcta cttatgcact catatccgta tccgctactt 2640 gctcttgtcg taagtcaata aattaatata aaaaaatact taaaacttgt tacaactaaa 2700 ttaaaaattt atttttaaat cattcaagca ccagtcagca tcatcacacc aaaagttagg 2760 cccgaatagt ttgaaattag aaagctcgca attgaggtct acaggccaaa ttcgctctta 2820 gccgtacaat attactcacc ggatcctaac cggtgtgatc atgggccgcg attaaaaatc 2880 tcaattatat ttggtctaat ttagtttggt attgagtaaa acaaattcga accaaaccaa 2940 aatataaata tatagttttt atatatatgc ctttaagact ttttatagaa ttttctttaa 3000 aaaatatcta gaaatatttg cgactcttct ggcatgtaat atttcgttaa atatgaagtg 3060 ctccattttt attaacttta aataattggt tgtacgatca ctttcttatc aagtgttact 3120 aaaatgcgtc aatctctttg ttcttccata ttcatatgtc aaaacctatc aaaattctta 3180 tatatctttt tcgaatttga agtgaaattt cgataattta aaattaaata gaacatatca 3240 ttatttaggt atcatattga tttttatact taattactaa atttggttaa ctttgaaagt 3300 gtacatcaac gaaaaattag tcaaacgact aaaataaata aatatcatgt gttattaaga 3360 aaattctcct ataagaatat tttaatagat catatgtttg taaaaaaaat taatttttac 3420 taacacatat atttacttat caaaaatttg acaaagtaag attaaaataa tattcatcta 3480 acaaaaaaaa aaccagaaaa tgctgaaaac ccggcaaaac cgaaccaatc caaaccgata 3540 tagttggttt ggtttgattt tgatataaac cgaaccaact cggtccattt gcacccctaa 3600 tcataatagc tttaatattt caagatatta ttaagttaac gttgtcaata tcctggaaat 3660 tttgcaaaat gaatcaagcc tatatggctg taatatgaat ttaaaagcag ctcgatgtgg 3720 tggtaatatg taatttactt gattctaaaa aaatatccca agtattaata atttctgcta 3780 ggaagaaggt tagctacgat ttacagcaaa gccagaatac aatgaaccat aaagtgattg 3840 aagctcgaaa tatacgaagg aacaaatatt tttaaaaaaa tacgcaatga cttggaacaa 3900 aagaaagtga tatatttttt gttcttaaac aagcatcccc tctaaagaat ggcagttttc 3960 ctttgcatgt aactattatg ctcccttcgt tacaaaaatt ttggactact attgggaact 4020 tcttctgaaa atagtggcca ccgcttaatt aaggcgcgcc atgcccgggc aagcggccgc 4080 acaagtttgt acaaaaaagc aggctccgcg gtgactgact gaaaagcttg tcgacctgca 4140 ggtcaacgga tcaggatatt cttgtttaag atgttgaact ctatggaggt ttgtatgaac 4200 tgatgatcta ggaccggata agttcccttc ttcatagcga acttattcaa agaatgtttt 4260 gtgtatcatt cttgttacat tgttattaat gaaaaaatat tattggtcat tggactgaac 4320 acgagtgtta aatatggacc aggccccaaa taagatccat tgatatatga attaaataac 4380 aagaataaat cgagtcacca aaccacttgc cttttttaac gagacttgtt caccaacttg 4440 atacaaaagt cattatccta tgcaaatcaa taatcataca aaaatatcca ataacactaa 4500 aaaattaaaa gaaatggata atttcacaat atgttatacg ataaagaagt tacttttcca 4560 agaaattcac tgattttata agcccacttg cattagataa atggcaaaaa aaaacaaaaa 4620 ggaaaagaaa taaagcacga agaattctag aaaatacgaa atacgcttca atgcagtggg 4680 acccacggtt caattattgc caattttcag ctccaccgta tatttaaaaa ataaaacgat 4740 aatgctaaaa aaatataaat cgtaacgatc gttaaatctc aacggctgga tcttatgacg 4800 accgttagaa attgtggttg tcgacgagtc agtaataaac ggcgtcaaag tggttgcagc 4860 cggcacacac gagtcgtgtt tatcaactca aagcacaaat acttttcctc aacctaaaaa 4920 taaggcaatt agccaaaaac aactttgcgt gtaaacaacg ctcaatacac gtgtcatttt 4980 attattagct attgcttcac cgccttagct ttctcgtgac ctagtcgtcc tcgtcttttc 5040 ttcttcttct tctataaaac aatacccaaa gcttcttctt cacaattcag atttcaattt 5100 ctcaaaatct taaaaacttt ctctcaattc tctctaccgt gatcaaggta aatttctgtg 5160 ttccttattc tctcaaaatc ttcgattttg ttttcgttcg atcccaattt cgtatatgtt 5220 ctttggttta gattctgtta atcttagatc gaagacgatt ttctgggttt gatcgttaga 5280 tatcatctta attctcgatt agggtttcat aaatatcatc cgatttgttc aaataatttg 5340 agttttgtcg aataattact cttcgatttg tgatttctat ctagatctgg tgttagtttc 5400 tagtttgtgc gatcgaattt gtcgattaat ctgagttttt ctgattaaca gagatctcca 5460 tggctcagac cactctccaa atcacaccca ctggtgccac cttgggtgcc acagtcactg 5520 gtgttcacct tgccacactt gacgatgctg gtttcgctgc cctccatgca gcctggcttc 5580 aacatgcact cttgatcttc cctgggcaac acctcagcaa tgaccaacag attacctttg 5640 ctaaacgctt tggagcaatt gagaggattg gcggaggtga cattgttgcc atatccaatg 5700 tcaaggcaga tggcacagtg cgccagcact ctcctgctga gtgggatgac atgatgaagg 5760 tcattgtggg caacatggcc tggcacgccg actcaaccta catgccagtc atggctcaag 5820 gagctgtgtt cagcgcagaa gttgtcccag cagttggggg cagaacctgc tttgctgaca 5880 tgagggcagc ctacgatgcc cttgatgagg caacccgtgc tcttgttcac caaaggtctg 5940 ctcgtcactc ccttgtgtat tctcagagca agttgggaca tgtccaacag gccgggtcag 6000 cctacatagg ttatggcatg gacaccactg caactcctct cagaccattg gtcaaggtgc 6060 atcctgagac tggaaggccc agcctcttga tcggccgcca tgcccatgcc atccctggca 6120 tggatgcagc tgaatcagag cgcttccttg aaggacttgt tgactgggcc tgccaggctc 6180 ccagagtcca tgctcaccaa tgggctgctg gagatgtggt tgtgtgggac aaccgctgtt 6240 tgctccaccg tgctgagccc tgggatttca agttgccacg tgtgatgtgg cactccagac 6300 tcgctggacg cccagaaact gagggtgctg ccttggtttg agtagttagc ttaatcacct 6360 agagctcggt caccagcata atttttatta atgtactaaa ttactgtttt gttaaatgca 6420 attttgcttt ctcgggattt taatatcaaa atctatttag aaatacacaa tattttgttg 6480 caggcttgct ggagaatcga tctgctatca taaaaattac aaaaaaattt tatttgcctc 6540 aattatttta ggattggtat taaggacgct taaattattt gtcgggtcac tacgcatcat 6600 tgtgattgag aagatcagcg atacgaaata ttcgtagtac tatcgataat ttatttgaaa 6660 attcataaga aaagcaaacg ttacatgaat tgatgaaaca atacaaagac agataaagcc 6720 acgcacattt aggatattgg ccgagattac tgaatattga gtaagatcac ggaatttctg 6780 acaggagcat gtcttcaatt cagcccaaat ggcagttgaa atactcaaac cgccccatat 6840 gcaggagcgg atcattcatt gtttgtttgg ttgcctttgc caacatggga gtccaaggtt 6900 gcggccgcgc gccgacccag ctttcttgta caaagtggtt gcggccgctt aattaaattt 6960 aaatgcccgg gcgtttaaac gcggccgctt aattaaggcc ggcctgcagc aaacccagaa 7020 ggtaattatc caagatgtag catcaagaat ccaatgttta cgggaaaaac tatggaagta 7080 ttatgtaagc tcagcaagaa gcagatcaat atgcggcaca tatgcaacct atgttcaaaa 7140 atgaagaatg tacagataca agatcctata ctgccagaat acgaagaaga atacgtagaa 7200 attgaaaaag aagaaccagg cgaagaaaag aatcttgaag acgtaagcac tgacgacaac 7260 aatgaaaaga agaagataag gtcggtgatt gtgaaagaga catagaggac acatgtaagg 7320 tggaaaatgt aagggcggaa agtaacctta tcacaaagga atcttatccc ccactactta 7380 tccttttata tttttccgtg tcatttttgc ccttgagttt tcctatataa ggaaccaagt 7440 tcggcatttg tgaaaacaag aaaaaatttg gtgtaagcta ttttctttga agtactgagg 7500 atacaacttc agagaaattt gtaagtttgt agatctccat gtctccggag aggagaccag 7560 ttgagattag gccagctaca gcagctgata tggccgcggt ttgtgatatc gttaaccatt 7620 acattgagac gtctacagtg aactttagga cagagccaca aacaccacaa gagtggattg 7680 atgatctaga gaggttgcaa gatagatacc cttggttggt tgctgaggtt gagggtgttg 7740 tggctggtat tgcttacgct gggccctgga aggctaggaa cgcttacgat tggacagttg 7800 agagtactgt ttacgtgtca cataggcatc aaaggttggg cctaggatcc acattgtaca 7860 cacatttgct taagtctatg gaggcgcaag gttttaagtc tgtggttgct gttataggcc 7920 ttccaaacga tccatctgtt aggttgcatg aggctttggg atacacagcc cggggtacat 7980 tgcgcgcagc tggatacaag catggtggat ggcatgatgt tggtttttgg caaagggatt 8040 ttgagttgcc agctcctcca aggccagtta ggccagttac ccagatctga ggtaccctga 8100 gcttgagctt atgagcttat gagcttagag ctcggatcca ctagtaacgg ccgccagtgt 8160 gctggaattc gcccttgact agataggcgc ccagatcggc ggcaatagct tcttagcgcc 8220 atcccgggtt gatcctatct gtgttgaaat agttgcggtg ggcaaggctc tctttcagaa 8280 agacaggcgg ccaaaggaac ccaaggtgag gtgggctatg gctctcagtt ccttgtggaa 8340 gcgcttggtc taaggtgcag aggtgttagc gggatgaagc aaaagtgtcc gattgtaaca 8400 agatatgttg atcctacgta aggatattaa agtatgtatt catcactaat ataatcagtg 8460 tattccaata tgtactacga tttccaatgt ctttattgtc gccgtatgta atcggcgtca 8520 caaaataatc cccggtgact ttcttttaat ccaggatgaa ataatatgtt attataattt 8580 ttgcgatttg gtccgttata ggaattgaag tgtgcttgcg gtcgccacca ctcccatttc 8640 ataattttac atgtatttga aaaataaaaa tttatggtat tcaatttaaa cacgtatact 8700 tgtaaagaat gatatcttga aagaaatata gtttaaatat ttattgataa aataacaagt 8760 caggtattat agtccaagca aaaacataaa tttattgatg caagtttaaa ttcagaaata 8820 tttcaataac tgattatatc agctggtaca ttgccgtaga tgaaagactg agtgcgatat 8880 tatggtgtaa tacatagcgg ccgggtttct agtcaccggt taggatccgt ttaaactcga 8940 ggctagcgca tgcacataga cacacacatc atctcattga tgcttggtaa taattgtcat 9000 tagattgttt ttatgcatag atgcactcga aatcagccaa ttttagacaa gtatcaaacg 9060 gatgtgactt cagtacatta aaaacgtccg caatgtgtta ttaagttgtc taagcgtcaa 9120 tattttaatt cttaacaatc aatattttaa ttcttaaact ttattaaatc 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ctcaaaaaag 10020 gaagttggat ttcttctcaa taactctaaa aaattattcc tatttcaaaa aatatttttt 10080 atgtctttct ctaattgatg aataatatct atttaagtat attttattgt gaaatccaca 10140 aaagtgactg ataaatctaa tttaggatct accattagag aaaaataaat aaattcttat 10200 attatatgtg at 10212

Claims (16)

  1. 곤충을 곤충 저항성 대두 식물에 노출시킴으로써 곤충을 방제하는 것을 포함하는 곤충 방제 방법으로서, 상기 대두 식물은 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 및 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 서열; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 서열을 포함하는 DNA를 포함하고, 상기 제1 및 제2 서열은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 존재의 특징인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 곤충이 슈도플루시아 인클루덴스 (Pseudoplusia includens) (대두 자벌레)인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 곤충이 안티카르시아 겜마탈리스 (Anticarsia gemmatalis) (벨벳빈 애벌레)인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 곤충이 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (가을 거염벌레)인 방법.
  5. 글리포시네이트 제초제, 페녹시아세트산 제초제, 피리딜옥시아세트산 제초제, 또는 이들의 조합을 대두 농작물을 포함하는 지역에 적용하는 것을 포함하는 대두 농작물에서의 잡초 방제 방법으로서, 상기 대두 농작물은 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 및 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 서열; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 서열을 갖는 DNA를 포함하는 대두 식물을 포함하고, 상기 서열들은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1의 존재의 특징인 방법.
  6. 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 및 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 단리된 DNA 서열.
  7. 제1 식물을 제2 대두 식물과 교배시켜 제3 대두 식물을 생산하며, 상기 제1 식물은 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 및 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물을 포함하는 DNA를 포함하는 단계; 및
    서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 및 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물을 포함하는 DNA의 존재에 대해 상기 제3 대두 식물을 분석하는 단계를 포함하는, 대두 식물의 육종법.
  8. 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 및 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 서열, 및 그의 상보물을 포함하고; 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 서열, 및 그의 상보물을 포함하는 접합부 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자.
  9. 슈도플루시아 인클루덴스 (대두 자벌레)에 대해 저항성을 가지며, 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 및 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열, 및 그의 상보물을 갖고; 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열, 및 그의 상보물을 갖는 DNA를 포함하는 대두 식물 또는 그의 일부.
  10. 제9항의 식물의 종자.
  11. 제5항의 대두 식물 또는 그의 일부로부터 유도된 조성물로서, 상기 조성물은 대두 밀 (soybean meal), 콩가루 (soy flour), 콩 단백질 농축물, 및 콩기름 (soy oil)으로 이루어진 군으로부터 선택된 상품인 조성물.
  12. 대두 낟알, 종자, 밀 또는 가루에서 해충을 방제하는 방법으로서, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1을 상기 낟알, 종자, 밀 또는 가루에 포함시키는 것을 포함하며, 이는 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 및 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열, 및 그의 상보물을 포함하는 DNA를 포함하는 것에 의해 입증되는 방법.
  13. 서열 1의 bp 1385-1415; 서열 1의 bp 1350-1450; 서열 1의 bp 1300-1500; 서열 1의 bp 1200-1600; 서열 2의 bp 137-168; 서열 2의 bp 103-203; 서열 2의 bp 3-303으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 DNA 서열; 및 서열 15의 bp 2680-2780; 서열 15의 bp 2630-2830; 서열 15의 bp 2530-2930; 서열 15의 bp 9071-9171; 서열 15의 bp 9021-9221; 및 서열 15의 bp 8921-9321로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 DNA 서열, 및 그의 상보물을 그의 게놈 내에 포함하는 대두 종자.
  14. 제13항의 대두 종자로부터 성장한 대두 식물.
  15. 꽃가루, 배주, 꽃, 출아물 (shoot), 뿌리 및 잎으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1을 포함하는, 제14항의 대두 식물의 일부.
  16. 대두 밀, 대두 가루 및 대두유로 이루어진 군으로부터 선택된 상품인, 제14항의 대두 식물 또는 그의 일부로부터 유도된 조성물.
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