BR112012014746B1 - Método para controlar o desenvolvimento da resistência de um inseto à uma proteína inseticida derivada de um bacillus thuringiensis, bem como composição e método para o controle de pragas de lepidópteros - Google Patents

Método para controlar o desenvolvimento da resistência de um inseto à uma proteína inseticida derivada de um bacillus thuringiensis, bem como composição e método para o controle de pragas de lepidópteros Download PDF

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Abstract

uso combinado de proteínas cry1ca e cry1ab para gerenciamento de resistência em inseto. a presente invenção refere-se a métodos e plantas para o controle de insetos lepidópteros, as referidas plantas compreendendo proteína inseticida cry1ca e uma proteína inseticida cry1ab em combinação para retardar ou impedir o desenvolvimento de resistência pelos insetos.

Description

Antecedentes da invenção
Os seres humanos cultivam o milho para aplicações alimentícias e energéticas. Seres humanos também cultivam muitas outras safras, incluindo soja e algodão. Insetos comem e danificam as plantas e, desse modo, minam esses esforços humanos. Bilhões de dólares são gastos por ano para controlar pestes de inseto e bilhões adicionais são perdidos pelo dano que elas causam. Inseticidas químicos orgânicos sintéticos têm sido as ferramentas primárias usadas para controlar pestes de inseto, mas inseticidas biológicos, tais como as proteínas inseticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt), têm exercido um papel importante em algumas áreas. A capacidade de produzir plantas resistentes a inseto mediante transformação com genes de proteína inseticida Bt tem revolucionado a agricultura moderna e destacado a importância e valor de proteínas inseticidas e seus genes.
Várias proteínas Bt têm sido usadas para criar as plantas trans- gênicas resistentes a inseto que foram registradas e comercializadas com sucesso até o momento. Essas incluem Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fa e Cry3Bb em milho, Cry1Ac e Cry2Ab em algodão e Cry3A em batata.
Os produtos comerciais que expressam essas proteínas expressam uma única proteína, exceto em casos onde o espectro inseticida combinado de 2 proteínas é desejado (e.g, Cry1Ab e Cry3Bb em milho combinadas para conferir resistência a pestes de lepidópteros e crisomelídeo, respectivamente) ou onde a ação independente das proteínas as tornam úteis como uma ferramenta para retardar o desenvolvimento de resistência em populações de inseto suscetíveis (por exemplo, Cry1Ac e Cry2Ab em algodão combinadas para conferir gerenciamento de resistência à lagarta do tabaco).
Isto é, algumas das qualidades de plantas transgênicas resisten- tes a inseto que levaram à adoção rápida e disseminada dessa tecnologia também deram origem à preocupação de que as populações de pestes detes a inseto que levaram à adoção rápida e disseminada dessa tecnologia também deram origem à preocupação de que as populações de pestes de- senvolverão resistência às proteínas inseticidas produzidas por essas plantas.
Várias estratégias foram sugeridas para preservar a utilidade de traços de resistência a inseto baseados em Bt, os quais incluem emprego de proteínas em uma alta dose em combinação com uma proteção e alternando com ou co-empregando diferentes toxinas (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management", Nature Biotechnol. 16: 144-146).
As proteínas selecionadas para uso em uma pilha de gerenciamento de resistência a inseto (Insect Resistant Management - IRM) precisam exercer seu efeito inseticida independentemente, de modo que a resistência desenvolvida a uma proteína não venha a conferir resistência à segunda proteína (isto é, não haja resistência cruzada às proteínas). Se, por exemplo, uma população de peste que é resistente à "Proteína A" é sensível à "Proteína B", se pode concluir que não há resistência cruzada e que uma combinação de Proteína A e Proteína B seria eficaz para retardar a resistência à Proteína A apenas.
Na ausência de populações de inseto resistentes, avaliações podem ser feitas com base em outras características que se presume estarem relacionadas ao mecanismo de ação e potencial de resistência cruzada. A utilidade de ligação mediada por receptor na identificação de proteínas inseticidas que provavelmente não exibem resistência cruzada foi sugerida (van Mellaert et al. 1999). O fator de previsão chave de falta de resistência cruzada inerente nessa abordagem é que as proteínas inseticidas não competem pelos receptores em uma espécie de inseto sensível.
No caso em que duas toxinas Bt competem pelo menos receptor, então, se esse receptor sofre mutação, de modo que uma das toxinas não se liga mais a esse receptor e, assim, não é mais inseticida contra o inseto, este poderia ser o caso onde o inseto também seria resistente à segunda toxina (a qual se liga competitivamente ao mesmo receptor). Isto é, o inseto é dito como tendo resistência cruzada a ambas as toxinas Bt. Contudo, se duas toxinas se ligam a dois receptores diferentes, isso poderia ser uma indicação de que o inseto não seria simultaneamente resistente a essas duas toxinas. CrylAb é uma proteína inseticida atualmente usada em milho transgênico para proteger as plantas de uma variedade de pestes de inseto. Uma peste chave em milho que confere proteção contra CrylAb é a broca do milho Europeu.
Toxinas Cry adicionais são listadas no website do Official B.t. Nomenclature Committee (Crickmore et al.; lifes- ci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Existem atualmente quase 60 grupos principais de toxinas "Cry" (Cry1-Cry59), com toxinas Cyt e toxinas VIP adicionais e semelhantes. Muitos de cada grupo numérico têm subgrupos em letra maiuscula e os subgrupos em letra maiuscula têm subgrupos em letra minúscula (Cry1 tem A-L e Cry1A tem a-i, por exemplo).
Breve Sumário da invenção
A presente invenção refere-se, em parte, à surpreendente descoberta de que a CrylCa é muito ativa contra broca da cana-de-açúcar, incluindo uma população de broca da cana-de-açúcar que é resistente a CrylAb. Conforme aqueles versados no campo reconhecerão com o benefício da presente divulgação, plantas que produzem CrylCa e CrylAb (incluindo porções inseticidas das mesmas),serão úteis para retardar ou prevenir o desenvolvimento de resistência a qualquer uma dessas proteínas inseticidas isoladamente. Um gene de Cry1 Fa, por exemplo, também poderia ser empilhado com esses dois pares de base de genes/proteínas.
A presente invenção refere-se também à descoberta de que CrylCa e CrylAb não competem uma com a outra pela ligação em receptores no intestino de lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda; FAW).
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 - Competição pela ligação a BBMVs de Spodoptera frugiperda pela toxina central CrylAb, toxina central CrylCa e proteína de toxina central CrylCa rotulada com 125l.
Figura 2 - Competição pela ligação a BBMVs de Spodoptera frugiperda pela toxina central CrylCa, toxina central CrylAb e proteína de toxina central CrylAb rotulada com 125l.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 - proteína quimérica CrylCa central/pró-toxina CrylAb de 1164 aa (DIG-152) SEQ ID NO: 2 - a toxina central CrylCa SEQ ID NO: 3 - a toxina central CrylAb DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se, em parte, à surpreendente descoberta de que a CrylCa é muito ativa contra uma população de broca da cana-de-açúcar (SCB; Diatraea saccharalis) que é resistente a CrylAb. Assim sendo, a presente invenção refere-se, em parte, à surpreendente descoberta de que a CrylCa pode ser usada em combinação com ou "empilhada" com a CrylAb para combater o desenvolvimento de resistência a qualquer uma dessas proteínas inseticidas isoladamente. Falando de outra forma, a presente invenção refere-se, em parte, à surpreendente descoberta de que uma população de broca da cana-de-açúcar selecionada pela resistência a CrylAb não é resistente a CrylCa; broca da cana-de-açúcar que é resistente à toxina CrylAb é suscetível (isto é, não mostra resistência cruzada) a CrylCa. Assim, a presente invenção inclui o uso de toxina CrylCa para controlar populações de broca da cana-de-açúcar que são resistentes a CrylAb.
Conforme aqueles versados no campo reconhecerão com o benefício da presente divulgação, plantas que expressam CrylCa e CrylAb (incluindo porções inseticidas das mesmas),serão úteis para retardar ou prevenir o desenvolvimento de resistência a qualquer uma dessas proteínas inseticidas isoladamente.
A presente invenção inclui o uso de CrylCa para proteger cana- de-açúcar e outras espécies de planta economicamente importantes contra dano e perda de rendimento causada pela broca da cana-de-açúcar ou a populações de broca da cana-de-açúcar que tenham desenvolvido resistência a CrylAb. A broca da cana-de-açúcar pode também ser uma peste de milho. Isso é particularmente verdadeiro em alguns países da América do Sul e Central, tais como Brasil e Argentina. Assim, milho, por exemplo, pode também ser protegido de acordo com a presente invenção.
A presente invenção, assim, ensina uma pilha de gerenciamento de resistência em inseto (IRM) para prevenir ou aliviar o desenvolvimento de resistência pela broca da cana-de-açúcar a CrylAb e/ou CrylCa.
Além disso, estudos de ligação a receptor usando CrylCa ra- diorrotulada e tecidos de lagarta-do-cartucho (FAW), Spodoptera frugipera, mostram que CrylAb não compete pelo sítio de alta afinidade de ligação ao qual a CrylCa se liga. Esses resultados indicam que a combinação de CrylAb e CrylCa pode ser usada como um meio eficaz para aliviar o desenvolvimento de resistência em populações de inseto (tais como FAW e SCB) a CrylAb e/ou CrylCa para plantas (tais como milho e cana-de-açúcar) que produzem ambas as proteínas. Embora estudos de sobreposição de toxina tenham demonstrado que a proteína CrylCa se liga a duas proteínas em BBMV's de S. frugiperda, uma de 40 kDa e uma de 44 kDa, enquanto que a proteína CrylAb se liga a uma única proteína de 150 kDa (Aranda et al., 1996), que não se referem a estudos de ligação não competitiva.
Assim, a presente invenção também inclui a combinação de CrylCa e CrylAb como uma pilha IRM para aliviar o desenvolvimento de resistência pela lagarta-do-cartucho e/ou broca da cana-de-açúcar a qualquer proteína ou a populações de broca da cana-de-açúcar que tenham desenvolvido resistência a CrylAb.
A presente invenção proporciona composições para o controle de pestes de lepidópteros compreendendo células que expressam uma proteína contendo toxina central CrylCa e uma proteína contendo toxina central CrylAb; um hospedeiro transformado para expressar uma proteína contendo toxina central CrylAb e uma proteína contendo toxina central Cry1C, em que o referido hospedeiro é um micro-organismo ou uma célula de planta (o(s) polinucleotídeo(s) em questão está(ão), de preferência, em um constru- to genético sob o controle de (operavelmente ligado a / compreendendo) um promotor que não é de Bacillus thuringiensis; os polinucleotídeos em questão podem compreender uso de códon para expressão intensificada em uma planta); um método de controle de pestes de lepidópteros compreendendo contato das referidas pestes ou do ambiente das referidas pestes com uma quantidade eficaz de uma composição que produz uma proteína contendo toxina central CrylAb e uma célula que expressa uma proteína contendo toxina central Cry1C; uma planta (tal como uma planta de milho ou soja ou algodão ou cana-de-açúcar, por exemplo) compreendendo DNA que codifica uma proteína contendo toxina central CrylCa e DNA que codifica uma proteína contendo toxina central CrylAb e cultivo de tal planta; uma planta (tal como uma planta de milho ou soja ou algodão ou cana-de-açúcar, por exemplo) em que DNA que codifica uma proteína contendo toxina central CrylCa e DNA que codifica uma proteína contendo toxina central CrylAb foram introgredidos na referida planta de milho e cultivo de tal planta.
Foi demonstrado, por exemplo, que a CrylCa (proteína da cepa recombinante de Pseudomonas fluorescens MR1206/DC639; plasmídeo pMYC2547) é muito eficaz no controle de populações de broca da cana-de- açúcar (SCB; Diatraea saccharalis), em bioensaios com dieta artificial, que tenham sido selecionadas pela resistência a CrylAb. Isso indica que a CrylCa é útil no controle de populações de SCB que tenham desenvolvido resistência a CrylAb ou para aliviar o desenvolvimento de resistência a CrylAb em populações de SCB.
Com base, em parte, nos dados descritos aqui, coexpressão de CrylCa e CrylAb pode produzir uma pilha IRM de alta dose para o controle de SCB. Outras proteínas podem ser adicionadas a essa combinação para adicionar espectro.Por exemplo em milho, a adição de CrylFa criaria uma pilha IRM para a broca do milho Europeu (ECB), Ostrinia nubilalis (Hübner), enquanto que adição de ainda outra MOA para o controle de SCB.
Para uma revisão de Cry1C como um bioinseticida potencial em plantas, vide (Avisar et al. 2009). Avisar D, Eilenberg H, Keller M, Reznik N, Segal M, Sneh B, Zilberstein A (2009) The Bacillus thuringiensis delta- endotoxin Cry1C as a potential bioinsecticide in plants. Plant Science 176: 315-324.
Receptores de Inseto.
Conforme descrito nos Exemplos, estudos de ligação competitiva a receptor usando proteína de toxina central CrylCa radiorrotulada mostram que a proteína de toxina central CrylAb não compete pelo sítio de alta afinidade de ligação presente em tecidos de inseto FAW aos quais a CrylCa se liga. Esses resultados indicam que a combinação de proteínas CrylAb e CrylCa seria um meio eficaz para aliviar o desenvolvimento de resistência em populações de FAW a CrylAb (e, da mesma forma, o desenvolvimento de resistência a CrylCa) e provavelmente aumentaria o nível de resistência a essa peste em plantas de milho que expressam ambas as proteínas.
Esses dados também sugerem que a Cry 1 Ca seria eficaz no controle de populações de SCB que tenham desenvolvido resistência a CrylAb. Uma opção de emprego seria usar essas proteínas Cry em locais onde CrylAb se tornou ineficaz no controle de SCB em virtude do desenvolvimento de resistência. Outra opção de emprego seria usar CrylCa em combinação com CrylAb para aliviar o desenvolvimento de resistência a CrylAb em SCB.
Combinações das toxinas descritas na invenção podem ser usadas para controlar pestes de lepidópteros. Lepidópteros adultos, isto é, borboletas e mariposas, se alimentam primariamente do néctar de flores. As larvas, isto é, lagartas, se alimentam quase todas sobre plantas e muitas são pestes graves. Lagartas se alimentam sobre ou dentro da folhagem ou sobre as raízes ou caule de uma planta, privando a planta de nutrientes e, muitas vezes, destruindo a estrutura de suporte físico da planta. Adicionalmente, lagartas se alimentam sobre os frutos, tecidos e grãos e farinhas armazenadas, arruinando esses produtos para venda ou diminuindo gravemente seu valor. Conforme usado aqui, referência a pestes de lepidópteros refere-se a vários estágios de vida da peste, incluindo estágios larvais.
As toxinas quiméricas da presente invenção compreendem uma porção de toxina central completa N-terminal de uma toxina B.t. e, em algum ponto que ultrapassa o final da porção de toxina, a proteína tem uma transi ção uma sequência de pró-toxina heteróloga. A porção de toxina N-terminal de uma toxina B.t. é referida aqui como a toxina "central". A transição para o segmento de pró-toxina heterólogo pode ocorrer aproximadamente na união de toxina/pró-toxina ou, alternativamente, uma porção da pró-toxina nativa (que se estende além da porção de toxina) pode ser retida com a transição to a pró-toxina heteróloga ocorrendo a jusante.
Como um exemplo, uma toxina quimérica da presente invenção tem a porção de toxina central completa de CrylAb (aminoácidos 1 a 601) e uma pró-toxina heteróloga (aminoácidos 602 até o C-término). Em uma modalidade preferida, a porção de uma toxina quimérica compreendendo a pró- toxina é derivada de uma toxina de proteína CrylAb. Como um segundo e- xemplo, uma segunda toxina quimérica da presente invenção, conforme divulgado no documento SEQ ID NO: 1 (DIG- 152) tem a porção de toxina central completa de CrylCa (aminoácidos 1 a 619) e uma pró-toxina heteróloga (aminoácidos 620 até o C-término). Em uma modalidade preferida, a porção de uma toxina quimérica compreendendo a pró-toxina é derivada de uma toxina de proteína CrylAb.
Aqueles versados no campo apreciarão que toxinas B.t., mesmo dentro de uma determinada classe, tal como CrylCa, variarão, até certo ponto, quanto ao comprimento e a localização precisa da transição da porção de toxina para a porção de pró-toxina. Tipicamente, as toxinas CrylCa têm cerca de 1150 a cerca de 1200 aminoácidos de comprimento. A transição da porção de toxina para a porção de pró-toxina ocorrerá, tipicamente, entre cerca de 50% a cerca de 60% da toxina de comprimento total. A toxina quimérica da presente invenção incluirá a extensão total dessa porção de toxina central N-terminal. Assim, a toxina quimérica compreenderá pelo menos cerca de 50% da toxina B.t. CrylCa ou CrylAb de comprimento total. Essa terá, tipicamente, pelo menos cerca de 590 aminoácidos. Com relação à porção de pró-toxina, a extensão total da porção de pró-toxina Cry1A(b) se estende da extremidade da porção de toxina até o C-término da molécula. Ela tem cerca de 100 a 150 aminoácidos dessa porção, os quais são mais críticos para inclusão na toxina quimérica da presente invenção.
Genes e Toxinas.
Os genes e toxinas úteis de acordo com a presente invenção incluem não apenas as sequências de comprimento total divulgadas, mas também fragmentos dessas sequências, variantes, mutantes e proteínas de fusão as quais retêm a atividade pesticida característica das toxinas especificamente exemplificadas aqui. Conforme usado aqui, os termos "variantes" ou "variações" de genes referem-se a sequências de nucleotídeo as quais codificam as mesmas toxinas ou as quais codificam toxinas equivalentes tendo atividade pesticida. Conforme usado aqui, o termo "toxinas equivalentes" refere-se a toxinas tendo a mesma ou essencialmente a mesma atividade biológica contra as pestes alvo que as toxinas reivindicadas.
Conforme usado aqui, os limites representam aproximadamente 95% (CrylAb's e 1Ca's), 78% (Cryl's e CrylCs) e 45% (CryTs) de identidade de sequência, conforme "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum e D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Esses cortes podem também ser aplicados a toxinas centrais apenas (para toxinas CrylAb e Cry1C). Os números do GENBANK listados no Apêndice A podem também ser usados para obter as sequências para qualquer um dos genes e proteínas divulgados ou mencionados aqui.
Será evidente para aqueles versados no campo que genes que codificam toxinas ativas podem ser identificados e obtidos através de vários meios. Os genes ou porções gênicas específicas exemplificados aqui podem ser obtidos dos isolados depositados em um depositório de cultura conforme descrito acima. Esses genes ou porções ou variantes dos mesmos, podem também ser construídos sinteticamente, por exemplo, mediante o uso de um sintetizador de gene. Variações gênicas podem também ser prontamente construídas usando técnicas padrões para fazer mutações por pontos. Também, fragmentos desses genes podem ser feitos usando exonucleases ou endonucleases comercialmente disponíveis de acordo com procedimentos padrões. Por exemplo, enzimas tal como Bal31 ou mutagênese sítio-dirigida pode ser usada para cortar sistematicamente nucleotídeos das extremidades desses genes. Também, genes os quais codificam fragmentos ativos podem ser obtidos usando uma variedade de enzimas de restrição. Proteases podem ser usadas para obter diretamente fragmentos ativos dessas toxinas.
Fragmentos e equivalentes os quais retêm a atividade pesticida das toxinas exemplificadas estariam dentro do escopo da presente invenção. Também, em virtude da redundância do código genético, uma variedade de diferentes sequências de DNA podem codificar as sequências de aminoácido divulgadas aqui. Está bem dentro da capacidade daqueles versados no campo para criar essas sequências de DNA alternativas que codificam as mesmas ou essencialmente as mesmas toxinas. Essas sequências de DNA variantes estão dentro do escopo da presente invenção. Conforme usado aqui, referência a "essencialmente a mesma" sequência refere-se a sequências as quais têm substituições, deleções, adições ou inserções de aminoácido as quais não afetam materialmente a atividade pesticida. Fragmentos que retêm atividade pesticida também são incluídos nessa definição.
Um outro método para identificação dos genes que codificam toxinas e porções gênicas úteis de acordo com a presente invenção é mediante o uso de sondas de oligonucleotídeo. Essas sondas são sequências de nucleotídeo detectáveis. Essas sequências podem ser detectáveis em virtude de um rótulo apropriado ou podem ser tornadas inerentemente fluorescentes, conforme descrito no Pedido Internacional No. WO93/16094. Conforme é bem conhecido na técnica, se a molécula de sonda e a amostra de ácido nucleico se hibridizam mediante formação de uma ligação forte entre as duas moléculas, pode-se presumir razoavelmente que a sonda e a amostra têm homologia substancial. De preferência, hibridização é conduzida sob condições estringentes através de métodos bem conhecidos na técnica, conforme descrito, por exemplo, em Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., páginas 169-170. Alguns exemplos de combinações de concentrações de sal e temperatura são como segue (em ordem crescente de estringência): 2X SSPE ou SSC em temperatura ambiente; 1X SSPE ou SSC a 42° C; 0,1X SSPE ou SSC a 42° C; 0,1X SS-
PE ou SSC a 65° C. Detecção da sonda constitui um meio para determinar, de uma maneira conhecida, se hibridização ocorreu. Tal análise de sonda proporciona um método rápido para identificação de genes que codificam toxina da presente invenção. Os segmentos de nucleotídeo os quais são usados como sondas de acordo com a invenção podem ser sintetizados u- sando um sintetizador de DNA e procedimentos padrões. Essas sequências de nucleotídeo podem também ser usadas como iniciadores de PCR para amplificar os genes da presente invenção.
Determinadas toxinas da presente invenção foram especificamente exemplificadas aqui. Uma vez que essas toxinas são meramente e- xemplificativas das toxinas da presente invenção, será prontamente evidente que a presente invenção compreende toxinas variantes ou equivalentes (e sequências de nucleotídeo que codificam toxinas equivalentes) tendo a mesma ou atividade pesticida similar à toxina exemplificada. Toxinas equivalentes terão homologia de aminoácido com uma toxina exemplificada. Essa homologia de aminoácido será, tipicamente, maior do que 75%, de preferência será maior do que 90% e, ainda mais preferivelmente, será maior do que 95%. A homologia de aminoácido será maior em regiões críticas da toxina as quais respondem pela atividade biológica ou estão envolvidas na determinação da configuração tridimensional a qual, por fim, é responsável pela atividade biológica. A esse respeito, determinadas substituições de aminoácido são aceitáveis e podem ser esperadas se essas substituições estão em regiões as quais não são críticas para atividade ou são substituições conservatives de aminoácido as quais não afetam a configuração tridimensional da molécula. Por exemplo, aminoácidos podem ser colocados nas classes a seguir: não polares, polares não carregados, básicos e ácidos. Substituições conservatives pelas quais um aminoácido de uma classe é substituído por outro aminoácido do mesmo tipo caem dentro do escopo da presente invenção, contando que a substituição não altere materialmente a atividade biológica do composto. A Tabela 1 fornece uma listagem de exemplos de aminoácidos pertencendo a cada classe. TABELA 1
Em alguns casos, substituições não conservatives podem tam bém ser feitas. O fator crítico é que essas substituições não devem prejudicar significativamente a atividade biológica da toxina.
Hospedeiros Recombinantes.
Os genes que codificam as toxinas da presente invenção podem ser introduzidos em uma ampla variedade de hospedeiros microbianos ou vegetais. Expressão do gene de toxina resulta, direta ou indiretamente, na produção intracelular e manutenção do pesticida. Transferência conjugal e transferência recombinante podem ser usadas para criar uma cepa de B.t. que expressa ambas as toxinas da presente invenção. Outros organismos hospedeiros podem também ser transformados com um ou ambos os genes de toxina, então, usados para obter o efeito sinergístico. Com hospedeiros microbianos adequados, por exemplo, Pseudomonas, os micróbios podem ser aplicados ao local da peste, onde eles proliferarão e serão ingeridos. O resultado é controle da peste. Alternativamente, o micróbio que hospeda o gene de toxina podem ser tratadas sob condições que prolongam a atividade da toxina e estabilizam a célula. A célula tratada, a qual retém a atividade tóxica pode, então, ser aplicada ao ambiente da peste alvo.
Onde o gene de toxina B.t. é introduzido via um vetor adequado em um hospedeiro microbiano e o referido hospedeiro é aplicado ao ambiente em um estado vivo, é essencial que determinados micróbios hospedeiros sejam usados. São selecionados hospedeiros microbianos os quais são conhecidos por ocupar a "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplano) de uma ou mais safras de interesse. Esses micro-organismos são selecionados de modo a serem capazes de competir com sucesso no ambiente particular (safra e outros habitats de insetos) com os micro-organismos do tipo silvestre, conferem manutenção e expressão estáveis do gene que expressa o polipeptídeo pesticida e, desejavelmente, conferem proteção aprimorada ao pesticida contra degradação ambiental e inativação.
Um grande número de micro-organismos são conhecidos por habitar o filoplano (a superfície das folhas planas) e/ou a rizosfera (the soil surrounding plant roots) de uma ampla variedade de safras importantes. Esses micro-organismos incluem bactérias, algas e fungos. De interesse particular são micro-organismos tais como bactérias, por exemplo, os gêneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobac- ter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc e Alcaligenes; fungos, particularmente levedura, por exemplo, os gêneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula e Aureobasi- dium. De interesse particular são espécies bacterianas da fitosfera, tais como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marces- cens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus e Azotobacter vinlandii; e espécies de levedura da fitosfera, tais como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae e Aureobasidium pollulans. De interesse particular são os micro-organismos pigmentados.
Uma ampla variedade de formas estão disponíveis para introdução de um gene de B.t. que codifica uma toxina em um hospedeiro microbiano sob condições as quais permitem manutenção e expressão estáveis do gene. Esses métodos são bem conhecidos por aqueles versados no campo e são descritos, por exemplo, in Na patente U.S. No. 5.135.867, a qual é incorporada aqui por referência.
Tratamento de Células.
Bacillus thuringiensis ou células recombinantes que expressam as toxinas B.t. podem ser tratadas para prolongar a atividade da toxina e estabilizar a célula. A microcápsula pesticida que é formada compreende a toxina ou toxinas B.t. dentro de uma estrutura celular que tenha sido estabilizada e protegerá a toxina quando a microcápsula é aplicada ao ambiente da peste alvo. Células hospedeiras adequadas podem incluir procariotas ou eucariotas, normalmente estando limitadas àquelas células as quais não produzem substâncias tóxicas para organismos superiores, tais como mamíferos. Contudo, organismos os quais produzem substâncias tóxicas para organismos superiores poderiam ser usadas, onde as substâncias tóxicas são instáveis ou o nível de aplicação suficientemente baixo de forma a evitar qualquer possibilidade de toxicidade para um hospedeiro mamífero. Como hospedeiros, de interesse particular serão os procariotas e os eucariotas inferiores, tais como fungos.
A célula usualmente estará intacta e estará substancialmente na forma proliferativa quando tratada, ao invés de em uma forma de esporo embora, em alguns casos, esporos possam ser empregados.
Tratamento da célula microbiana, por exemplo, um micróbio contendo o gene ou genes de toxina B.t., pode ser através de meios químicos ou físicos ou através de uma combinação de meios químicos e/ou físicos, contanto que a técnica não afete prejudicialmente as propriedades da toxina, nem diminua a capacidade celular de proteção da toxina. Exemplos de reagentes químicos são agentes de halogenação, particularmente halogênios de número atômico 17-80. Mais particularmente, iodo pode ser usado sob condições suaves e durante um tempo suficiente para obter os resultados desejados. Outras técnicas adequadas incluem tratamento com aldeídos, tal como glutaraldeído; anti-infectivos, tais como cloreto de zefirano e cloreto de cetilpiridínio; álcoois, tais como álcool isopropílico e etanol; vários fixadores histológicos, tais como iodo Lugol, fixador de Bouin, vários ácidos e fixador de Helly (vide: Humason, Gretchen L, Animal Tissue Técnicas, W. H. Freeman and Company, 1967); ou uma combinação de agentes físicos (calor) e químicos que preservam e prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é administrada ao ambiente do hospedeiro. Exemplos de meios físicos são radiação com comprimento de onda curto, tal como radiação gama e raios X, congelamento, irradiação UV, liofilização e seme- lhantes. Métodos para tratamento de células microbiais são divulgados nas patentes U.S. Nos. 4.695.455 e 4.695.462, as quais são incorporadas aqui por referência.
As células têm, geralmente, estabilidade estrutural intensificada, a qual intensificará a resistência às condições ambientais. Onde o pesticida está em uma pró-forma, o método de tratamento celular deverá ser selecionado de modo a não inibir o processamento da pró-forma à forma madura do pesticida pela peste patogênica alvo. Por exemplo, formaldeído causará ligação cruzada das proteínas e poderia inibir o processamento da pró-forma de um pesticida polipeptídico. O método de tratamento deverá reter pelo menos uma porção substancial da biodisponibilidade ou bioatividade da toxina.
Características de interesse particular na seleção de uma célula hospedeira para fins de produção incluem facilidade de introdução o gene ou genes de B.t. no hospedeiro, disponibilidade de sistemas de expressão, eficiência de expressão, estabilidade do pesticida no hospedeiro e a presença de capacidades genéticas auxiliares. Características de interesse para uso como uma microcápsula pesticida incluem qualidades protetoras para o pesticida, tais como paredes celulares espessas, pigmentação e engolfamento intracelular ou formação de corpos de inclusão; sobrevivência em ambientes aquosos; falta de toxicidade em mamífero; atratividade para ingestão pelas pestes; facilidade de morte e fixação sem dano à toxina; e semelhantes. Outras considerações incluem facilidade de formulação e manipulação, custos, estabilidade ao armazenamento e semelhantes.
Crescimento de Células.
O hospedeiro celular contendo o gene ou genes inseticidas de B.t. pode ser crescido em qualquer meio nutriente conveniente, onde o cons- truto de DNA confere uma vantagem seletiva, constituindo um meio seletivo, de modo que substancialmente todas as células retenham o gene de B.t. Essas células podem, então, ser coletadas de acordo com formas convencionais. Alternativamente, as células podem ser tratadas antes de coleta.
As células de B.t. que produzem as toxinas da invenção podem ser cultivadas usando meios padrões no campo e técnicas de fermentação. Quando de término do ciclo de fermentação, as bactérias podem ser coletadas primeiro separando os esporos e cristais de B.t. do caldo de fermentação através de meios bem conhecidos na técnica. Os esporos e cristais de B.t. recuperados podem ser formulados em um pó umidecível, concentrado líquido, grânulos ou outras formulações mediante a adição de tensoativos, dispersantes, veículos inertes e outros componentes para facilitar a manipulação e aplicação para pestes alvo particulares. Essas formulações e proce-dimentos de aplicação são todos bem conhecidos na técnica.
Formulações.
Grânulos de isca formulados contendo um atraente e esporos, cristais e toxinas dos isolados de B.t. ou micróbios recombinantes compreendendo os genes obteníveis dos isolados de B.t. divulgados aqui, podem ser aplicados ao solo. O produto formulado pode também ser aplicado como um revestimento para semente ou tratamento para a raiz ou tratamento para a planta toda nos estágios posteriores do ciclo da safra. Tratamentos do solo e da planta com células de B.t. podem ser empregados como pós umedecí- veis, grânulos ou pós, mediante mistura com vários materiais inertes, tais como minerais inorgânicos (filo-silicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos e semelhantes) ou materiais botânicos (sabugos de milho em pó, cascas de arroz, cascas de nozes e semelhantes). As formulações podem incluir adjuvantes dispersantes-aderentes, agentes de estabilização, outros aditivos pesticidas ou tensoativos. Formulações líquidas podem ser aquosas ou não aquosas e empregadas como espumas, géis, suspensões, concentrados emulsificáveis ou semelhante. Os ingredientes podem incluir agentes reoló- gicos, tensoativos, emulsificantess, dispersantes ou polímeros.
Conforme será apreciado por aqueles versados na técnica, a concentração de pesticida variará amplamente, dependendo da natureza da formulação em particular, particularmente se ela é um concentrado ou tem de ser usada diretamente. O pesticida estará presente em pelo menos 1% em peso e pode ser 100% em peso. As formulações secas terão de cerca de 1-95% em peso do pesticida, enquanto que as formulações líquidas geral- mente terão de cerca de 1-60% em peso dos sólidos na fase líquida. As for-mulações geralmente terão de cerca de 102 a cerca de 104 células/mg. Essas formulações serão administradas em cerca de 50 mg (líquidas ou secas) a 1 kg ou mais por hectare.
As formulações podem ser aplicadas ao ambiente da peste lepi- dóptera, por exemplo, folhagem ou solo, através de pulverização, polvilha- mento, borrifação ou semelhante.
Transformação de Planta.
Um hospedeiro recombinante preferido para produção das proteínas inseticidas da presente invenção é uma planta transformada. Genes que codificam proteínas de toxina de Bt, conforme divulgado aqui, podem ser inseridas em células de planta usando uma variedade de técnicas, as quais são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, um grande número de vetores de clonagem compreendendo um sistema de replicação em Escherichia coli e um marcador que permite seleção das células transformadas estão disponíveis para o preparo para a inserção de genes estranhos em plantas superiores. Os vetores compreendem, por exemplo, pBR322, a série pUC, a série M13mp, pACYC184, inter alia. Assim sendo, o fragmento de DNA tendo a sequência que codifica a proteína de toxina de Bt pode ser inserido no vetor em um sítio de restrição adequado. O plasmídeo resultante é usado para transformação em E. coli. As células de E. coli são cultivadas em um meio nutriente adequado, então, coletadas e submetidas à lise. O plasmídeo é recuperado. Análise de sequência, análise de restrição, eletroforese e outros métodos biológicos moleculares-bioquímicos são, em geral, realizados como método de análise. Após cada manipulação, a sequência de DNA usada pode ser clivada e unida à próxima sequência de DNA. Cada sequên-cia de plasmídeo pode ser clonada no mesmo ou em outros plasmídeo. De-pendendo do método de inserção dos genes desejados na planta, outras sequências de DNA podem ser necessárias. Se, por exemplo, o plasmídeo Ti ou Ri é usado para a transformação da célula de planta, então, pelo menos a borda direita, mas frequentemente as bordas direita e esquerda do T- DNA dos plasmídeos Ti ou Ri, têm de ser unidas como a região de flanque- amento dos genes a serem inseridos. O uso de T-DNA para a transformação de células de planta foi intensivamente pesquisado e suficientemente descrito no documento EP 120 516, Lee e Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986) e An et a!., (1985) e é bem estabelecido na técnica.
Uma vez que o DNA inserido tenha sido integrado no genoma da planta, ele é relativamente estável. O vetor de transformação normalmente contém um marcador selecionável que confere, às células de planta transformadas, resistência a um biocida ou um antibiótico, tal como Bialaphos, Canamicina, G418, Bleomicina ou Higromicina, inter alia. O marcador individualmente empregado deverá, assim, permitir a seleção de células transformadas, ao invés de células que não contêm o DNA inserido.
Um grande número de técnicas está disponível para inserção de DNA em uma célula de planta hospedeira. Essas técnicas incluem transformação com T-DNA usando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como agente de transformação, fusão, injeção, biolística (bombardeamento de micropartícula) ou eletroporação, bem como outros possíveis métodos. Se Agrobactérias são usadas para a transformação, o DNA a ser inserido tem de ser clonado em plasmídeos especiais, isto é, em um vetor intermediário ou em um vetor binário. O vetor intermediário pode ser integrado no plasmídeo Ti ou Ri por meio de recombinação homóloga em virtude de sequências que são homólogas a sequências no T-DNA. O plasmídeo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferência do T-DNA. Vetores intermediários não podem se reproduzir em Agrobactérias. O vetor intermediário pode ser transferido em Agrobacterium tumefaciens por meio de um plasmídeo auxiliar (conjugação). Vetores binários podem se reproduzir em E. coli e em Agrobactérias. Eles compreendem um gene marcador de seleção e um ligante ou poliligante o qual está em rede pelas regiões de borda de T-DNA Direita e Esquerda. Eles podem ser transformados diretamente em Agrobactérias (Holsters et al., 1978). As agrobactérias usadas como célula hospedeira têm de compreender um plasmídeo trazendo uma região vir. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA na célula de planta. T-DNA adicional pode estar contido. A bactéria assim trans- formada é usada para a transformação de células de planta. Explantes de planta podem, vantajosamente, ser cultivados com Agrobacterium tumefaci- ens ou Agrobacterium rhizogenes para a transferência do DNA na célula de planta. Plantas inteiras podem, então, ser regeneradas a partir do material de planta infectado (por exemplo, pedaços de folha, segmentos de caule, raízes, mas também protoplastos ou células cultivadas em suspensão) em um meio adequado, o qual pode conter antibióticos ou biocidas para seleção. As plantas assim obtidas podem, então, ser testadas quanto à presença do DNA inserido. Nenhuma demanda especial é com relação aos plasmí- deos no caso de injeção e eletroporação. É possível usar plasmídeos comuns tais como, por exemplo, derivados de pUC.
As células transformadas crescem dentro das plantas da maneira usual. Eles podem formar células germe e transmitir o(s) traço(s) trans- formado(s) às plantas de prole. Tais plantas podem ser crescidas da maneira normal e cruzadas com plantas que têm os mesmos fatores hereditários transformados ou outros fatores hereditários. Os indivíduos híbridos resultantes têm as propriedades fenotípicas correspondentes.
Em uma modalidade preferida da presente invenção, as plantas serão transformadas com genes em que o uso de códon tenha sido otimizados para plantas. Vide, por exemplo, Patente US No. 5.380.831, a qual é aqui incorporada por referência. Embora algumas toxinas truncadas sejam exemplificadas aqui, é bem sabido na técnica de Bt que toxinas do tipo 130 kDa (comprimento total) têm uma metade N-terminal que é a toxina central e uma metade C-terminal que é uma "cauda" de pró-toxina, Assim, "caudas" apropriadas podem ser usada com toxinas truncadas / centrais da presente invenção. Vide, por exemplo, Patente US No. 6.218.188 e Patente US No. 6.673.990. Além disso, métodos para criação de genes de Bt sintéticos para uso em plantas são conhecidos na técnica (Stewart e Burgin, 2007). Um e- xemplo não limitativo de uma planta transformada preferida é uma planta de milho fértil compreendendo um gene de planta passível de expressão que codifica a proteína Cry1 Fa e ainda compreendendo um segundo gene passível de expressão em planta que codifica uma proteína CrylCa.
Transferência (ou introgressão) do(s) traço(s) de CrylAb e Cry1C em linhagens de milho endógamas pode ser obtida através de melhoramento por seleção recorrente, por exemplo, por meio de re-cruzamento. Nesse caso, uma parental recorrente desejado é primeiro cruzado com um doador endógamo (o parental não recorrente) que traz o(s) gene(s) apropri- ado(s) para o(s) traço(s) de CrylAb e Cry1C. A prole desse cruzamento é, então, cruzada novamente com o parental recorrente, seguido por seleção na prole resultante para que o(s) traço(s) desejado(s) seja(m) transferido(s) do parental não recorrente. Após três, de preferência quatro, mais preferivelmente cinco ou mais gerações de re-cruzamentos com o parental recorrente com seleção pelo(s) traço(s) desejado(s), a prole será heterozigótica para loci que controlam o(s) traço(s) que está(ão) sendo transferido(s), mas será semelhante ao recorrente parental quanto a maioria ou quase todos os outros genes (vide, por exemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4a Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376).
Estratégias de gerenciamento de resistência (IRM) a inseto.
Roush et al., por exemplo, esboçam duas estratégias com toxina, também denominadas "formação de pirâmide" ou "empilhamento", para gerenciamento de safras transgênicas inseticidas (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786). Em seu website, a United States Environmental Protection Agency (e- pa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/Bt_corn_refuge_2006.htm) publica os requisitos a seguir para proporcionar refugos não transgênicos (isto é, não B.t.) (um bloco de safras não-Bt / milho) para uso com safras transgênicas que produzem uma única proteína de Bt ativa contra pestes alvo.
Os requisitos estruturados específicos para produtos de milho protegidos contra broca por Bt (CrylAb ou Cry1F) são como segue: Refugos estruturados: 20% de refugo de milho Bt não lepidópte- ro no cinturão do milho; 50% de refugo de Bt não lepidóptero no cinturão do algodão Blocos 1. Interno (isto é, dentro do campo de Bt) 2. Externo (isto é, campos distintos dentro de 54 milha (% de milha se possível) do campo de Bt para maximizar o cruzamento aleatório) Tiras em-campo As tiras devem ter pelo menos 4 fileiras de largura (de preferência 6 fileiras) para reduzir os efeitos de movimento larval Além disso, a National Corn Growers Association, em seu website: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-fít-corn) também fornece orientação similar com relação aos requisitos do refugo. Por exemplo: "Requisitos da IRM para Broca do Milho: - Plantar pelo menos 20% de seus acres de milho para híbridos de refugo - Em regiões que produzem algodão, o refugo deve ser 50% - Deve ser plantado dentro % milha dos híbridos de refugo - Refugo pode ser plantado como tiras dentro do campo de Bt; o refugo as tiras devem ter pelo menos 4 fileiras de largura - O refugo pode ser tratado com pesticidas convencionais apenas se limiares econômicos são atingidos para o inseto alvo - Inseticidas pulverizáveis baseados em Bt não podem ser usados sobre o milho de refugo - Refugo apropriado deve ser plantado em cada fazenda com milho Bt
Conforme afirmado por Roush et al. (nas páginas 1780 e 1784, coluna da direita, por exemplo), empilhamento ou formação de pirâmide de duas proteínas diferentes, cada uma eficaz contra as pestes alvo e com pouca ou nenhuma resistência cruzada, pode permitir o uso de um refugo menor. Roush sugere que, para uma pilha com sucesso, um tamanho de proteção de menos de 10% de refugo, pode conferir gerenciamento de resistência comparável a cerca de 50% de refugo para um único traço (não es- tando em pirâmide). Para produtos de milho Bt em pirâmide atualmente dis-poníveis, a U.S. Environmental Protection Agency requer que significativamente menos (em geral 5%) refugo estruturado de milho não-Bt seja plantado do que para produtos com um único traço (em geral 20%).
Qualquer um dos percentuais acima (tais como aqueles para 1F/1Ab) ou proporções de refugo similares podem ser usadas para as pilhas ou pirâmides duplas ou triplas em questão. A presente invenção inclui acres comerciais - acima de 10 acres, por exemplo - plantados com (ou sem) tal refugo e com plantas de acordo com a presente invenção.
Há várias formas de proporcionar o refugo, incluindo diversos padrões de plantio geométrico nos campos (conforme mencionado acima), a misturas de semente em sacos, conforme ainda discutido por Roush e, por exemplo, a Patente U.S. No. 6.551.962.
Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios e publicações mencionados ou citados aqui são incorporados por referência na íntegra até o ponto em que eles não sejam inconsistentes com os ensinamentos explícitos do presente relatório descritivo. A menos que especificamente indicado ou implicado, os termos "um", "uma", "o" e "a" significam "pelo menos um(a)", conforme usado aqui.
Os exemplos a seguir ilustram a invenção. Os exemplos não deverão ser construídos como limitativos.
EXEMPLO 1 Design de toxinas quiméricas compreendendo toxinas centrais Cry1 e pró- toxinas heteróloqas e Atividade inseticida de Proteína DIG-152 produzida em Pseudomonas fluorescens Toxinas quiméricas.
Proteínas quiméricas que utilizam um domínio de toxina central de uma toxina Cry fundido a um segmento de pró-toxina de outra toxina Cry foram reportadas anteriormente, por exemplo, na Patente US No. 5.593.881 e Patente US No. 5.932.209.
Variantes de proteína quimérica CrylCa da presente invenção incluem toxinas quiméricas compreendendo um segmento de toxina central
N-terminal derivado de uma toxina inseticida Cry1Ca3 fundido a um segmento de pró-toxina de delta endotoxina heteróloga em algum ponto que ultrapassa o final do segmento de toxina central. A transição da toxina central para o segmento de pró-toxina heteróloga pode ocorrer aproximadamente na junção de toxina central nativa/pró-toxina ou uma porção da pró-toxina nativa (que se estende além do segmento de toxina central) pode ser retida, com a transição para a pró-toxina heteróloga ocorrendo a jusante. De modo variado, os segmentos de toxina central e pró-toxina podem compreender exatamente a sequência de aminoácido das toxinas nativas das quais eles são derivados ou podem incluir adições, deleções ou substituições de aminoácido que não diminuem e podem intensificar a função biológica dos segmentos quando fundidos uns aos outros.
Por exemplo, uma toxina quimérica da presente invenção com-preende um segmento de toxina central derivado de Cry1Ca3 e uma pró- toxina heteróloga. Em uma modalidade preferida da invenção, um segmento de toxina central derivado de Cry1Ca3 (619 aminoácidos) é fundido a um segmento heterólogo compreendendo um segmento de pró-toxina derivado de uma delta-endotoxina CrylAb (545 aminoácidos). A sequência de 1164 aminoácidos da proteína quimérica, aqui referida como DIG-152, é divulgada como SEQ ID NO: 1. Deve ser entendido que outras fusões quiméricas compreendendo variantes de toxina central Cry1Ca3 e pró-toxinas derivadas de CrylAb são dentro do escopo da presente invenção.
Atividade inseticida sobre lepidópteros da proteína DIG-152 foi demonstrada sobre larvas neonatais de broca da cana-de-açúcar (SCB; Dia- traea saccharalis) e SCB resistente a CrylAb (rSCB) em experimentos de dose-resposta que utilizam procedimentos de incorporação de dieta. Corpos de inclusão de DIG-152 foram solubilizados agitando ligeiramente a 4° durante 4 horas em 7,5 ml_ de CAPS a 100 mM, pH de 11, EDTA a 1 mM, ao qual tenham sido adicionados 200 μL de inibidor de protease bacteriana (Sigma P4865; preparado conforme as instruções do fornecedor). Após centrifugação para peletizar o material insolúvel, a concentração de proteína de estoque foi ajustada para 4,0 mg/mL em CAPS a 100 mM, pH de 11. Para bioensaio com insetos, concentrações de proteína DIG-152 na faixa de 0,030 μg a 102 μg/gm de dieta foram preparadas mediante mistura de volumes apropriados com uma dieta merídica (Bio-Serv, Frenchtown, NJ) exatamente antes de distribuição de aproximadamente 0,7 mL da dieta em células individuais de bandejas com 128 cavidades (Bio-Ba-128, C-D International).
Proteína CrylAb ativada por tripsina (usada como um controle positivo para atividade inseticida) foi testada na faixa de 0,03125 μg a 32 μg/gm de dieta (preparada mediante mistura de pó liofilizado com quantidades apropriadas de água destilada antes de preparo da dieta).
Dietas preparadas com água destilada (Controle "Blank", para testes com CrylAb) ou tampão apenas (CAPS a 100 mM, pH de 11, para testes com DIG-152) foram usadas como tratamentos de controle. Uma larva neonata de D. saccharalis (<24 horas após eclosão) foi liberada sobre a superfície da dieta em cada cavidade. Após inoculação larval, as células foram cobertas com tampas ventiladas (C-D International) e as bandejas de bioensaio foram colocadas em uma câmara ambiental mantida a 28°, UR de 50% e um fotoperíodo de 16 horas:8 horas (claro.escuro). A mortalidade larval, peso larval e número de larvas que sobrevivem que não demonstram ganhos de peso (< 0,1 mg por larva) foram registrados no sétimo dia após inoculação. Cada combinação de concentração de cepa de inseto/proteína Cry foi reproduzida quatro vezes, com 16 a 32 larvas em cada réplica.
Os critérios de mortalidade larval foram medidos como mortalidade "prática", a qual considerava as larvas mortas (mórbidas) e as larvas que sobreviveram (abatidas, sem se alimentar) que não mostram um ganho significativo no peso corporal (isto é, < 0,1 mg por larva). A mortalidade prática de larvas em um tratamento foi calculada usando a equação:
Mortalidade prática (%) = [TDS/TNIT] x 100 onde TDS é o número total de larvas mortas mais o número de larvas abatidas, e TNIT é o número total de insetos no tratamento
A mortalidade "prática" (aqui depois simplificada como Mortali- dade) de cada cepa de D. saccharalis foi corrigida para a mortalidade larval observada sobre a dieta de Controle "Blank" de água para análise dos resultados após tratamento com CrylAb ou a dieta tratada apenas com tampão para o tratamento com DIG-152.
Os resultados dos experimentos de dose-resposta foram ainda analisados para estabelecer um valor de Gl5o , [isto é, a concentração de proteína B.t. na dieta na qual o valor de inibição de crescimento larval (%GI) era de 50]. O valor %GI de larvas sobre dieta contendo proteína CrylAb foi calculado usando a fórmula: %GI = [TWC -TWT]/TWC x 100 onde TWC é o peso corporal total de larvas que se alimentam sobre a dieta de controle de água e TWT é o peso corporal total de larvas que se alimentam sobre a dieta tratada com CrylAb enquanto que, para análise de %GI larval como um resultado de ingestão de proteína DIG-152, foi calculado usando a fórmula: %GI = [TWB -TwryrwB x 100 onde TWB é o peso corporal total de larvas que se alimentam sobre dieta tratada com controle de tampão apenas e TWT é o peso corporal total de larvas que se alimentam sobre dieta tratada com DIG-152
Uma inibição de crescimento larval de 100% foi atribuída a uma réplica se não havia larvas que tinham ganho de peso significativo (<0,1 mg por larva). Os dados de inibição de crescimento foram analisados usando um ANOVA bidirecional com cepa de inseto e a concentração de proteína Cry como os dois fatores principais. Testes LSMEANS foram usados para determinar as diferenças de tratamento no nível α = 0,05.
Os resultados dos bioensaios de incorporação de dieta sobre larvas de Diatraea saccharalis são fornecidos na Tabela 2. Tabela 2. Dose-resposta da mortalidade larval e inibição de crescimento média % ± sem) de Diatraea saccharalis suscetível a CrylAb (SCB) e resistente a CrylAb que se alimentam sobre dieta contendo CrylAb ou Proteína DIG-152a aValores médios dentro de uma coluna através de todos os tratamentos seguido pela mesma letra não são significativamente diferentes (P < 0,05; teste LSMEANS), sem = erro padrão da média bμg de proteína/gm de dieta c A medida de mortalidade larval foi conforme definido no texto. d Esses valores percentuais foram calculados usando a fórmula descrita no texto. e Esses valores percentuais foram calculados usando a fórmula descrita no texto. fNT = Não testado
Análise de dados.
Dados de dose/mortalidade corrigidos foram, então, submetidos à análise Probit para determinar as concentrações de proteína para tratamento que causavam um valor de mortalidade de 50% (LC50) e os intervalos de confiança correspondentes de 95% (Cl). Os tratamentos usados na análise de Probit incluíam uma concentração maior que produzia mortalidade zero, a menor concentração que resultou em mortalidade de 100% e todos os resultados entre esses extremos. As proporções de resistência foram calculadas dividindo-se o valor de LC50 da cepa rSCB por aquele dos insetos SCB. Um teste de proporção de dose letal foi usado para determinar se as proporções de resistência eram significativas em um nível = 0,05. Um ANO- VA bidirecional também foi usado para analisar os dados de mortalidade, seguido pelo teste LSMEANS no nível a = 0,05 para determinar as diferenças de tratamento. Os resultados das análises são apresentados na Tabela 3. Tabela 3. Sumário de testes de bioensaio sobre larvas de SCB e rSCB u- sando dieta para inseto na qual proteína DIG-152 ou proteína CrylAb foi incorporada. a A medida de mortalidade larval foi definida conforme descrito no texto. b Proporções de resistência com uma letra "S" são significativas, enquanto que aquelas com letras ’NS" não são significativas a nível de 5%, com base em testes de dose letal.
É uma característica da proteína DIG-152 da presente invenção que o crescimento de larvas neonatas de broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis) é inibido ou as larvas são mortas, após ingestão de proteína DIG-152 em níveis similares àqueles da proteína CrylAb ativada os quais proporcionam a mesma resposta biológica. É ainda uma outra característica da proteína DIG-152 que larvas de Diatraea saccharalis que são resistentes aos efeitos tóxicos da proteína CrylAb são, todavia, suscetíveis à ação tóxica da proteína DIG-152.
EXEMPLO 2 Construção de plasmídeos de expressão que codificam proteínas quiméricas e expressão em Pseudomonas
Métodos padrões de clonagem [conforme descrito, por exemplo, em Sambrook et al, (1989) e Ausubel et al, (1995) e atualizações dos mesmos] foram usados na construção do construto de expressão de Pseudomonas fluorescens (Pf) pMYC2547 manipulado para produzir uma proteína quimérica DIG-152 de comprimento total. Produção de proteína foi realizada na cepa MB214 de Pseudomonas fluorescens (um derivado da cepa MB101; P. fluorescens biovar I), tendo uma inserção de um óperon lac modificado, conforme divulgado no documento Patente US No. 5.169.760. A estratégia básica de clonagem requer subclonagem de um fragmento de DNA que codifica DIG-152 em vetores de plasmídeo, pelo que ele é colocado sob o controle de expressão do promotor Ptac e o terminador rrnBT1BT2 do plasmídeo pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, Wl). Um de tais plasmídeos foi denominado pMYC2547 e o isolado MB214 trazendo esse plasmídeo é denominado Dpfl08.
Análise de crescimento e expressão em frascos de agitação.
Produção de Proteína DIG-152 para caracterização e bioensaio com inseto foi realizada através de crescimento, em frasco de agitação, da cepa DpflOδ de P. fluorescens. Produção de proteína DIG-152 acionada pelo promotor Ptac foi conduzida conforme descrito anteriormente na Patente US No. 5.527.883. Detalhes das manipulações microbiológicas estão disponíveis em Squires et al., (2004), Pedido de Patente US 20060008877, Pedido de Patente US 20080193974 e Pedido de Patente US 20080058262, incorporados aqui por referência. Expressão foi induzida mediante a adição de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosideo (IPTG) após uma incubação inicial de 24 horas a 30 °C com agitação. As culturas foram coletadas no momento de indução e em vários tempos pós-indução. A densidade celular foi medida pela densidade óptica a 600 nm (OD6oo)-
Fracionamento de célula e Análise por SDS-PAGE de Amostras em Frasco de Agitação.
Em cada tempo de amostragem, a densidade celular de amostras foi ajustada para OD6oo = 20 e alíquotas de 1 ml_ foram centrifugadas a 14000 x g durante cinco minutos. As pelotas de célula foram congeladas a - 80°. Frações solúveis e insolúveis de amostras de pelota celular congeladas em frasco de agitação foram geradas usando EasyLyse™ Bacterial Protein Extraction Solution (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, Wl). Cada pelota de célula foi ressuspensa em 1 mL de solução EasyLyse™ e ainda diluída a 1:4 em tampão de lise e incubada com agitação em temperatura ambiente durante 30 minutos. O lisato foi centrifugado a 14.000 rpm durante 20 minutos a 4o e o sobrenadante foi recuperado como a fração solúvel. A pelota (fração insolúvel) foi, então, resuspensa em um volume igual de solução salina tamponada com fosfato (PBS; Na2HPO4 a 11,9 mM, NaCI a 137 mM, KCI a 2,7 mM, pH de 7,4).
As amostras foram misturadas a 1:1 com 2X tampão de amostra Laemmli contendo β-mercaptoetanol (Sambrook et al., supra.) e fervida durante 5 minutos antes de carregamento sobre géis de Bis-Tris a 12% Criterion XT (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Eletroforese foi realizada no tampão MOPS XT recomendado. Os géis foram corados com Corante Coomassie Bio-Safe de acordo com o protocolo do fabricante (Bio-Rad) e a imagem formada usando o sistema Alpha Innotech Imaging (San Leandro, CA).
Preparo de corpo de inclusão.
Preparados de corpo de inclusão (IB) de proteína DIG-152 foram realizados sobre células de fermentações de P. fluorescens que produziam proteína inseticida Bt insolúvel, conforme demonstrado por SDS-PAGE e MALDI-MS (Matrix Assisted Laser Desorption/lonization Mass Spectrometry). Pelotas de fermentação de P. fluorescens foram descongeladas em um banho de água a 37 °C. As células foram ressuspensas para 25% peso/v em tampão de lise [Tris a 50 mM, pH de 7,5, NaCI a 200 mM, sal dissódico de EDTA a 20 mM (Ácido etileno diamina tetra acético), Triton X-100 a 1% e ditiotreitol a 5 mM (DTT); 5 ml_/L de coquetel inibidor de protease bacteriana (Catálogo # P8465; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram adicionados exatamente antes de uso]. As células foram suspensas usando um homogeneiza- dor manual no ajuste mais baixo (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Lysozyme (25 mg de Sigma L7651, de clara de ovo de galinha) foi adicionada à suspensão celular mediante mistura com uma espátula de metal e a suspensão foi incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A suspensão foi esfriada sobre gelo durante 15 minutos, então, sonicada usando um Branson Sonifier 250 (duas sessões de 1 minuto, em um ciclo de operação de 50%, produtividade > 30%). A lise de célula foi verificada através de microscopia. Mais 25 mg de Lysozyme foram adicionados se necessário e a incubação e sonicação foram repetidas. Após confirmação de lise celular via microscopia, o lisato foi centrifugado a 11.500 x g durante 25 minutos (4o) para formar a pelota IB e o sobrenadante foi descartado. A pelota IB foi resuspensa com 100 mL de tampão de lise, homogenizada com o misturador manual e centrifugado conforme acima. A pelota IB foi repetidamente lavada por meio de resuspensão (em 50 mL de tampão de lise), homogenização, sonicação e centrifugação até o sobrenadante se tornasse incolor e a pelota IB se tornasse firme e de cor acinzentada. Para a lavagem final, a pelota IB foi resuspensa em água destilada filtrada estéril (0,22 μm) contendo EDTA a 2 mM e centrifugada. A pelota final foi resuspensa em á- gua destilada filtrada estéril contendo EDTA a 2 mM e armazenada em alíquotas de 1 mL a -80°.
Análise por SDS-PAGE e quantificação de proteína em preparados de IB foi feita descongelando uma alíquota de 1 mL de pelota IB e diluindo a 1:20 com água destilada filtrada estéril. A amostra diluída foi, então, fervida com 4X tampão de redução de amostra [Tris a 250 mM, pH de 6,8, glicerol a 40% (v/v), Azul de Bromofenol a 0,4% (peso/v), SDS a 8% (peso/v) e β-mercaptoetanol a 8% (v/v)] e carregada sobre um gel de Tris-Glicina 12+2 a 4-20% Novex® (Invitrogen) passado com 1X tampão de Tris/Glicina/SDS (BioRad). O gel foi passado durante 60 min a 200 volts então, corado com Coomassie Blue (G-250 a 50%/R-250 a 50% em metanol a 45%, ácido acético a 10%) e descorado com ácido acético a 7%, metanol a 5% em água destilada. Quantificação das bandas alvo foi feita comparando- se os valores densitométricos para as bandas contra Amostras padrões de Albumina de Soro Bovino (BSA) passadas sobre o mesmo gel para gerar uma curva padrão.
Solubilização de Corpos de inclusão.
Seis mL de suspensão de corpo de inclusão DIG-152 do clone de Pf DPflO8 foram centrifugados sobre o ajuste mais alto de uma microcen- trífuga Eppendorf modelo 5415C (aproximadamente 14.000 x g) para peleti- zar as inclusões. O sobrenadante do tampão de armazenamento foi removido e substituído por 25 mL de tampão de carbonato de sódio a 100 mM, pH de 11, em um tubo cônico de 50 mL. Inclusões foram resuspensas usando uma pipeta e submetidos à mistura totalmente. O tubo foi colocado sobre uma plataforma de rolamento suave a 4o durante a noite para extrair a proteína alvo. O extrato foi centrifugado a 30.000 x g durante 30 min a 4 °C e o sobrenadante resultante foi concentrado 5 vezes usando um dispositivo de filtro centrífugo de celulose regenerada Amicon Ultra-15 (corte de peso molecular de 30.000; Millipore). O tampão de amostra foi, então, trocado para CAPS a 10 mM [ácido 3-(ciclo-hexamino)-1-propano-sulfônico], pH de 10 usando colunas PD-10 descartáveis (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
Solubilização e ativação com tripsina de Proteína de corpo de inclusão.
Em alguns casos, suspensão em corpo de inclusão DIG-152 do clone de Pf DPflO8 foi centrifugada sobre o ajuste mais alto de uma microcen- trífuga Eppendorf modelo 5415C (aproximadamente 14.000 x g) para peletizar as inclusões. O sobrenadante do tampão de armazenamento foi removido e substituído por CAPS a 100 mM, pH 11 para proporcionar uma concentração de proteína de aproximadamente 50 mg/mL. O tubo foi rolado em temperatura ambiente durante três horas para solubilizar completamente a proteína. Tripsi- na foi adicionada em uma quantidade igual a 5% a 10%> (peso:peso, com base no peso inicial do pó IB) e digestão foi realizada através de incubação enquanto se rolava durante a noite a 4o ou rolando 90-120 minutos em temperatura ambiente. O material insolúvel foi removido por meio de centrifugação a 10,000 x g durante 15 minutos e o sobrenadante foi aplicado a uma coluna de troca de ânions MonoQ (10 mm por 10 cm). Proteína DIG-152 ativada foi eluí- da (conforme determinado por meio de SDS-PAGE, vide abaixo) através de um gradiente de NaCI a 0% a 100% a 1 M sobre 25 volumes de coluna. Frações contendo a proteína ativada foram empoçadas e, quando necessário, concentrada para menos de 10 mL usando um dispositivo de filtro centrífugo de celulose regenerada Amicon Ultra-15 conforme acima. O material foi, então, passado através de uma coluna Superdex 200 (16 mm por 60 cm) em tampão contendo NaCI a 100 mM, glicerol a 10%, Tween-20 a 0,5% e EDTA a 1 mM. Foi determinado, através de análise por SDS-PAGE, que a proteína ativada (enzimaticamente truncada) elui a 65 a 70 mL. Frações contendo a proteína ativada foram empoçadas e concentradas usando o dispositivo de concentração centrífuga conforme acima.
Eletroforese em Gel.
Os preparados de proteína concentrada foram preparados para eletroforese diluindo a 1:50 em tampão de amostra LDS NuPAGE® (Invitro- gen) contendo DTT a 5 mM como um agente de redução e aquecida a 95° durante 4 minutos. A amostra foi carregada em fileiras em duplicata de um gel a 4-12% NuPAGE® ao longo de cinco padrões de BSA oscilando de 0,2 μg a 2 μg/fileira (para geração de curva padrão). Tensão foi aplicada a 200 V usando tampao de operação de SDS MOPS (Invitrogen) até que o corante de rastreamento atingisse o fundo do gel. O gel foi corado com Coomassie Blue G-250 a > 0,2% em metanol a 45%, ácido acético a 10% e descorado, primeiro rapidamente com metanol a 45%, ácido acético a 10% e, então, junto com ácido acético a 7%, metanol a 5% até que a base fosse clarificada. Após descoloração, o gel sofreu uma varredura com um BioRad Fluor-S Multilmager. O Quantity One Software v.4.5.2 do instrumento foi usado para obter volumes sem a base das bandas de proteína coradas e para gerar a curva padrão de BSA que foi usada para calcular a concentração de proteína DIG-152 quimérica na solução de estoque.
EXEMPLO 3 Preparo de Proteínas de toxina central CrylCa e CrylAb e isolamento de vesículas de membrana da borda pilosa de Spodoptera frugiperda para uso em experimentos de ligação competitiva
Os exemplos a seguir avaliam a ligação competitiva de proteínas de toxina central Cry1 a receptores putativos em tecidos de intestino de inseto. É mostrado que proteína de toxina central CrylCa rotulada com 125l se liga com alta afinidade a Vesículas de Membrana de Borda Pilosa (Brush Border Membrane Vesicles - BBMV's) preparadas de Spodoptera frugiperda (lagarta-do-cartucho) e que a proteína de toxina central CrylAb não compete com essa ligação. Alternativamente, é mostrado que proteína de toxina central CrylAb rotulada com 1251 se liga com alta afinidade a s BBMV's preparadas de S. frugiperda e que a proteína de toxina central CrylCa não compete com essa ligação.
Purificação de Proteínas Cry.
Um gene que codifica a proteína DIG-152 quimérica, compreendendo a toxina central Cry1Ca3 e pró-toxina CrylAb, foi expresso na cepa de expressão de Pseudomonas fluorescens conforme descrito no Exemplo 2. De um modo similar, um gene que codifica a proteína CrylAb foi expresso no sistema Pf. A cepa de P. fluorescens que expressa proteína CrylAb foi denominada DPf88.
As proteínas foram purificadas através dos métodos do Exemplo 2 e digestão com tripsina para produzir toxinas centrais ativadas das proteínas de comprimento total foi, então, realizada e os produtos foram purificados através dos métodos descritos no Exemplo 2. Preparados das proteínas processadas por tripsina (toxina central ativada) eram >95% puros e tinham um peso molecular de aproximadamente 65 kDa conforme determinado experimentalmente através de SDS-PAGE. Conforme usado aqui, a toxina central ativada preparada da proteína DIG-152 é denominada uma proteína de toxina central CrylCa e a toxina central ativada preparada da proteína CrylAb é denominada uma proteína de toxina central CrylAb.
Preparo e fracionamento de BBMVs solubilizadas.
Métodos padrões de quantificação de proteína e eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida foram empregados conforme ensinado, por exemplo, em Sambrook et al. (1989) e Ausubel et al. (1995) e atualizações dos mesmos.
Larvas de S. frugiperda no último estágio foram submetidas a jejum durante a noite e, então, dissecadas após esfriar sobre gelo durante 15 minutos. O tecido de intestino mediano foi removido da cavidade corporal, deixando para trás o intestino traseiro preso ao integumento. O intestino mediano foi colocado em um volume 9X de tampão de homogeneização gelado (manitol a 300 mM, EGTA a 5 mM, base de Tris a 17 mM, pH de 7,5), suplementado com Coquetel Inibidor de Protease (Sigma- Aldrich P-2714) diluído conforme recomendado pelo fornecedor. O tecido foi homogeneizado com 15 recalques de um homogeneizador tecidual de vidro. BBMVs foram preparadas através do método de precipitação com MgCI2 de Wolfersberger (1993). Resumidamente, um volume igual de uma solução MgCI2 a 24 mM em manitol a 300 mM foi misturado com o homogenato de intestino mediano, agitado durante 5 minutos e deixado descansar sobre gelo durante 15 min. A solução foi centrifugada a 2.500 x g durante 15 min a 4 °C.
O sobrenadante foi guardado e a pelota suspensa no volume o- riginal de tampão de homogeneização diluído a 0,5X e centrifugada novamente. Os dois sobrenadantes foram combinados e centrifugados a 27.000 x g durante 30 min a 4 °C para formação da fração de BBMV. A pelota foi suspensa em Tampão de Armazenamento de BBMV (HEPES 10 mM, KCI 130 mM, glicerol a 10%, pH de 7,4) para uma concentração de proteína de cerca de 3 mg/mL. A concentração de proteína foi determinada usando Albumina de Soro Bovino (Bovine Serum Albumin - BSA) como o padrão. Determinação de fosfatase alcalina (uma enzima marcadora para a fração de BBMV) foi feita antes de congelamento das amostras usando o kit QuantiChrom™ DALP-250 Alkaline Phosphatase Assay (Gentaur Molecular Products, Kam- penhout, BE) seguindo as instruções do fabricante. A atividade específica dessa enzima aumentou, tipicamente, 7 vezes comparado com aquela encontrada na fração inicial de homogenato de intestino mediano. As BBMVs foram transformadas em alíquotas em 250 amostras, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°.
Eletroforese.
Análise de proteínas através de SDS-PAGE foi conduzida sob condições de redução (isto é, em β-mercaptoetanol a 5%, BME) e desnaturação (isto é, aquecida 5 minutos a 90° na presença de SDS a 2%). As proteínas foram carregadas em cavidades de um gel de Tris-Glicina / poliacri- lamida a 4% a 20% (BioRad; Hercules, CA) e separadas a 200 volts durante 60 minutos. As bandas de proteína foram detectadas através de coloração com Coomassie Brilliant Blue R-250 (BioRad) durante uma hora e descorado com uma solução de metanol a 5% em ácido acético a 7%. Os géis foram formados e analisados usando um BioRad Fluro-S Multi Imager™. Os pesos moleculares relativos das bandas de proteína foram determinados compa- rando-se as mobilidades de proteínas de peso molecular conhecido observadas em uma amostra de Ladder de Proteína BenchMark™ (Life Technologies, Rockville, MD) carregada em uma cavidade do gel.
lodinação de Proteínas de toxina central CrylAb ou CrylCa.
Proteína de toxina de central CrylCa purificada ou proteína de toxina central CrylAb foi iodinada usando Glóbulos de lodinação da Pierce (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Resumidamente, dois Glóbulos de lodinação foram lavados duas vezes com 500 de PBS (fosfato de sódio a 20 mM, NaCI a 0,15 M, pH de 7,5) e colocados em um tubo para centrífuga de 1,5 mL com 100 de PBS. 0,5 mCi de iodeto de sódio rotulado com 125l foram adicionados, os componentes foram deixados reagir durante 5 minutos em temperatura ambiente, então, 1 μg de proteína de toxina central CrylCa (ou 1 μg de proteína de toxina central CrylAb) foi adicionado à solução e deixado reagir durante mais 3 a 5 minutos.
A reação foi terminada pipeteando a solução dos Glóbulos de lodinação e aplicando-a a uma coluna de centrifugação Zeba™ (Invitrogen) equilibrada em CAPS a 50 mM, pH de 10,0, DTT a 1 mM (ditiotreitol), EDTA a 1 mM e glicerol a 5%. Os Glóbulos de lodinação foram lavados duas vezes com 10 μT de PBS e a solução de lavagem foi também aplicada à coluna de dessalinização Zeba™. A solução radioativa foi eluída através da coluna de centrifugação por meio de centrifugação a 1.000 x g durante 2 min. Proteína de toxina central CrylCa radiorrotulada a 125l (ou proteína de toxina central CrylAb) foi, então, submetida à diálise contra CAPS a 50 mM, pH de 10,0, DTT 1 mM, EDTA a 1 mM e glicerol a 5%.
Formação de Imagem.
A radiopureza das proteínas de toxina central CrylAb ou CrylCa iodinadas foi determinada através SDS-PAGE e Phosphor-lmaging. Resumi-damente, géis de SDS-PAGE foram secos usando um aparelho de secagem de gel BioRad seguindo as instruções do fabricante. Os géis secos foram formados enrolando os mesmos em filme Mylar (espessura de 12 μm) e expondo os mesmos sob uma Molecular Dynamics Storage Phosphor Screen (35 cm x 43 cm) durante 1 hora. As lâminas foram reveladas usando um Molecular Dynamics Storm 820 Phosphor-lmager e a imagem foi analisada u- sando o software ImageQuant™.
EXEMPLO 4 Ligação de proteína de toxina central Cry1 rotulada com 125l as BBMV's de Spodoptera frugiperda
Uma curva de saturação foi gerada para determinar a quantidade ótima de proteína BBMV para uso em ensaios de ligação com proteínas de toxina central CrylCa e CrylAb. 0,5 nM de proteína de toxina central Cry1 radiorrotulada com 125l foi incubada durante 1 hora a 28 °C em tampão de ligação (NaHPO4 a 8 mM, KH2PO4 a 2 mM, NaCI a 150 mM, BSA a 0,1%, pH de 7,4) com quantidades de proteína BBMV oscilando de 0 μg/mL a 500 μg/mL (volume total de 0,5 mL). Proteína de toxina central Cry1 rotulada com 1 ligada às proteínas BBMV foi separada da fração não ligada coletando 150 μi da mistura de reação em triplicata em tubos para centrífuga de separação de 1,5 mL e centrifugando as amostras a 14.000 x g durante 8 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante foi gentilmente removido e a pe- lota foi lavada três vezes com tampão de ligação gelado. O fundo do tubo da centrífuga contendo a pelota foi cortado, colocado em um tubo para cultura de vidro de 13 x 75 mm e as amostras foram contadas durante 5 minutos cada no contador gama. CPM (contagens por minuto) obtida menos a CPM de base (reação sem proteína BBMV) foi plotada versus a concentração de proteína BBMV. De acordo com os resultados reportados por outros (Luo et al. 1999), a concentração ótima de proteína BBMV para uso em ensaios de ligação foi determinada como sendo 150 pg/mL.
EXEMPLO 5 Ensaios de ligação competitiva a BBMVs de S. frugiperda com proteínas de toxina central CrylAb e CrylCa
Ensaios de ligação competitiva homólogos e heterólogos foram conduzidos usando 150 μg/mL de S. frugiperda BBMV protein e 0,5 nM da proteína de toxina central CrylCa radiorrotulada com 125l. As concentrações da proteína de toxina central CrylAb não radiorrotulada competitiva adicionada à mistura de reação oscilava de 0,045 nM a 300 nM e foram adicionados ao mesmo tempo que a proteína de toxina central CrylCa radioativo, a fim de assegurar competição por ligação verdadeira. As incubações foram realizadas durante 1 hora a 28° e a quantidade de proteína de toxina central CrylCa rotulada com 1251 ligada a BBMV (ligação específica ) foi medida conforme descrito acima. Ligação não específica foi representada pelas contagens obtidas na presença de 1.000 nM de proteína de toxina central CrylCa não radiorrotulada. Ligação total de cem porcento foi considerada como sendo a quantidade de ligação na ausência de qualquer competitor proteína de toxina central CrylAb.
Ensaios de ligação a receptor usando proteína de toxina central CrylCa rotulada com 125l determinaram a capacidade da proteína de toxina central CrylAb de deslocar esse ligante radiorrotulado de seu sítio de ligação sobre BBMVs de S. frugiperda. Os resultados (figura 1) mostram que a proteína de toxina central CrylAb não desloca proteína de toxina central CrylCa rotulada com 125l ligada de sua(s) proteína(s) de receptor em concentrações tão altas quanto 300 nM (600 vezes a concentração do ligante de ligação radioativa). Conforme esperado, proteína de toxina central CrylCa não rotulada foi capaz de deslocar proteína de toxina central CrylCa radior- rotulada de sua(s) proteína(s) de ligação, exibindo uma curva de dose- resposta sigmoidal com deslocamento de 50% ocorrendo a 5 nM.
Assim, é indicado que a proteína de toxina central CrylCa interage com um sítio de ligação em BBMVs de S. frugiperda que não se liga à proteína de toxina central CrylAb.
EXEMPLO 6 Ensaios de ligação competitiva a BBMVs de S. frugiperda com proteínas de toxina central CrylCa e CrylAb
Ensaios de ligação competitiva homólogos e heterólogos foram conduzidos usando 150 μg/mL de proteína BBMV e 0,5 nM da proteína de toxina central CrylAb radiorrotulada com 125l. As concentrações da proteína de toxina central CrylCa não radiorrotulada competitiva adicionada à mistura de reação oscilava de 0,045 nM a 1000 nM e foram adicionados ao mesmo tempo que a proteína de toxina central CrylAb radioativa, a fim de assegurar competição por ligação verdadeira. As incubações foram realizadas durante 1 hora a 28 °C e a quantidade de proteína de toxina central CrylAb rotulada com 1251 ligada a BBMV (ligação específica ) foi medida conforme descrito acima. Ligação não específica foi representada pelas contagens obtidas na presença de 1000 nM de uma proteína de toxina central CrylAb não radiorrotulada. Ligação total de cem porcento foi considerada como sendo a quantidade de ligação na ausência de qualquer proteína de toxina central CrylCa competidora.
Ensaios de ligação a receptor usando proteína de toxina central CrylAb rotulada com 125l determinaram a capacidade da proteína de toxina central CrylCa de deslocar esse ligante radiorrotulado de seu sítio de ligação sobre BBMVs de S. frugiperda. Os resultados (Figura 2) mostram que a proteína de toxina central CrylCa não desloca a proteína de toxina central CrylAb rotulada com 125l ligada de sua(s) proteína(s) de receptor em concentrações tão altas quanto 300 nM (600 vezes a concentração do ligante de ligação radioativa). Conforme esperado, proteína de toxina central CrylAb não rotulada foi capaz de deslocar a proteína de toxina central CrylAb ra-diorrotulada de sua(s) proteína(s) de ligação, exibindo uma curva de dose- resposta sigmoidal com deslocamento de 50% ocorrendo a 5 nM.
Assim, é indicado que a proteína de toxina central CrylAb interage com um sítio de ligação em BBMV de S. frugiperda que não se liga à proteína de toxina central CrylCa. Referências Finney, D.J. 1971. Probit analysis. Cambridge University Press, England. Hua, G., L. Masson, J. L. Jurat-Fuentes, G. Schwab e M. J. Adang. Binding analyses of Bacillus thuringiensis Cry δ-endotoxins using brush border membrane vesicles of Ostrinia nubilalis. Applied and Environmental Microbiology 67[2], 872-879. 2001. LeOra Software. 1987. POLO-PC. A user's guide to probit and logit analysis. Berkeley, CA. McGaughey, W. H., F. Gould e W. Gelernter. Bt resistance man-agement. Nature Biotechnology 16[2], 144-146. 1998 Marcon, P.R.G.C, L.J. Young, K. Steffey e B.D. Siegfried. 1999. Baseline susceptibility of the European corn borer, Ostrinia nubilalis (Hubner) (Lepidoptera: Pyralidae) to Bacillus thuringiensis toxins. J. Econ. Entomol. 92 (2): 280-285. Robertson, L.J. e H.K. Preisler. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC Press, Boca Ranton, FL. SAS Institute Inc. 1988. SAS procedures guide, Release 6.03 edition. SAS Institute Inc, Cary, NC. Stone, B.F. 1968. A formula for determining degree of dominance in cases of monofactorial inheritance of resistance to chemicals. Bull. WHO 38: 325-329. Van Mellaert, H., J. Botterman, J. Van Rie e H. Joos. Transgenic plants for the prevention of development of insects resistant to Bacillus thuringiensis toxins. (Plant Genetic Systems N.V., Belg. 89-401499 [400246], 57-19901205. EP. 5-31-1989 APÊNDICE A Lista de delta-endotoxinas - do website de Crickmore et al. (citado no pedido) Número de Acesso é a entrada no NCBI

Claims (5)

1. Método para controlar o desenvolvimento da resistência de um inseto à uma proteína inseticida derivada de um Bacillus thuringiensis, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de plantar sementes para a produção de um campo de plantas que expressam uma proteína inseticida Cry1Ca e uma proteína inseticida Cry1Ab em um ambiente sujeito a insetos, em que a referida proteína inseticida Cry1Ca compreende SEQ ID NO: 2 e a referida proteína inseticida Cry1Ab compreende SEQ ID NO: 3, bem como os referidos insetos são broca da cana-de-açúcar ou lagarta-do cartucho.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda plantar sementes que não expressam uma proteína inseticida derivada de um Bacillus thuringiensis para criar um refúgio para os referidos insetos.
3. Composição para o controle de pragas de lepidópteros, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula hospedeira microbiana transformada para expressar quantidades eficazes tanto deuma proteína inseticida Cry1Ca quanto de uma proteína inseticida Cry1Ab, em que a referida proteína inseticida Cry1Ca compreende SEQ ID NO: 2 e a referida proteína inseticida Cry1Ab compreende SEQ ID NO: 3; em que as ditas pragas são broca da cana-de-açúcar ou lagarta-do-cartucho e em que a composição compreende ainda, uma solução não aquosa, um pó umidecível, grânulos ou pós, dispersante, veículo inerte, agente reológico, emulsionantes, polímero, adjuvante espargidor-adesivo, agente estabilizante, aditivo pesticida, tensoativo ou solução tamponada.
4. Método para o controle de pragas de lepidópteros, caracterizado pelo fato de que compreende proporcionar para as referidas pragas, ou ao meio ambiente das referidas pragas, uma quantidade eficaz de uma composição como definida em qualquer uma da reivindicação 3, em que as ditas pragas são broca da cana-de-açúcar ou lagarta-do-cartucho.
5. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda uma solução tamponada.
BR112012014746-3A 2009-12-16 2010-12-16 Método para controlar o desenvolvimento da resistência de um inseto à uma proteína inseticida derivada de um bacillus thuringiensis, bem como composição e método para o controle de pragas de lepidópteros BR112012014746B1 (pt)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
US28429209P 2009-12-16 2009-12-16
US61/284,292 2009-12-16
PCT/US2010/060819 WO2011084622A1 (en) 2009-12-16 2010-12-16 Combined use of cry1ca and cry1ab proteins for insect resistance management

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