CN116003550A - 植物来源的杀昆虫蛋白及其使用方法 - Google Patents

植物来源的杀昆虫蛋白及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物来源的杀昆虫蛋白及其使用方法。具体地，本发明提供了用于控制有害生物的组合物和方法。这些方法涉及用编码杀昆虫蛋白的核酸序列来转化生物体。具体地，这些核酸序列可用于制备具有杀昆虫活性的植物和微生物。因此，本发明提供了经转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织以及种子。组合物是细菌物种的杀昆虫核酸和蛋白。这些序列在用于随后转化到包括植物在内的目的生物体中的表达载体的构建中具有用途，充当用于分离其他同源（或部分同源的）基因的探针。这些杀有害生物蛋白可用于控制鳞翅目（Lepidopteran）、鞘翅目（Coleopteran）、双翅目（Dipteran）、半翅目（Hemipteran）、真菌和线虫有害生物群体、抑制其生长或将其杀灭，并且可用于生产具有杀昆虫活性的组合物。

Description

植物来源的杀昆虫蛋白及其使用方法
本申请是申请日为2016年7月8日的中国专利申请201680057978.9“植物来源的杀昆虫蛋白及其使用方法”的分案申请。
以电子方式提交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“6472WOPCT_Sequence_Listing”，创建于2016年6月3日，且具有4,831千字节大小，并与本说明书同时提交。包含在该ASCII格式的文件中的序列表是说明书的一部分并通过引用以其全文结合在此。
技术领域
本公开涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖基因。这些杀有害生物蛋白和编码它们的核酸序列可用于制备杀有害生物配制品和生产转基因有害生物抗性植物。
背景技术
使用微生物剂(如真菌、细菌或其他昆虫物种)对具有农业意义的昆虫有害生物进行生物防治，为合成型化学杀有害生物剂提供了环境友好且有商业吸引力的替代方案。一般来说，使用生物杀有害生物剂造成污染和环境危害的风险较低，并且生物杀有害生物剂提供比传统广谱化学杀昆虫剂所特有的靶特异性更强。此外，生物杀有害生物剂往往生产成本较低，并且因此能提高各种作物的经济产量。
已知芽孢杆菌属微生物的某些物种对于一系列昆虫有害生物具有杀有害生物活性，这些昆虫有害生物包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)和日本金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)是迄今为止发现的最成功的生物防治剂。昆虫致病性还归因于幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)的菌株。微生物杀昆虫剂，特别是从芽孢杆菌属菌株获得的那些微生物杀昆虫剂，在农业上作为有害生物化学防治的替代方案起着重要作用。
通过将作物植物进行遗传工程改造以生产来自芽孢杆菌属(Bacillus)的杀有害生物蛋白，已经开发出昆虫抗性增强的作物植物。例如，已经对玉米和棉花植物进行遗传工程改造以产生从Bt株分离的杀有害生物蛋白。现在，这些遗传工程化作物广泛应用于农业中，并且为农民提供了取代传统昆虫防治方法的环境友好型替代方案。虽然它们已被证明在商业上非常成功，但是这些遗传工程化抗昆虫作物植物仅针对窄范围的经济上重要的昆虫有害生物提供抗性。在某些情况下，昆虫可以对不同杀昆虫化合物产生抗性，这就导致需要鉴别用于有害生物防治的替代性生物防治剂。
因此，仍然需要对昆虫有害生物具有不同范围的杀昆虫活性的新颖杀有害生物蛋白质，例如针对鳞翅目和鞘翅目中的各种昆虫具有活性的杀昆虫蛋白质，这些昆虫包括但不限于已对现存杀昆虫剂产生抗性的昆虫有害生物。
发明内容
在一个方面，提供了用于对细菌、植物、植物细胞、组织以及种子赋予杀有害生物活性的组合物和方法。组合物包含杀有害生物和杀昆虫多肽的核酸分子编码序列、包含那些核酸分子的载体、以及包含这些载体的宿主细胞。组合物还包括杀有害生物多肽序列和那些多肽的抗体。这些核酸序列可以在DNA构建体或表达盒中使用，以用于在多种生物体(包括微生物和植物)中进行转化和表达。这些核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，这些合成序列已经被设计用于在生物体中表达，该生物体包括但不限于：微生物或植物。组合物还包含经转化的细菌、植物、植物细胞、组织以及种子。
在另一方面，提供编码植物来源的穿孔素的分离的或重组的核酸分子，这些穿孔素包括氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。特别地，提供了编码IPD079多肽的分离的或重组的核酸分子，这些多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。此外，涵盖了对应于IPD079多肽的氨基酸序列。提供了能够编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、和SEQ ID NO:140的IPD079多肽的分离的或重组的核酸分子，以及氨基酸取代变体、缺失变体、插入变体、其片段、及其组合。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。
在另一方面，提供了分离的或重组的IPD079多肽，这些多肽包括但不限于SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ IDNO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、和SEQ ID NO:140的多肽，以及氨基酸取代变体、缺失变体、插入变体、其片段、及其组合。
在另一方面，提供了用于产生多肽和使用那些多肽用来控制或杀死鳞翅目、鞘翅目、线虫、真菌、和/或双翅目有害生物的方法。实施例的转基因植物表达本文公开的杀有害生物序列中的一种或多种。在不同的实施例中，该转基因植物进一步包含一种或多种另外的昆虫抗性基因，例如，用于控制鞘翅目、鳞翅目、半翅目或线虫有害生物的一种或多种另外的基因。本领域技术人员将理解，转基因植物也可以包含给予目的农艺性状的任何基因。
在另一方面，还包括用于检测在样品中的实施例的这些核酸和多肽的方法。提供用于检测植物来源的穿孔素(包括但不限于本公开的IPD079多肽)的存在，或者检测样品中编码IPD079多肽的多核苷酸的存在的试剂盒。该试剂盒可以与实施用于检测预期试剂的方法所需的所有试剂和对照样品，以及使用说明书一起提供。
实施例的这些组合物和方法可用于产生具有增强的有害生物抗性或耐受性的生物体。这些生物体以及包含这些生物体的组合物对于农业目的是所希望的。实施例的组合物还可用于产生具有杀有害生物活性的经改变或改进的蛋白质，或用于检测IPD079多肽的存在。
附图说明
图1A-1I显示使用IPD079Aa(SEQ ID NO:2)、IPD079Ab(SEQ ID NO:4)、IPD079Ac(SEQ ID NO:6)、IPD079Ad(SEQ ID NO:8)、IPD079Ae(SEQ ID NO:10)、IPD079Af(SEQ IDNO:12)、IPD079Ag(SEQ ID NO:14)、IPD079Ah(SEQ ID NO:16)、IPD079Ai(SEQ ID NO:18)、IPD079Aj(SEQ ID NO:20)、IPD079Ak(SEQ ID NO:22)、IPD079Al(SEQ ID NO:26)、IPD079Am(SEQ ID NO:28)、IPD079An(SEQ ID NO:30)、IPD079Ao(SEQ ID NO:32)、IPD079Ap(SEQ IDNO:36)、IPD079Aq(SEQ ID NO:38)、IPD079Ar(SEQ ID NO:40)、IPD079As(SEQ ID NO:44)、IPD079At(SEQ ID NO:46)、IPD079Au(SEQ ID NO:48)、IPD079Av(SEQ ID NO:50)、IPD079Aw(SEQ ID NO:52)、IPD079Ax(SEQ ID NO:54)、IPD079Az(SEQ ID NO:74)、IPD079Ba(SEQ IDNO:24)、IPD079Bb(SEQ ID NO:34)、IPD079Bc(SEQ ID NO:42)、IPD079Bd(SEQ ID NO:76)、IPD079Be(SEQ ID NO:78)、IPD079Bf(SEQ ID NO:80)、IPD079Bg(SEQ ID NO:82)、IPD079Bh(SEQ ID NO:84)、IPD079Bi(SEQ ID NO:86)、IPD079Bj(SEQ ID NO:88)、IPD079Bk(SEQ IDNO:90)、IPD079Bl(SEQ ID NO:92)、和IPD079Bm(SEQ ID NO:94)的Vector
Figure BDA0003795187100000061
套件的
Figure BDA0003795187100000062
模块的氨基酸序列比对。突出了序列多样性。
图2A-2J显示使用IPD079Eb(SEQ ID NO:58)、IPD079Ea(SEQ ID NO:56)、IPD079Eaa(SEQ ID NO:132)、IPD079Eab(SEQ ID NO:134)、IPD079Eac(SEQ ID NO:136)、IPD079Ead(SEQ ID NO:138)、IPD079Eae(SEQ ID NO:140)、IPD079Ec(SEQ ID NO:60)、IPD079Ed(SEQ ID NO:62)、IPD079Ee(SEQ ID NO:64)、IPD079Ef(SEQ ID NO:66)、IPD079Eg(SEQ ID NO:68)、IPD079Eh(SEQ ID NO:70)、IPD079Ei(SEQ ID NO:96)、IPD079Ej(SEQ IDNO:98)、IPD079Ek(SEQ ID NO:100)、IPD079El(SEQ ID NO:102)、IPD079Em(SEQ ID NO:104)、IPD079En(SEQ ID NO:106)、IPD079Eo(SEQ ID NO:108)、IPD079Ep(SEQ ID NO:110)、IPD079Eq(SEQ ID NO:112)、IPD079Er(SEQ ID NO:114)、IPD079Es(SEQ ID NO:116)、IPD079Et(SEQ ID NO:118)、IPD079Eu(SEQ ID NO:120)、IPD079Ev(SEQ ID NO:122)、IPD079Ew(SEQ ID NO:124)、IPD079Ex(SEQ ID NO:126)、IPD079Ey(SEQ ID NO:128)、IPD079Ez(SEQ ID NO:130)和IPD079Fa(SEQ ID NO:142)的Vector
Figure BDA0003795187100000071
套件的
Figure BDA0003795187100000072
模块的氨基酸序列比对。突出了序列多样性。
图3显示与西方玉米根虫(Western Corn Rootworm)(WCRW)刷状缘膜囊泡(BBMV)结合的1nM标记Alexa的IPD079Aa多肽(SEQ ID NO:2)总％与未标记的IPD079Aa多肽(SEQID NO:2)的浓度(nM)的同源竞争的图。
图4显示与西方玉米根虫(WCRW)刷状缘膜囊泡(BBMV)结合的1nM标记Alexa的IPD079Ea多肽(SEQ ID NO:56)总％与未标记的IPD079Ea多肽(SEQ ID NO:56)的浓度(nM)的同源竞争的图。
图5显示与阴性对照事件(含有缺乏IPD079多核苷酸(空)的构建体)比较，对于用PHP68039、PHP68040、PHP76130和PHP76131构建体(含有编码IPD079Aa多肽(SEQ ID NO:2)和IPD079Ea多肽(SEQ ID NO:56)的基因设计)转化的单个事件的玉米根虫节点损伤评分(CRWNIS)的图。每个
Figure BDA0003795187100000073
符号代表单个事件。
图6A-6B显示IPD079Aa(SEQ ID NO:2)、IPD079Ea(SEQ ID NO:56)、和IPD079嵌合体：嵌合体1(SEQ ID NO:1277)、嵌合体2(SEQ ID NO:1278)、和嵌合体3(SEQ ID NO:1276)的Vector
Figure BDA0003795187100000074
套件的
Figure BDA0003795187100000075
模块的氨基酸序列比对。突出了序列多样性。嵌合体的交叉位置由IPD079Aa序列上方的“▼”表示。
具体实施方式
应理解，本公开不局限于所描述的特定方法、方案、细胞系、属、以及试剂，因此可以变化。还应当理解的是在此使用的术语是仅为了描述具体实施例的目的，并且不旨在限制本公开的范围。
如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”以及“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白质”包括本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质及其等效物等。在此所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。
本公开涉及用于控制有害生物的组合物和方法。这些方法涉及用编码植物来源的穿孔素的核酸序列来转化生物体。这些方法涉及用编码IPD079多肽的核酸序列转化生物体。具体地，实施例的核酸序列可用于制备具有杀有害生物活性的植物和微生物。因此，提供了经转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织以及种子。这些组合物是植物物种的核酸序列或穿孔素。这些核酸序列可用于表达载体的构建，用于随后转化到目的生物体中，作为用于分离其他同源(或部分同源)基因的探针，并且通过本领域已知的方法(如定点诱变、结构域交换或DNA改组)用于生产经改变的植物来源的穿孔素(特别是IPD079多肽)。植物来源的穿孔素可用于控制或杀灭鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真菌、半翅目和线虫有害生物群体，并可用于生产具有杀有害生物活性的组合物。目的昆虫有害生物包括但不限于鳞翅目物种(包括但不限于：例如棉铃虫(CEW)(Helicoverpa zea)、欧洲玉米螟(ECB)(玉米螟(Ostrinianubilalis))、小菜蛾，例如棉铃虫(Helicoverpa zea Boddie)；大豆尺蠖，例如大豆尺夜娥(Pseudoplusia includens Walker)；和绒毛豆毛虫，例如大豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis Hübner))和鞘翅目物种(包括但不限于西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)-WCRW、南方玉米根虫(斑点黄瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctata howardi))-SCRW、和北方玉米根虫(Northern corn rootworm，Diabrotica barberi)-NCRW)。IPD079多肽可用于控制或杀灭鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真菌、半翅目和线虫有害生物群体，并可用于生产具有杀有害生物活性的组合物。
“杀有害生物毒素”或“杀有害生物蛋白”在此用于是指毒素或与这种蛋白质具有同源性的蛋白质，该毒素具有针对以下一种或多种有害生物的毒性活性，这些有害生物包括但不局限于：鳞翅目、双翅目、半翅目以及鞘翅目或线虫门的成员。已经从生物体中分离出杀有害生物蛋白，这些生物体包括例如，芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)、假单孢菌属物种(Pseudomonas sp.)、发光杆菌属物种(Photorhabdus sp.)、致病杆菌属物种(Xenorhabdus sp.)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)以及鲍比氏类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。杀有害生物蛋白包括但不限于：来自假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)，如PSEEN3174(Monalysin；(2011)PLoS Pathogens[公共科学图书馆]7:1-13)的杀昆虫蛋白；来自假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株CHA0和Pf-5(以前称为荧光菌(fluorescens))(Pechy-Tarr，(2008)Environmental Microbiology[环境微生物学]10:2368-2386；GenBank登录号EU400157)的杀昆虫蛋白；来自台湾假单胞菌(Pseudomonas Taiwanensis)(Liu等人，(2010)J.Agric.Food Chem.[农业与食品化学杂志]，58:12343-12349)和来自假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcligenes)(Zhang等人，(2009)Annals of Microbiology[微生物学杂志]59:45-50和Li等人，(2007)PlantCell Tiss.Organ Cult.[植物细胞，组织和器官培养杂志]89:159-168)的杀昆虫蛋白；来自发光杆菌属物种和致病杆菌属物种(Hinchliffe等人，(2010)The Open ToxicologyJournal[开放毒理学杂志]，3:101-118和Morgan等人，(2001)Applied and Envir.Micro.[应用与环境微生物学]67:2062-2069)的杀昆虫蛋白；来自美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946的杀昆虫蛋白；美国专利公开号US 20140007292的PIP-1多肽；美国专利公开号US 20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽；美国专利公开号US 20140274885和US20160040184的PHI-4多肽；PCT公开号WO 2015/023846的PIP-47多肽、PCT公开号WO 2015/038734的PIP-72多肽；PCT公开号WO 2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽；PCT公开号WO 2015/120276的PtIP-83多肽；PCT序列号PCT/US 15/55502的PtIP-96多肽；PCT序列号PCT/US 16/32273的IPD073多肽、美国序列号62/269482的IPD082多肽，以及δ-内毒素包括但不限于Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry50、Cry51、Cry52、Cry53、Cry54、Cry55、Cry56、Cry57、Cry58、Cry59、Cry60、Cry61、Cry62、Cry63、Cry64、Cry65、Cry66、Cry67、Cry68、Cry69、Cry70、Cry71、Cry72、Cry73和Cry74类的δ-内毒素基因和苏云金芽孢杆菌溶细胞cyt1和cyt2基因。这些类别的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的成员是本领域技术人员熟知的(参见，Crickmore等人，“Bacillus thuringiensistoxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法]”(2011)，在lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/，可以使用“www”前缀在万维网上访问该网址。
δ-内毒素的实例还包括但不限于：美国专利号5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白；美国专利号8,304,604、8,304,605、8,476,226和9,006,520的DIG-3或DIG-11毒素(cry蛋白(如Cry1A、Cry3A)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的N末端缺失)；美国专利申请公开号2006/0112447的Cry1B；美国专利号6,033,874的Cry1C；美国专利号5,188,960和6,218,188的Cry1F；美国专利号7,070,982、6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体；美国专利号7,064,249的Cry2蛋白如Cry2Ab蛋白；Cry3A蛋白，包括但不限于：通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区的独特组合产生的工程化杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公开号2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员；Cry15蛋白，描述于以下文献中：Naimov等人(2008)Applied and Environmental Microbiology[应用与环境微生物学]74:7145-7151；美国专利号6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的CryET33和cryET34蛋白；美国专利号8,796,026、美国专利公开号2012/0278954，和PCT公开号WO2012/139004的CryET33和CryET34同源物；美国专利号6,083,499、6,548,291和6,340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白、Cry51蛋白、Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；美国专利号8,609,936的TIC807；WO 2007/027776的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利号8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；美国专利号7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO 2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO2005/038032的AXMI-010；WO 2005/021585的AXMI-003；美国专利号7,351,881的AXMI-008；美国专利申请公开号2004/0216186的AXMI-006；美国专利申请公开号2004/0210965的AXMI-007；美国专利申请号2004/0210964的AXMI-009；美国专利申请公开号2004/0197917的AXMI-014；美国专利号7,355,099的AXMI-004；WO 2006/119457、美国专利号7,622,572、7,803925、7,803,391、7,811,598、8,314,292的AXMI-028和AXMI-029；WO 2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；美国专利号8,084,416的AXMI-150；美国专利申请公开号2011/0023184的AXMI-205；美国专利号8,829,279的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063和AXMI-064，或者美国专利公开号US20140344999；美国专利号8,299,217的AXMI-R1和相关蛋白；美国专利号8,686,124的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；美国专利号8,759,619的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231；美国专利号8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；美国专利申请公开号2013/0117884的AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045；美国专利申请公开号2009/0144852的AXMI-066和AXMI-076；美国专利号8,318,900，或者美国专利公开号2013/0055469的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；美国专利号8,461,421，以及美国专利公开号2013/0305412的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137，具有美国专利号8,319,019的修饰的蛋白水解位点的Cry蛋白如Cry1A和Cry3A；美国专利号8,551,757的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员所熟知的(回顾参见van Frannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.[无脊椎动物病理学杂志]101:1-16)。使用Cry蛋白作为转基因植物性状是本领域技术人员熟知的，并且Cry转基因植物(包括但不限于表达以下的植物：Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt)已获得法规性审批(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal[植物生物技术杂志]9:283-300和CERA(2010)环境风险评估的转基因作物数据库中心(CERA)(GM CropDatabase Center for Environmental Risk Assessment(CERA))，ILSI研究基金会(ILSIResearch Foundation)，华盛顿特区，网址为cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database，可以使用“www”前缀在万维网上访问该网址)。本领域技术人员熟知的多于一种杀有害生物蛋白也可以在植物如Vip3Ab和Cry1Fa(US 2012/0317682)；Cry1BE和Cry1F(US2012/0311746)；Cry1CA和Cry1AB(US 2012/0311745)；Cry1F和CryCa(US 2012/0317681)；Cry1DA和Cry1BE(US 2012/0331590)；Cry1DA和Cry1Fa(US 2012/0331589)；Cry1AB和Cry1BE(US 2012/0324606)；Cry1Fa和Cry2Aa以及Cry1I和Cry1E(US 2012/0324605)；Cry34Ab/35Ab和Cry6Aa(US 20130167269)；Cry34Ab/VCry35Ab和Cry3Aa(US20130167268)；以及Cry3A和Cry1Ab或Vip3Aa(US 20130116170)中表达。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，这些杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7,491,869的脂质酰基水解酶，以及胆固醇氧化酶，例如来自链霉菌(Streptomyces)(Purcell等人，(1993)Biochem BiophysRes Commun[生物化学与生物物理研究通讯]15:1406-1413)。杀有害生物蛋白还包括美国专利号5,877,012、6,107,2796,137,033、7,244,820、7,615,686、和8,237,020等的VIP(营养期杀昆虫蛋白)毒素。其他VIP蛋白质是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。杀有害生物蛋白还包括毒素复合物(TC)蛋白，该毒素复合物(TC)蛋白可从生物体如致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属获得(参见，美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的TC蛋白。如在此所述，A类蛋白(“蛋白A”)是独立的毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)提高了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛肽的实例包括但不限于莱科毒素-1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。
在一些实施例中，IPD079多肽包含从本文公开的全长核酸序列推导出的氨基酸序列，以及由于使用替代性下游起始位点、或由于加工产生具有杀昆虫活性的较短蛋白而比全长序列短的氨基酸序列。加工可以在表达该蛋白的生物体内或在摄取蛋白后的有害生物中发生。
因此，本文提供了赋予杀有害生物活性的新颖的分离的或重组的核酸序列。还提供了IPD079多肽的氨基酸序列。由这些IPD079多肽基因翻译产生的蛋白质允许细胞控制或杀灭摄取该蛋白质的有害生物。
核酸分子及其变体和片段
在一些实施例中，包含编码植物来源的穿孔素或其生物活性部分的核酸序列的分离或重组的核酸分子，以及足以用作杂交探针以识别编码具有序列同源性区域的蛋白质的核酸分子的多种核酸分子。一个实施例涉及包含编码IPD079多肽或其生物活性部分的核酸序列的分离或重组的核酸分子，以及足以用作杂交探针以识别编码具有序列同源性区域的蛋白质的核酸分子的多种核酸分子。如在此使用的，术语“核酸分子”是指DNA分子(例如，重组DNA、cDNA、基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物而产生的DNA或RNA的类似物。该核酸分子可以是单链的或双链的，但优选地是双链的DNA。
在此使用的“分离的”核酸分子(或DNA)是指不再处于其天然环境中，例如处于体外的核酸序列(或DNA)。在此使用的“重组”核酸分子(或DNA)是指在重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或DNA)。在一些实施例中，“分离的”或“重组的”核酸不含有天然地位于在衍生出该核酸的生物体的基因组DNA中的该核酸侧翼的序列(即，位于该核酸的5’和3’末端的序列)(优选蛋白质编码序列)。出于本公开的目的，“分离的”或“重组的”当用于指核酸分子时不包括分离的染色体。例如，在不同的实施例中，编码IPD079多肽的重组核酸分子可以包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核酸序列，该核酸序列在衍生出该核酸的细胞的基因组DNA中天然地位于该核酸分子的侧翼。
在一些实施例中，与天然或基因组核酸序列相比，编码植物来源的穿孔素或IPD079多肽的分离的核酸分子在核酸序列中具有一个或多个变化。在一些实施例中，天然或基因组核酸序列的变化包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列的变化；与天然或基因组序列相比，由于氨基酸取代、插入、缺失和/或添加造成的核酸序列的变化；一个或多个内含子的去除；一个或多个上游或下游调节区域的缺失；和与基因组核酸序列相关的5’和/或3’非翻译区域的缺失。在一些实施例中，编码本公开的植物来源的穿孔素或IPD079多肽的核酸分子是非基因组序列。
考虑了编码植物来源的穿孔素和IPD079多肽或相关蛋白的多种多核苷酸。当有效地连接到合适的启动子、增强子、转录终止和/或聚腺苷酸化序列上时，这类多核苷酸可用于在宿主细胞中生产本公开的植物来源的穿孔素和IPD079多肽。这类多核苷酸还可用作用于分离编码植物来源的穿孔素和IPD079多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多核苷酸的探针。
编码IPD079多肽的多核苷酸
编码植物来源的穿孔素和IPD079多肽或相关的蛋白的多核苷酸的一个来源是蕨类或原始植物物种。编码IPD079多肽或相关蛋白的多核苷酸的一个来源是蕨类植物或原始植物物种，该蕨类或原始植物物种包含编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ IDNO:136、SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:140的IPD079多肽的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ IDNO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:139的IPD079多核苷酸。SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ IDNO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:139的多核苷酸在细菌宿主中表达IPD079多肽，这些细菌宿主包括但不限于农杆菌属(Agrobacterium)、芽胞杆菌属、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属和根瘤菌属(Rhizobium)细菌宿主细胞。这些多核苷酸还可用作用于分离编码IPD079多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多核苷酸的探针。这样的探针可用于鉴定源自蕨类植物(Pteridophyta)物种的同源或基本上同源的多核苷酸。
编码本公开的植物来源的穿孔素和IPD079多肽的多核苷酸也可以从植物来源的穿孔素或IPD079多肽序列从头合成。该多核苷酸基因的序列可以通过使用遗传密码从IPD079多肽序列中推导出来。计算机程序如“BackTranslate”(GCGTM包，阿克莱瑞公司(Acclerys，Inc.)，加利福尼亚州圣迭戈市)可用于将肽序列转换成编码该肽的相应核苷酸序列。可以用于获得相应的核苷编码序列的植物来源的穿孔素序列的实例包括但不限于SEQ ID NO:158-1248的任一项的多肽。可以用于获得相应的核苷编码序列的IPD079多肽序列的实例包括但不限于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、和SEQ ID NO:140的IPD079多肽。此外，编码本公开的植物来源的穿孔素和IPD079多肽的合成的多核苷酸序列可以被设计成使得它们在植物中表达。美国专利号5,500,365描述了用于合成植物基因以改进由所合成的基因编码的蛋白质的表达水平的方法。该方法涉及对外源转基因的结构基因序列的改性，使该外源转基因更有效地被植物转录、加工、翻译和表达。在植物中表达良好的基因的特征包括消除可能在基因转录物的编码区域中引起不希望的内含子剪接或聚腺苷酸化的序列，同时基本上保留杀有害生物蛋白的有毒部分的氨基酸序列。美国专利号5,689,052中公开了用于在单子叶植物中获得转基因的增强表达的类似方法。
在一些实施例中，编码IPD079多肽的核酸分子是具有列于SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ IDNO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:139中的序列的多核苷酸、及其变体、片段和互补序列。在本文中使用“互补序列”来指与给定核酸序列充分互补的核酸序列，使得其可以与该给定核酸序列杂交从而形成稳定的双链体。在本文中使用“多核苷酸序列变体”来指除遗传密码的简并性之外编码相同多肽的核酸序列。
在一些实施例中，编码植物来源的穿孔素或IPD079多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。如在此使用的，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”或“非基因组多核苷酸”是指与天然或基因组核酸序列相比，具有核酸序列的一个或多个变化的核酸分子。在一些实施例中，天然或基因组核酸分子的变化包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列的变化；用于在植物中表达的核酸序列的密码子优化；与天然或基因组序列相比，将至少一个氨基酸取代、插入、缺失和/或添加引入的核酸序列的变化；去除与该基因组核酸序列相关的一个或多个内含子；插入一个或多个异源内含子；缺失与该基因组核酸序列相关的一个或多个上游或下游调节区；插入一个或多个异源上游或下游调节区；缺失与该基因组核酸序列相关的5'和/或3'非翻译区；插入异源5'和/或3'非翻译区；和聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施例中，非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施例中，非基因组核酸分子是合成的核酸序列。
在一些实施例中，编码IPD079多肽的核酸分子是具有核苷酸序列的非基因组多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:139的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，其中该IPD079多肽具有杀昆虫活性。
在一些实施例中，该核酸分子编码IPD079多肽，该IPD079多肽包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ IDNO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:140的氨基酸序列，与在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:140的相应位置的天然氨基酸相比，该IPD079多肽具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个或更多个氨基酸取代。
在一些实施例中，该核酸分子编码SEQ ID NO:158-1248的任一项的植物来源的穿孔素多肽。
在一些实施例中，编码植物来源的穿孔素或IPD079多肽的核酸分子来源于蕨类植物(Pteridophyta)分类中的蕨类物种。本文使用的蕨类的系统发生基于A.R.Smith等人，TAXON[分类学]，55:705-731(2006)对现存蕨类的分类。现存的蕨类的其他系统发生的分类是本领域技术人员已知的。基于三个质体基因，可以在mobot.org/MOBOT/research/APweb/(其可以使用“www”前缀访问)以及Schuettpelz E.和Pryer K.M.，TAXON[分类学]56:1037-1050(2007)中发现蕨类的系统发生的另外的信息。可以在homepages.caverock.net.nz/～bj/fern/list.htm(其可以使用http://前缀访问)中另外的蕨类和其他原始植物物种发现。
还提供了编码如下转录和/或翻译产物的核酸分子，这些转录和/或翻译产物随后被剪接以最终产生功能性植物来源的穿孔素或IPD079多肽。剪接可以在体外或体内完成，并且可以涉及顺式或反式剪接。用于剪接的底物可以是多核苷酸(例如，RNA转录物)或多肽。多核苷酸的顺式剪接的实例是去除插入到编码序列中的内含子并剪接两个侧翼外显子区域以产生IPD079多肽编码序列。反式剪接的实例是通过将该编码序列分离成两个或更多个片段来对多核苷酸进行加密，这些片段可以单独转录并且然后被剪接以形成全长杀有害生物编码序列。使用可以引入到构建体中的剪接增强子序列可以促进多肽的顺式或反式剪接(美国专利号6,365,377和6,531,316)。因此，在一些实施例中，这些多核苷酸并不直接编码全长IPD079多肽，而是编码IPD079多肽的一个或多个片段。这些多核苷酸可用于通过涉及剪接的机制来表达功能性IPD079多肽，其中剪接可以在多核苷酸(例如内含子/外显子)和/或多肽(例如内含肽/外显肽)的水平上发生。这可以用于，例如，控制杀有害生物活性的表达，因为如果在允许剪接过程以产生功能性产物的环境中表达所有必需的片段，则仅表达功能性杀有害生物多肽。在另一个实例中，将一个或多个插入序列引入多核苷酸中可促进与低同源性多核苷酸的重组；使用针对该插入序列的内含子或内含肽便于去除该间插序列，从而恢复经编码的变体的功能。
作为编码IPD079多肽的这些核酸序列的片段的核酸分子也涵盖在实施例中。在本文中使用“片段”来指编码IPD079多肽的核酸序列的一部分。核酸序列的片段可以编码IPD079多肽的生物活性部分，或者它可以是可以使用下文公开的方法用作杂交探针或PCR引物的片段。作为编码IPD079多肽的核酸序列的片段的核酸分子包含至少约180、210、240、270、300、330、360、390或420个连续核苷酸或至多存在于编码本文公开的IPD079多肽的全长核酸序列中的核苷酸数目，这取决于预期用途。“连续核苷酸”在此用于时指彼此紧邻的核苷酸残基。实施例的核酸序列的片段将编码保留IPD079多肽的生物学活性并因此保留杀昆虫活性的蛋白质片段。“保留杀昆虫活性”在本文中用于是指具有全长多肽的至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀昆虫活性。在一些实施例中，该IPD079多肽具有全长IPD079Aa多肽(SEQ ID NO:2)的至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀昆虫活性。在一个实施例中，该杀昆虫活性针对鞘翅目物种。在一个实施例中，该杀昆虫活性针对根萤叶甲属物种。在一些实施例中，该杀昆虫活性针对玉米根虫复合物的一种或多种昆虫有害生物：西方玉米根虫，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera)；北方玉米根虫(northern corn rootworm，D.barberi)；南方玉米根虫或斑点黄瓜甲虫；斑点黄瓜甲虫，和墨西哥玉米根虫(Mexicancorn rootworm，D.virgifera zeae)。
在一些实施例中，编码IPD079多肽、编码蛋白质的生物活性部分的核酸序列的片段将编码至少约15个、20个、30个、50个、75个、100个、125个连续氨基酸或高达本公开的全长IPD079多肽中存在的总数量的氨基酸。在一些实施例中，该片段是通过以下来自于相对于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ IDNO:140或其变体的N末端和/或C末端的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或更多个氨基酸的N-末端和/或C-末端截短，例如通过蛋白质水解、起始密码子的插入、编码缺失的氨基酸的密码子的缺失并伴随终止密码子插入，或在编码序列中插入终止密码子。
在一些实施例中，该IPD079多肽通过与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ IDNO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:139的核酸序列充分同源的核酸序列编码。在本文中使用“充分同源的”来指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同源性的氨基酸或核酸序列。本领域技术人员将认识到，可以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等来适当地调整这些值以确定由两个核酸序列编码的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，该序列同源性是针对编码IPD079多肽的多核苷酸的全长序列或针对IPD079多肽的全长序列。
在一些实施例中，编码IPD079多肽的核酸选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ IDNO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:139。
在一些实施例中，该核酸编码与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:140相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的IPD079多肽。在一些实施例中，使用ClustalW算法在Vector
Figure BDA0003795187100000301
程序包(英杰公司(Invitrogen Corporation)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)的
Figure BDA0003795187100000302
模块中在所有默认参数下计算该序列同一性。在一些实施例中，使用ClustalW算法在Vector NTI程序包(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)的ALIGNX模块中在所有默认参数下计算该整个全长多肽的序列同一性。
在一些实施例中，该核酸编码与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:94相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的IPD079多肽。
在一些实施例中，该核酸编码与SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的IPD079多肽。
为了确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的，将序列进行比对。两个序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同位置的数量的函数(即，同一性百分比＝相同位置数/位置总数(例如重叠位置)×100)。在一个实施例中，两个序列具有相同的长度。在另一个实施例中，比较实在整个参考序列中进行(例如，在整个SEQID NO:1中)。可使用类似于上述那些技术的技术，在容许或不容许缺口的情况下确定两个序列之间的百分比同一性。在计算百分比同一性中，典型地计数确切的匹配。
用于比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是如下文献中所述算法：Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48(3):443-453，使用GAP版本10软件来确定序列同一性或相似性，使用以下默认参数：对于核酸序列的同一性％和相似性％，使用GAP权重为50和长度权重为3，以及nwsgapdna.cmpii评分矩阵；对于氨基酸序列的同一性％或相似性％，使用GAP权重为8和长度权重为2，以及BLOSUM62评分程序。也可以使用等效的程序。在此使用的“等效的程序”是指任何序列比较程序，该程序对于任何两个所讨论的序列产生一个比对，当与GAP版本10所产生的对应的比对相比较时，该比对具有相同的核苷酸残基配对以及相同的序列同一性百分比。
这些实施例还涵盖编码IPD079多肽变体的核酸分子。编码核酸序列的IPD079多肽的“变体”包括编码本文公开的IPD079多肽但是由于遗传密码的简并性以及如上所述的充分同一的那些序列而存在保守差异的那些序列。可以使用熟知的分子生物学技术(如下文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术)来识别天然存在的等位基因变体。变体核酸序列还包括经合成衍生的核酸序列，该核酸序列已经例如通过使用定点诱变而产生，但是仍然编码如下所讨论的所公开的IPD079多肽。
本公开提供编码本文公开的IPD079多肽中的任何一个的经分离或重组的多核苷酸。本领域普通技术人员将容易理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码本公开的IPD079多肽的核苷酸序列。
本领域技术人员将进一步了解，可以通过核酸序列的突变来引入变化，从而导致已编码的IPD079多肽的氨基酸序列的改变，而不改变这些蛋白质的生物活性。因此，变体核酸分子可以通过以下方式产生：将一个或多个核苷酸取代、添加和/或缺失引入到在此所公开的相应的核酸序列中，这样使得将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入到所编码的蛋白质中。可以通过标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)引入突变。本公开也涵盖此类变体核酸序列。
可替代地，可以通过沿编码序列的全部或部分随机引入突变(例如通过饱和诱变)来制备变体核酸序列，并且可以筛选所得突变体赋予杀有害生物活性以识别保留活性的突变体的能力。在诱变之后，这种经编码的蛋白质可以进行重组地表达，并且这种蛋白质的活性可以使用标准的测定技术来确定。
本公开的多核苷酸及其片段任选用作各种重组和递归重组反应的底物，除了例如Ausubel、Berger和Sambrook所述的标准克隆方法之外，即，以产生具有所需性质的另外的杀有害生物多肽同源物及其片段。各种这样的反应是已知的，包括由诸位发明人及其同事开发的那些反应。用于生产在此列出的任何核酸的变体的方法(这些方法包括将此多核苷酸与第二(或更多)多核苷酸递归重组，从而形成变体多核苷酸文库)也是本公开的实施例，所产生的文库、包括这些文库的细胞和通过这些方法产生的任何重组多核苷酸也是如此。另外，这样的方法任选地包括基于杀有害生物活性从这些文库中选择变体多核苷酸，正如其中这样的递归重组在体外或体内进行。
各种多样性产生方案，包括核酸递归重组方案是可获得的并且在本领域中被充分描述。该程序可以单独和/或组合使用以产生核酸或核酸组的一种或多种变体，以及所编码蛋白质的变体。单独地或整体地，这些程序提供了产生多样化核酸和核酸集合(包括例如核酸文库)的稳健且广泛适用的方式，这些方式可用于，例如，具有新的和/或改进的特征的核酸、蛋白质、途径、细胞和/或生物体的工程化或快速进化。
虽然在随后的讨论过程中作出明确的区分和分类，但是应当理解，这些技术通常不是相互排斥的。实际上，各种方法可以单独使用或组合、平行或串联使用，以便取得不同的序列变体。
在此描述的任何多样性产生程序的结果可以是一种或多种核酸的产生，其可以选择或筛选具有或赋予所需性质的核酸或编码具有或者赋予所需性质的蛋白的核酸。通过本领域技术人员可以在此或以其他方式获得的一种或多种方法进行多样化之后，可以针对所需活性或性质，例如，杀有害生物活性或，在所需pH下的这种活性等选择所产生的任何核酸。这可以包括通过本领域任何测定来识别可以例如以自动化或可自动化形式检测的任何活性，参见例如以下的杀昆虫活性筛选的讨论。各种相关(或甚至不相关)的性质可以由执业者酌情串联或平行评估。
用于产生改性的核酸序列的各种多样性产生程序的描述，例如编码具有杀有害生物活性的多肽或其片段的那些可以在以下出版物和其中引用的参考文献中找到：Soong等人，(2000)，Nat Genet[自然遗传学]，25(4):436-439；Stemmer等人，(1999)，TumorTargeting[肿瘤靶向]，4:1-4；Ness等人，(1999)，Nat Biotechnol[自然生物技术，17:893-896；Chang等人，(1999)，Nat Biotechnol[自然生物技术]，17:793-797；Minshull和Stemmer，(1999)，Curr Opin Chem Biol[生物化学当代观点]，3:284-290；Christians等人，(1999)，Nat Biotechnol[自然生物技术]，17:259-264；Crameri等人，(1998)，Nature[自然]，391:288-291；Crameri等人，(1997)，Nat Biotechnol[自然生物技术]，15:436-438；Zhang等人，(1997)，PNAS USA[美国科学院院报]，94:4504-4509；Patten等人，(1997)，Curr Opin Biotechnol[当前生物技术的观点]，8:724-733；Crameri等人，(1996)，Nat Med[自然医学]，2:100-103；Crameri等人，(1996)，Nat Biotechnol[自然生物技术]，14:315-319；Gates等人，(1996)，J Mol Biol[分子生物学杂志]，255:373-386；Stemmer，(1996)，“Sexual PCR and AssemblyPCR[有性PCR和装配PCR]”，在：The Encyclopedia ofMolecular Biology[分子生物学百科全书]，VCH出版商，纽约，第447-457页中；Crameri和Stemmer，(1995)，BioTechniques[生物技术]，18:194-195；Stemmer等人，(1995)，Gene[基因]，164:49-53；Stemmer，(1995)，Science[科学]，270:1510；Stemmer，(1995)，Bio/Technology[生物/技术]，13:549-553；Stemmer，(1994)，Nature[自然]，370:389-391和Stemmer，(1994)，PNAS USA[美国科学院院报]，91:10747-10751。
产生多样性的突变方法包括例如定点诱变(Ling等人，(1997)Anal Biochem[分析生物化学]254(2):157-178；Dale等人，(1996)，Methods Mol Biol[分子生物学方法]，57:369-374；Smith，(1985)，Ann Rev Genet[遗传学年评]，19:423-462；Botstein和Shortle，(1985)，Science[科学]，229:1193-1201；Carter，(1986)，Biochem J[生物化学杂志]，237:1-7和Kunkel，(1987)，“The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis[寡核苷酸定向诱变的效率]”，在：Nucleic Acids&Molecular Biology[核酸与分子生物学](Eckstein和Lilley主编，施普林格出版公司，柏林]))；使用含尿嘧啶的模板的诱变(Kunkel，(1985)PNAS USA[美国科学院院报]82:488-492；Kunkel等人，(1987)MethodsEnzymol[酶学方法]154:367-382以及Bass等人，(1988)Science[科学]242:240-245)；寡核苷酸定向诱变(Zoller和Smith，(1983)Methods Enzymol[酶学方法]100:468-500；Zoller和Smith，(1987)Methods Enzymol[酶学方法]154:329-350(1987)；Zoller和Smith，(1982)Nucleic Acids Res[核酸研究]10:6487-6500)；经硫代磷酸改性的DNA诱变(Taylor等人，(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13:8749-8764；Taylor等人，(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13:8765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein，(1986)Nucl Acids Res[核酸研究]14:9679-9698；Sayers等人，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16:791-802以及Sayers等人，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16:803-814)；使用有缺口的双链体DNA的诱变(Kramer等人，(1984)Nucl Acids Res[核酸研究]12:9441-9456；Kramer和Fritz，(1987)Methods Enzymol[酶学方法]154:350-367；Kramer等人，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16:7207以及Fritz等人，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16:6987-6999)。
其他合适的方法包括点错配修复(Kramer等人，(1984)Cell[细胞]38:879-887)、使用有修复缺陷的宿主菌株的诱变(Carter等人，(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13:4431-4443以及Carter，(1987)Methods in Enzymol[酶学方法]154:382-403)、缺失诱变(Eghtedarzadeh和Henikoff，(1986)Nucl Acids Res[核酸研究]14:5115)、限制性-选择和限制性-纯化(Wells等人，(1986)Phil Trans R Soc Lond A[伦敦皇家学会哲学会刊系列A]317:415-423)、通过全基因合成的诱变(Nambiar等人，(1984)Science[科学]223:1299-1301；Sakamar和Khorana，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]14:6361-6372；Wells等人，(1985)Gene[基因]34:315-323以及
Figure BDA0003795187100000361
等人，(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13:3305-3316)、双链断裂修复(Mandecki，(1986)PNAS USA[美国科学院院报]，83:7177-7181以及Arnold，(1993)Curr Opin Biotech[生物技术当代观点]4:450-455)。许多上述方法的另外的细节可以在酶学方法第154卷中找到，其还描述了用各种诱变方法故障查找问题的有用对照。
关于各种多样性产生方法的另外的细节可以在以下美国专利、PCT公开物和申请和EPO公开物中找到：美国专利号5,723,323、美国专利号5,763,192、美国专利号5,814,476、美国专利号5,817,483、美国专利号5,824,514、美国专利号5,976,862、美国专利号5,605,793、美国专利号5,811,238、美国专利号5,830,721、美国专利号5,834,252、美国专利号5,837,458、WO 1995/22625、WO 1996/33207、WO 1997/20078、WO 1997/35966、WO 1999/41402、WO 1999/41383、WO 1999/41369、WO 1999/41368、EP 752008、EP 0932670、WO 1999/23107、WO 1999/21979、WO 1998/31837、WO 1998/27230、WO 1998/27230、WO 2000/00632、WO 2000/09679、WO 1998/42832、WO 1999/29902、WO 1998/41653、WO 1998/41622、WO1998/42727、WO 2000/18906、WO 2000/04190、WO 2000/42561、WO 2000/42559、WO 2000/42560、WO 2001/23401和PCT/US 01/06775。
实施例的核苷酸序列可以用于从植物分离相应的序列，这些植物包括但不限于蕨类和其他原始植物。以这种方式，可以使用如PCR、杂交等方法来识别这样的序列(基于其与本文所述序列的序列同源性)。实施例涵盖基于与在此阐明的全部序列或其片段的序列同一性选择的序列。这些序列包含作为公开序列的直向同源物的序列。术语“直向同源物”是指衍生自共同祖先基因并且由于物种形成而在不同物种中发现的基因。当其核苷酸序列和/或其编码的蛋白质序列共有如本文其他地方所定义的实质同一性时，在不同物种中发现的基因被认为是直向同源物。直向同源物的功能通常在物种间是高度保守的。
在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以从由任何目的生物体提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物以及PCR克隆的方法是本领域通常已知的并且公开于Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版，冷泉港实验室出版社，普莱恩维尤，纽约州))中，以下为“Sambrook”。还参见，Innis等人编辑，(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications(Academic Press,New York)[PCR方案：方法与应用指南(学术出版社，纽约)]；Innis和Gelfand编辑，(1995)PCR Strategies(Academic Press,New York)[PCR策略(学术出版社，纽约)]；以及Innis和Gelfand编辑，(1999)PCR Methods Manual(AcademicPress,New York)[PCR方法手册(学术出版社，纽约)]。已知的PCR方法包括但不限于：使用成对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
为了从蕨类、苔藓或其他原始植物收集物中鉴定潜在的IPD079多肽，可以使用蛋白质印迹和/或ELISA方法，用针对IPD079多肽和/或IPD079多肽产生的抗体筛选该蕨类、苔藓或其他原始植物细胞裂解物。这种类型的测定可以以高通量方式进行。可以通过各种技术(例如基于抗体的蛋白质纯化和识别)进一步分析阳性样品。产生抗体的方法是本领域公知的，如下文所述。
可替代地，基于质谱的蛋白质识别方法可以使用文献中的方案用于识别IPD079多肽的同源物(Scott Patterson，(1998)，10.22，1-24，由约翰&威利父子公司出版的CurrentProtocol in Molecular Biology[当前分子生物学方案])。具体来说，使用基于LC-MS/MS的蛋白质识别方法将给定细胞裂解物或所需分子量富集样品(从与IPD079多肽的相关分子量带的SDS-PAGE凝胶切除的)的MS数据与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140的IPD079多肽及其同源物的序列信息结合。肽序列中的任何匹配表明在样品中具有同源蛋白的可能性。可以使用另外技术(蛋白质纯化和分子生物学)来分离蛋白质并识别同源物的序列。
在杂交方法中，全部或部分杀有害生物核酸序列可用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建此类cDNA和基因组文库的方法是本领域通常已知的，并且公开于Sambrook和Russell，(2001)，同上。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用一个可检测基团(如32P或任何其他可检测的标志物，如其他放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)进行标记。用于杂交的探针可以通过标记基于在此公开的编码已知的IPD079多肽的核酸序列的合成的寡核苷酸来制备。可以另外使用简并引物，这些简并引物是基于在该核酸序列或所编码的氨基酸序列中的保守性核苷酸或氨基酸残基而设计的。这种探针典型地包含以下核酸序列的区域，该核酸序列区域在严格条件下与编码本公开的IPD079多肽的核酸序列或其片段或变体的至少约12个、至少约25个、至少约50、75、100、125、150、175或200个连续核酸进行杂交。用于制备用于杂交的探针的方法是本领域通常已知的，并且公开于Sambrook和Russell，(2001)，同上，其通过引用结合在此。
例如，编码本文公开的IPD079多肽的完整核酸序列或者其一个或多个部分可以用作能够与编码IPD079多肽样序列和信使RNA的相应核酸序列特异性杂交的探针。为了实现在不同的条件下的特异性杂交，这样的探针包括以下序列，这些序列是独特的并且长度优选为至少约10个核苷酸、或长度为至少约20个核苷酸。此类探针可以用于通过PCR对来自所选生物体的相应杀有害生物序列进行扩增。可以使用这种技术从所希望的生物体中分离另外的编码序列，或作为用于确定生物体中存在编码序列的诊断试验。杂交技术包括铺板的DNA文库的杂交筛选(斑块或群落；参见，例如，Sambrook等人，(1989)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州)。
这种序列的杂交可以在严格条件下进行。在此使用的“严格条件”或“严格杂交条件”是指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，比背景高至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以识别与该探针100％互补的靶序列(同源探测)。可替代地，也能够调节严格条件以允许序列中的某些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度为小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。
蛋白质及其变体和片段
植物来源的穿孔素和IPD079多肽也由本公开涵盖。本文使用的“植物来源的穿孔素”是指从植物中分离的多肽，或者通过来自植物基因组或转录组(包含MAC/穿孔素(MACPF)Pfam结构域(PF01823)或其变体)的蛋白质组学识别的。本文中可互换地使用的“IPD079多肽”和“IPD079蛋白”是指具有杀昆虫活性(包括但不限于对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物的杀昆虫活性)的植物来源的穿孔素多肽，并且与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:56的蛋白质充分同源。多种IPD079多肽是预期的。在一些实施例中，该IPD079多肽来源于蕨类植物(Pteridophyta)分类中的蕨类物种。植物来源的穿孔素和IPD079多肽或相关蛋白的来源是来自选自但不限于以下的植物物种：石长生属(Adiantum)、侧金盏花属(Adonis)、连珠蕨属(Aglaomorpha)、天门冬属(Asparagus)、铁角蕨属(Asplenium)、紫葳属(Bignonia)、乌毛蕨属(Blechnum)、实蕨属(Bolbitis)、附生蕨属(Campyloneurum)、青葙属(Celosia)、白粉藤属(Cissus)、线蕨属(Colysis)、骨碎补属(Davallia)、翼囊蕨属(Didymochlaena)、东风菜属(Doellingeria)、鳞毛蕨属(Dryopteris)、舌蕨属(Elaphoglossum)、木贼属(Equisetum)、常春藤属(Hedera)、石杉属(Huperzia)、石松属(Lycopodium)、海金沙属(Lygodium)、苹属(Marsilea)、果蕨属(Matteuccia)、星蕨属(Microsorum)、肾蕨属(Nephrolepis)、球子蕨属(Onoclea)、瓶尔小草属(Ophioglossum)、粉花凌霄属(Pandorea)、旱蕨属(Pellaea)、新西兰麻(Phormium)、鹿角蕨属(Platycerium)、多足蕨属(Polypodium)、耳蕨属(Polystichium)、Prostanthera、松叶蕨属(Psilotum)、凤尾蕨属(Pteris)、复叶耳蕨属(Rumohra)、钻地风属(Schizophragma)、卷柏属(Selaginella)、白桫椤属(Sphaeropteris)、光叶藤蕨属(Stenochiaena)、毛核木属(Symphoricarpos)、金星蕨属(Thelypteris)、多蕊木属(Tupidanthus)、毛蕊花属(Verbascum)、斑鸠菊属(Vernonia)、和林石草属(Waldsteinia)物种。植物来源的穿孔素和IPD079多肽或相关蛋白的来源是选自但不限于以下的蕨类和其他原始植物物种：石杉属、瓶尔小草属、石松属、和鹿角蕨属物种。本文中可互换地使用的“IPD094多肽”和“IPD094蛋白”是指具有杀昆虫活性(包括但不限于对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物的杀昆虫活性)的植物来源的穿孔素多肽，并且与SEQ ID NO:144的蛋白质充分同源。
本文所使用的“充分同源”是指，使用标准参数、使用本文所述的比对程序之一，与参比序列相比，具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在本文中与序列同一性百分比一起使用时，术语“约”意指+/-0.5％。在一些实施例中，序列同源性针对多肽的全长序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，使用ClustalW算法在Vector
Figure BDA0003795187100000421
程序包(英杰公司(Invitrogen Corporation)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)的
Figure BDA0003795187100000422
模块中在所有默认参数下计算该序列同一性。在一些实施例中，序列同一性贯穿于多肽的整个长度，使用具有所有默认参数的Vector
Figure BDA0003795187100000423
程序组(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation))的
Figure BDA0003795187100000424
模块中的ClustalW算法进行计算。
如在此使用的，术语“蛋白质”、“肽分子”、或“多肽”包括包含五个或更多个氨基酸的任何分子。本领域熟知蛋白质、肽或多肽分子可以进行改性，该改性包括翻译后改性，如但不限于二硫键形成、糖基化、磷酸化或寡聚化。因此，如在此使用的，术语“蛋白质”、“肽分子”或“多肽”包括通过任何生物或非生物过程改性的任何蛋白质。术语“氨基酸”是指所有天然存在的L-氨基酸。
在此使用的“重组蛋白”是指不再在其天然环境中的蛋白质，例如在体外或重组细菌或植物宿主细胞中。基本上不含细胞材料的多肽包括具有小于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的非杀有害生物蛋白的蛋白质的制剂(在此也称为“污染蛋白”)。
“片段”或“生物活性部分”包括包含与多肽充分同一并且显示杀昆虫活性的氨基酸序列的多肽片段。这样的生物活性部分可以通过重组技术制备并评价杀昆虫活性。
本文所使用的“变体”是指具有如下氨基酸序列的蛋白质或多肽，该氨基酸序列与亲本氨基酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。与天然相比，变体能以氨基酸取代；缺失(包括但不限于在N末端和/或C末端缺失氨基酸)；和添加(包括但不限于N-末端和/或C-末端)的形式。
植物来源的穿孔素
在一些实施例中，该植物来源的穿孔素包含MAC/穿孔素(MACPF)Pfam结构域(PF01823)。在一些实施例中，使用本领域技术人员已知的蛋白质组学方法识别植物来源的穿孔素。在一些实施例中，通过BLAST和/或HMMSearch来识别植物来源的穿孔素。在一些实施例中，该植物来源的穿孔素匹配Pfam ID#IPR020864的HMM谱，具有小于0.01的E值并具有大于250个氨基酸的长度。在一些实施例中，该植物来源的穿孔素与SEQ ID NO:158-1248的任一项具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大氨基酸序列同一性。在一些实施例中，该植物来源的穿孔素包含SEQ ID NO:158-1248的任一项的多肽、其同系物或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，该植物来源的穿孔素与SEQ ID NO:144的IPD094多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大氨基酸序列同一性。在一些实施例中，该植物来源的穿孔素是本公开的IPD094多肽、其同系物或其变体。在一些实施例中，该植物来源的穿孔素是本公开的IPD079多肽。
IPD079多肽
在一些实施例中，IPD079多肽包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:140的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该IPD079多肽具有杀昆虫活性。
在一些实施例中，anIPD079多肽包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92或SEQID NO:94的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该IPD079多肽具有杀昆虫活性。
在一些实施例中，IPD079多肽包含与SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ IDNO:140的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该IPD079多肽具有杀昆虫活性。
在一些实施例中，IPD079多肽包含与贯穿SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92或SEQID NO:94的氨基酸序列的整个长度具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，IPD079多肽包含与贯穿SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ IDNO:140的氨基酸序列的整个长度具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，IPD079多肽包含与在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92或SEQID NO:94的相应位置的天然氨基酸相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70个或更多个氨基酸取代的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:94的氨基酸序列。
在一些实施例中，IPD079多肽包含在SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ IDNO:140的相应位置的天然氨基酸相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70个或更多个氨基酸取代的SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:140的氨基酸序列。
在一些实施例中，序列同一性贯穿于多肽的整个长度，使用具有所有默认参数的Vector
Figure BDA0003795187100000491
程序组(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(InvitrogenCorporation))的
Figure BDA0003795187100000492
模块中的ClustalW算法进行计算。
在一些实施例中，IPD079多肽包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQID NO:42、SEQID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:94的氨基酸序列。
在一些实施例中，该IPD079多肽包含SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ IDNO:140的氨基酸序列。
IPD079多肽的片段或生物活性部分包括片段，该片段包含与列于SEQID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:140中的氨基酸序列充分同一的氨基酸序列，其中该IPD079多肽具有杀昆虫活性。这样的生物活性部分可以通过重组技术制备并评价杀昆虫活性。
在一些实施例中，该IPD079多肽片段是通过以下来自相对于SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:140的N末端和/或C末端的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或更多个氨基酸的N-末端和/或C-末端截短，例如通过蛋白质水解、通过初始密码子的插入、通过编码缺失的氨基酸的密码子的缺失并伴随初始密码子的插入、和/或终止密码子的插入。
对于杀昆虫蛋白家族的系统发育的、序列基序、和结构分析
可以使用序列和结构分析方法，并可以由四个部分组成：系统发育树构建、蛋白质序列基序发现、二级结构预测、和蛋白质序列与二级结构的比对。关于每个部分的详细信息的描述如下：
1)系统发育树构建
可以使用软件MEGA5进行系统发育分析。将蛋白质序列经受ClustalW版本2分析(Larkin M.A等人(2007)Bioinformatics[生物信息学]23(21):2947-2948)，用于多重序列比对。然后通过基于JTT矩阵的模型的最大似然量法推断进化历史。获得具有最高对数似然值的树，以Newick格式导出，并进一步处理，以与出现在树中的相同顺序提取序列ID。可以为每个杀昆虫蛋白家族手工识别代表亚科的几个进化枝。
2)蛋白质序列基序发现
根据先前构建的系统发育树对蛋白质序列进行重新排序，并送入MOTIF分析工具MEME(多重EM用于MOTIF启发)(Bailey T.L.和Elkan C.，Proceedings of the SecondInternational Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology[第二届国际分子生物学智能系统会议论文集]，第28-36页，AAAI出版社，门洛帕克，加利福尼亚，1994)用于鉴定关键序列基序。MEME设置如下：最小位点数2，最小基序宽度5，和最大基序数30。通过视觉观察确定了每个亚家族独有的序列基序。贯穿整个基因家族的MOTIF分布在HTML网页中可以是可视化的。相对于每个MOTIF的E-值的排名对MOTIF进行编号。
3)二级结构预测
可以将PSIPRED(顶级二级结构预测方法)(Jones DT.(1999)J.Mol.Biol.[分子细胞生物学]292:195-202)安装在本地的Linux服务器中，并用于蛋白质二级结构预测。该工具使用基于PSI-BLAST输出的两个前馈神经网络提供准确的结构预测。通过去除Uniref100中的低复杂度、跨膜和卷曲的螺旋区域来创建PSI-BLAST数据库。PSIPRED结果包含二级结构(α螺旋：H，β链：E，以及线圈：C)和给定蛋白质序列中每个氨基酸的相应置信度得分。
4)蛋白质序列与二级结构的比对
可以开发脚本，以根据来自步骤1的所有蛋白质的多重蛋白质序列比对来产生间隙二级结构比对。所有经比对的蛋白质序列和结构都被连接成单个FASTA文件，并然后导入到MEGA中用于可视化和鉴定保守结构。
在一些实施例中，IPD079多肽具有在约30kD和约70kD之间、在约40kD和约60kD之间、在约45kD和约55kD之间、在约47.5kD和约52.5kD之间的计算的分子量。关于分子量，“约”意指±1kD。
在一些实施例中，IPD079多肽具有改性的物理性质。如在此使用的，术语“物理性质”是指适于描述蛋白质的物理化学特征的任何参数。如在此使用的，“目的物理性质”和“目的性质”可互换使用，以指正在研究和/或改性的蛋白质的物理性质。物理性质的实例包括但不限于：蛋白质表面上的净表面电荷和电荷分布、蛋白质表面上的净疏水性和疏水残基分布、表面电荷密度、表面疏水密度、表面电离基团的总计数、表面张力、蛋白质大小及其在溶液中的分布、熔融温度、热容量、和第二位力系数。物理性质的实例还包括但不限于：溶解度、折叠、稳定性、和消化性。在一些实施例中，IPD079多肽增加了昆虫肠中的蛋白水解片段的消化性。模拟胃液消化的模型是本领域技术人员已知的(Fuchs,R.L.和J.D.Astwood.Food Technology[食品技术]50:83-88,1996；Astwood,J.D.等人，NatureBiotechnology[生物技术]14:1269-1273,1996；Fu TJ等人，J.Agric Food Chem.[农业与食品化学杂志]50:7154-7160,2002)。
在一些实施例中，变体包括由于诱变而在氨基酸序列方面不同的多肽。本公开所涵盖的变体蛋白质具有生物学活性，即它们仍然具有天然蛋白质所需的生物学活性(即杀有害生物活性)。在一些实施例中，该变体将具有至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、至少约80％或更高的天然蛋白质的杀昆虫活性。在一些实施例中，变体可以具有比天然蛋白质改进的活性。
细菌基因通常在可读框的起始附近具有多个甲硫氨酸起始密码子。经常，在这些起始密码子中的一个或多个处的翻译起始将导致一种功能蛋白质的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，细菌(如，芽孢杆菌属物种)还将该密码子GTG识别为起始密码子，并且在GTG密码子处起始翻译的蛋白质在第一个氨基酸处包含甲硫氨酸。在少数情况下，细菌系统中的翻译可以在TTG密码子处启动，尽管在此事件中TTG编码甲硫氨酸。此外，常常不首先确定这些密码子中的哪一些在细菌中自然地使用。因此，应当理解，使用这些可替代的甲硫氨酸密码子之一也可能导致杀有害生物蛋白的产生。这些杀有害生物蛋白涵盖于本公开之中，并且可以在本公开的这些方法中使用。应当理解的是当在植物中表达时将有必要将替代起始密码子改变为ATG以用于正确的翻译。
本领域技术人员理解，可以修饰多核苷酸编码序列以在甲硫氨酸起始密码子后面的倒数第二位添加密码子以产生用于重组克隆目的和/或用于表达目的的限制性酶切位点。在一些实施例中，该IPD079多肽在翻译起始因子甲硫氨酸之后的倒数第二位进一步包含丙氨酸残基。
在一些实施例中，IPD079多肽的翻译起始子甲硫氨酸在翻译后被切除。本领域技术人员理解，在许多细胞表达系统中，N-末端翻译起始子甲硫氨酸可以被甲硫氨酸氨基肽酶去除。
在另一个实施例中，包括但不限于IPD079多肽的植物来源的穿孔素表达为具有催化多步翻译后蛋白质剪接的间插序列的前体蛋白。蛋白质剪接涉及从多肽切除间插序列，并伴随连接侧翼序列以产生新的多肽(Chong等人，(1996)，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，271:22159-22168)。这种被称为内含肽的间插序列或蛋白质剪接元件，通过在N末端和C末端剪接点处的以下三个协调反应催化其自身的切除：N末端半胱氨酸或丝氨酸的酰基重排；两个末端之间形成支链酯或硫酯中间体的酯交换反应，和与内含肽C末端天冬酰胺的环化相偶联释放内含肽的肽键切割(Evans等人，(2000)，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，275:9091-9094)。阐明蛋白质剪接的机制导致了许多基于内含肽的应用(Comb等人，美国专利号5,496,714；Comb等人，美国专利号5,834,247；Camarero和Muir，(1999)，J.Amer.Chem.Soc.[美国化学学会学报]，121:5597-5598；Chong等人，(1997)，Gene[基因]，192:271-281，Chong等人，(1998)，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，26:5109-5115；Chong等人，(1998)，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，273:10567-10577；Cotton等人，(1999)，J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]，121:1100-1101；Evans等人，(1999)，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，274:18359-18363；Evans等人，(1999)，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，274:3923-3926；Evans等人，(1998)，ProteinSci.[蛋白质科学]，7:2256-2264；Evans等人，(2000)，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，275:9091-9094；Iwai和Pluckthun，(1999)，FEBS Lett.[欧洲生化学会联盟通讯]，459:166-172；Mathys等人，(1999)，Gene[基因]，231:1-13；Mills等人，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，95:3543-3548；Muir等人，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，95:6705-6710；Otomo等人，(1999)，Biochemistry[生物化学]，38:16040-16044；Otomo等人，(1999)，J.Biolmol.NMR[生物分子核磁共振杂志]，14:105-114；Scott等人，(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，96:13638-13643；Severinov和Muir，(1998)，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，273:16205-16209；Shingledecker等人，(1998)，Gene[基因]，207:187-195；Southworth等人，(1998)，EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]，17:918-926；Southworth等人，(1999)，Biotechniques[生物技术]，27:110-120；Wood等人，(1999)，Nat.Biotechnol.[自然生物技术]，17:889-892；Wu等人，(1998a)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，95:9226-9231；Wu等人，(1998b)，Biochim Biophys Acta[生物化学与生物物理学报]，1387:422-432；Xu等人，(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，96:388-393；Yamazaki等人，(1998)，J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]，120:5591-5592)。针对在植物转基因中应用内含肽，参见，Yang等人，(Transgene Res[转基因研究]，15:583-593(2006))和Evans等人，(Annu.Rev.Plant Biol.[植物生物学年评]，56:375-392(2005))。
在另一个实施例中，包括但不限于IPD079多肽的植物来源的穿孔素可以由两个单独的基因编码，其中前体蛋白的内含肽来自两个称为分裂内含肽的基因，并且前体的两部分通过肽键形成而连接起来。该肽键的形成通过内含肽介导的反式剪接实现。为此目的，包含两个单独基因的第一和第二表达盒进一步编码能够介导蛋白质反式剪接的内含肽。通过反式剪接，由第一和第二片段编码的蛋白质和多肽可以通过肽键形成连接。反式剪接内含肽可以选自包括真核生物、古细菌和真细菌在内的不同生物体的核仁和细胞器基因组。可以使用的内含肽列在neb.com/neb/inteins.html上，其可以使用“www”前缀在万维网上访问。编码内含肽的核苷酸序列可以分裂成5'和3'部分，该5'和3'部分分别编码内含肽的5'和3'部分。可能使内含肽剪接不需要的序列部分(例如归巢内切核酸酶结构域)缺失。将内蛋白编码序列分裂，使得5'和3'部分能够进行反式剪接。为了选择内含肽编码序列的合适的分裂位点，可以遵循由Southworth等人，(1998)，EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]，17:918-926公开的注意事项。在构建第一和第二表达盒中，5’内含肽编码序列连接到编码IPD079多肽的N末端部分的第一片段的3’末端，并且3’内含肽编码序列连接到编码IPD079多肽的C末端部分的第二片段的5’末端。
通常，可以使用任何分裂内含肽来设计反式剪接配偶体，包括任何天然存在或人工分裂的分裂内含肽。已知若干种天然存在的分裂内含肽，例如：集胞藻属物种PCC6803的DnaE基因的分裂内含肽(参见，Wu等人，(1998)，Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]，95(16):9226-31和Evans等人，(2000)，J Biol Chem.[生物化学杂志]，275(13):9091-4)和来自点状念珠藻的DnaE基因的分裂内含肽(参见，Iwai等人，(2006)，FEBS Lett.[欧洲生化学会联盟通讯]，580(7):1853-8)。非分裂内含肽在实验室中人为分裂以产生新的分裂内含肽，例如：人工分裂Ssp DnaB内含肽(参见，Wu等人，(1998)，Biochim Biophys Acta.[生物化学与生物物理学报]，1387:422-32)和分裂Sce VMA内含肽(参见，Brenzel等人，(2006)，Biochemistry.[生物化学]，45(6):1571-8)和人工分裂的真菌微型内含肽(参见，Elleuche等人，(2007)，Biochem Biophys Res Commun.[生物化学与生物物理学研究通讯]，355(3):830-4)。还有把已知的内含肽编入目录的内含肽数据库(参见，例如，可以在bioinformatics.weizmann.ac.il/～pietro/inteins/Inteinstable.html处获得的在线数据库，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。
天然存在的非分裂内含肽可能具有内切核酸酶活性或其他酶活性，这些活性通常可以在设计人工分裂的分裂内含肽时被去除。这样的迷你内含肽或最小化的分裂内含肽是本领域熟知的，并且通常小于200个氨基酸残基长(参见，Wu等人，(1998)，Biochim BiophysActa.[生物化学与生物物理学报]，1387:422-32)。合适的分裂内含肽可以向其结构添加使其他纯化可行的多肽元件，条件是这些元件不会抑制分裂内含肽的剪接，或以允许它们在拼接之前被去除的方式添加。已经报道了使用包含以下的蛋白质的蛋白质剪接：细菌内含肽样(BIL)结构域(参见，Amitai等人，(2003)Mol Microbiol.[分子微生物学]，47:61-73)和刺猬(Hog)自动加工结构域(当称为Hog/内含肽超家族或HINT家族时，后者与内含肽组合；参见，Dassa等人，(2004)，J Biol Chem.[生物化学杂志]，279:32001-7))以及结构域如还可用于制备人工分裂的内含肽的这些。特别地，可以通过分子生物学方法来改性这些家族的非剪接成员，以引入或恢复在这些相关物种中的剪接活性。最近的研究表明，当允许N末端分裂内含肽组分与自然界中未发现的C末端裂解内含肽组分反应作为其“配偶体”时，可以观察到剪接；例如，已经观察到使用与“自然”剪接配偶体具有少至30％至50％同源性的配偶体进行剪接(参见，Dassa等人，(2007)，Biochemistry.[生物化学]，46(1):322-30)。不同分裂内含肽的其他这种混合物已被证明是与另一个不反应的混合物(参见，Brenzel等人，(2006)，Biochemistry.[生物化学]，45(6):1571-8)。然而，使用常规方法并且酶有运用创造性技能是情况下确定特定的一对多肽是否能够彼此结合以提供功能性内含肽，在相关领域的技术人员的能力范围内。
在另一个实施例中，包括但不限于IPD079多肽的植物来源的穿孔素是环状排列的变体。在某些实施例中，该IPD079多肽是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、或SEQ ID NO:140的多肽的环状排列的变体。
重组DNA方法的发展使得有可能研究序列转座对蛋白质折叠、结构和功能的影响。创建新序列中使用的方法类似于通过其氨基酸序列的线性改组对天然存在的蛋白质对进行关联的方法(Cunningham等人，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院报]76:3218-3222；Teather和Erfle，(1990)J.Bacteriol.[细菌学杂志]172:3837-3841；Schimming等人，(1992)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]204:13-19；Yamiuchi和Minamikawa，(1991)FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]260:127-130；MacGregor等人，(1996)FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]378:263-266)。Goldenberg和Creighton描述了这种类型的重排对蛋白质的第一次体外应用(J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，165:407-413，1983)。在创建环形排列的变体中，在原始序列的内部位点(断点)处选择新的N末端，该新序列从断点与原始序列具有氨基酸相同的次序，直到其达到原始C末端或其附近的氨基酸。在这一点上，新序列直接或通过序列(接头)的另外部分连接到原始N末端或其附近的氨基酸，并且新序列以原始序列相同的序列继续，直到其达到原始序列的断点位点的N末端的氨基酸处于或附近的点，该残基形成链的新C末端。接头的氨基酸序列的长度可以凭经验或以结构信息的指导或通过使用两种方法的组合来选择。当没有结构信息可用时，可以使用设计和采取必要的确认，而不会破坏杀有害生物多肽的构型的能力(构象灵活；Karplus和Schulz，(1985)，Naturwissenschaften[自然科学]，72:212-213)制备小系列接头用于测试，该设计的长度为了跨越从0至
Figure BDA0003795187100000591
的范围而变化并且选择该设计的序列以与表面暴露一致(亲水性，Hopp和Woods，(1983)，Mol.Immunol.[分子免疫学]，20:483-489；Kyte和Doolittle，(1982)，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，157:105-132；溶剂暴露表面积，Lee和Richards，(1971)，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，55:379-400)。假设每个残基平均翻译为2.0至
Figure BDA0003795187100000602
这意味着要测试的长度在0至30个残基之间，其中0至15个残基为优选范围。这种经验性系列的实例将是使用重复n次的盒序列如Gly-Gly-Gly-Ser构建接头，其中n为1、2、3或4。本领域技术人员将认识到，存在许多长度或组成不同的这样的序列，其可以用作接头，其中主要注意事项是它们是既不过长也不过短的(参见Sandhu，(1992)，Critical Rev.Biotech.[生物技术评论]，12:437-462)；如果它们太长，熵效应可能会使三维折叠不稳定，并且也可能使得折叠在动力学上是不切实际的，并且如果它们太短，则它们可能由于扭转或空间应变使分子不稳定。蛋白质结构信息分析的技术人员将认识到，使用定义为c-α碳之间距离的链末端之间的距离可用于定义待使用的序列的长度，或至少限制在接头的经验选择中必须测试的可能性的数量。他们还将认识到，在有时多肽链末端的位置在源自X射线衍射或核磁共振光谱数据的结构模型中是不明确的情况下，并且在当真实时的情况下，因此，需要考虑这种情况，以便正确估计所需接头的长度。从其位置定义明确的那些残基选择两个与链末端顺序接近的残基，并且使用它们的c-α碳之间的距离来计算它们之间的接头的近似长度。使用计算出的长度作为指导，然后选择具有一定范围数量的残基(每个残基使用2至
Figure BDA0003795187100000601
计算)的接头。这些接头可以由原始序列组成，必要时缩短或延长，并且当延长时，可以如上所述选择灵活的和亲水性的另外的残基；或任选地，原始序列可以用一系列接头取代，一个实例是以上提及的Gly-Gly-Gly-Ser盒方法；或任选地，可以使用具有适当总长度的原始序列和新序列的组合。能够折叠到生物活性状态的杀有害生物多肽的序列可以通过从原始多肽链中开始(氨基末端)和末端(羧基末端)位置的适当选择，同时使用如上所述的接头序列来制备。氨基和羧基末端使用下面所述的方法从称为断点区域的序列的常见延伸中选出。因此，通过从同一断点区域内选择氨基和羧基末端来产生新颖的氨基酸序列。在许多情况下，新末端的选择将使得羧基末端的原始位置紧邻氨基末端的位置。然而，本领域技术人员将认识到，区域内任何地方的末端的选择可能起作用，并且这些将有效地导致新序列的氨基或羧基部分的缺失或添加。蛋白质的主要氨基酸序列决定了折叠至表达其生物功能所必需的三维结构是分子生物学的核心原则。本领域技术人员已知使用单一蛋白晶体的x射线衍射或蛋白质溶液的核磁共振光谱来获得和解释三维结构信息的方法。与断点区域的识别相关的结构信息的实例包括蛋白质二级结构的位置和类型(α和3-10个螺旋，平行和反向平行β片材，链逆转(chain reversal)和回转，以及环；Kabsch和Sander，(1983)Biopolymers[生物聚合物]22:2577-2637)；氨基酸残基的溶剂暴露程度、残基彼此之间相互作用的程度和类型(Chothia，(1984)Ann.Rev.Biochem.[生物化学年鉴]53:537-572)以及沿多肽链的构象的静态和动态分布(Alber和Mathews，(1987)Methods Enzymol.[酶学方法]154:511-533)。在某些情况下，关于残基的溶剂暴露的其他信息是已知的；一个例子是必须位于该蛋白质表面的碳水化合物的翻译后附着位点。当实验结构信息不可获得或不可能获得时，也可以使用方法来分析初级氨基酸序列，以便预测蛋白质三级和二级结构，溶剂可及性以及回转和环的存在。当直接结构方法不可行时，生物化学方法有时也适用于经验性地确定表面暴露；例如，在有限的蛋白水解之后使用断链位点的识别来推断表面暴露(Gentile和Salvatore，(1993)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]218:603-621)。因此，使用实验衍生的结构信息或预测方法(例如，Srinivisan和Rose，(1995)，Proteins:Struct.,Funct.&Genetics[蛋白质：结构，功能和遗传学]，22:81-99)，检查亲本氨基酸序列根据它们是否对维持二级和三级结构是必不可少的对区域进行分类。已知涉及周期性二级结构(α和3-10个螺旋，平行和反平行β折叠)的区域内的序列的存在是应该避免的区域。相似地，观察或预测具有低溶剂暴露程度的氨基酸序列的区域更可能是蛋白质的所谓疏水核心的一部分，并且也应避免选择氨基和羧基末端。相比之下，已知或预测为表面回转或循环的那些区域，并且特别是已知生物活性所不需要的那些区域，是用于定位多肽链极端的优选位点。基于上述标准优选的氨基酸序列的连续延伸被称为断点区域。可以基本上遵循Mullins等人，(1994)，J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]，116:5529-5533中所描述的方法制备编码具有新N末端/C末端的环形排列的IPD079多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含将原C末端与N末端分隔开的连接区。聚合酶链反应(PCR)扩增的多个步骤用于重排编码蛋白质的一级氨基酸序列的DNA序列。可以基于Horlick等人，(1992)，Protein Eng.[蛋白质工程]，5:427-431中所描述的串联重复方法制备编码具有新N末端/C末端的环形排列的IPD079多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含将原C末端与N末端分隔开的连接区。使用串联重复的模板DNA进行新的N末端/C末端基因的聚合酶链反应(PCR)扩增。
在另一个实施例中，提供了包含植物来源的穿孔素的融合蛋白，该植物来源的穿孔素包括但不限于本公开的IPD079多肽。在一些实施例中，这些融合蛋白包含IPD079多肽，该IPD079多肽包括但不限于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ IDNO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ IDNO:138、或SEQ ID NO:140的多肽，及其活性片段。
用于设计和构建融合蛋白(以及编码它们的多核苷酸)的方法是本领域技术人员已知的。编码植物来源的穿孔素或IPD079多肽的多核苷酸可以融合到信号序列，这些信号序列将指导蛋白质定位于原核或真核细胞的特定区室和/或指导来自原核或真核细胞的实施例的IPD079多肽的分泌。例如，在大肠杆菌中，人们可能希望指导蛋白质表达至周质空间。IPD079多肽可以融合以便指导多肽表达至细菌周质空间的信号序列或蛋白质(或其片段)的实例包括但不限于：pelB信号序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列、MBP、ompA信号序列，周质性大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基的信号序列和碱性磷酸酶的信号序列。用于构建将指导蛋白质定位的融合蛋白的若干种载体是可商购的，如可从New England Biolabs获得的pMAL系列的载体(特别是pMAL-p系列)。在具体实施例中，IPD079多肽可以与pelB果胶酸裂解酶信号序列融合，以增加革兰氏阴性菌中这些多肽的表达和纯化的效率(参见，美国专利号5,576,195和5,846,818)。植物质体转运肽/多肽融合是本领域熟知的(参见，美国专利号7,193,133)。质外体转运肽如稻或大麦α-淀粉酶分泌信号也是本领域熟知的。质体转运肽通常与待靶向的多肽(例如，融合配偶体)进行N末端融合。在一个实施例中，融合蛋白基本上由待靶向的质体转运肽和IPD079多肽组成。在另一个实施例中，融合蛋白包含待靶向的质体转运肽和多肽。在这样的实施例中，质体转运肽优选位于融合蛋白的N末端。然而，另外的氨基酸残基可以是在质体转运肽的N末端，条件是该融合蛋白质至少部分地靶向质体。在具体实施例中，质体转运肽在融合蛋白的N末端一半处，N末端三分之一处或N末端四分之一处。当插入质体时，大部分或全部质体转运肽通常从融合蛋白上切割。由于特定的细胞间条件或所使用的转运肽/融合配偶体的具体组合，在不同植物发育阶段，切割位置可能在植物物种之间略有变化。在一个实施例中，质体转运肽切割是均相的，使得切割位点在融合蛋白群体中是相同的。在另一个实施例中，质体转运肽不是均匀的，使得融合蛋白群体中切割位点相差1-10个氨基酸。质体转运肽可以以若干种方式之一重组融合到第二种蛋白质。例如，可以将限制性内切核酸酶识别位点引入到其C末端的相应位置的转运肽的核苷酸序列中，并且可以将相同或相容的位点工程化为在其N末端待靶向的蛋白质的核苷酸序列。必须注意设计这些位点，以确保转运肽和第二个蛋白质的编码序列保持“框架”，以允许合成所需的融合蛋白。在一些情况下，当引入新的限制性位点时，优选除去第二种蛋白质的引发剂甲硫氨酸密码子。在两个亲本分子上引入限制性内切核酸酶识别位点，以及它们随后通过重组DNA技术连接可导致在转运肽和第二蛋白质之间添加一个或多个额外的氨基酸。这通常不影响靶向活性，只要转运肽切割位点保持可及，并且通过在其N末端添加这些额外的氨基酸而不改变第二蛋白质的功能。可替代地，本领域技术人员可以使用基因合成(Stemmer等人，(1995)，Gene[基因]，164:49-53)或相似的方法在转运肽和第二蛋白质之间产生精确的切割位点(有或没有其引发剂甲硫氨酸)。此外，转运肽融合可以有意地包括切割位点下游的氨基酸。成熟蛋白质N末端的氨基酸可影响转运肽将蛋白质靶向质体的能力和/或蛋白质进入后的切割效率。这可能取决于待靶向的蛋白质。参见，例如，Comai等人，(1988)，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，263(29):15104-9。
在一些实施例中，提供了包含植物来源的穿孔素(包括但不限于IPD079多肽)的融合蛋白，以及通过氨基酸接头连接的杀昆虫多肽。在一些实施例中，提供了由选自下组的化学式所示的融合蛋白，该组由以下组成：
R1-L-R2、R2-L-R1、R1-R2或R2-R1
其中R1是植物来源的穿孔素或IPD079多肽，R2是目的蛋白质。该R1多肽直接或通过接头(L)区段融合至R2多肽。术语“直接”定义在没有肽接头的情况下多肽连接的融合。因此，“L”表示R1和R2在框架中融合的化学结合或多肽区段，最常见的是，L是R1和R2通过酰胺键将R1的羧基末端连接到L的氨基末端并且将L的羧基末端连接到R2的氨基末端的线性肽。“在框内融合”意指R1和R2的阅读框之间没有翻译终止或中断。连接基团(L)通常是长度在1至500个氨基酸之间的多肽。连接两个分子的接头优选设计成(1)允许两个分子彼此独立地折叠并且起作用，(2)不具有发展可能干扰两种蛋白质的功能结构域的有序二级结构的倾向，(3)具有可与功能性蛋白质结构域相互作用的最小的疏水或带电特征，并且(4)提供R1和R2的空间分离，使得R1和R2可以与单个细胞上的相应受体同时相互作用。通常，在柔性蛋白质区域中的表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser。期望包含Gly、Asn和Ser的氨基酸序列的几乎任何排列满足上述接头序列的标准。其他中性的氨基酸，如Thr和Ala也可以用于接头序列中。由于在接头序列中添加了独特的限制性位点以便于构建融合体，另外的氨基酸也可以包括在接头中。
在一些实施例中，接头包含选自以下组的化学式的序列：(Gly3Ser)n、(Gly4Ser)n、(Gly5Ser)n、(GlynSer)n或(AlaGlySer)n，其中n是整数。高度柔性接头的一个实例是存在于丝状噬菌体(例如，噬菌体M13或fd)的pIII蛋白质内的富含(GlySer)的间隔子(Schaller等人，1975)。该区域在pIII表面蛋白质的两个结构域之间提供长、柔性的间隔子区域。还包括接头，在接头中包括内肽酶识别序列。这样的切割位点对于分离融合物的各个组分以确定它们在体外是否适当折叠和是否具有活性可能是有价值的。各种内肽酶的实例包括但不限于：纤溶酶、肠激酶、激肽释放酶、尿激酶、组织纤溶酶原激活剂、梭菌蛋白酶、凝乳酶、胶原酶、鲁塞尔氏蝰蛇毒蛋白酶、后脯氨酸切割酶、V8蛋白酶、凝血酶和因子Xa。在一些实施例中，接头包含来自多基因表达载体(MGEV)的氨基酸EEKKN(SEQ ID NO:157)，其如美国专利申请公开号US 2007/0277263中所公开的被液泡蛋白酶切割。在其他实施例中，来自重链免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的铰链区域的肽接头区段在附着的多肽之间提供角度关系。特别有用的是那些半胱氨酸被丝氨酸替换的铰链区域。本公开的接头包括源自鼠IgGγ2b铰链区域的序列，其中半胱氨酸已经被变为丝氨酸。融合蛋白不受所使用的接头序列的形式、大小或数目的限制，并且接头的唯一要求是功能上不会与融合的各个分子的折叠和功能产生不利的干扰。
在另一个实施例中，提供了通过连结IPD079基因的两个或多个部分而产生的嵌合IPD079多肽，该IPD079基因最初编码分离的IPD079蛋白以产生嵌合基因。嵌合基因的翻译产生具有衍生自原始多肽中的每个的区域、基序或结构域的单一嵌合IPD079多肽。在某些实施例中，该嵌合蛋白包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、或SEQ ID NO:140的IPD079多肽的任意组合的部分、基序或结构域。
应当认识到，可以通过各种方法改变DNA序列，并且这些改变可能导致编码具有与野生型(或天然)杀有害生物蛋白编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列的蛋白质的DNA序列。在一些实施例中，IPD079多肽按各种方式改变，这些方式包括与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、或SEQ ID NO:140的任一项相比，一个或多个氨基酸的氨基酸取代、缺失、截短和插入，包括高达2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145个或更多个氨基酸取代、缺失和/或插入或其组合。
这种操作的方法在本领域中是普遍已知的。例如，可以通过DNA中的突变来制备IPD079多肽的氨基酸序列变体。这还可以通过几种诱变形式之一和/或在定向进化中来完成。在一些方面，在该氨基酸序列中所编码的变化将基本上不影响该蛋白质的功能。这样的变体将具有所希望的杀有害生物活性。然而，应当理解，可以通过在本公开的组合物上使用这些技术改进IPD079多肽赋予杀有害生物活性的能力。
例如，可以在一个或多个、非必需氨基酸残基处做出保守性氨基酸取代。“非必需”氨基酸残基是可以从IPD079多肽的野生型序列改变而来的并且不改变生物活性的残基。“保守的氨基酸取代”是其中用具有相似侧链的氨基酸残基替换该氨基酸残基的取代。在本领域中已经限定了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；具有极性的、带负电荷的残基及其酰胺的氨基酸(例如，天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺)；具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)；具有小脂肪族、非极性或微小极性的残基的氨基酸(例如，丙胺酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘胺酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙胺酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；具有大脂肪族、非极性残基的氨基酸(例如，甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸)；具有β-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)；具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)；具有大芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。
氨基酸取代可以在保留功能的非保守性区域中进行。总体上，此类取代并非针对保守的氨基酸残基、或针对在一个保守基序内的氨基酸残基而进行，其中此类残基是蛋白质活性所必要的。保守的并且对于蛋白质活性可能是必需的残基的实例包括例如，在与实施例的序列相相似或相关的毒素的比对中所包含的全部蛋白质之间是相同的残基(例如，在同源蛋白比对中相同残基)。保守的但可能允许保守的氨基酸取代、并且仍保留活性的残基的实例包括例如，在与实施例的序列相相似或相关的毒素的比对中所包含的全部蛋白质之间仅具有保守性取代的残基(例如，在同源蛋白比对中所包含的全部蛋白质之间仅具有保守性取代的残基)。然而，本领域的技术人员应当理解，功能性变体在保守的残基中可以具有少量的保守的或非保守的改变。关于不影响目的蛋白质的生物活性的适当的氨基酸取代的指导可以发现于Dayhoff等人，(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure[蛋白质序列和结构图谱](国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.)，华盛顿)的模型中，其通过引用结合在此。
在进行这种变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质以交互性生物功能中的重要性在本领域中通常是被理解的(Kyte和Doolittle，(1982)，J MolBiol.[分子生物学杂志]，157(1):105-32)。接受的是该氨基酸的相对亲水特征有助于所得蛋白的次级结构，该次级结构进而定义该蛋白与其他分子(例如酶、基质、受体、DNA、抗体、抗原等等)的相互作用。
本领域已知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸取代，并且仍然产生具有相似生物学活性的蛋白质，即仍然获得生物功能等同的蛋白质。每个氨基酸基于其疏水性和电荷特征被指定亲水指数(Kyte和Doolittle，同上)。这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在进行这种变化时，优选亲水性指数在+2以内的氨基酸取代，特别优选在+1以内的氨基酸取代，并且甚至更特别优选+0.5以内的氨基酸取代。
在本领域中也可以理解，可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取代。美国专利号4,554,101说明蛋白的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性支配的)与该蛋白的生物特性相关。
如美国专利号4,554,101中所详述的，以下亲水性值已被分配到氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+0.1)；谷氨酸(+3.0.+0.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘胺酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+0.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
可替代地，可以在氨基或羧基的末端上对多种蛋白质的蛋白质序列进行改变，而基本上不影响活性。这可以包括由现代分子方法所引入的插入、缺失或改变，这些方法如PCR，包括PCR扩增，这些PCR扩增借助于将氨基酸编码序列包括到在PCR扩增中所使用的寡核苷酸之中而改变或延长了这种蛋白质编码序列。可替代地，所添加的蛋白质序列可以包括完整的蛋白质编码序列，如在本领域内通常用于产生蛋白质融合物的那些序列。此类融合蛋白常常用于(1)增加目的蛋白质的表达；(2)引入结合结构域、酶活性或表位以促进蛋白质纯化、蛋白检测或本领域已知的其他实验用途；(3)将蛋白质的分泌或翻译靶向亚细胞器，如革兰氏阴性菌的周质空间，植物的线粒体或叶绿体或真核细胞的内质网，这些中的后者常常导致蛋白质的糖基化。
本公开的变体核苷酸和氨基酸序列还涵盖了由诱变和引起重组的程序(如DNA改组)所衍生的序列。在这样的程序的情况下，例如，可以使用本公开的编码区域的一种或多种不同的IPD079多肽来产生具有所需性质的新的IPD079多肽。以此方式，由一群相关的序列多核苷酸产生重组多核苷酸文库，这些多核苷酸包含具有基本序列同一性并且能够在体外或体内同源重组的序列区域。例如，使用这种方法，可以将编码目的结构域的序列基序在杀有害生物基因与其他已知的杀有害生物基因之间进行改组，以获得编码具有改进的目的性质(如增加的杀昆虫活性)的新基因。这种DNA改组的策略在本领域中是已知的。参见例如，Stemmer，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91:10747-10751；Stemmer，(1994)Nature[自然]370:389-391；Crameri等人，(1997)Nature Biotech.[自然生物技术]15:436-438；Moore等人，(1997)J Mol Biol.[分子生物学杂志]272:336-347；Zhang等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]94:4504-4509；Crameri等人，(1998)，Nature[自然]，391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。
结构域交换或改组是用于产生改变的IPD079多肽的另一种机制。可以在本公开的IPD079多肽之间交换结构域，导致具有改进的杀昆虫活性或靶谱的杂交或嵌合毒素。用于产生重组蛋白并测试其杀有害生物活性的方法是本领域熟知的(参见例如Naimov等人，(2001)Appl.Environ.Microbiol.[应用环境微生物学]67:5328-5330；de Maagd等人，(1996)Appl.Environ.Microbiol.[应用环境微生物学]62:1537-1543；Ge等人，(1991)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]266:17954-17958；Schnepf等人，(1990)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]265:20923-20930；Rang等人，(1999)Appl.Environ.Microbiol.[应用环境微生物学]65:2918-2925)。
IPD079同源物的的比对(图1和2)允许鉴定该家族中的同源物之间高度保守的残基。
组合物
还涵盖包含本公开的植物来源的穿孔素(包括但不限于本公开的IPD079多肽)的组合物。在一些实施例中，该组合物包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、或SEQ ID NO:140的IPD079多肽。在一些实施例中，该组合物包含IPD079融合蛋白。
抗体
还涵盖本公开的植物来源的穿孔素(包括但不限于实施例的IPD079多肽)、或其变体或片段的抗体。本公开的抗体包括保留其结合昆虫肠道中发现的IPD079多肽的能力的多克隆和单克隆抗体及其片段。据信抗体、单克隆抗体或其片段能够与分子结合，前提是该抗体、单克隆抗体或其片段能够与该分子特异性反应，从而将该分子与抗体、单克隆抗体或其片段结合。术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)意在包括能够结合半抗原的完整分子及其片段或结合区域或结构域(例如，像Fab和F(ab).sub.2片段)。此类片段通常通过蛋白水解切割(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)产生。可替代地，可以通过应用重组DNA技术或通过合成化学来产生半抗原结合片段。制备本公开的抗体的方法是本领域公知的。例如，参见Antibodies,A Laboratory Manual[抗体，实验室手册]，Ed Harlow和David Lane(编辑)，冷泉港实验室，纽约州，(1988)，以及其中引用的参考文献。阐述免疫学的一般原则的标准参考文献包括：Klein,J.Immunology:The Science of Cell-Noncell Discrimination[免疫学：细胞-非细胞鉴别科学]，纽约约翰威利父子公司(1982)；Dennett等人，MonoclonalAntibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses,Plenum Press,N.Y.(1980)[单克隆抗体，杂交瘤：生物分析中的新维度，纽约普莱南出版社(1980)]以及Campbell，“Monoclonal Antibody Technology[单克隆抗体技术]”，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology[生物化学和分子生物学中的实验室技术]，第13卷，Burdon等人(编辑)，阿姆斯特丹爱思唯尔出版社(1984)。还参见，美国专利号4,196,265；4,609,893；4,713,325；4,714,681；4,716,111；4,716,117和4,720,459。IPD079多肽抗体或其抗原结合部分可以通过多种技术产生，这些技术包括常规单克隆抗体方法，例如以下文献中所述的标准体细胞杂交技术：Kohler和Milstein，(1975)Nature[自然]256:495。还可以使用产生单克隆抗体的其他技术，如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。用于制备杂交瘤的动物系统是小鼠系统。分离用于融合的免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，小鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。本公开的抗体和单克隆抗体可以通过利用IPD079多肽作为抗原来制备。
提供了用于检测样品中IPD079多肽的存在或检测编码IPD079多肽的核苷酸序列的存在的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒提供了用于检测组织样品中IPD079多肽的存在的基于抗体的试剂。在另一个实施例中，试剂盒提供了用于检测编码IPD079多肽的一种或多种多核苷酸的存在的经标记的核酸探针。将试剂盒与用于进行检测方法的适当的试剂和对照物，以及试剂盒的使用说明书一起提供。
受体鉴别和分离
还涵盖了针对实施例的IPD079多肽或其变体或片段的受体。用于鉴定受体的方法是本领域熟知的(参见，Hofmann等人，(1988)，Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]，173:85-91；Gill等人，(1995)，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，27277-27282)可以使用来自易感昆虫的刷状缘膜囊泡用于鉴定和分离识别IPD079多肽的受体。除了引用文献中列出的放射性标记方法之外，可以将IPD079多肽用荧光染料和其他常见标记如链霉亲和素进行标记。可以根据参考文献中列出的方案制备易感昆虫(如大豆夜蛾和椿象)的刷状缘膜囊泡(BBMV)，并在SDS-PAGE凝胶上分离，并在合适的膜上印迹。标记的IPD079多肽可以与BBMV的印迹膜一起孵育，并标记的IPD079多肽可以用标记的报道基因识别。与IPD079多肽相互作用的一个或多个蛋白质带的鉴定可以通过基于N末端氨基酸气相测序或基于质谱的蛋白质鉴定方法进行检测(Patterson，(1998)，10.22，1-24，由约翰&威利父子公司出版的CurrentProtocol in Molecular Biology[当前分子生物学方案])。一旦鉴定出蛋白质，可以从易感昆虫的基因组DNA或cDNA文库中克隆相应的基因，并且可以直接用IPD079多肽测量结合亲和力。通过IPD079多肽的杀昆虫活性的受体功能可以通过RNAi型的基因敲除法完成验证(Rajagopal等人，(2002)，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，277:46849-46851)。
核苷酸构建体、表达盒和载体
在此使用术语“核苷酸构建体”并不旨在将实施例限制为包含DNA的核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到，核苷酸构建体特别是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合组成的多核苷酸和寡核苷酸也可用于在此公开的方法中。实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外涵盖这种构建体、分子和序列的所有互补形式。此外，实施例的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列涵盖能用于实施例的转化植物方法的所有核苷酸构建体、分子和序列，包括但不限于由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其组合所构成的那些。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还涵盖核苷酸构建体的所有形式，这些形式包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。
另一实施例涉及经转化的生物体，如选自以下的生物体：植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻的生物体。转化的生物体包含实施例的DNA分子、包含DNA分子的表达盒或包含表达盒的载体，它可以稳定地并入所转化生物体的基因组。
在DNA构建体中提供实施例的序列，用于在目的生物体中表达。该构建体将包括有效地连接至实施例的序列的5'和3'的调节序列。如在此使用的术语“有效地连接”是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动并介导相应于第二序列的DNA序列的转录。通常，有效地连接意味着所连接的核酸序列是连续的，并且在必要时在相同阅读框中连接两个蛋白质编码区域。该构建体可以另外包含待共转化进生物体的至少一个另外的基因。可替代地，可以在多DNA构建体上提供另外的基因。
这种DNA构建体具有多个用于插入IPD079多肽基因序列的限制性位点，该杀昆虫多肽基因序列将位于调节性区域的转录调节之下。该DNA构建体可另外包含可选标记基因。
按5'到3'的转录方向，DNA构建体将通常包括：转录和翻译起始区域(即，启动子)、实施例的DNA序列以及在用作宿主的生物体内具有功能的转录和翻译终止区域(即，终止区域)。转录起始区域(即，启动子)对于实施例的宿主生物体和/或序列，可以是天然的、类似的、外源的或异源的。此外，该启动子可以是自然序列或者，可替代地，是合成序列。如在此使用的术语“外源”表示在引入启动子的天然生物体中没有发现启动子。在启动子对于实施例的序列而言是“外源的”或“异源的”的情况下，它是指该启动子对于实施例的有效地连接的序列而言不是天然的或天然存在的启动子。如在此使用的，嵌合基因包含有效地连接至与编码序列异源的转录起始区域的编码序列。当启动子是天然或自然的序列时，有效地连接的序列的表达改造自野生型表达，这导致表型的改变。
在一些实施例中，DNA构建体还可以包括转录增强子序列。如在此使用的，术语“增强子”是指可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是插入以增强启动子的水平或组织特异性的启动子的先天元件或异源元件。各种增强子是本领域已知的，包括例如，在植物中具有基因表达增强特性的内含子(美国专利申请公开号2009/0144863)、泛素内含子(即，玉蜀黍泛素内含子1(参见，例如，NCBI序列S94464))、ω增强子或ω主要增强子(Gallie等人，(1989)，Molecular Biology of RNA[RNA的分子生物学]，编辑：Cech(丽丝，纽约)237-256和Gallie等人，(1987)，Gene[基因]，60:217-25)、CaMV 35S增强子(参见，例如，Benfey等人，(1990)，EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]，9:1685-96)和也可以使用的美国专利号7,803,992的增强子，其中每一个通过引用并入。以上转录增强子的列表并不意指是限制性的。任何合适的转录增强子都可用于实施例中。
该终止区域可以与该转录起始区域一起是天然的，可以与目的有效地连接的DNA序列一起是天然的，可以与该宿主植物一起是天然的，或者可以衍生自另一种来源(即，对于该启动子、目的序列、该宿主植物、或其任何组合是外源的或异源的)。
方便的终止区可获自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，诸如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见，Guerineau等人，(1991)Mol Gen.Genet.[分子遗传和基因组学]262:141-144；Proudfoot，(1991)Cell[细胞]64:671-674；Sanfacon等人，(1991)GenesDev.[基因与发展]5:141-149；Mogen等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]2:1261-1272；Munroe等人，(1990)Gene[基因]，91:151-158；Ballas等人，(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17:7891-7903以及Joshi等人，(1987)Nucleic Acid Res.[核酸研究]15:9627-9639。
适当时可以优化核酸以增加在宿主生物体中的表达。因此，当宿主生物体是植物时，合成核酸可以使用植物偏好性密码子合成以改进表达。对于宿主偏好性密码子使用的讨论，参见，例如，Campbell and Gowri,(1990)Plant Physiol.92:1-11[Campbell和Gowri，(1990)，植物生理学，92:1-11]。例如，虽然在单子叶和双子叶植物物种中均可以表达实施例的核酸序列，但是可以改性序列，以解决单子叶或双子叶植物特异的密码子偏好和GC含量偏好，这是因为这些偏好已经表现出了差异(Murray等人，(1989)，Nucleic AcidsRes.[核酸研究]，17:477-498)。因而，特定氨基酸的玉米偏好性密码子可以源自玉米的已知基因序列。来自玉米植物的28种基因的玉米密码子使用在Murray等人(同上)的表4中列出。本领域中可获得用于合成植物偏好的基因的方法。参见，例如，美国专利号5,380,831,和5,436,391，以及Murray等人，(1989)，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，17:477-498，和Liu H等人，Mol Bio Rep[分子生物学报告]，37:677-684,2010，通过引用结合在此。玉米密码子使用表也可以在kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝4577上找到，其可以使用www前缀进行访问。
大豆密码子使用表可以在kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝3847&aa＝1&style＝N上找到，其可以使用www前缀进行访问。
在一些实施例中，编码IPD079多肽的重组核酸分子具有玉米优化的密码子。
已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括清除序列，这些序列编码假的聚腺苷化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复和可能不利于基因表达的其他良好表征的序列。可以将序列的GC含量调整至给定细胞宿主的平均水平，如参考在该宿主细胞中表达的已知基因而计算的。如在此使用的术语“宿主细胞”是指包含载体并支持表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖类或哺乳动物细胞、或单子叶或双子叶植物细胞。单子叶宿主细胞的实例是玉米宿主细胞。当可能时，修饰序列以避免出现预测的发夹二级mRNA结构。
表达盒可以另外包含5'前导序列。这些前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区域)(Elroy-Stein等人，(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，86:6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人，(1995)，Gene[基因]，165(2):233-238)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)、人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人，(1991)，Nature[自然]，353:90-94)；来自苜蓿花叶病病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling等人，(1987)，Nature[自然]，325:622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人，(1989)，在：MolecularBiology of RNA[RNA的分子生物学]，编辑：Cech(丽丝，纽约)，第237-256页)；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人，(1991)，Virology[病毒学]，81:382-385)。还参见，Della-Cioppa等人，(1987)，Plant Physiol.[植物生理学]，84:965-968。此类构建体还可以包含“信号序列”或“前导序列”，以促进该肽的共翻译成或翻译后运输至某些细胞内结构，如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体。
如在此使用的“信号序列”是指已知或怀疑导致跨细胞膜的共翻译或翻译后肽运输。在真核生物中，这典型地涉及分泌到高尔基体内，其中具有某些产生的糖基化。细菌的杀昆虫毒素经常被合成为原毒素，它们是在该靶标有害生物的肠中经蛋白水解激活(Chang，(1987)，Methods Enzymol.[酶学方法]，153:507-516)。在一些实施例中，该信号序列位于该天然的序列中，或可以源自实施例的序列。如在此使用的术语“前导序列”是指当翻译时产生足以引发肽链与亚细胞器的共翻译转运的氨基酸序列的任何序列。因此，这包括通过进入内质网内、进入液泡、质体(包括叶绿体、线粒体)等中来对运输和/或糖基化进行靶向的前导序列。靶向叶绿体类囊体腔室的核编码蛋白具有由基质靶向信号肽和腔靶向信号肽组成的特征二分转运肽。基质靶向信息位于转运肽的氨基-近端部分。腔靶向信号肽位于转运肽的羧基近端部分，并且包含用于靶向腔的所有信息。最近对高等植物叶绿体的蛋白质组学的研究已经在许多核编码的腔蛋白质的识别中实现(Kieselbach等人，FEBSLETT[欧洲生化学会联盟通讯]，480:271-276,2000；Peltier等人，Plant Cell[植物细胞]，12:319-341,2000；Bricker等人，Biochim.Biophys Acta[生物化学与生物物理学报]，1503:350-356,2001)，根据本公开可能使用该核编码的腔蛋白质的腔靶向信号肽。Kieselbach等人，Photosynthesis Research[光合作用研究]，78:249-264,2003报道了来自拟南芥属约80种蛋白质以及来自菠菜和豌豆的同源蛋白。特别地，该出版物的表2(其通过引用并入本说明书中)公开了通过其登录号鉴别的来自叶绿体腔的85种蛋白质(还参见美国专利申请公开2009/09044298)。此外，最近公开的稻基因组草拟版本(Goff等人，Science[科学]，296:92-100,2002)是可以根据本公开使用的用于腔靶向信号肽的合适来源。
本领域技术人员熟知的合适的叶绿体转运肽(CTP)还包含嵌合CTP，这些嵌合CTP包括但不限于：来自以下的CTP的N末端结构域、中心结构域或C末端结构域：稻1-脱氧-D木酮糖-5-磷酸合酶、稻-超氧化物歧化酶、稻-可溶性淀粉合酶、稻-NADP-依赖性苹果酸酶、稻-磷酸2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶2、稻-L-抗坏血酸过氧化物酶5、稻-磷酸葡聚糖水二激酶、玉蜀黍ssRUBISCO、玉蜀黍-β-葡糖苷酶、玉蜀黍-苹果酸脱氢酶、玉蜀黍硫氧还蛋白M-型(美国专利申请公开2012/0304336)。
可以针对在叶绿体中的表达来优化待靶向该叶绿体的IPD079多肽基因，以解决植物核与该细胞器之间密码子使用的差异。以此方式，目的核酸可使用叶绿体偏好性密码子进行合成。参见，例如，美国专利号5,380,831，其通过引用结合在此。
在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以提供处于适当方向以及合适时，处于适当阅读框中的DNA序列。为此，可使用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或可以涉及其他操纵以提供方便的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。
许多启动子可用于实施这些实施例。可基于所需结果，选择启动子。核酸可与组成性、组织偏好性、可诱导的或其他启动子组合用于在宿主生物体中的表达。用于植物宿主细胞中的合适的组成型启动子包括，例如Rsyn7启动子的核心启动子和其他在WO 1999/43838和美国专利号6,072,050中公开的组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature[自然]313:810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]2:163-171)；泛素(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]12:619-632以及Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81:581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如以下专利文献中所讨论的那些：美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611。
根据期望的结果，从诱导型启动子表达基因可能是有益的。用于调节植物中实施例的核苷酸序列表达的特定的目的启动子是损伤诱导型启动子。这种损伤诱导型启动子可以对由昆虫取食引起的损害作出反应，并且包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan，(1990)Ann.Rev.Phytopath.[植物病理学年鉴]28:425-449；Duan等人，(1996)NatureBiotechnology[自然生物技术]14:494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和win2(Stanford等人，(1989)Mol.Gen.Genet.[分子遗传和基因组学]215:200-208)；系统素(McGurl等人，(1992)Science[科学]225:1570-1573)；WIP1(Rohmeier等人，(1993)PlantMol.Biol.[植物分子生物学]22:783-792；Eckelkamp等人，(1993)FEBS Letters[欧洲生物学化学会联盟通讯]323:73-76)；MPI基因(Corderok等人，(1994)Plant J.[植物杂志]6(2):141-150)等，以上文献通过引用并入本文。
此外，可以在实施例的方法和核苷酸构建体中使用病原体诱导型启动子。这些病原体诱导型启动子包括来自病程相关蛋白(PR蛋白)的那些启动子，其在被病原体感染后收到诱导；例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如Redolfi等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.[荷兰植物病理学杂志]89:245-254；Uknes等人(1992)PlantCell[植物细胞]4:645-656；以及Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.[植物分子病毒学]4:111-116。还参见，WO 1999/43819，其通过引用结合在此。
目的是在病原体侵染部位处或附近局部表达的启动子。参见例如Marineau等人，(1987)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]9:335-342；Matton等人，(1989)MolecularPlant-Microbe Interactions[分子植物-微生物相互作用]2:325-331；Somsisch等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83:2427-2430；Somsisch等人，(1988)Mol.Gen.Genet.[分子遗传和基因组学]2:93-98以及Yang,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]93:14972-14977。还参见Chen等人，(1996)Plant J.[植物杂志]10:955-966；Zhang等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91:2507-2511；Warner等人，(1993)Plant J.[植物杂志]3:191-201；Siebertz等人，(1989)Plant Cell[植物细胞]1:961-968；美国专利号5,750,386(线虫诱导型)及其中引用的参考文献。特定的目的是玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达是由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导的(参见例如Cordero等人，(1992)Physiol.Mol.PlantPath.[生理学与分子植物病理学]41:189-200)。
可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节剂来调节植物中的基因表达。根据目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学品来诱导基因表达，或化学抑制型启动子，其中施用化学品来抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括但不限于由苯磺酰胺除草剂安全剂活化的玉米In2-2启动子、由用作萌前除草剂的疏水亲电子化合物活化的玉米GST启动子、以及由水杨酸活化的烟草PR-1a启动子。其他目的化学品调节型启动子包括类固醇应答启动子(参见，例如，Schena等人，(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，88:10421-10425和McNellis等人，(1998)，Plant J.[植物杂志]，14(2):247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见，例如，Gatz等人，(1991)，Mol.Gen.Genet[分子遗传学和基因组学]，227:229-237，以及美国专利号5,814,618和5,789,156)，其通过引用结合在此。
组织偏好性启动子可以用于靶向特定植物组织内的增强的IPD079多肽表达。组织偏好性启动子包括描述于以下文献中的那些：Yamamoto等人，(1997)Plant J.[植物杂志]12(2):255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]38(7):792-803；Hansen等人(1997)Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]254(3):337-343；Russell等人，(1997)Transgenic Res.[转基因研究]6(2):157-168；Rinehart等人，(1996)PlantPhysiol.[植物生理学]112(3):1331-1341；Van Camp等人，(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2):525-535；Canevascini等人，(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2):513-524；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]35(5):773-778；Lam，(1994)Results Probl.Cell Differ.[细胞分化的结果和问题]20:181-196；Orozco等人，(1993)Plant Mol Biol.[植物分子生物学]23(6):1129-1138；Matsuoka等人，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90(20):9586-9590；以及Guevara-Garcia等人，(1993)Plant J.[植物杂志]4(3):495-505。必要的话，此类启动子可经改性用于弱表达。
叶偏好性启动子是本领域已知的。参见，例如，Yamamoto等人，(1997)Plant J.[植物杂志]12(2):255-265；Kwon等人，(1994)Plant Physiol.[植物生理学]105:357-67；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]35(5):773-778；Gotor等人，(1993)Plant J.[植物杂志]3:509-18；Orozco等人，(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]23(6):1129-1138以及Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90(20):9586-9590。
根偏好性或根特异性的启动子是已知的，并且可以从来自文献中的许多可获得的启动子来选择，或者从不同的相容物种从头分离。参见例如Hire等人，(1992)PlantMol.Biol.[植物分子生物学]20(2):207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner，(1991)Plant Cell[植物细胞]3(10):1051-1061(法国菜豆的GRP1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]14(3):433-443(根癌农杆菌的甘露聚糖合成酶(MAS)基因的根特异性启动子)以及Miao等人，(1991)Plant Cell[植物细胞]3(1):11-22(编码细胞溶质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还参见，Bogusz等人，(1990)，Plant Cell[植物细胞]，2(7):633-641，其中描述了从来自固氮的非豆科植物榆科山黄麻(Parasponiaandersonii)以及相关的非固氮的非豆科植物山黄麻(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。这些基因的启动子被连接至β-葡萄糖醛酸酶报道基因并且被引入非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)以及豆科植物百脉根(Lotus corniculatus)两者中，并且在两个实例中根特异性启动子活性被保留。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对发根土壤杆菌的高表达的roIC和roID根诱导基因的启动子的分析(参见，Plant Science[植物科学](利默里克)79(1):69-76)。他们得出结论，增强子和组织偏好性DNA决定簇在这些启动子中是解离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合以显示编码章鱼碱合酶的农杆菌属T-DNA基因尤其是在根尖的表皮中有活性，并且TR2'基因在完整植物中具有根特异性并且被叶组织中的创伤刺激，这是与杀昆虫的或杀幼虫的基因一起使用的特征的特别所希望的组合(参见，EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]，8(2):343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1'基因显示相似的特征。另外的根优先的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人，(1995)，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]，29(4):759-772)；和rolB启动子(Capana等人，(1994)，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]，25(4):681-691)。还参见，美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。在US 20130117883中公开了拟南芥根偏好性调节序列。
“种子偏好性”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子发芽性”启动子(在种子发芽期间有活性的那些启动子)。参见，Thompson等人，(1989)，BioEssays[生物测定]，10:108，其通过引用结合在此。这样的种子优选的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见，美国专利号6,225,529，其通过引用结合在此)。γ-玉蜀黍蛋白和Glb-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于，Kunitz型胰蛋白酶抑制剂3(KTi3)(Jofuku和Goldberg，(1989)PlantCell[植物细胞]1:1079-1093)、菜豆β-菜豆素、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白1、大豆凝集素、十字花科蛋白等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、蜡质、收缩素1、收缩素2、球蛋白1等。还参见WO 2000/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好性启动子；通过引用结合在此。在双子叶植物中，种子特异性启动子包括但不限于：来自拟南芥属的种皮启动子，pBAN；和来自拟南芥属的早期种子启动子，p26、p63、和p63tr(美国专利号7,294,760和7,847,153)。在特定组织中具有“优选”表达的启动子在该组织中比在至少一种其他植物组织中更大程度地表达。一些组织优先的启动子几乎专门在特定组织中表达。
当希望低水平表达时，可使用弱启动子。通常，如在此使用的术语“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。低水平表达旨在约1/1000转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物之间的水平。可替代地，应当认识到，术语“弱启动子”还涵盖仅在少数细胞中驱动表达但不在其他细胞中表达以给出完全低表达水平的启动子。当启动子以不可接受的高水平驱动表达时，可以删除或改性部分启动子序列以降低表达水平。
这样的弱组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子(WO 1999/43838和美国专利号6,072,050)，核心35SCaMV启动子等。其他组成型启动子包括，例如以下专利文献中所公开的那些：美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611，通过引用结合在此。
以上启动子的列表并不意指是限制性的。任何合适的启动子都可用于实施例中。
通常，表达盒将包括可选标记基因，用于选择转化的细胞。利用可选标记基因来选择经转化的细胞或组织。标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草剂化合物(如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D))的抗性的基因。合适的可选标记基因的其他实例包括但不限于编码耐氯霉素的基因(Herrera Estrella等人，(1983)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]2:987-992)；甲氨蝶呤(Herrera Estrella等人，(1983)Nature[自然]303:209-213和Meijer等人，(1991)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]16:807-820)；链霉素(Jones等人，(1987)Mol.Gen.Genet.[分子遗传和基因组学]210:86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人，(1996)Transgenic Res.[转基因研究]5:131-137)；博来霉素(Hille等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]7:171-176)；磺酰胺类(Guerineau等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]15:127-136)；溴草腈(Stalker等人，(1988)Science[科学]242:419-423)；草甘膦(Shaw等人，(1986)Science[科学]233:478-481以及美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草丁膦(DeBlock等人，(1987)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]6:2513-2518)。主要参见Yarranton，(1992)Curr.Opin.Biotech.[生物技术新见]3:506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89:6314-6318；Yao等人(1992)Cell[细胞]71:63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.[分子微生物学]6:2419-2422；Barkley等人(1980)The Operon[操纵子]中，第177-220页；Hu等人(1987)Cell[细胞]48:555-566；Brown等人(1987)Cell[细胞]49:603-612；Figge等人(1988)Cell[细胞]52:713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86:5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86:2549-2553；Deuschle等人(1990)Science[科学]248:480-483；Gossen(1993)博士学位论文，德国海德堡大学；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90:1917-1921；Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]10:3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89:3952-3956；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88:5072-5076；Wyborski等人(1991)NucleicAcids Res.[核酸研究]19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.[热点分子结构生物学]10:143-162；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂]35:1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry[生物化学]27:1094-1104；Bonin(1993)博士学位论文，德国海德堡大学；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89:5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂]36:913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology[实验药理学手册]，第78卷(Springer-Verlag,Berlin[柏林施普林格出版社])和Gill等人，(1988)Nature[自然]334:721-724。此类公开内容通过引用结合在此。
以上可选择标记基因的列表并不意指是限制性的。任何可选标记基因均可用于这些实施例中。
植物转化
这些实施例的方法涉及将多肽或多核苷酸引入到植物中。如在此使用的“引入”意指将该多核苷酸或多肽呈送给该植物，以这样的方式使得该序列进入该植物细胞的内部。这些实施例的方法不取决于用于将多核苷酸或多肽引入植物中的具体方法，只要该多核苷酸或多肽进入该植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，该方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。
如在此使用的“稳定转化”意指经引入植物中的核苷酸构建体合并到该植物的基因组中，并且能够被其子代遗传。如本文所使用的，“瞬时转化”意指将多核苷酸引入该植物中并且不合并到该植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。如本文所使用的“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、及其胚胎和子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶子细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。
转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案可以根据要进行转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而异。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的适合方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques[生物技术]4:320-334)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83:5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人，(1984)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]3:2717-2722)以及弹道粒子加速(参见例如，美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244和5,932,782；Tomes等人(1995)，Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基本方法]，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag，Berlin[德国柏林施普林格出版公司])；和McCabe等人，(1988)Biotechnology[生物技术]6:923-926)；以及Lecl转化法(WO 00/28058)。对于马铃薯转化法，参见Tu等人，(1998)Plant MolecularBiology[植物分子生物学]37:829-838和Chong等人，(2000)Transgenic Research[转基因研究]9:71-78。可以在以下文献中找到另外的转化方法：Weissinger等人，(1988)Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]22:421-477；Sanford等人，(1987)Particulate Scienceand Technology[粒子科学与技术]5:27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87:671-674(大豆)；McCabe等人，(1988)Bio/Technology[生物/技术]6:923-926(大豆)；Finer和McMullen，(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.[体外细胞和发育生物学]27P:175-182(大豆)；Singh等人，(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96:319-324(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8:736-740(稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85:4305-4309(玉米)；Klein等人，(1988)Biotechnology[生物技术]6:559-563(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91:440-444(玉米)；Fromm等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8:833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人，(1984)Nature[自然](伦敦)311:763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]84:5345-5349(百合科)；De Wet等人，(1985)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues[胚珠组织的实验操作]，Chapman等人编辑，(纽约朗文出版社)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人，(1990)PlantCell Reports[植物细胞报告]9:415-418和Kaeppler等人，(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84:560-566(晶体介导的转化)；D'Halluin等人，(1992)Plant Cell[植物细胞]4:1495-1505(电穿孔法)；Li等人，(1993)Plant Cell Reports[植物细胞报道]12:250-255以及Christou和Ford，(1995)Annals of Botany[植物学年报]75:407-413(稻)；Osjoda等人，(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14:745-750(经由根瘤土壤杆菌的玉米)；以上所有文献都通过引用并入本文。
在特定实施例中，可以使用各种瞬时转化法向植物提供这些实施例的序列。这种瞬时转化法包括但不限于将IPD079多肽或者其变体和片段直接引入植物中或将IPD079多核苷酸转录物引入植物中。此类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见，例如，Crossway等人，(1986)Mol Gen.Genet.[分子和普通遗传学]202:179-185；Nomura等人，(1986)PlantSci.[植物科学]44:53-58；Hepler等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.[国家科学院院刊]91:2176-2180和Hush等人，(1994)The Journal of CellScience[细胞科学杂志]107:775-784，以上所有文献都通过引用并入本文。可替代地，使用本领域已知的技术可以将该IPD079多核苷酸瞬时地转化至植物中。此类技术包括病毒载体系统，和以阻止DNA后续释放的方式使多核苷酸沉淀。因此，可以从微粒结合的DNA进行转录，但其被释放以整合至基因组的频率大大降低了。这种方法包括使用包被有聚乙烯亚胺(PEI；西格玛(Sigma)#P3143)的粒子。
用于在植物基因组的特定位置定向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所期望的基因组位置的插入。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，其全部通过引用结合在此。简而言之，本实施例的多核苷酸可以包含在侧翼为两个不相同重组位点的转移盒内。将转移盒引入植物中，该植物已经稳定地将靶位点并入其基因组，该靶位点侧接对应转移盒位点的两个不相同重组位点。提供适当的重组酶，并将该转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中特定的染色体位置。
植物转化载体可以由对于实现植物转化所需要的一个或多个DNA载体构成。例如，本领域常见做法是利用由多于一个连续DNA片段组成的植物转化载体。这些载体在本领域中通常被称为“双元载体”。双元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA片段的大小和复杂性相当大，并且将功能分离到单独的DNA分子上是有利的。双元载体通常含有包含T-DNA转移(如左边界和右边界)所需的顺式作用序列的质粒载体、被设计成能够在植物细胞中表达的可选标记、和“目的基因”(经工程改造成能够在植物细胞(理想的是转基因植物代的细胞)中表达的基因)。在这种质粒载体上还存在着细菌复制所需要的序列。将顺式作用序列以允许有效转移到植物细胞中并在其中表达的方式进行排列。例如，该可选标记基因和杀有害生物基因位于左边界和右边界之间。通常第二质粒载体含有介导T-DNA从农杆菌转移到植物细胞的反式作用因子。如本领域所理解的，该质粒通常含有允许通过农杆菌感染植物细胞、以及通过在边界序列切割进行DNA的转移和vir介导的DNA转移的毒力功能(Vir基因)(Hellens和Mullineaux，(2000)Trendsin Plant Science[植物科学趋势]5:446-451)。几种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。通过其他方法如显微投影、显微镜注射、电穿孔、聚乙二醇等来转化植物不需要第二质粒载体。
通常，植物转化方法涉及将异源DNA转移到靶植物细胞中(例如未成熟或成熟的胚胎、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，随后施用最大阈值水平的适当选择(取决于可选标记基因)以从一组未转化的细胞群中回收经转化的植物细胞。在将异源外源DNA整合到植物细胞中之后，然后在该培养基中应用最大阈值水平的合适选择以杀灭这些未转化的细胞，并且通过定期转移到新鲜培养基中来分离和增殖从这种选择处理中存活的这些假定转化的细胞。通过连续传代和使用合适的选择进行攻击，识别并增殖了这些用该质粒载体转化的细胞。然后，可以使用分子和生物化学的方法来证实整合到该转基因植物的基因组中的目的异源基因的存在。
典型地将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并将其常规培养。随后，在被置于补充有最大阈值水平的选择试剂的再生培养基上之后，这些转化的细胞分化成枝条。然后，将这些枝条转移到选择性生根培养基中用于回收已生根的枝条或小植株。然后，该转基因小植株长成成熟植物并且产生能育的种子(例如，Hiei等人，(1994)，The Plant Journal[植物杂志]，6:271-282；Ishida等人，(1996)，Nature Biotechnology[自然生物科技]，14:745-750)。典型地将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并将其常规培养。用于生产转基因植物的技术和方法的一般描述发现于以下文献中：Ayres和Park，(1994)CriticalReviews in Plant Science[植物科学评论]13:219-239以及Bommineni和Jauhar，(1997)Maydica[美迪卡杂志]42:107-120。由于已转化的材料含有许多细胞，已转化的和未转化的细胞都存在于任何一块受试的目标愈伤组织或组织或者细胞组中。杀灭未转化的细胞并允许已转化的细胞增殖的能力产生已转化的植物培养物。通常，去除未转化的细胞的能力是对已转化的植物细胞的快速回收和转基因植物的成功产生的限制。
可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见，例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports[植物细胞报告]5:81-84。这些植物然后可以生长，并且用同样转化的菌株或不同的菌株授粉，并且所得杂交体具有识别的所需表型特征的组成型或诱导型表达。可以培养两代或更多代，以确保所需表型特征的表达稳定地保持并遗传，并且然后收获种子以确保已经实现了所需表型特征的表达。
可以通过使植物与病毒或者病毒核酸接触而向植物提供实施例的核苷酸构建体。通常，这类方法涉及将目的核苷酸构建体并入到病毒DNA或RNA分子中。应当认识到，实施例的重组蛋白最初可以被合成为病毒多蛋白的一部分，然后该病毒多蛋白的一部分可以通过在体内或体外蛋白水解加工，以产生所希望的IPD079多肽。还认识到，包含实施例的IPD079的至少一部分氨基酸序列的这种病毒多蛋白可具有所需的杀有害生物活性。这类病毒多蛋白和编码它们的核苷酸序列涵盖在这些实施例中。用于为植物提供核苷酸构建体并在这些植物中产生已编码的蛋白质的方法(涉及病毒DNA或RNA分子)是本领域已知的。参见例如美国专利号5,889,191；5,889,190；5,866,785；5,589,367和5,316,931；通过引用结合在此。
用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如，Svab等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]87:8526-8530；Svab和Maliga，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90:913-917；Svab和Maliga，(1993)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:601-606。该方法依赖于粒子枪递送含有可选标记的DNA和通过同源重组将DNA靶向质体基因组。此外，通过组织优选表达核编码的和质体定向的RNA聚合酶，可以通过沉默的质体携带的转基因的反式激活来实现质体转化。这种系统已被报道于以下文献中：McBride等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91:7301-7305。
这些实施例进一步涉及实施例的已转化的植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶以及根和芽的插条。
这些实施例可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的实例包括但不限于玉米(玉蜀黍)，芸苔属(例如，甘蓝型油菜、芜菁、芥菜)(特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)，苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))，稻(rice，Oryza sativa)，黑麦(rye，Secale cereale)，高粱(甜高粱(Sorghum bicolor)，高粱(Sorghum vulgare))，粟(例如，珍珠粟(御谷(Pennisetum glaucum))，黍(粟米(Panicummiliaceum))，粟(谷子(Setaria italica))，穇子(龙爪稷(Eleusine coracana)))，向日葵(sunflower，Helianthus annuus)，红花(safflower，Carthamus tinctorius)，小麦(wheat，Triticum aestivum)，大豆(soybean，Glycine max)，烟草(tobacco，Nicotianatabacum)，马铃薯(potato，Solanum tuberosum)，花生(peanut，Arachis hypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))，甘薯(番薯(Ipomoeabatatas))，木薯(cassava，Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属(Coffea spp.))，椰子(coconut，Cocos nucifera)，菠萝(pineapple，Ananas comosus)，柑橘树(柑橘属(Citrusspp.))，可可(cocoa，Theobroma cacao)，茶树(tea，Camellia sinensis)，香蕉(芭蕉属(Musa spp.))，鳄梨(avocado，Persea americana)，无花果(fig或(Ficus casica))，番石榴(guava，Psidium guajava)，芒果(mango，Mangifera indica)，橄榄(olive，Oleaeuropaea)，木瓜(番木瓜(Carica papaya))，腰果(cashew，Anacardium occidentale)，澳洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)，巴旦杏(almond，Prunus amygdalus)，甜菜(sugar beets，Beta vulgaris)，甘蔗(甘蔗属(Saccharum spp.))，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(tomatoes，Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，莴苣(Lactucasativa))、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利马豆(lima bean，Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属(Lathyrus spp.))和黄瓜属的成员诸如黄瓜(cucumber，C.sativus)、香瓜(cantaloupe，C.cantalupensis)和甜瓜(musk melon，C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属(Rhododendron spp.))、绣球花(hydrangea，Macrophylla hydrangea)、木槿(hibiscus，Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属(Tulipa spp.))、水仙(水仙属(Narcissus spp.))、矮牵牛(petunias，Petunia hybrida)、康乃馨(carnation，Dianthus caryophyllus)、一品红(poinsettia，Euphorbia pulcherrima)和菊花。可以用于实践实施例的针叶树包括(例如)松树诸如火炬松(loblolly pine，Pinustaeda)、湿地松(slash pine，Pinus elliotii)、西黄松(ponderosa pine，Pinusponderosa)、黑松(lodgepole pine，Pinus contorta)和辐射松(Monterey pine，Pinusradiata)；花旗松(Douglas-fir，Pseudotsuga menziesii)；西方铁杉(Western hemlock，Tsuga canadensis)；北美云杉(白云杉(Picea glauca))；红杉(北美红杉(Sequoiasempervirens))；枞树(true firs)诸如银杉(胶冷杉(Abies amabilis))和胶枞(香脂冷杉(Abies balsamea))；以及雪松，如西方红雪松(北美乔柏(Thuja plicata))和阿拉斯加黄雪松(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。这些实施例的植物包括作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)，例如玉米和大豆植物。
草皮草包括但不限于：一年生早熟禾(annual bluegrass，Poa annua)；一年生黑麦草(黑麦草(Lolium multiflorum))；加拿大早熟禾(Canada bluegrass，Poacompressa)；紫羊茅(Chewing’s fescue，Festuca rubra)；细弱翦股颖(colonialbentgrass，Agrostis tenuis)；匍匐翦股颖(creeping bentgrass，Agrostis palustris)；冰草(沙生冰草(Agropyron desertorum))；扁穗冰草(fairway wheatgrass，Agropyroncristatum)；硬羊茅(长叶羊茅(Festuca longifolia))；草地早熟禾(Kentuckybluegrass，Poa pratensis)；鸭茅(orchardgrass，Dactylis glomerata)；多年生黑麦草(perennial ryegrass，Lolium perenne)；红狐茅(紫羊茅(Festuca rubra))；小糠草(redtop，Agrostis alba)；粗茎早熟禾(rough bluegrass，Poa trivialis)；羊茅(sheepfescue，Festuca ovina)；无芒雀麦(smooth bromegrass，Bromus inermis)；高羊茅(tallfescue，Festuca arundinacea)；梯牧草(timothy，Phleum pratense)；绒毛剪股颖(velvetbentgrass，Agrostis canina)；碱茅(weeping alkaligrass，Puccinellia distans)；蓝茎冰草(western wheatgrass，Agropyron smithii)；狗牙根(狗牙根属(Cynodon spp.))；圣奥古斯丁草(St.Augustine grass，Stenotaphrum secundatum)；结缕草(结缕属(Zoysiaspp.))；百喜草(Bahia grass，Paspalum notatum)；地毯草(carpet grass，Axonopusaffinis)；假俭草(centipede grass，Eremochloa ophiuroides)；隐花狼尾草(kikuyugrass，Pennisetum clandesinum)；海滨雀稗(seashore paspalum，Paspalum vaginatum)；格兰马草(blue gramma，Bouteloua gracilis)；野牛草(buffalo grass，Buchloedactyloids)；垂穗草(sideoats gramma，Bouteloua curtipendula)。
目的植物包括提供目的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦、粟等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
植物转化评估
在将异源外源DNA引入植物细胞后，通过各种方法(例如分析与已整合的基因相关的核酸、蛋白质和代谢物)证实异源基因在该植物基因组中的转化或整合。
PCR分析是在移植到土壤中之前的早期阶段检查已转化的细胞、组织或芽中已整合的基因存在的快速方法(Sambrook和Russell，(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual[分子克隆：实验手册]，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY[纽约冷泉港冷泉港实验室出版社])。使用对目的基因或农杆菌属载体背景等具有特异性的寡核苷酸引物进行PCR。
可以通过基因组DNA的DNA印迹分析来证实植物转化(Sambrook和Russell，(2001)，同上)。通常，从转化体中提取总DNA，该转化体用适当的限制酶进行消化，在琼脂糖凝胶中进行分馏并且转到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后，根据标准的技术，用例如放射性标记32P的靶DNA片段来探测该膜或“印迹”以证实引入的基因整合到该植物基因组中(Sambrook和Russell，(2001)，同上)。
在RNA印迹分析中，从该转化体的特定组织中分离了RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中进行分馏，并且根据本领域常规使用的标准程序来印迹到尼龙滤膜上(Sambrook和Russell，(2001)，同上)。然后，通过在本领域内已知的方法，通过将该滤膜与源自杀有害生物基因的放射性探针进行杂交来测试由该杀有害生物基因所编码的RNA的表达(Sambrook和Russell，(2001)，同上)。
可以对转基因植物进行蛋白质印迹、生物化学测定以及类似测定，以便通过标准程序(Sambrook和Russell，(2001)，同上)使用与IPD079多肽上存在的一个或多个表位结合的抗体来证实由该杀有害生物基因所编码的蛋白质的存在。
转基因植物中性状的堆叠
转基因植物可以包含在此公开的一种或多种杀昆虫多核苷酸与一种或多种另外的多核苷酸的堆叠，导致产生或抑制多个多肽序列。包含多核苷酸序列堆叠的转基因植物可以通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一种或两种获得。这些方法包含但不限于：育种各自包含目的多核苷酸的单个系，将包含在此公开的基因的转基因植物与随后的基因转化并将基因共转化为单个植物细胞。如在此使用的，术语“堆叠”包括在同一植物中存在多个性状(即，将两个性状并入核基因组中，将一个性状并入核基因组中，并且将一个性状并入质体的基因组中，或者这两种性状都被并入质体的基因组中)。在一个非限制性实例中，“堆叠性状”包括其中序列在物理上彼此相邻的分子堆叠。如在此使用的性状是指源自特定序列或序列组群的表型。可以使用包含多个基因或在多个载体上分别携带的基因的单一转化载体进行基因的共转化。如果通过对该植物进行基因转化来堆叠这些序列，则可以在任何时间和以任何顺序组合目的这些多核苷酸序列。可以用共转化方案将这些性状与转化盒的任何组合所提供的目的多核苷酸一起引入。例如，若引入两个序列，则这两个序列可包含在分开的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)。这些序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子驱动。在某些情况下，可能所希望的是引入一种将抑制所关注的聚核苷酸的表达的转化盒。此可以与其他抑制盒或过度表达盒的任何组合进行组合以在该植物中产生所需性状组合。进一步应当认识到，可以使用位点特异重组系统，来在希望的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，其全部通过引用结合在此。
在一些实施例中，编码本文公开的IPD079多肽、单独的或与一种或多种另外的昆虫抗性性状相堆叠的多核苷酸可以与一种或多种另外的投入性状(例如，除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育性、茎秆强度等)或产出性状(例如，增加的产量、改性的淀粉、改进的油特性、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增加的消化性、改进的纤维品质、抗旱性等)相堆叠。因此，多核苷酸实施例可用于提供具有灵活地且成本有效地防治任何数量的农艺有害生物的能力的经改进的作物品质的完整农艺学方案。
可用于堆叠的转基因包括但不限于：
1.赋予昆虫抗性或抗病性并编码以下基因的转基因：
(A)植物抗病性基因。通常通过植物中抗病性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用来活化植物防御。可以用经克隆的抗性基因来转化植物变种，以工程化对特定病原菌株具有抗性的植物。参见，例如Jones等人(1994)Science[科学]266:789(cloning of the tomato Cf-9 gene for resistance toCladosporium fulvum[克隆番茄Cf-9基因以抵抗番茄叶霉病菌])；Martin等人(1993)Science[科学]262:1432(tomato Pto gene for resistance to Pseudomonas syringaepv.tomato encodes a protein kinase[用于抵抗丁香假单胞菌番茄致病变体的番茄Pto基因编码蛋白激酶])；Mindrinos等人，(1994)Cell[细胞]78:1089(Arabidopsis RSP2gene for resistance to Pseudomonas syringae[拟南芥RSP2基因用于对抗丁香假单胞菌])，McDowell和Woffenden，(2003)Trends Biotechnol.[生物科技趋势]21(4):178-83以及Toyoda等人，(2002)Transgenic Res.[转基因研究]11(6):567-82。与野生型植物相比，具有抗病性的植物对病原体更具抗性。
(B)编码苏云金芽孢杆菌蛋白质的基因，其衍生物或其上建模的合成多肽。参见，例如，Geiser等人，(1986)Gene[基因]48:109，其公开了Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可购自美国典型培养物保藏中心(罗克维尔(Rockville)，马里兰州)，例如在
Figure BDA0003795187100001011
登录号40098、67136、31995和31998下。经遗传工程化的苏云金芽孢杆菌转基因的其他非限制性实例在以下专利和专利申请中给出，并且特此通过引用并入本文中：美国专利号5,188,960；5,689,052；5,880,275；5,986,177；6,023,013、6,060,594、6,063,597、6,077,824、6,620,988、6,642,030、6,713,259、6,893,826、7,105,332；7,179,965、7,208,474；7,227,056、7,288,643、7,323,556、7,329,736、7,449,552、7,468,278、7,510,878、7,521,235、7,544,862、7,605,304、7,696,412、7,629,504、7,705,216、7,772,465、7,790,846、7,858,849和WO 1991/14778；WO 1999/31248；WO 2001/12731；WO 1999/24581和WO 1997/40162。
编码杀有害生物蛋白的基因也可以被堆叠，这些杀有害生物蛋白包括但不限于：来自以下的杀昆虫蛋白：假单孢菌属物种，如PSEEN3174(Monalysin,(2011)PLoSPathogens[PLoS病原体]，7:1-13)、假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株CHA0和Pf-5(之前为荧光假单孢菌)(Pechy-Tarr，(2008)Environmental Microbiology[环境微生物学]10:2368-2386；GenBank登录号EU400157)；台湾假单孢菌(Pseudomonas Taiwanensis)(Liu等人，(2010)J.Agric.Food Chem.[农业与食品化学杂志]58:12343-12349)和假产碱假单孢菌(Zhang等人，(2009)Annals of Microbiology[微生物学年鉴]59:45-50和Li等人，(2007)Plant Cell Tiss.Organ Cult.[植物细胞、组织和器官培养]89:159-168)；来自发光杆菌属物种和致病杆菌属物种(Hinchliffe等人，(2010)The Open ToxicologyJournal[开放毒理学杂志]，3:101-118和Morgan等人，(2001)Applied and Envir.Micro.[应用与环境微生物学]67:2062-2069)的杀昆虫蛋白；来自美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946的杀昆虫蛋白；美国专利公开号US 20140007292的PIP-1多肽；美国专利公开号US 20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽；美国专利公开号US 20140274885和US20160040184的PHI-4多肽；PCT公开号WO 2015/023846的PIP-47多肽、PCT公开号WO 2015/038734的PIP-72多肽；PCT公开号WO 2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽；PCT公开号WO 2015/120276的PtIP-83多肽；PCT序列号PCT/US 15/55502的PtIP-96多肽；PCT序列号PCT/US 16/32273的IPD073多肽、美国序列号62/269482的IPD082多肽，以及δ-内毒素包括但不限于Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry50、Cry51、Cry52、Cry53、Cry54、Cry55、Cry56、Cry57、Cry58、Cry59、Cry60、Cry61、Cry62、Cry63、Cry64、Cry65、Cry66、Cry67、Cry68、Cry69、Cry70、Cry71、Cry72、Cry73和Cry74类的δ-内毒素基因和苏云金芽孢杆菌溶细胞cyt1和cyt2基因。这些类别的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的成员是本领域技术人员熟知的(参见，Crickmore等人，“Bacillus thuringiensistoxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法]”(2011)，在lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/，可以使用“www”前缀在万维网上访问该网址。
δ-内毒素的实例还包括但不限于：美国专利号5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白；美国专利号8,304,604、8,304,605、8,476,226和9,006,520的DIG-3或DIG-11毒素(cry蛋白(如Cry1A、Cry3A)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的N末端缺失)；美国专利申请公开号2006/0112447的Cry1B；美国专利号6,033,874的Cry1C；美国专利号5,188,960和6,218,188的Cry1F；美国专利号7,070,982、6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体；美国专利号7,064,249的Cry2蛋白如Cry2Ab蛋白；Cry3A蛋白，包括但不限于：通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区的独特组合产生的工程化杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公开号2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员；Cry15蛋白，描述于以下文献中：Naimov等人(2008)Applied and Environmental Microbiology[应用与环境微生物学]74:7145-7151；美国专利号6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的CryET33和cryET34蛋白；美国专利号8,796,026、美国专利公开号2012/0278954，和PCT公开号WO2012/139004的CryET33和CryET34同源物；美国专利号6,083,499、6,548,291和6,340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白、Cry51蛋白、Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；美国专利号8,609,936的TIC807；WO 2007/027776的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利号8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；美国专利号7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO 2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO2005/038032的AXMI-010；WO 2005/021585的AXMI-003；美国专利号7,351,881的AXMI-008；美国专利申请公开号2004/0216186的AXMI-006；美国专利申请公开号2004/0210965的AXMI-007；美国专利申请号2004/0210964的AXMI-009；美国专利申请公开号2004/0197917的AXMI-014；美国专利号7,355,099的AXMI-004；WO 2006/119457、美国专利号7,622,572、7,803925、7,803,391、7,811,598、8,314,292的AXMI-028和AXMI-029；WO 2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；美国专利号8,084,416的AXMI-150；美国专利申请公开号2011/0023184的AXMI-205；美国专利号8,829,279的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063和AXMI-064，或者美国专利公开号US20140344999；美国专利号8,299,217的AXMI-R1和相关蛋白；美国专利号8,686,124的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；美国专利号8,759,619的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231；美国专利号8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；美国专利申请公开号2013/0117884的AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045；美国专利申请公开号2009/0144852的AXMI-066和AXMI-076；美国专利号8,318,900，或者美国专利公开号2013/0055469的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；美国专利号8,461,421，以及美国专利公开号2013/0305412的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137，具有美国专利号8,319,019的修饰的蛋白水解位点的Cry蛋白如Cry1A和Cry3A；美国专利号8,551,757的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员所熟知的(回顾参见van Frannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.[无脊椎动物病理学杂志]101:1-16)。使用Cry蛋白作为转基因植物性状是本领域技术人员熟知的，并且Cry转基因植物(包括但不限于表达以下的植物：Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt)已获得法规性审批(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal[植物生物技术杂志]9:283-300和CERA(2010)环境风险评估的转基因作物数据库中心(CERA)(GM CropDatabase Center for Environmental Risk Assessment(CERA))，ILSI研究基金会(ILSIResearch Foundation)，华盛顿特区，网址为cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database，可以使用“www”前缀在万维网上访问该网址)。本领域技术人员熟知的多于一种杀有害生物蛋白也可以在植物如Vip3Ab和Cry1Fa(US 2012/0317682)；Cry1BE和Cry1F(US2012/0311746)；Cry1CA和Cry1AB(US 2012/0311745)；Cry1F和CryCa(US 2012/0317681)；Cry1DA和Cry1BE(US 2012/0331590)；Cry1DA和Cry1Fa(US 2012/0331589)；Cry1AB和Cry1BE(US 2012/0324606)；Cry1Fa和Cry2Aa以及Cry1I和Cry1E(US 2012/0324605)；Cry34Ab/35Ab和Cry6Aa(US 20130167269)；Cry34Ab/VCry35Ab和Cry3Aa(US20130167268)；以及Cry3A和Cry1Ab或Vip3Aa(US 20130116170)中表达。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，这些杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7,491,869的脂质酰基水解酶，以及胆固醇氧化酶，例如来自链霉菌(Streptomyces)(Purcell等人，(1993)Biochem BiophysRes Commun[生物化学与生物物理研究通讯]15:1406-1413)。杀有害生物蛋白还包括美国专利号5,877,012、6,107,2796,137,033、7,244,820、7,615,686、和8,237,020等的VIP(营养期杀昆虫蛋白)毒素。其他VIP蛋白质是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。杀有害生物蛋白还包括毒素复合物(TC)蛋白，该毒素复合物(TC)蛋白可从生物体如致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属获得(参见，美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的TC蛋白。如在此所述，A类蛋白(“蛋白A”)是独立的毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)提高了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛肽的实例包括但不限于莱科毒素-1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。
(C)编码昆虫特异性激素或信息素(如蜕化类固醇和保幼激素)的多核苷酸，其变体，基于其的模拟物，或者其拮抗剂或激动剂。参见，例如Hammock等人，(1990)Nature[自然]344:458，该文献公开了经克隆的保幼激素酯酶的杆状病毒表达是保幼激素的灭活剂。
(D)编码昆虫特异性肽的多核苷酸，其在表达时破坏受影响有害生物的生理机能。例如，参见Regan，(1994)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]269:9的公开内容(表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的DNA)；Pratt等人，(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理研究通讯]163:1243(在Diploptera puntata中识别出了阿洛斯德汀(allostatin))；Chattopadhyay等人，(2004)Critical Reviews in Microbiology[微生物学评论]30(1):33-54；Zjawiony，(2004)J Nat Prod[天然产物杂志]67(2):300-310；Carlini和Grossi-de-Sa，(2002)Toxicon[毒素]40(11):1515-1539；Ussuf等人，(2001)Curr Sci.[当代科学]80(7):847-853以及Vasconcelos和Oliveira，(2004)Toxicon[毒素]44(4):385-403。还参见，美国专利号5,266,317，作者Tomalski等人，他们公开了编码昆虫特异性毒素的基因。
(E)编码如下酶的多核苷酸，该多核苷酸负责单萜、倍半萜烯、类固醇、异羟肟酸、苯丙素衍生物或具有杀昆虫活性的其他非蛋白质分子的超累积。
(F)编码参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶的多核苷酸；例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然还是合成的。参见，PCT申请WO1993/02197，所属人为Scott等人，该文献公开了愈创葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列。含有几丁质酶编码序列的DNA分子可以例如从登录号39637和67152下的
Figure BDA0003795187100001081
获得。还参见，Kramer等人，(1993)，Insect Biochem.Molec.Biol.[昆虫生物化学与分子生物学]，23:691，其教导编码烟草钩虫几丁质酶的cDNA的核苷酸序列，和Kawalleck等人，(1993)Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]，21:673，其提供欧芹ubi4-2多泛素基因的核苷酸序列，和美国专利号6,563,020、7,145,060和7,087,810。
(G)编码刺激信号转导的分子的多核苷酸。例如，参见Botella等人，(1994)PlantMolec.Biol.[分子细胞生物学]24:757，该文献公开了绿豆钙调素cDNA克隆的核苷酸序列，以及Griess等人，(1994)Plant Physiol.[植物生理学]104:1467，他们提供了玉米钙调素cDNA克隆的核苷酸序列。
(H)编码疏水时刻肽(moment peptide)的多核苷酸。参见，PCT申请WO 1995/16776和美国专利号5,580,852，速普肽(其抑制真菌植物病原体)的肽衍生物的公开和PCT申请WO1995/18855和美国专利号5,607,914(教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽)。
(I)编码膜通透酶、通道形成剂(channel former)或通道阻断剂的多核苷酸。例如，参见Jaynes等人，(1993)Plant Sci.[植物科学]89:43，该文献公开了天蚕素-β裂解肽类似物的异源表达，以提供对烟草假单胞菌具有抗性的转基因烟草植物。
(J)编码病毒侵入性蛋白质的基因或由其衍生的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累赋予由外源蛋白基因来源的病毒以及由相关病毒导致的病毒侵染和/或疾病发展的抗性。参见，Beachy等人，(1990)Ann.Rev.Phytopathol.[植物病理学年评]28:451。外壳蛋白介导的抗性已被赋予至转化植物抵抗：苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒。同上。
(K)编码昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素的基因。因此，靶向昆虫肠道中关键代谢功能的抗体将使受影响的酶失活，杀死该昆虫。Cf.Taylor等人，摘要#497，SEVENTHINT'L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS[分子植物-微生物相互作用的第七届国际研讨会](爱丁堡，苏格兰，1994)(通过生产单链抗体片段在转基因烟草中酶促失活)。
(L)编码病毒特异性抗体的基因。参见，例如Tavladoraki等人，(1993)Nature[自然]366:469，其显示，表达重组抗体基因的转基因植物不受病毒侵袭。
(M)编码由病原体或寄生虫在自然中产生的发育阻滞蛋白的多核苷酸。因此，真菌内α-1,4-D-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁homo-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶来促进真菌定植和植物营养释放。参见Lamb等人，(1992)Bio/Technology[生物技术]10:1436。以下文献描述了编码豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征：Toubart等人，(1992)Plant J.[植物杂志]2:367。
(N)编码由植物在自然中产生的发育抑制蛋白的多核苷酸。例如，已在以下文献中表明表达大麦核糖体失活基因的转基因植物具有增加的对真菌疾病的抗性：Logemann等人，(1992)Bio/Technology[生物技术]10:305。
(O)参与系统获得抗性(SAR)反应的基因和/或发病机制相关的基因。Briggs，(1995)Current Biology[当代生物学]5(2)，Pieterse和Van Loon，(2004)Curr.Opin.Plant Bio.[植物生物学新观点]7(4):456-64，以及Somssich，(2003)Cell[细胞]113(7):815-6。
(P)抗真菌基因(Cornelissen和Melchers，(1993)Pl.Physiol.[植物生理学]101:709-712，和Parijs等人，(1991)Planta[植物]183:258-264，以及Bushnell等人，(1998)Can.J.of Plant Path.[加拿大植物病理学杂志]20(2):137-149)。还参见，美国专利申请序列号09/950,933；11/619,645；11/657,710；11/748,994；11/774,121以及美国专利号6,891,085和7,306,946。LysM受体样激酶用于感知几丁质片段，作为植物对真菌病原体防御反应的第一步(US2012/0110696)。
(Q)解毒基因，如伏马菌素、白僵菌素、串珠镰刀菌素和玉米赤霉烯酮及其结构上相关的衍生物。例如，参见美国专利号5,716,820；5,792,931；5,798,255；5,846,812；6,083,736；6,538,177；6,388,171和6,812,380。
(R)编码胱抑素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多核苷酸。参见，美国专利号7,205,453。
(S)防御素基因。参见，WO 2003/000863和美国专利号6,911,577；6,855,865；6,777,592和7,238,781。
(T)赋予线虫抗性的基因。参见，例如PCT申请WO 1996/30517；PCT申请WO 1993/19181、WO 2003/033651，以及Urwin等人，(1998)Planta[植物]204:472-479，和Williamson，(1999)Curr Opin Plant Bio.[植物生物学新观点]2(4):327-31；美国专利号6,284,948和7,301,069以及miR164基因(WO 2012/058266)。
(U)赋予对疫霉根腐病抗性的基因，如Rps 1、Rps 1-a、Rps 1-b、Rps 1-c、Rps 1-d、Rps 1-e、Rps 1-k、Rps 2、Rps 3-a、Rps 3-b、Rps 3-c、Rps 4、Rps 5、Rps 6、Rps 7和其他Rps基因。参见，例如Shoemaker等人，Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mappingin Soybean[大豆中疫霉根腐病抗性基因图谱]，植物基因组第四次会议，加利福尼亚州圣迭戈(San Diego，Calif.)(1995)。
(V)赋予对褐茎腐病抗性的基因，如美国专利号5,689,035所述，并为此通过引入并入本文。
(W)赋予对炭疽菌抗性的基因，如美国专利申请公开US 2009/0035765中所述，并为此通过引用并入本文。这包括可以用作单一基因座转化的Rcg基因座。
2.赋予对除草剂的抗性的转基因，例如：
(A)编码对如下除草剂的抗性的多核苷酸，该除草剂抑制生长点或分生组织，如咪唑啉酮或磺酰脲。这个类别的实例性基因编码突变体ALS和AHAS酶，分别如以下文献中所述：Lee等人，(1988)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]7:1241和Miki等人，(1990)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]80:449。还参见，美国专利号5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937和5,378,824；美国专利申请序号11/683,737和国际公开WO 1996/33270。
(B)编码草甘膦抗性的蛋白质的多核苷酸(5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP)和aroA基因给予的抗性)和其他膦酰基化合物如草胺膦(草胺膦乙酰转移酶(PAT)和吸水链霉菌草胺膦乙酰转移酶(bar)基因)，以及吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)。参见，例如Shah等人的美国专利号4,940,835，其公开了EPSPS形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。Barry等人的美国专利号5,627,061也描述了编码EPSPS酶的基因。还参见，美国专利号6,566,587；6,338,961；6,248,876；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；5,094,945、4,940,835；5,866,775；6,225,114；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；Re.36,449；RE 37,287 E和5,491,288以及国际公开EP 1173580；WO 2001/66704；EP1173581和EP 1173582，为此目的将以上专利通过引用结合在此。还给予植物草甘磷抗性，使该植物表达编码草甘磷氧化还原酶的基因，这在美国专利号5,776,760和5,463,175中进行了更全面地描述，为此目的将这两份专利以引用方式并入本文。另外，可通过过量表达编码草甘磷N-乙酰转移酶的基因，来给予植物草甘磷抗性。参见例如美国专利号7,462,481；7,405,074以及美国专利申请公开号2008/0234130。编码突变aroA基因的DNA分子可以在
Figure BDA0003795187100001121
登录号39256下获得，并且该突变基因的核苷酸序列公开于授予Comai的美国专利号4,769,061中。欧洲申请号0 333 033(Kumada等人)和美国专利号4,975,374(Goodman等人)公开了赋予除草剂(如L-草铵膦)抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。EP申请号0242 246和0 242 236至Leemans等人中提供了草丁膦乙酰基转移酶基因的核苷酸序列；DeGreef等人，(1989)，Bio/Technology[生物/技术]，7:61描述了表达编码草丁膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的生产。还参见，美国专利号5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616和5,879,903，为此目的将以上专利通过引用结合在此。赋予苯氧基丙酸和环己酮(如稀禾啶和吡氟氯禾灵)抗性的示例性基因是Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因，其描述于以下文献中：Marshall等人，(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]83:435。
(C)编码对抑制光合作用的除草剂具有抗性的蛋白质的多核苷酸，例如三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)。Przibilla等人，(1991)Plant Cell[植物细胞]3:169，描述了用编码突变体psbA基因的质粒对衣藻进行转化。针对腈水解酶基因的核苷酸序列公开在美国专利号4,810,648(Stalker)中，并且含有这些基因的DNA分子可以在ATCC登录号53435,67441和53435,67442下获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达描述于以下文献中：Hayes等人，(1992)Biochem.J.[生物化学杂志]285:173。
(D)已经发现，编码对乙酰醇酸合成酶具有抗性的蛋白质的多核苷酸能产生表达这种对多种类型的除草剂具有抗性的酶的植物，并已将该多核苷酸引入到多种植物中(参见，例如Hattori等人(1995)Mol Gen Genet.[分子和普通遗传学]246:419)。赋予除草剂抗性的其他基因包括：编码大鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota等人，(1994)Plant Physiol[植物生理学]106:17)，针对谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶的基因(Aono等人，(1995)Plant Cell Physiol[植物细胞生理学]36:1687)和各种磷酸转移酶的基因(Datta等人，(1992)Plant Mol Biol[植物分子生理学]20:619)。
(E)编码靶向原卟啉原氧化酶(protox)(对于生产叶绿素所必需的)的除草剂抗性的多核苷酸。原卟啉原氧化酶(protox)作为针对各种除草化合物的靶标。这些除草剂还抑制存在的所有不同种类的植物的生长，导致其完全破坏。美国专利号6,288,306、6,282,837和5,767,373和国际公开WO 2001/12825中描述了包含对这些除草剂具有抗性的改变的原卟啉原氧化酶活性的植物的发育。
(F)aad-1基因(最初来自鞘脂单胞菌(Sphingobium herbicidovorans))编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)蛋白。该性状赋予对2,4-二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(通常称为“fop”除草剂，例如喹禾灵)除草剂的耐受性。用于植物中除草剂耐受性的aad-1基因本身首先在WO 2005/107437中公开(还参见US 2009/0093366)。来自食酸丛毛单胞菌的aad-12基因，其编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-12)蛋白，该蛋白通过用芳氧基链烷酸酯部分(包括苯氧基生长素(例如2,4-D，MCPA)以及吡啶氧基生长素(例如氯氟吡氧乙酸，三氯吡氧乙酸))使几种除草剂失活来赋予对2,4-二氯苯氧基乙酸和吡啶氧基乙酸酯除草剂的耐受性。
(G)美国专利申请公开2003/0135879中所公开的用于给予麦草畏耐受性的编码除草剂抗性的麦草畏单加氧酶的多核苷酸。
(H)美国专利号4,810,648中所公开的用于给予溴苯腈耐受性的编码溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子。
(I)用于达草灭耐受性的编码八氢番茄红素(crt1)的多核苷酸分子描述于以下文献中：Misawa等人，(1993)Plant J.[植物杂志]4:833-840和Misawa等人，(1994)Plant J.[植物杂志]6:481-489。
3.赋予或贡献于改变的谷物特征的转基因
如：
(A)改变的脂肪酸，例如，通过以下方式：
(1)下调硬脂酰-ACP以增加植物的硬脂酸含量。参见，Knultzon等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89:2624和WO 1999/64579(Genes to AlterLipid Profiles in Corn[改变玉米脂质谱的基因])。
(2)通过FAD-2基因修饰提高油酸和/或通过FAD-3基因修饰降低亚麻酸(参见，美国专利号6,063,947、6,323,392、6,372,965和WO 1993/11245)。
(3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，如在WO 2001/12800中。
(4)改变LEC1，AGP，Dek1，Superal1，mi1 ps，各种Ipa基因如Ipa1、Ipa3、hpt或hggt。例如，参见WO 2002/42424，WO 1998/22604，WO 2003/011015，WO 2002/057439，WO2003/011015，美国专利号6,423,886、6,197,561、6,825,397，和美国专利申请公开号US2003/0079247、US 2003/0204870，以及Rivera-Madrid等人，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.[国家科学院院刊]92:5620-5624。
(5)编码用于制备长链多不饱和脂肪酸的δ-8去饱和酶(美国专利号8,058,571和8,338,152)，用于降低饱和脂肪的δ-9去饱和酶(美国专利号8,063,269)，用于改进ω-3脂肪酸谱的报春花属Δ6-去饱和酶的基因。
(6)与脂质和糖代谢调节相关的分离的核酸和蛋白质，具体地，在生产转基因植物和调节种子储存化合物(包括脂质、脂肪酸、淀粉或种子贮藏蛋白)的水平的方法中使用的和在调节植物的种子大小、种子数、种子重量、根长和叶片大小的方法中使用的脂质代谢蛋白(LMP)(EP 2404499)。
(7)改变植物中糖诱导型2(HSI2)蛋白的高水平表达以增加或减少植物中HSI2的表达。增加HSI2的表达增加油含量，然而降低HSI2的表达降低脱落酸敏感性和/或增加抗旱性(美国专利申请公开号2012/0066794)。
(8)细胞色素b5(Cb5)单独或与FAD2一起表达调节植物种子中的油含量，特别是增加ω-3脂肪酸的水平，并改进ω-6与ω-3脂肪酸的比例(美国专利申请公开号2011/0191904)。
(9)编码wrinkled1样多肽的核酸分子用于调节糖代谢(美国专利号8,217,223)。
(B)经改变的磷含量，例如，通过
(1)引入植酸酶编码基因将促进植酸盐的分解，向经转化的植物中添加更多的游离磷酸盐。例如，参见Van Hartingsveldt等人，(1993)Gene[基因]127:87，该文献公开了黑曲霉植酸酶基因的核苷酸序列。
(2)调节降低植酸盐含量的基因。例如，这可以在玉米中通过以下方法来完成：克隆然后重新引入与一个或多个等位基因相关联的DNA，例如在以低水平的植酸为特征的玉米突变体中经识别的LPA等位基因，例如WO 2005/113778中所述；和/或改变肌醇激酶活性，如WO 2002/059324、美国专利申请公开号2003/0009011、WO 2003/027243、美国专利申请公开号2003/0079247、WO 1999/05298、美国专利号6,197,561、美国专利号6,291,224、美国专利号6,391,348、WO 2002/059324、美国专利申请公开号2003/0079247、WO 1998/45448、WO1999/55882、WO 2001/04147中所述。
(C)例如，通过改变影响淀粉分支模式的酶的基因而影响的改变的碳水化合物，或改变硫氧还蛋白如NTR和/或TRX(参见，美国专利号6,531,648，以此目的其通过引用结合)和/或γ玉蜀黍蛋白敲除或突变体如cs27或TUSC27或en27的基因(参见，美国专利号6,858,778和美国专利申请公开号2005/0160488、美国专利申请公开号2005/0204418，以此目的其通过引用结合)。参见，Shiroza等人，(1988)，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，170:810(链球菌突变果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz等人，(1985)，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和基因组学]，200:220](枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)，Pen等人，(1992)，Bio/Technology[生物/技术]，10:292(生产表达地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的转基因植物)，Elliot等人，(1993)，Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]，21:515(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，
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等人，(1993)，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，268:22480(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)和Fisher等人，(1993)，Plant Physiol.[植物生理学]，102:1045(玉米胚乳淀粉分支酶II)，WO 1999/10498(通过修饰UDP-D-木糖4-差向异构酶、脆性1和2、Ref1、HCHL、C4H改进的消化性和/或淀粉提取)，美国专利号6,232,529(通过改变淀粉水平(AGP)生产高油种子的方法)。本文提及的脂肪酸修饰基因也可用于通过淀粉和油途径的相互关系来影响淀粉含量和/或组成。
(D)改变的抗氧化剂含量或组成，如改变生育酚或生育三烯酚。例如，参见，涉及操作抗氧化剂水平的美国专利号6,787,683、美国专利申请公开号2004/0034886和WO 2000/68393，和通过改变尿黑酸香叶基转移酶(hggt)的WO 2003/082899。
(E)改变的必需种子氨基酸。例如，参见，美国专利号6,127,600(增加种子中必需氨基酸积累的方法)，美国专利号6,080,913(增加种子中必需氨基酸积累的二元方法)，美国专利号5,990,389(高赖氨酸)，WO 1999/40209(种子中氨基酸组成的变化)，WO 1999/29882(用于改变蛋白质氨基酸含量的方法)，美国专利号5,850,016(种子中氨基酸组成的改变)，WO 1998/20133(具有增加必需氨基酸水平的蛋白质)，美国专利号5,885,802(高甲硫氨酸)，美国专利号5,885,801(高苏氨酸)，美国专利号6,664,445(植物氨基酸生物合酶)，美国专利号6,459,019(增加的赖氨酸和苏氨酸)，美国专利号6,441,274(植物色氨酸合酶β亚基)，美国专利号6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)，美国专利号5,939,599(高硫)，美国专利号5,912,414(增加的甲硫氨酸)，WO 1998/56935(植物氨基酸生物合酶)，WO 1998/45458(具有较高百分比必需氨基酸的工程化种子蛋白)，WO 1998/42831(增加的赖氨酸)，美国专利号5,633,436(增加的硫氨基酸含量)，美国专利号5,559,223(具有包含可编程水平的必需氨基酸的所定义结构的合成贮藏蛋白，用于改进植物的营养价值)，WO 1996/01905(增加的苏氨酸)，WO 1995/15392(增加的赖氨酸)，美国专利申请公开号2003/0163838，美国专利申请公开号2003/0150014，美国专利申请公开号2004/0068767，美国专利号6,803,498，WO 2001/79516。
4.控制雄性不育的基因：
有几种赋予遗传性雄性不育的方法，例如赋予雄性不育的基因组内单独位置处的多个突变基因，如Brar等人在美国专利号4,654,465和4,727,219中所公开的，以及染色体易位，如Patterson在美国专利号3,861,709和3,710,511中所述。除了这些方法之外，Albertsen等人在美国专利号5,432,068中描述了细胞核雄性不育的系统，该系统包括：识别对雄性生育力至关重要的基因；沉默这种对雄性生育力至关重要的天然基因；从必需的雄性生育力基因中除去天然启动子并用诱导型启动子取代；将这种遗传工程化基因插回入该植物中；并因此产生雄性不育的植物，因为诱导型启动子不是“开”的，导致雄性能育性基因不被转录。通过诱导或将启动子打“开”来恢复生育力，该启动子反过来又允许赋予雄性生育力的基因被转录。
(A)在绒毡层特异性启动子的控制下并施用化学品N-Ac-PPT来引入脱乙酰酶基因(WO 2001/29237)。
(B)引入各种雄蕊特异性启动子(WO 1992/13956，WO 1992/13957)。
(C)引入barnase和barstar基因(Paul等人，(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]19:611-622)。
关于细胞核雄性和雌性不育系统和基因的另外的实例，也可参见美国专利号5,859,341；6,297,426；5,478,369；5,824,524；5,850,014和6,265,640，所有这些专利都通过引用结合在此。
5.创建用于位点特异性DNA整合的位点的基因
这包括引入可能用于FLP/FRT系统中的FRT位点和可能用于Cre/Loxp系统中的Lox位点。例如，参见Lyznik等人(2003)Plant Cell Rep[植物细胞报告]21:925-932和WO1999/25821，以上文献通过引用结合在此。可以使用的其他系统包括噬菌体Mu的Gin重组酶(Maeser等人，(1991)，Vicki Chandler，The Maize Handbook[玉米手册]，第118章(施普林格出版社，1994))、大肠杆菌的Pin重组酶(Enomoto等人，1983)和pSRi质粒的R/RS系统(Araki等人，1992)。
6.影响非生物胁迫抗性的基因
包括但不限于开花，穗和种子发育，提高氮利用效率，改变氮反应性，抗旱性或耐旱性，抗寒性或耐寒性，抗盐性或耐盐性以及在胁迫下产量的增加。
(A)例如，参见：WO 2000/73475，其中通过改变苹果酸来改变水分的使用效率；美国专利5,892,009、5,965,705、5,929,305、5,891,859、6,417,428、6,664,446、6,706,866、6,717,034、6,801,104、WO 2000/060089、WO 2001/026459、WO 2001/035725、WO 2001/034726、WO 2001/035727、WO 2001/036444、WO 2001/036597、WO 2001/036598、WO 2002/015675、WO 2002/017430、WO 2002/077185、WO 2002/079403、WO 2003/013227、WO 2003/013228、WO 2003/014327、WO 2004/031349、WO 2004/076638、WO 199809521。
(B)WO 199938977描述了基因(包括CBF基因)以及有效减轻冷冻、高盐度和干旱对植物的负面影响以及赋予植物表型其他积极作用的转录因子。
(C)美国专利申请公开号2004/0148654和WO 2001/36596，其中在植物中改变脱落酸，产生改良的植物表型，例如增加的产量和/或增加的对非生物胁迫的耐受性。
(D)WO 2000/006341、WO 2004/090143、美国专利号7,531,723和6,992,237，其中改性细胞分裂素表达，产生具有增加的胁迫耐受性(例如耐旱性和/或增加的产量)的植物。还可参见，WO 2002/02776、WO 2003/052063、JP 2002/281975、美国专利号6,084,153、WO2001/64898、美国专利号6,177,275和美国专利号6,107,547(提高氮利用率和改变氮反应性)。
(E)关于乙烯改变，参见美国专利申请公开号2004/0128719、美国专利申请公开号2003/0166197和WO 2000/32761。
(F)关于非生物胁迫的植物转录因子或转录调节子，参见例如美国专利申请公开号2004/0098764或美国专利申请公开号2004/0078852。
(G)增加液泡焦磷酸酶(如AVP1)表达的基因(美国专利号8,058,515)，用于提高产量；编码HSFA4或HSFA5的核酸(A4或A5类的热休克因子)多肽，寡肽转运蛋白(OPT4样)多肽；Plastochron2样(PLA2样)多肽或Wuschel相关同源盒1样(WOX1样)多肽(美国专利申请公开号US 2011/0283420)。
(H)下调编码聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白的多核苷酸来调节程序性细胞死亡(美国专利号8,058,510)，用于增加活力。
(I)编码用于赋予抗旱性的DTP21多肽的多核苷酸(美国专利申请公开号US 2011/0277181)。
(J)编码ACC合酶3(ACS3)蛋白质的核苷酸序列，用于调节发育、调节胁迫应答和调节胁迫耐受性(美国专利申请公开号2010/0287669)。
(K)编码赋予耐旱表型(DTP)的蛋白质以赋予抗旱性的多核苷酸(WO 2012/058528)。
(L)赋予耐旱性和耐盐性的生育酚环化酶(TC)基因(美国专利申请公开号2012/0272352)。
(M)CAAX氨基末端家族蛋白质，用于胁迫耐受性(美国专利号8,338,661)。
(N)SAL1编码基因中的突变具有增加的胁迫耐受性，包括增加的抗旱性(美国专利申请公开号2010/0257633)。
(O)编码增加产量相关性状的多肽(选自由GRF多肽、RAA1样多肽、SYR多肽、ARKL多肽和YTP多肽组成的组)的核酸序列的表达(美国专利申请公开号2011/0061133)。
(P)调节植物中编码III类海藻糖磷酸酯酶(TPP)多肽的核酸的表达，用于增强植物中产量相关的性状，特别是增加种子产量(美国专利申请公开号2010/0024067)。
影响植物生长和农艺性状的其他基因和转录因子如产量，开花，植物生长和/或植物结构可以被引入或渗入植物，参见，例如，WO 1997/49811(LHY)、WO 1998/56918(ESD4)、WO 1997/10339和美国专利号6,573,430(TFL)、美国专利号6,713,663(FT)、WO 1996/14414(CON)、WO 1996/38560、WO 2001/21822(VRN1)、WO 2000/44918(VRN2)、WO 1999/49064(GI)、WO 2000/46358(FR1)、WO 1997/29123、美国专利号6,794,560、美国专利号6,307,126(GAI)、WO 1999/09174(D8和Rht)和WO 2004/076638和WO 2004/031349(转录因子)。
7.赋予增加的产量的基因
(A)由1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶多肽(ACCDP)编码核酸转化的转基因作物植物，其中在作物植物中核酸序列的表达导致与植物的野生型品种相比，植物的根生长增加和/或增加的产量，和/或对环境胁迫的耐受性增加(美国专利号8,097,769)。
(B)已显示，使用种子偏好性启动子的玉米锌指蛋白基因(Zm-ZFP1)的过表达能促进植物生长、增加每株植物的核数和总核重量(美国专利申请公开号2012/0079623)。
(C)已显示，玉米侧生器官界限(LOB)结构域蛋白(Zm-LOBDP1)的组成型过表达能增加每株植物的核数和总核重量(美国专利申请公开号2012/0079622)。
(D)通过调节植物中编码VIM1(甲基化1中的变体)样多肽或VTC2样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽或DUF1685多肽或ARF6样(生长素应答因子)多肽(WO 2012/038893)的核酸的表达来增强植物中产量相关的性状。
(E)调节植物中编码Ste20样多肽或其同系物的核酸的表达，得到相对于对照植物具有增加的产量的植物(EP 2431472)。
(F)编码用于修饰植物根系结构的核苷二磷酸酶激酶(NDK)多肽及其同系物的基因(美国专利申请公开号2009/0064373)。
8.赋予植物消化性的基因
(A)通过调节木聚糖合成酶的表达来改变存在于植物细胞壁中的木聚糖水平(美国专利号8,173,866)。
在一些实施例中，堆叠的性状可以是已经获得包括但不限于具有监管许可的事件的监管许可的性状或事件，这些监管许可是本领域技术人员熟知的并且可以在环境风险评估中心(cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database，其可以使用www前缀进行访问)和在国际农业生物技术应用服务部门(isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp，其可以使用www前缀进行访问)找到。
基因沉默
在一些实施例中，堆叠的性状可以处于一种或多种目的多核苷酸沉默的形式，导致抑制一种或多种靶标有害生物多肽。在一些实施例中，通过使用抑制DNA构建体来实现该沉默。
在一些实施例中，将编码IPD079多肽的多肽或其片段或变体的一种或多种多核苷酸可以与编码具有如上所述的杀昆虫活性或农艺性状的一种或多种多肽的一种或多种多核苷酸堆叠，并且任选地可以进一步包括提供如下文所述一种或多种靶多核苷酸的基因沉默的一种或多种多核苷酸。
“抑制DNA构建体”是重组DNA构建体，当被转化或稳定整合到植物的基因组中时，导致该植物中靶基因的“沉默”。该靶基因对于该植物可以是内源性的或转基因的。本文中关于靶基因使用的“沉默”通常是指抑制由该靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平，和/或酶活性或蛋白质功能性的水平。术语“抑制”包括调低、降低、下降、减少、抑制、消除和预防。“沉默”或“基因沉默”并没有指定机制，并且包括但不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi的方法和基于小RNA的方法。
抑制DNA构建体可以包含衍生自目的靶基因的区域，并且可以包含目的靶基因的正义链(或反义链)的全部或部分核酸序列。取决于将要使用的方法，该区域可以与目的基因的全部或部分正义链(或反义链)100％相同或小于100％相同(例如，至少50％或者51％和100％相同之间的任何整数)。
抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选择了目的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体、以及(更普遍地)RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体(如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微小RNA)构建体)。
“反义抑制”是指能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物的产生。
“反义RNA”是指与靶标初级转录物或mRNA的全部或部分互补、并且阻断靶标分离的核酸片段表达的RNA转录物(美国专利号5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5'非编码序列、3'非编码序列、内含子或编码序列互补。
“共抑制”是指能够抑制靶蛋白表达的正义RNA转录物的产生。“正义”RNA是指包括mRNA并且可在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已通过着眼于以正义方向过表达与天然mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见，Vaucheret等人，(1998)，Plant J.[植物杂志]，16:651-659和Gura，(2000)，Nature[自然]，404:804-808)。
另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(PCT公开WO 1998/36083)。
最近的工作已经描述了并入互补方向上的全部或部分mRNA编码序列的“发夹”结构的用途，该“发夹”结构产生了已表达的RNA的潜在“茎-环”结构(PCT公开WO 1999/53050)。在这种情况下，该茎由对应于相对于启动子在正义或反义方向上插入的目的基因的多核苷酸形成，并且该环由目的基因的一些多核苷酸形成，这些多核苷酸在该构建体中不具有互补序列。这增加了已回收的转基因植物中共抑制或沉默的频率。对于发夹抑制的综述，参见Wesley等人，(2003)Methods in Molecular Biology,Plant FunctionalGenomics:Methods and Protocols[分子生物学中的方法，植物功能基因组：方法和方案]236:273-286。
具有由来自待抑制的基因的至少30个核苷酸形成的茎和由随机核苷酸序列形成环的构建体也已被有效地用于抑制(PCT公开WO 1999/61632)。
已经描述了使用聚-T和聚-A序列产生茎环结构中的茎(PCT公开WO 2002/00894)。
然而另一种变型包括使用合成的重复序列来促进茎环结构中的茎的形成。已经证实，用这样的重组DNA片段制备的转基因生物体具有降低水平的由形成环的核苷酸片段编码的蛋白，如PCT公开WO 2002/00904中所述。
RNA干扰是指由短干扰性RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，(1998)，自然，391:806)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中又称为压制(quelling)。转录后基因沉默的过程被认为是进化上保守的细胞防御机制，用于预防外源基因的表达，并且通常为不同的区系(flora)和门(phyla)所共享(Fire等人，(1999)Trends Genet.[遗传学趋势]15:358)。这种防止外源基因表达的保护可能已经响应于双链RNA(dsRNA)的产生而演变，这些双链RNA源自病毒侵染或源自通过细胞应答将转座子元件随机整合到宿主基因组中，该细胞应答特异性地破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA。dsRNA在细胞中的存在通过尚未完全表征的机制来触发RNAi应答。
细胞中长dsRNA的存在刺激被称为切丁酶(dicer)的核糖核酸酶III酶的活性。切丁酶参与将dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的dsRNA短片(Berstein等人，(2001)Nature[自然]409:363)。衍生自切丁酶活性的短干扰RNA的长度通常为约21至约23个核苷酸并且包含约19个碱基对双链体(Elbashir等人，(2001)Genes Dev.[基因与发展]15:188)。切丁酶也已经涉及从涉及翻译控制的保守结构的前体RNA中切除21-和22-核苷酸时序小RNA(stRNA)(Hutvagner等人，(2001)Science[科学]293:834)。RNAi应答也是内切核酸酶复合物的特点，该内切核酸酶复合物通常被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其介导与siRNA双链体的反义链具有序列互补性的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中间(Elbashir等人，(2001)Genes Dev.[基因与发展]15:188)。此外，RNA干扰还可以涉及小RNA(例如miRNA)介导的基因沉默，推测是通过调节染色质结构的细胞机制，并且从而防止靶基因序列的转录(参见例如，Allshire，(2002)Science[科学]297:1818-1819；Volpe等人，(2002)Science[科学]297:1833-1837；Jenuwein，(2002)Science[科学]297:2215-2218以及Hall等人，(2002)Science[科学]297:2232-2237)。因此，本公开的miRNA分子可用于经由与RNA转录物的相互作用或者通过与特定基因序列的相互作用来介导基因沉默，其中这种相互作用导致转录或转录后水平的基因沉默。
进一步提供了允许产生自沉默元件的RNAi增加的方法和组合物。在这类实施例中，这些方法和组合物采用第一多核苷酸，其包含有效地连接于在植物细胞中有活性的启动子的靶标有害生物序列的沉默元件；以及第二多核苷酸，其包含抑制增强子元件，该抑制增强子元件包含靶标有害生物序列或者与在植物细胞中有活性的启动子有效地连接的活性变体或其片段。具有抑制增强子元件的沉默元件的组合表达导致从该沉默元件产生的抑制性RNA的扩增增加超过了仅单独通过该沉默元件的表达可实现的增加程度。除了特异性RNAi物种本身的扩增增加之外，这些方法和组合物进一步允许产生可以增强破坏靶基因表达的有效性的多种RNAi物种群体。正如，当抑制增强子元件在植物细胞中与沉默元件组合表达时，这些方法和组合物可以允许在整个植物内系统地产生RNAi；生产比仅单独用沉默元件构建体所能观察到的更大量的RNAi；以及更多的RNAi加载入植物韧皮部中，从而通过RNAi方法更好地防治取食韧皮部的昆虫。因此，各种方法和组合物提供了将抑制性RNA递送至靶生物体的改进方法。参见，例如，美国专利申请公开2009/0188008。
如本文所使用的，“抑制增强子元件”包含如下多核苷酸，该多核苷酸包含待抑制的靶序列或者其活性片段或变体。应当认识到，抑制增强子元件不需要与靶序列相同，但是该抑制增强子元件可以包含该靶序列的变体，只要该抑制增强子元件与靶序列具有足够的序列同一性，以允许由该沉默元件产生的RNAi的水平增加超过仅通过该沉默元件的表达可达到的增加程度。类似地，该抑制增强子元件可以包含该靶序列的片段，其中该片段具有足够的长度以允许由该沉默元件产生的RNAi的水平增加超过仅通过该沉默元件表达可实现的增加程度。
应当认识到，可以使用来自相同靶序列或来自不同靶序列或者来自相同靶序列的不同区域的多种抑制增强子元件。例如，所使用的抑制增强子元件可以包含衍生自靶序列的不同区域(即来自3'UTR、编码序列、内含子和/或5'UTR)的靶序列片段。此外，如本文别处所述，该抑制增强子元件可以包含在表达盒中，并且在具体实施例中，该抑制增强子元件在与该沉默元件相同或不同的DNA载体或构建体上。该抑制增强子元件可以有效地连接到如本文公开的启动子上。应当意识到，可以组成型或替代地表达抑制增强子元件，或可任选地，它可以以阶段特异性方式使用在此别处讨论的各种可诱导或组织优先的或发育调节的启动子产生。
在具体实施例中，使用沉默元件和抑制增强子元件两者时，RNAi的系统性产生发生在整个植物中。在另外的实施例中，本公开的植物或植物部分具有比用单独的沉默元件构建体的表达所能观察到的更多的RNAi加载入植物韧皮部中，并且从而通过RNAi方法更好地防治取食韧皮部的昆虫。在具体实施例中，本公开的植物、植物部分和植物细胞可以进一步被表征为允许产生可以增强破坏靶基因表达的有效性的RNAi物种的多样性。
在具体实施例中，沉默元件和抑制增强子元件的组合表达使植物细胞、植物、植物部分、植物组织或韧皮部中抑制性RNA的浓度增加超过单独表达该沉默元件时所能达到的增加水平。
如本文所使用的，当与适当的对照植物相比时，“抑制性RNA的水平增加”包括在具有该组合表达的植物中产生的RNAi水平的任何统计学上显著的增加。例如，当与适当的对照相比时，植物、植物部分或植物细胞中RNAi水平的增加可以包含植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中RNAi水平的至少约1％、约1％-5％、约5％-10％、约10％-20％、约20％-30％、约30％-40％、约40％-50％、约50％-60％、约60％-70％、约70％-80％、约80％-90％、约90％-100％或更高的增加。在其他实施例中，当与适当的对照相比时，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中RNAi水平的增加可以包含植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中RNAi水平的至少约1倍、约1倍-5倍、约5倍-10倍、约10倍-20倍、约20倍-30倍、约30倍-40倍、约40倍-50倍、约50倍-60倍、约60倍-70倍、约70倍-80倍、约80倍-90倍、约90倍-100倍或更多倍的增加。用于控制蝽象和草盲蝽的沉默元件与抑制增强子元件的组合表达的实例可以在美国专利申请公开2011/0301223和美国专利申请公开2009/0192117中找到。
一些实施例涉及通过干扰核糖核酸(RNA)分子下调昆虫有害生物物种中靶基因的表达。PCT公开WO 2007/074405描述了抑制包括科罗拉多马铃薯甲虫在内的无脊椎动物有害生物中靶标基因表达的方法。PCT公开WO 2005/110068描述了抑制无脊椎动物有害生物(特别是包括西方玉米根虫)中靶标基因表达的方法，该方法作为防治昆虫侵染的手段。此外，PCT公开WO 2009/091864描述了用于抑制来自昆虫有害生物物种(包括来自草盲蝽属的有害生物)的靶标基因的组合物和方法。核酸分子包括用于靶向液泡ATP酶H亚基的RNAi，可用于控制如美国专利申请公开号2012/0198586中所述的鞘翅目有害生物群体和侵染。PCT公开WO 2012/055982描述了抑制或下调如下靶标基因的表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)，该靶标基因编码：昆虫核糖体蛋白，如核糖体蛋白L19、核糖体蛋白L40或核糖体蛋白S27A；昆虫蛋白酶体亚基，如Rpn6蛋白，Pros 25，Rpn2蛋白，蛋白酶体β1亚基蛋白或Prosβ2蛋白；COPI囊泡的昆虫β-外被体，COPI囊泡的γ-外被体，COPI囊泡的β'-外被体蛋白或ζ-外被体；昆虫四跨膜蛋白2A蛋白，其是假定跨膜结构域蛋白；属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白，如肌动蛋白5C；昆虫泛素-5E蛋白；昆虫Sec23蛋白，其是参与细胞内蛋白质转运的GTP酶活化剂；涉及运动活性的作为非常规肌球蛋白的昆虫皱纹蛋白质；涉及核替代mRNA剪接调节的昆虫曲颈蛋白；昆虫液泡H+-ATP酶G亚基蛋白和昆虫Tbp-1如Tat结合蛋白。美国专利申请公开2012/029750，US 20120297501、和2012/0322660描述了干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其在昆虫有害生物物种摄取时起作用以下调所述昆虫有害生物中靶基因的表达，其中该RNA包含至少一个沉默元件，其中该沉默元件是包含退火的互补链的双链RNA的区域，该双链RNA中的一条链包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列或由其组成。美国专利申请公开2012/0164205描述了用于干扰双链核糖核酸(用于抑制无脊椎动物有害生物)的潜在靶标，包括：Chd3同源序列、β-微管蛋白同源序列、40kDa V-ATP酶同源序列、EF1α同源序列、26S蛋白质体亚基p28同源序列、保幼激素环氧化物酶水解酶同源序列、溶胀依赖氯通道蛋白同源序列、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白同源序列、Act42A蛋白同源序列、ADP-核糖因子1同源序列、转录因子IIB蛋白同源序列、几丁质酶同源序列、泛素缀合酶同源序列、甘油醛-3-磷酸脱氢酶同源序列、泛素B同源序列、保幼激素酯酶同系物、和α微管蛋白同源序列。
在有害生物控制方面的用途
在有害生物控制或使其他生物体工程化中使用包含实施例的核酸序列或其变体的菌株作为杀有害生物剂的一般方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,039,523和EP 0480762 A2。
可以选择已知占据一种或多种目的作物的“植物圈”(叶面、叶际、根际和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在具体环境中成功地与野生型微生物竞争，为表达IPD079多肽的基因供给稳定的维持和表达，并且理想的是，增加对该杀有害生物剂的保护使其不受环境降解和失活的影响。
可替代地，通过将异源基因引入细胞宿主中来产生IPD079多肽。异源基因的表达直接或间接地导致杀有害生物剂在细胞内产生和维持。然后当将该细胞应用于一种或多种靶标有害生物的环境中时，在延长该细胞中所产生的毒素的活性的条件下处理这些细胞。所得产物保留该毒素的毒性。然后可以根据常规技术配制这些天然包封的IPD079多肽，以施用于靶标有害生物所寄宿的环境(例如，土壤、水和植物的叶子)中。参见，例如EPA0192319及其中引用的参考文献。
杀有害生物组合物
在一些实施例中，植物来源的穿孔素能以组合物的形式施用并且可以与其他化合物同时或相继施用于需要处理的作物区域或植物。这些化合物可以是在单次施用该配制品后允许长期对目标区域进行给予的肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、杀有害生物肥皂、休眠油、聚合物和/或延时释放的或可生物降解的载体配制品。它们还可以是选择性除草剂、化学杀昆虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀有害生物剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制剂中的若干种的混合物，如果希望的话，与在配制品领域内通常使用的其他农业上可接受的载体、表面活性剂或促进施用的佐剂一起。合适的载体和佐剂可以是固体或液体，并且相应于在配制技术中常常采用的物质，例如天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。同样地，可将这些配制品制备成可食用的“诱饵”或塑造成有害生物“陷阱”以允许由靶有害生物来摄食或摄取该杀有害生物配制品。
施用含有由细菌菌株产生的本公开的植物来源的穿孔素(包括但不限于IPD079多肽)中的至少一种的活性成分或农用化学组合物的方法包括叶子施用、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用速度取决于相应有害生物侵染的强度。
可以将组合物配制成粉末、尘剂、丸剂、颗粒、喷雾、乳液、胶体、溶液等，并且可以通过干燥、冻干、匀浆、萃取、过滤、离心、沉降或浓缩包含该多肽的细胞培养物等常规方法进行制备。在所有这类含有至少一种这样的杀有害生物多肽的组合物中，该多肽可以以按重量计从约1％至约99％的浓度存在。关于按重量计％，“约”意指±0.5％。
可以通过本公开的方法在给定区域中杀灭鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目或鞘翅目有害生物或减少其数量，或者可以预防性地将其施用于环境区域以防止易感有害生物的侵染。优选地，该有害生物摄入杀有害生物有效量的多肽或与其接触。本文所使用的“杀有害生物有效量”是指能够对至少一种有害生物造成死亡或显著减少有害生物生长、取食或正常生理发育的有害生物的量。该量将根据例如待防治的具体靶标有害生物，待处理的特定环境、地点、植物、作物或农业场所，环境条件以及杀有害生物有效的多肽组合物施用的方法、速率、浓度、稳定性和数量等因素而变化。配制品也可以根据气候条件、环境因素和/或施用频率和/或有害生物侵染的严重程度而变化。
可以通过用所需的农业上可接受的载体配制细菌细胞、晶体和/或孢子悬浮液或分离的蛋白质组分来制备所需的杀有害生物剂组合物。可以在施用之前以适当方式(如冻干、冷冻干燥、干燥)或者在水性载体、培养基或合适的稀释剂(例如盐水或其他缓冲液)中配制这些组合物。配制的组合物可以是尘剂或颗粒状物质的形式或者在油(植物或矿物)或水或油/水乳液中的悬浮液或者作为可湿性粉剂或者与适用于农业应用的任何其他载体材料组合的形式。合适的农业载体可以是固体或液体，并且是本领域公知的。术语“农业上可接受的载体”涵盖通常用于杀有害生物剂配制品技术的所有佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些是杀有害生物剂配制品技术人员所熟知的。配制品可以与一种或多种固体或液体佐剂混合，并通过各种方法(例如通过使用常规配制品技术将杀有害生物组合物与合适的佐剂均匀混合、共混和/或研磨)制备。美国专利号6,468,523中描述了合适的配制品和施用方法，其通过引用并入本文。还可以用一种或多种化学组合物处理种子或植物，该化学组合物包括一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂。示例性化学组合物包括：果实/蔬菜除草剂：莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草铵膦、氯吡嘧磺隆Gowan、百草枯、戊炔草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、茚嗪氟草胺(Indaziflam)；果实/蔬菜杀昆虫剂：涕灭威、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuriengiensis)、甲萘威、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、二嗪磷、马拉硫磷、阿维菌素、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、λ-氯氟氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、双苯氟脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、唑虫酰胺、噻虫胺、螺螨酯、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、氯虫酰胺、氰虫酰胺、Spinoteram、杀虫脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氯虫双酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、Cyanopyrafen、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、Spinotoram、硫双威、氟啶虫酰胺、甲硫威、因灭汀-苯甲酸盐、茚虫威、噻唑磷、苯线磷、硫线磷、蚊蝇醚、苯丁锡、噻螨酮、灭多威、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮；果实/蔬菜杀真菌剂：多菌灵、百菌清、EBDC、硫、甲基硫菌灵、嘧菌酯、霜脲氰、氟啶胺、乙膦酸、异菌脲、醚菌酯、甲霜灵/精甲霜灵、肟菌酯、噻唑菌胺、丙森锌、肟菌酯、环酰菌胺、富马酸噁咪唑、氰霜唑、咪唑菌酮、苯酰菌胺、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、环氟菌胺、啶酰菌胺；谷物除草剂：异丙隆、溴苯腈、碘苯腈、苯氧基类、氯磺隆、炔草酸、禾草灵、吡氟草胺、噁唑禾草灵、双氟磺草胺、氟草烟、甲磺隆、醚苯磺隆、氟酮磺隆、碘磺隆、丙苯磺隆、氟吡酰草胺、甲磺胺磺隆、氟丁酰草胺、唑啉草酯、酰嘧磺隆、噻吩磺隆甲基、苯磺隆、氟啶嘧磺隆、磺酰磺隆、磺酰草吡唑、甲氧磺草胺、氟噻草胺、肟草酮、吡咯磺隆；谷物杀真菌剂：多菌灵、百菌清、嘧菌酯、环唑醇、嘧菌环胺、丁苯吗啉、氟环唑、醚菌酯、喹氧灵、戊唑醇、肟菌酯、硅氟唑、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌胺、丙硫菌唑、氟嘧菌酯；谷物杀昆虫剂：乐果、λ-氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、α-氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、Clorphyriphos、甲胺磷、乙酰甲胺磷、抗蚜威、甲硫威；玉米除草剂：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S-)二甲酚草胺、草铵膦、草甘膦、异噁唑草酮、(S-)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、苯吡唑草酮、环磺酮(Tembotrione)、嘧啶肟草醚、酮脲磺草吩酯、氟噻草胺、吡咯磺隆；玉米 杀昆虫剂：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、λ-氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、螺甲螨酯、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、杀虫隆、七氟菊酯、嘧丙磷、乙虫腈、氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素、甲硫威、螺螨酯、螺虫乙酯；玉米杀真菌剂：种衣酯、福美双、丙硫菌唑、戊唑醇、肟菌酯；稻除草剂：丁草胺、敌稗、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草酯、杀草隆、四唑酰草胺、唑吡嘧磺隆、苯噻草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、禾草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、去稗安、苯并双环酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚、丙炔噁草酮、乙氧嘧磺隆、丙草胺、甲基磺草酮、特呋三酮、噁草酮、噁唑禾草灵、吡丙醚；稻 杀昆虫剂：二嗪磷、杀螟硫磷、仲丁威、久效磷、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、噻虫胺、乙虫腈、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氯氰菊酯、毒死蜱、杀螟丹、甲胺磷、醚菊酯、三唑磷、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、克百威、丙硫克百威；稻杀真菌剂：甲基硫菌灵、嘧菌酯、环丙酰菌胺、敌瘟磷、嘧菌腙、异稻瘟净、稻瘟灵、戊菌隆、噻菌灵、咯喹酮、三环唑、肟菌酯、双氯氰菌胺、氰菌胺、硅氟唑、噻酰菌胺；棉花除草剂：敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、吡氟禾草灵-丁基、草甘膦、达草灭、二甲戊乐灵、嘧硫草醚钠、三氟啶磺隆、得杀草、草铵膦、丙炔氟草胺、塞苯隆；棉花杀昆虫剂：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、马拉硫磷、久效磷、阿维菌素、啶虫脒、因灭汀-苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威、λ-氯氟氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氯虫双酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、γ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、氟啶虫胺腈、丙溴磷、三唑磷、硫丹；棉花杀真菌剂：土菌灵、甲霜灵、喹硫磷；大豆除草剂：甲草胺、灭草松、氟乐灵、氯嘧磺隆-乙基、氯酯磺草胺、噁唑禾草灵、氟磺胺草醚、吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊乐灵、得杀草、草铵膦；大豆 杀昆虫剂：λ-氯氟氰菊酯、灭多威、对硫磷、硫威(Thiocarb)、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀虫脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂：嘧菌酯、环唑醇、氟环唑、粉唑醇、吡唑醚菌酯、戊唑醇、肟菌酯、丙硫菌唑、四氟醚唑；甜菜除草剂：杀草敏、甜菜安、乙氧氟草黄、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、氟胺磺隆、得杀草、喹禾灵；甜菜杀 昆虫剂：吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ/λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基))甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、氰虫酰胺、氟虫腈、克百威；卡诺拉除草剂：二氯吡啶酸、禾草灵、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐灵、胺苯磺隆、喹草酸、喹禾灵、烯草酮、得杀草；卡诺拉杀真菌 剂：嘧菌酯、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、丙氯灵、烯菌酮；卡诺拉杀昆虫剂：克百威、有机磷酸盐类、拟除虫菊酯、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ以及λ氯氟氰菊酯、τ-氟氰胺菊酯、乙虫腈、多杀菌素、Spinotoram、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。
在一些实施例中，除草剂是莠去津、除草定、敌草隆、氯磺隆、甲磺隆、噻吩磺隆甲基、苯磺隆、乙草胺、麦草畏、异噁唑草酮、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆、嘧硫草醚钠、丙炔氟草胺、氯嘧磺隆-乙基、嗪草酮、喹禾灵、精-异丙甲草胺、环己通(Hexazinne)或其组合。
在一些实施例中，杀昆虫剂是高氰戊菊酯、氯虫苯甲酰胺、灭多威、茚虫威、草氨酰或其组合。
杀有害生物和杀昆虫活性
“有害生物”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。昆虫有害生物包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等，特别是鳞翅目和鞘翅目。
本领域的技术人员会知道，不是所有的化合物均对所有有害生物同样有效。实施例的化合物显示针对昆虫有害生物的活性，其可以包括经济上重要的农艺学、森林、温室、苗圃观赏植物、食物和纤维，公共和动物健康，国内和商业结构，家庭和储存产品有害生物。
鳞翅目幼虫包括但不限于：夜蛾科(Noctuidae)中的夜蛾、地老虎、尺蠖和实夜蛾亚科，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda JE Smith)(秋夜蛾(fall armyworm))；甜菜夜蛾(S.exigua Hübner)(甜菜夜蛾(beet armyworm))；斜纹夜蛾(S.litura Fabricius)(斜纹夜蛾(tobacco cutworm)，茶蚕(cluster caterpillar))；蓓带夜蛾(Mamestraconfigurata Walker)(披肩粘虫(bertha armyworm))；甘蓝夜蛾(M.brassicae Linnaeus)(菜夜蛾(cabbage moth))；小地老虎(Agrotis ipsilon Hufnagel)(黑切根虫(blackcutworm))；西方灰地老虎(A.orthogonia Morrison)(西部切根虫(western cutworm))；粒肤地老虎(A.subterranea Fabricius)(粒肤切根虫(granulate cutworm))；棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea Hübner)(棉叶虫(cotton leaf worm))；粉纹夜蛾(TrichoplusianiHübner)(甘蓝银纹夜蛾(cabbage looper))；大豆尺夜蛾(大豆夜蛾)；梨豆夜蛾(黎豆夜蛾)；粗长须夜蛾(Hypena scabra Fabricius)(苜猜绿夜蛾(green cloverworm))；烟芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius)(烟青虫(tobacco budworm))；一星黏虫(Pseudaletia unipuncta Haworth)(夜蛾)；粗皮委夜蛾(Athetis mindara Barnes andMcdunnough)(粗皮切根虫(rough skinned cutworm))；暗缘地老虎(Euxoa messoriaHarris)(暗黑切根虫(darksided cutworm))；棉斑实蛾(Earias insulana Boisduval)(多刺螟蛉(spiny bollworm))；翠纹钻夜蛾(E.vittella Fabricius)(斑点螟蛉(spottedbollworm))；棉铃虫(Helicoverpa armigera Hübner)(美洲螟蛉(American bollworm))；玉米穗虫(玉米穗蛾(corn earworm)或棉螟蛉(cotton bollworm))；斑马纹夜蛾(Melanchra picta Harris)(斑马纹夜蛾(zebra caterpillar))；柑橘夜蛾(Egira(Xylomyges)curialis Grote)(柑橘地老虎(citrus cutworm))；来自螟蛾科欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis Hübner，European corn borer)的螟虫、鞘蛾、结网虫、锥形虫(coneworms)、和雕叶虫(skeletonizers)；脐橙螟蛾(Amyelois transitella Walker)(脐橙螟(naval orangeworm))；地中海粉螟(Anagasta kuehniella Zeller)(地中海粉斑螟(Mediterranean flour moth))；干果斑螟(Cadra cautella Walker)(粉斑螟(almondmoth))；二化螟(Chilo suppressalis Walker)(稻螟虫(rice stem borer))；斑禾草螟(C.partellus)，(高粱螟(sorghum borer))；米螟(Corcyra cephalonica Stainton)(米蛾(rice moth))；玉米根草螟(Crambus caliginosellus Clemens)(玉米根网虫(corn rootwebworm))；早熟禾草螟(C.teterrellus Zincken)(早熟禾草螟(bluegrass webworm))；稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenée)(稻纵卷叶螟(rice leaf roller))葡萄里予螟(Desmia funeralis Hübner)(葡萄野螟(grape leaffolder))；甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus)(甜瓜野螟(melon worm))；黄瓜绢野螟(D.nitidalisStoll)(泡菜虫(pickleworm))；巨座玉米螟(Diatraea grandiosella Dyar)(西南玉米秆草螟(southwestern corn borer))、蔗螟(D.saccharalis Fabricius)(甘蔗螟虫(surgarcane borer))；墨西哥稻螟(Eoreuma loftini Dyar)(墨西哥稻螟(Mexican riceborer))；烟草粉斑螟(Ephestia elutella Hübner)(烟草飞蛾(tobacco(cacao)moth))；大蜡螟(Galleria mellonella Linnaeus)(大蜡蛾(greater wax moth))；稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis Walker)(草地螟(sod webworm))；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum Hulst)(向日葵螟(sunflower moth))；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus Zeller)(小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer))；小蜡螟(Achroia grisella Fabricius)(小蜡蛾(lesser wax moth))；草地螟(Loxostegesticticalis Linnaeus)(草地螟(beet webworm))；茶树螟(Orthaga thyrisalis Walker)(茶树蛾(tea tree web moth))；豆荚野螟(Maruca testulalis Geyer)(豆荚蛀螟(beanpod borer))；印度谷螟(Plodia interpunctella Hübner)(印度谷螟(Indian mealmoth))；三化螟(Scirpophaga incertulas Walker)(三化螟(yellow stem borer))；温室螟(Udea rubigalis Guenée)(芹菜卷叶螟(celery leaftier))；和卷蛾科(Tortricidae)中的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫，西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloveranaWalsingham)(西部黑头蚜虫(Western blackheadedbudworm))；东部黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald)(东部黑头蚜虫(Eastern blackheaded budworm))；果树黄卷蛾(Archips argyrospila Walker)(果树卷叶蛾(fruit tree leaf roller))；罗萨娜黄卷蛾(A.rosana Linnaeus)(欧洲卷叶蛾(European leaf roller))；和其他黄卷蛾属物种，苹小卷叶蛾(Adoxophyes orana Fischer von
Figure BDA0003795187100001391
)(苹果小卷蛾(summer fruittortrix moth))；条纹向日葵螟(Cochylis hospes Walsingham)(带状向日葵斑蛾(bandedsunflower moth))；榛小卷蛾(Cydia latiferreana Walsingham)(filbertworm)；苹果蠹蛾(C.pomonella Linnaeus)(苹果蚕蛾(codling moth))；杂色卷叶蛾(Platynotaflavedana Clemens)(色稻纵卷叶螟(variegated leafroller))；荷兰石竹小卷蛾(P.stultana Walsingham)(杂食卷叶蛾(omnivorous leafroller))；鲜食葡萄小卷蛾(Lobesia botrana Denis&Schiffermüller)(欧洲葡萄蛾(European grape vine moth))；苹白小卷蛾(Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller)(苹果芽小卷叶蛾(eyespottedbud moth))；萄果实虫主虫(Endopiza viteana Clemens)(葡萄小卷叶蛾(grape berrymoth))；女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella Hübner)(葡萄果蠹蛾(vine moth))；巴西苹果卷叶虫(Bonagota salubricola Meyrick)(巴西苹果小卷叶蛾(Brazilian appleleafroller))；东方果实蛾(Grapholita molesta Busck)(梨小食心虫(oriental fruitmoth))；向日葵芽蛾(Suleima helianthana Riley)(向日葵芽蛾(sunflower bud moth))。带卷蛾属物种；卷叶蛾属物种。
鳞翅目中选择的其他农艺学有害生物包括但不限于秋星尺蠖(Alsophilapometaria Harris)(秋星尺蠖(fall cankerworm))；桃条麦蛾(Anarsia lineatellaZeller)(桃条麦蛾(peach twig borer))；栎橙纹犀额蛾(Anisota senatoria J.E.Smith)(橙色斑纹橡木虫(orange striped oakworm))；柞蚕(Antheraea pernyi Guérin-Méneville)(中橡木柞蚕虫(Chinese Oak Tussah Moth))；家蚕(Bombyx mori Linnaeus)(桑蚕(Silkworm))；棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella Busck)(棉叶潜蛾(cotton leafperforator))；纹黄豆粉蝶(Colias eurytheme Boisduval)(苜蓿粉蝶(alfalfacaterpillar))；核桃舟蛾(Datana integerrima Grote&Robinson)(核桃天社蛾(walnutcaterpillar))；落叶松毛虫(Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov)(西伯利亚蚕蛾(Siberian silk moth))，白尺蠖蛾(Ennomos subsignaria Hübner)(榆角尺蠖(elmspanworm))；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris)(椴尺蠖(linden looper))；黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus)(棕尾毒蛾(browntail moth))；黑拟蛉蛾(Harrisina americana Guérin-Méneville)(野棉花夜蛾(grapeleaf skeletonizer))；牧草天蚕蛾(Hemileuca oliviae Cockrell)(牧草天蚕蛾(range caterpillar))；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury)(美国白蛾(fall webworm))；番茄茎麦蛾(Keiferialycopersicella Walsingham)(番茄蛲虫(tomato pinworm))；东部铁杉尺蠖(Lambdinafiscellaria fiscellaria Hulst)(东部铁杉尺蠖(Eastern hemlock looper))；西部铁杉尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)(西部铁杉尺蠖(Western hemlock looper))；柳毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)(雪毒蛾(satin moth))；舞毒蛾(Lymantria disparLinnaeus)(舞毒蛾(gypsy moth))；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata Haworth，fivespotted hawk moth，tomato hornworm)；烟草天蛾(M.sexta Haworth)(番茄天蛾(tomatohornworm)，烟草天蛾(tobacco hornworm))；冬尺蠖蛾(Operophtera brumata Linnaeus)(冬尺蠖蛾(winter moth))；春尺蠖(Paleacrita vernata Peck)(春尺蠖(springcankerworm))；美洲大芷凤蝶(Papilio cresphontes Cramer)(大黄带凤蝶(giantswallowtail)，柑桔凤蝶(orange dog))；加州木角斗蛾(Phryganidia californicaPackard)(加州槲蛾(California oakworm))；柑桔潜蛾(Phyllocnistis citrellaStainton)(柑桔潜叶蛾(citrus leafminer))；斑幕潜叶蛾(Phyllonorycterblancardella Fabricius)(斑幕潜叶虫(spotted tentiform leafminer))；欧洲粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)(大白粉蝶(large white butterfly))；菜青虫(P.rapaeLinnaeus)(小白粉蝶(small white butterfly))；暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus)(绿脉菜粉蝶(green veined white butterfly))；洋蓟葱羽蛾(Platyptilia carduidactylaRiley)(洋蓟羽蛾(artichoke plume moth))；小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus)(小菜蛾(diamondback moth))；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella Saunders)(粉螟蛉(pink bollworm))；多形云粉蝶(Pontia protodice Boisduval and Leconte)(南方菜青虫(Southern cabbageworm))；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata Guenée)(杂食尺蠖(omnivorous looper))；红抚天社蛾(Schizura concinna J.E.Smith)(红疣天社蛾(redhumped caterpillar))；麦蛾(Sitotroga cerealella Olivier)(麦蛾(Angoumois grainmoth))；松异带蛾(Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller)(松树列队毛虫(pineprocessionary caterpillar))；幕谷蛾(Tineola bisselliella Hummel)(负袋夜蛾(webbing clothesmoth))；番茄斑潜蝇(Tuta absoluta Meyrick)(番茄斑潜蝇(tomatoleafminer))；苹果巢蛾(Yponomeuta padella Linnaeus)(巢蛾(ermine moth))；Heliothis subflexa Guenée；天幕毛虫属(Malacosoma)物种和古毒蛾属(Orgyia)物种目的是鞘翅目的幼虫和成体，其包括来自长角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫(包括但不限于：墨西哥棉铃象(Anthonomus grandisBoheman)(棉铃象甲(boll weevil))；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel)(稻水象虫(rice water weevil))；谷象(Sitophilus granarius Linnaeus)(谷象(granary weevil))；米象(S.oryzae Linnaeus)(米象(rice weevil))；三叶草叶象(Hypera punctata Fabricius)(车轴草叶象虫(clover leaf weevil))；密点细枝象(Cylindrocopturus adspersus LeConte)(向日葵茎象鼻虫(sunflower stem weevil))；黄褐小爪象(Smicronyx fulvus LeConte)(红葵花籽象甲(red sunflower seedweevil))；灰色小爪象(S.sordidus LeConte)(灰葵花籽象甲(gray sunflower seedweevil))；玉米隐啄象(Sphenophorus maidis Chittenden)(玉米象虫(maizebillbug)))；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫(包括但不限于：马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata Say)(马铃薯甲虫(Coloradopotato beetle))；玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)(西方玉米根虫)；北方玉米根虫(D.barberi Smith and Lawrence)(北方玉米根虫(northern cornrootworm))；黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi Barber)(南方玉米根虫(southern corn rootworm))；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria Melsheimer)(玉米跳甲(corn flea beetle))；十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze)(十字花科蔬菜跳甲(Crucifer flea beetle))；黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)(黄曲条跳甲(stripped flea beetle))；肖叶甲褐斑(Colaspis brunnea Fabricius)(葡萄肖叶甲(grape colaspis))；橙足负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)(谷叶甲虫(cereal leafbeetle))；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius)(向日葵叶甲(sunflowerbeetle)))；来自瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachnavarivestis Mulsant)(墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle)))；金龟子和来自金龟子科(Scarabaeidae)的其他甲虫(包括但不限于：日本丽金龟(Popillia japonica Newman)(日本金龟子(Japanese beetle))；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis Arrow)(北方独角仙(northern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；南方圆头犀金龟(C.immaculataOlivier)(南方独角仙(southern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogus majalis Razoumowsky)(欧洲金龟子(European chafer))；长毛食叶然金龟(Phyllophaga crinita Burmeister)(白蛴螬(white grub))；胡萝卜金龟(Ligyrusgibbosus De Geer)(胡萝卜金龟(carrot beetle)))；来自皮蠹科的皮蠹；来自叩甲科，伪金针虫属物种，梳爪叩头虫属物种的金针虫；宽胸叩头虫属物种；Limonius属物种；缺隆叩甲属物种；Ctenicera属物种；Aeolus属物种；来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫和来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫。
目的是双翅目的成虫和未成熟的虫，包括潜叶虫玉米斑潜蝇(Agromyzaparvicornis Loew)(玉米斑潜蝇(corn blotch leafminer))；摇蚊科(包括但不限于：高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola Coquillett)(高梁瘿蚊(sorghum midge))；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor Say)(黑森蝇(Hessian fly))；麦红吸浆虫(Sitodiplosismosellana Géhin)(小麦吸浆虫(wheat midge))；葵花籽蚊(Neolasiopteramurtfeldtiana Felt)，(向日葵籽瘿蚊(sunflower seed midge)))；果蝇(实蝇科(Tephritidae))、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit Linnaeus)(果蝇(frit flies))；蛆虫(包括但不限于：灰地种蝇(Delia platura Meigen)(种蝇(seedcorn maggot))；麦地种蝇(D.coarctata Fallen)(麦种蝇(wheat bulb fly))和其他地种蝇属，美洲麦秆蝇(Meromyza americana Fitch)(美洲麦秆蝇(wheat stem maggot))；家蝇(Muscadomestica Linnaeus)(家蝇(house flies))；夏厕蝇(Fannia canicularis Linnaeus)、小舍蝇(F.femoralis Stein)(小家蝇(lesser houseflies))；厩螫蝇(Stomoxys calcitransLinnaeus)(螫蝇(stable flies))；秋家蝇，角蝇，绿头苍蝇，金蝇属；蝇属物种和其他麝香蝇(muscoid fly)有害生物、马蝇虻属(Tabanus)物种；肤蝇胃蝇属(Gastrophilus)物种；狂蝇属(Oestrus)物种；纹皮蝇皮蝇属(Hypoderma)物种；鹿蝇斑虻属(Chrysops)物种；绵羊虱蝇(Melophagus ovinus Linnaeus)(绵羊蜱)和其他短角亚目，蚊子伊蚊属(Aedes)物种；疟蚊属(Anopheles)物种；家蚊属(Culex)物种；黑蝇原蚋属(Prosimulium)物种；蚋属(Simulium)物种；吸血蠓、沙蝇、眼菌蚊(sciarid)和其他长角亚目(Nematocera)。
作为目的昆虫包括了半翅目和同翅目的成体和若虫，如但不限于：来自球蚜科(Adelgidae)的球蚜、来自盲蝽科(Miridae)的盲蝽、来自蝉科(Cicadidae)的蝉、叶蝉、小绿叶蝉属(Empoasca)物种；来自叶蝉科的，来自菱蜡蝉科(Cixiidae)、青翅飞虱科(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、瓢蜡蝉科(Issidae)和(Delphacidae)的飞虱，来自角蝉科(Membracidae)的角蝉，来自木虱科(Psyllidae)的木虱，来自粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱，来自蚜科(Aphididae)的蚜虫，来自根瘤蚜科(Phylloxeridae)的葡萄根瘤蚜，来自粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧，来自链介壳虫科(Asterolecanidae)、蚧科(Coccidae)、粉蚧科(Dactylopiidae)、盾蚧科(Diaspididae)、绒蚧科(Eriococcidae)、旌介壳虫科(Ortheziidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)和绵蚧科(Margarodidae)的介壳虫，来自网蝽科的网蝽，来自蝽科(Pentatomidae)的椿象，长蝽(cinchbug)，土长蝽属物种；和来自长蝽科(Lygaeidae)的其他籽长蝽、来自沫蝉科(Cercopidae)的沫蝉、来自缘蝽科(Coreidae)的南瓜缘蝽和来自红蝽科(Pyrrhocoridae)的秋恙螨和棉蝽。
来自同翅目的农艺重要成员进一步包括但不限于：豌豆蚜(Acyrthisiphon pisumHarris)(豌豆蚜虫(pea aphid))；黑豆蚜(Aphis craccivora Koch)(蚕豆蚜(cowpeaaphid))；黑豆蚜(A.fabae Scopoli)(蚕豆蚜(black bean aphid))；棉蚜(A.gossypiiGlover)(棉蚜(cotton aphid)，瓜叶菊蚜虫(melon aphid))；玉米根蚜(A.maidiradicisForbes)(玉米根蚜(corn root aphid))；苹果黄蚜(A.pomi De Geer)(苹蚜(appleaphid))；绣线菊蚜(A.spiraecola Patch)(绣线菊蚜(spirea aphid))；茄粗额蚜(Aulacorthum solani Kaltenbach)(指顶花无网长管蚜(foxglove aphid))；草莓钉蚜(Chaetosiphon fragaefolii Cockerell)(草莓毛管蚜(strawberry aphid))；麦双尾蚜(Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko)(俄罗斯小麦蚜虫(Russian wheat aphid))；车前圆尾蚜(Dysaphis plantaginea Paaserini)(苹粉红劣蚜(rosy apple aphid))；苹果绵蚜(Eriosoma lanigerum Hausmann)(苹果绵蚜(woolly apple aphid))；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae Linnaeus)(菜蚜(cabbage aphid))；桃粉大尾蚜(Hyalopteruspruni Geoffroy)(桃大尾蚜(mealy plum aphid))；萝卜蚜(Lipaphis erysimiKaltenbach)(萝卜蚜(turnip aphid))；麦无网长管蚜(Metopolophium dirrhodumWalker)(麦蚜虫(cereal aphid))；马铃薯长管蚜(Macrosiphum euphorbiae Thomas)(马铃薯蚜(potato aphid))；桃蚜(Myzus persicae Sulzer)(桃蚜(peach-potato aphid,green peach aphid))；莴苣衲长管蚜(Nasonovia ribisnigri Mosley)(莴苣蚜(lettuceaphid))；癭绵对属(Pemphigus)物种(根蚜虫(root aphids)和倍蚜(gall aphids))；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch)(玉米蚜(corn leaf aphid))；禾谷缢管蚜(R.padiLinnaeus)(禾谷缢管蚜(bird cherry-oat aphid))；麦二叉蚜(Schizaphis graminumRondani)(麦二叉蚜(greenbug))；牛鞭草蚜(Sipha flava Forbes)(甘蔗黄蚜(yellowsugarcane aphid))；麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius)(麦长管蚜(English grainaphid))；苜蓿斑蚜(Therioaphis maculata Buckton)(苜蓿斑蚜(spotted alfalfaaphid))；茶二叉蚜(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe)(黑色柑橘蚜(blackcitrus aphid)和褐色橘蚜(T.citricida Kirkaldy)(桔二叉蚜(brown citrus aphid))；球属(Adelges)物种(球蚜(adelgids))；长山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrixPergande)(山胡桃根瘤蚜(pecan phylloxera))；烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)(烟粉虱(tobacco whitefly)，甘薯粉虱(sweetpotato whitefly))；银叶粉虱(B.argentifolii Bellows&Perring)(银叶粉虱(silverleaf whitefly))；柑橘粉虱(Dialeurodes citri Ashmead)(柑桔粉虱(citrus whitefly))；结翅白粉虱(Trialeurodes abutiloneus)(带状翅白粉虱(bandedwinged whitefly)和温室粉虱(T.vaporariorum Westwood)(温室粉虱(greenhouse whitefly))；马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae Harris)(马铃薯叶蝉(potato leafhopper))；灰飞虱(Laodelphaxstriatellus Fallen)(灰飞虱(smaller brown planthopper))；二点叶蝉(Macrolestesquadrilineatus Forbes)(紫菀叶蝉(aster leafhopper))；黑尾叶蝉(Nephotettixcinticeps Uhler)(绿叶蝉(green leafhopper))；二条斑黑尾叶蝉(N.nigropictus
Figure BDA0003795187100001461
)(稻叶蝉(rice leafhopper))；褐飞虱(Nilaparvata lugens
Figure BDA0003795187100001462
)(褐飞虱(brownplanthopper))；玉米蜡蝉(Peregrinus maidis Ashmead)(玉米飞虱(cornplanthopper))；白背飞虱(Sogatella furcifera Horvath)(白背飞虱(white-backedplanthopper))；稻条背飞虱(Sogatodes orizicola Muir)(稻飞虱(rice delphacid))；苹果白叶蝉(Typhlocyba pomaria McAtee)(苹白小叶蝉(white apple leafhopper))；葡萄斑叶蝉属(Erythroneoura)物种(葡萄叶蝉(grape leafhoppers))；十七年蝉(Magicicadaseptendecim Linnaeus)(周期蝉(periodical cicada))；吹绵蚧(Icerya purchasiMaskell)(吹绵蚧(cottony cushion scale))；梨圆蚧(Quadraspidiotus perniciosusComstock)(梨圆蚧(San Jose scale))；臀纹粉蚧(Planococcus citri Risso)(桔粉蚧(citrus mealybug))；粉蚧属(Pseudococcus)物种(其他粉蚧系群)；梨木虱(Cacopsyllapyricola Foerster)(梨木虱(pear psylla))；柿木虱(Trioza diospyri Ashmead)(柿木虱(persimmon psylla))。
来自半翅目的目的农艺重要物种包括但不限于：拟绿蝽(Acrosternum hilareSay)(稻绿蝽(green stink bug))；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer)(南瓜虫(squashbug))；美洲谷长蝽(Blissus leucopterus leucopterus Say)(麦长蝽(chinch bug))；方翅网蝽(Corythuca gossypii Fabricius)(棉网蝽(cotton lace bug))；番茄蝽(Cyrtopeltis modesta Distant)(番茄蝽(tomato bug))；棉蝽(Dysdercus suturellusHerrich-
Figure BDA0003795187100001471
)(棉红蝽(cotton stainer))；褐臭蝽(Euschistus servus Say)(褐臭蝽(brown stink bug))；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois)(一斑臭蝽(one-spotted stink bug))；长蝽属(Graptostethus)物种(果实蝽系群(complex of seedbugs))；松叶根蝽(Leptoglossus corculus Say)(松叶根蝽(leaf-footed pine seedbug))；美洲牧草盲蝽(Lygus lineolaris Palisot de Beauvois)(牧草盲蝽(tarnishedplant bug))；牧草盲蝽(L.Hesperus Knight)(西部牧草盲蝽(Western tarnished plantbug))；牧草盲蝽(L.pratensis Linnaeus)(牧草盲蝽(common meadow bug))；长毛草盲蝽(L.rugulipennis Poppius)(长毛草盲蝽(European tarnished plant bug))；长绿盲蝽(Lygocoris pabulinus Linnaeus)(苹绿盲蝽(common green capsid))；稻绿蝽(Nezaraviridula Linnaeus)(南方绿椿象(southern green stink bug))；美洲稻蝽(Oebaluspugnax Fabricius)(稻褐蝽(rice stink bug))；马利筋长蝽(Oncopeltus fasciatusDallas)(大马利筋长蝽(large milkweed bug))；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatusReuter)(棉跳盲蝽(cotton fleahopper))。
此外，实施例可以对半翅目有效，如草莓蝽(Calocoris norvegicus Gmelin)(草莓长蝽(strawberry bug))；Orthops campestris Linnaeus；苹果盲蝽(Plesiocorisrugicollis Fallen)(苹盲蝽(apple capsid))；番茄蝽(Cyrtopeltis modestus Distant)(番茄蝽(tomato bug))；黑斑烟盲蝽(Cyrtopeltis notatus Distant)(吸蝇(suckfly))；白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus Reuter)(白斑盲蝽(whitemarkedfleahopper))；皂荚蝽(Diaphnocoris chlorionis Say)(皂角蝽(honeylocust plantbug))；洋葱蝽(Labopidicola allii Knight)(葱盲蝽(onion plant bug))；棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter)(棉盲蝽(cotton fleahopper))；苜蓿褐盲蝽(Adelphocoris rapidus Say)(苜蓿褐盲蝽(rapid plant bug))；四线盲蝽(Poecilocapsus lineatus Fabricius)(四线叶虫(four-lined plant bug))；小长蝽(Nysius ericae Schilling)(多彩长蝽(false chinch bug))；假麦长蝽(Nysiusraphanus Howard)(假麦长蝽(false chinch bug))；稻绿蝽(Nezara viridula Linnaeus)(南方绿椿象(Southern green stink bug))；扁盾蝽属(Eurygaster spp.)物种；缘蝽属(Coreidae spp.)物种；红蝽属(Pyrrhocoridae spp.)物种；谷蛾属(Tinidae spp.)物种；Blostomatidae属物种；猎蝽科(Reduviidae)物种和臭虫科(Cimicidae)物种。
另外，包括蜱螨目(Acari)(螨类)的成体和幼虫，如小麦瘤瘿螨(Aceriatosichella Keifer)(小麦卷叶螨(wheat curl mite))；麦岩螨(Petrobia latens Müller)(褐色小麦螨(brown wheat mite))；在叶螨科(Tetranychidae)中蜘蛛螨和红螨，苹果全爪螨(Panonychus ulmi Koch)(欧洲红螨(European red mite))；二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)(二点叶螨(two spotted spider mite))；迈叶螨(T.mcdanieli McGregor)(迈叶螨(McDaniel mite))；朱砂叶螨(T.cinnabarinusBoisduval)(朱砂叶螨(carmine spider mite))；土耳其斯坦叶螨(T.turkestani Ugarov&Nikolski)(土耳其斯坦叶螨(strawberry spider mite))；细须螨科中的葡萄短须螨，桔短须螨(Brevipalpus lewisi McGregor)桔短须螨(citrus flat mite))；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他食叶螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱。黑脚硬蜱(Ixodes scapularis Say)(鹿蜱(deertick))；全环硬蜱(I.holocyclus Neumann)(澳大利亚致瘫痪埤(Australianparalysis tick))；变异矩头蜱(Dermacentor variabilis Say)(美洲犬蜱(American dogtick))；美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum Linnaeus)(孤星蜱(lone star tick))以及在痒螨科、蒲螨科和疥螨科中的痒螨和疥螨。
缨尾目(Thysanura)的昆虫有害生物是目的，如衣鱼(Lepisma saccharinaLinnaeus)(蠹虫(silverfish))；斑衣鱼(Thermobia domestica Packard)(小灶衣鱼(firebrat))。
所覆盖的另外节肢动物有害生物包括：蛛蛛目中的蜘蛛如褐隐毒蛛(Loxoscelesreclusa Gertsch and Mulaik)(褐皮花蛛(brown recluse spider))和黑寡妇蜘蛛(Latrodectus mactans Fabricius)(黑寡妇毒蛛(black widow spider))，以及蚰蜒目(Scutigeromorpha)中的蜈蚣如蚰蜒(Scutigera coleoptrata Linnaeus)(蚰蜒(housecentipede))。
目的昆虫有害生物包括椿象和其他相关昆虫的超家族，包括但不限于属于以下各科的物种：蝽科(稻绿蝽、茶翅蝽(Halyomorpha halys)、Piezodorus guildini、褐臭蝽、拟绿蝽、英雄美洲蝽(Euschistus heros)、美洲蝽(Euschistus tristigmus)、拟绿蝽、褐蝽(Dichelops melacanthus)、和蓓蝽(Bagrada hilaris)(蓓蝽(Bagrada Bug)))，龟蝽科(Plataspidae)(筛豆龟蝽(Megacopta cribraria)-豆平腹蝽蟓(Bean plataspid))和土蝽科(Scaptocoris castanea-Root stink bug)，以及鳞翅目物种包括但不限于：小菜蛾，例如，玉米穗虫；大豆夜蛾，例如，大豆尺夜蛾和黎豆夜蛾，例如，梨豆夜蛾。
用于测量杀有害生物活性的方法是本领域中所熟知的。参见，例如，Czapla和Lang，(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]83:2480-2485；Andrews等人，(1988)Biochem.J.[生物化学杂志]252:199-206；Marrone等人，(1985)J.of EconomicEntomology[经济昆虫学杂志]78:290-293以及美国专利号5,743,477，所有这些通过引用一起全文结合在此。总体上，在摄食测定中混合并使用了这种蛋白质。参见，例如，Marrone等人，(1985)，J.of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]，78:290-293。此类测定可以包括将植物与一种或多种有害生物接触，并且确定该植物存活和/或造成这些有害生物死亡的能力。
线虫包括寄生线虫如根结线虫、胞囊线虫、和腐线虫，包括异皮线虫属物种、根结线虫属物种、和球异皮线虫属物种；特别是胞囊线虫的成员，包括但不限于：大豆异皮线虫(大豆胞囊线虫)；甜菜异皮线虫(甜菜胞囊线虫)；燕麦异皮线虫(谷物胞囊线虫(cerealcyst nematode))和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯胞囊线虫(potato cyst nematodes))。腐线虫包括短体线虫属物种。
种子处理
为了保护并提高产量生产和性状技术，种子处理方案可以为昆虫、杂草和疾病提供另外的作物计划灵活性和成本有效的控制。种子材料可以用包含化学或生物除草剂、除草剂安全剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、发芽抑制剂和增强剂、营养素、植物生长调节剂和活化剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀鸟剂和/或杀软体动物剂的组合的组合物进行处理，通常进行表面处理。这些化合物通常与配制品领域中通常使用的其他载体、表面活性剂或促进施用的佐剂一起配制。这些包衣可通过用液体配制品浸渍增殖材料或通过用组合的湿或干配制品进行涂覆来施加。在以下提供了可用作种子处理的各种类型的化合物的实例：ThePesticide Manual:A World Compendium,C.D.S.Tomlin Ed.,Published by the BritishCrop Production Council[农药手册：世界纲要，C.D.S.汤姆林编辑，由英国作物生产委员会出版]，其通过引用结合在此。
可用于作物种子的一些种子处理包括但不限于下列一种或多种：脱落酸、阿拉酸式苯-S-甲基、阿维菌素、杀草强、阿扎康唑、固氮螺菌属、印楝素、嘧菌酯、芽孢杆菌属物种(包括蜡状芽孢杆菌，坚果芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，球形芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌物种中的一种或多种)，短根瘤菌属物种(包括bradyrhizobium betae、bradyrhizobium canariense、埃氏慢生根瘤菌、西表岛慢生根瘤菌、慢生型大豆根瘤菌、bradyrhizobium liaonigense、bradyrhizobium pachyrhizi和/或圆明慢生根瘤菌)，克菌丹，萎锈灵，壳聚糖，噻虫胺，铜，溴氰虫酰胺，苯醚甲环唑，氯唑灵，氟虫腈，咯菌腈，氟嘧菌酯，氟喹唑，解草胺，氟草肟，超敏蛋白，抑霉唑，吡虫啉，种菌唑，isoflavenoids，脂质几丁寡糖，代森锰锌，锰，代森锰，精甲霜灵，甲霜灵，叶菌唑，腈菌唑，PCNB，氟唑菌苯胺，青霉菌属，吡噻菌胺，氯菊酯，啶氧菌酯，丙硫菌唑，唑菌胺酯，氯虫苯甲酰胺，S-metolachlor，皂苷，氟唑环菌胺，TCMTB，戊唑醇，噻苯咪唑，噻苯哒唑，硫威，福美双，甲基立枯磷，三唑醇，木霉属，肟菌酯，灭菌唑和/或锌。PCNB种皮是指包含喹硫磷和氯唑灵的EPA注册号00293500419。TCMTB是指2-(硫氰基甲基硫代)苯并噻唑。
可以测试具有特定转基因性状的种子品种和种子以确定哪些种子处理方案和施用率可以补充这些品种和转基因性状以增加产量。例如，具有良好产量潜力但丝黑穗病易感性的品种可以受益于使用提供针对丝黑穗病的保护的种子处理，具有良好产量潜力但胞囊线虫易感性的品种可以受益于使用提供针对胞囊线虫的保护的种子处理等。同样，涵盖赋予昆虫抗性的转基因性状的品种可以从种子处理赋予的第二种作用方式中获益，涵盖赋予除草剂抗性的转基因性状的品种可以从用安全剂的种子处理中获益，这种安全剂增强植物对该除草剂的抗性等。此外，当与种子处理组合时，正确使用种子处理所产生的良好根系建立和早期出苗可能导致更有效的氮利用，更好的抗干旱能力以及包含某种性状的一种或多种品种的产量潜力的总体增加。
用于杀灭昆虫有害生物和控制昆虫群体的方法
在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫有害生物的方法，这些方法包括将昆虫有害生物与杀昆虫有效量的至少一种重组植物来源的穿孔素(包括但不限于IPD079多肽)接触。在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫有害生物的方法，这些方法包括将昆虫有害生物与杀昆虫有效量的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、或SEQ ID NO:140重组杀昆虫蛋白或其变体的接触。
在一些实施例中，提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，这些方法包括使该昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的重组IPD079多肽接触。在一些实施例中，提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，这些方法包括使该昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、或SEQ ID NO:140的重组IPD079多肽或其变体接触。如在此使用的，“控制有害生物群体”或“控制有害生物”是指对有害生物的任何影响，导致对有害生物造成的损害的限制。控制有害生物包括但不限于以一定方式杀灭有害生物、抑制有害生物发育、改变有害生物能育性或生长，使得有害生物对植物造成较少的损害，减少所产生后代的数量，产生适应力较弱的有害生物，产生易受捕食者攻击的有害生物或阻止有害生物啃食植物。
在一些实施例中，提供了用于控制对杀有害生物蛋白具有抗性的昆虫有害生物群体的方法，这些方法包括将昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的重组IPD079多肽接触。在一些实施例中，提供了用于控制对杀有害生物蛋白具有抗性的昆虫有害生物群体的方法，这些方法包括将昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、或SEQ ID NO:140的重组IPD079多肽或其变体接触。
在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，这些方法包括在植物或其细胞中使至少一种编码IPD079多肽的异源重组多核苷酸表达。在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，这些方法包括在植物或其细胞中使编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、或SEQID NO:140的IPD079多肽或其变体重组多核苷酸表达。
在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，这些方法包括在植物或其细胞中使至少一种编码异源植物来源的穿孔素的重组多核苷酸表达。在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，这些方法包括在植物或其细胞中使至少一种编码IPD094多肽的重组多核苷酸表达。
在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，这些方法包括在植物或其细胞中使至少一种编码SEQ ID NO:144的IPD094Aa多肽的重组多核苷酸或其同系物或变体表达。在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，这些方法包括在植物或其细胞中使至少一种编码异源植物来源的穿孔素的重组多核苷酸表达。在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，这些方法包括在植物或其细胞中使使至少一种编码SEQ ID NO:158-1248中的任一项的异源植物来源的穿孔素的重组多核苷酸或其同系物或变体表达。
昆虫抗性管理(IRM)策略
苏云金芽孢杆菌δ-内毒素在转基因玉米植物中的表达已被证明是控制农业重要昆虫有害生物的有效手段(Perlak等人，1990；1993)。然而，昆虫已经进化，这些昆虫对在转基因植物中表达的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素是具有抗性的。如果这种抗性普遍存在，它将明显限制包含编码这种苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的基因的种质的商业价值。
增加转基因杀昆虫剂对靶标有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的一种方法是提供非转基因(即，非杀昆虫蛋白)庇护所(一部分非杀昆虫作物/玉米)用于与生产对靶标有害生物具有活性的单一杀昆虫蛋白的转基因作物一起使用。美国环境保护局(epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm，其可以使用www前缀进行访问)发布与生产一种对靶标有害生物具有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的要求。另外，国家玉米种植者协会在他们的网站上也提供了有关庇护所要求的类似指导：(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn，其可以使用www前缀进行访问)。由于庇护区内的昆虫所造成的损失，较大的庇护所可能会降低总产量。
增加转基因杀昆虫剂对靶标有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的另一种方法是具有杀昆虫基因的储存库，该储存库可以有效地对抗昆虫有害生物的组，并通过不同的作用方式显现其作用。
在植物中表达对相同昆虫物种有毒的两种或更多种杀昆虫组合物，每种杀昆虫剂以有效水平表达是实现对抗性发展的控制的另一种方法。这是基于以下原则：对两种不同行动模式的抗性演变比仅一种远远更不可能。例如，Rouss概述了用于管理杀昆虫转基因作物的双毒素策略，也称为“金字塔结构”或“堆叠”。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.[皇家学会伦敦皇家学会哲学会刊B系列]，(1998)353:1777-1786)。每种都能有效抵抗靶标有害生物并几乎没有或没有交叉抗性的两种不同蛋白质的堆叠或金字塔可以允许使用较小的庇护所。美国环境保护局要求所种植非Bt玉米的结构性庇护所(通常为5％)比单一性状产品(通常为20％)显著更少。存在提供庇护所的IRM效应的各种方法，包括在田地中的各种几何种植模式和包装好(in-bag)的种子混合物，如进一步通过Roush所讨论的。
在一些实施例中，本公开的植物来源的穿孔素(包括但不限于IPD079多肽)可用作与其他杀有害生物蛋白(包括但不限于Bt毒素、致病杆菌属或发光杆菌属杀昆虫蛋白等)组合(即，金字塔化)的昆虫抗性管理策略。
提供了在促进昆虫抗性管理的转基因植物中控制鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵袭的方法，该方法包括在植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白。
在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性管理的方法中的这些杀昆虫蛋白中的至少一种包含对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的IPD094多肽。
在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性管理的方法中的这些杀昆虫蛋白中的至少一种包含对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的植物来源的穿孔素。
在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性管理的方法中的这些杀昆虫蛋白中的至少一种包含对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的IPD079多肽。
在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性管理的方法中的这些杀昆虫蛋白中的至少一种包含对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、或SEQID NO:140的IPD079多肽或其变体。
在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性管理的方法包括在该转基因植物中表达IPD079多肽和对具有不同作用模式的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的Cry蛋白。
在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性管理的方法包括在该转基因植物中表达SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ IDNO:136、SEQ ID NO:138、或SEQ ID NO:140的IPD079多肽或其变体，以及表达对具有不同作用模式的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的Cry蛋白。
还提供了降低鳞翅目和/或鞘翅目昆虫对在这些植物中表达杀昆虫蛋白以控制这些昆虫物种的转基因植物产生抗性的可能性的方法，该方法包括表达与具有不同作用方式的第二种杀昆虫蛋白组合的、对这些昆虫物种具有杀昆虫作用的IPD079多肽。
还提供了用于转基因植物的有效鳞翅目和/或鞘翅目昆虫抗性管理的手段，该手段包括在植物中以高水平共表达对鳞翅目和/或鞘翅目具有毒性的两种或更多种杀昆虫蛋白，但是每种都展现出不同的实行其杀灭活性的模式，其中两种或更多种杀昆虫蛋白包含IPD079多肽和Cry蛋白。还提供了用于转基因植物的有效鳞翅目和/或鞘翅目昆虫抗性管理的手段，该手段包括在植物中以高水平共表达对鳞翅目和/或鞘翅目具有毒性的两种或更多种杀昆虫蛋白，但是每种都展现出不同的实行其杀灭活性的模式，其中两种或更多种杀昆虫蛋白包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、或SEQ ID NO:140的IPD079多肽或其变体，以及Cry蛋白。
此外，提供了用于获得让监管部门批准种植或商业化表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的蛋白的植物的方法，包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤，该数据显示IPD079多肽不与此类昆虫中的Cry蛋白的结合位点竞争。此外，提供了用于获得让监管部门批准种植或商业化表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的蛋白的植物的方法，包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤，该数据显示SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ IDNO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、或SEQ ID NO:140的IPD079多肽或其变体不与此类昆虫中的Cry蛋白的结合位点竞争。
提高植物产量的方法
提供了用于提高植物产量的方法。这些方法包括提供表达编码本文公开的杀有害生物多肽序列的多核苷酸的植物或植物细胞，并在有害生物(该多肽对其具有杀有害生物活性)侵染的田地中种植该植物或其种子。在一些实施例中，该多肽对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫有害生物具有杀有害生物活性，并且用鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫有害生物侵染该田地。
如本文所定义的，植物的“产量”是指该植物生产的生物质的质量和/或数量。本文所使用的“生物质”是指任何经测量的植物产物。生物质产量的增加是所测量的植物产物的产量上的任何改进。提高植物产量具有几个商业应用。例如，增加植物叶片生物质可以增加用于人或动物消耗的叶菜类的产量。此外，增加叶片生物质可用于增加植物衍生的药物或工业产品的产量。产量上的增加可以包括任何统计学上显著的增加，包括但不限于，与不表达杀有害生物序列的植物相比，产量上至少增加1％、至少增加3％、至少增加5％、至少增加10％、至少20％增加、至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大的增加。
在具体方法中，由于表达本文公开的IPD079多肽的植物的经改进的有害生物抗性使得植物产量得到提高。IPD079多肽的表达导致有害生物侵染植物或在该植物上取食的能力下降，从而提高植物产量。
加工方法
进一步提供了加工植物、植物部分或种子以从包含植物来源的穿孔素或IPD079多肽的植物、植物部分或种子获得食物或饲料产品的方法。可以对本文提供的植物、植物部分或种子进行加工以产生通过加工具有商业价值的植物、植物部分或种子获得的衍生物的油、蛋白质产物和/或副产物。非限制性实例包括包含编码IPD079多肽的核酸分子的转基因种子，其可以被加工以产生大豆油、大豆产品和/或大豆副产品。
“加工”是指用于获得任何大豆产品的任何物理和化学方法，包括但不限于热调节(heat conditioning)、剥落和研磨、挤出、溶剂萃取或水性浸泡以及全部或部分种子萃取。
以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。
实验
实例1-鉴定杀昆虫蛋白IPD079Aa针对来自垂枝石松(Huperzia phlegmaria)的根 萤叶甲物种的活性
从如下垂枝石松(L.)Rothm.(Id.#PS-8582)，通过蛋白质纯化、质谱(MS)和PCR克隆鉴定杀昆虫蛋白质IPD079Aa(SEQ ID NO:2)。收集垂枝石松(L.)Rothm.(Id.#PS-8582)样品，在液N2中快速冷冻并储存在-80℃。在储存之后，将其在液N2温度用Geno/
Figure BDA0003795187100001641
球磨机(SPEX样品有限责任公司(SPEX Sample PrepLLC)，麦塔成(Metuchen)，新泽西州)研磨至精细的粉末。为了提取蛋白，向每5克鲜重组织中添加20ml的50mM Tris缓冲液(pH 8.0)、150mM KCl、2.5mM EDTA、1.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)和蛋白酶抑制剂混合物(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)，德国)。将该匀浆离心以去除细胞碎片，通过0.22μm过滤器过滤并使用10ml ZebaTM Spi nDesalting柱(赛默科技公司(Thermo Scientific)，IL.)脱盐。
使用覆盖在基于琼脂的鞘翅目饮食(Southland Products Inc.，Lake Village，AR)上的脱盐蛋白提取物，以96孔板形式进行抗西方玉米根虫(WCRW)(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera))的体外生物测定。每个样品使用三个重复。在饮食的顶部允许样品干燥，并将五到八个新生昆虫置于处理过的板的每个孔中。在27℃孵育48小时之后，对幼虫死亡率或发育迟缓的严重程度进行评分。得分在数字上记录为死亡(3)、严重地生长迟缓(2)(很少或根本没有生长但活着，相当于一龄幼虫)、生长迟缓(1)(增长到二龄，但不等于对照)、或者标准(0)。使样品经受蛋白酶K和热处理导致活性丧失，表明样品本质上是蛋白质。生物测定结果显示在表1中。
表1
Figure BDA0003795187100001651
实例2-IPD079Aa同系物的纯化
使用的蛋白质纯化方案如下，将50g的PS-8582植物材料研磨，提取蛋白质部分，并如实例1中描述进行脱盐。将脱盐的物质应用至5ml GE HiTrapTMSP柱(GE医疗集团(GE)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西)上，并用在50mM MES (pH 6.0)中从0至0.35M NaCl的线性30柱体积梯度以1.5ml级分洗脱。通过体外生物测定(如上文描述)，SP流出物被鉴定为WCRW活性。使用
Figure BDA0003795187100001652
分子量截留过滤(密理博公司(Millipore)，比勒利卡(Billerica)，MA)浓缩3kD的流出物级分为3kD。将约3.2x浓缩的残留物提高至30％(NH4)2SO4。将该30％(NH4)2SO4溶液离心以去除任何沉淀物并应用至1ml GE HiTrapTM Butyl HIC柱(GE医疗集团(GE)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西)上，并用在50mM MES(pH 6.0)中从1M至0M(NH4)2SO4的线性50柱体积梯度以1.0ml级分洗脱。将级分用0.5ml ZebaTM脱盐柱(赛默科技公司(Thermo Scientific)，IL.)脱盐以除去(NH4)2SO4。通过体外生物测定(如上文描述)，将WCRW级分鉴定为活性的。活性级分的SDS-PAGE含有约55kD的
Figure BDA0003795187100001653
染色的条带，将其切下并胰蛋白酶消化。
在蛋白质用胰蛋白酶消化后，通过质谱(MS)分析进行蛋白质测序和鉴定。在用
Figure BDA0003795187100001654
亮蓝G-250染色的LDS-PAGE凝胶上跑样之后获得用于MS鉴定的蛋白质。将两条目的条带从凝胶上切下，脱色，用二硫苏糖醇还原，然后用碘乙酰胺烷基化。用胰蛋白酶消化过夜后，将样品提交给液相色谱-质谱(LC-MS)分析。使用在QToF PremiereTM质谱仪(
Figure BDA0003795187100001655
米尔福德(Milford)，MA)上的电喷雾与NanoAcquityTM纳米-LC系统(
Figure BDA0003795187100001661
米尔福德(Milford)，MA)偶联来进行胰蛋白酶消化的肽的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析，用从2％乙腈、0.1％甲酸至60％乙腈、0.1％甲酸的梯度。使用蛋白质全球服务器(Protein Lynx Global Server)(
Figure BDA0003795187100001662
米尔福德(Milford)，MA)分析得到的LC-MS数据以产生DeNovo序列数据。质谱测序结果表明，当针对实例3中描述的垂枝石松(Id.#PS-8582)的转录组序列数据库进行搜索时，IPD079Aa多肽(SEQ ID NO:2)是穿孔素样。
实例3-垂枝石松的转录组测序
如以下制备用于垂枝石松(Id.#PS-8582)的转录组。通过使用
Figure BDA0003795187100001663
试剂盒
Figure BDA0003795187100001664
从冷冻组织中分离总RNA用于总RNA分离。使用TruSeqTM mRNA-Seq试剂盒和来自
Figure BDA0003795187100001665
Inc.(圣地亚哥，加利福尼亚州)的方案制备来自所得总RNA的测序文库。简而言之，将mRNA经由附接至寡(dT)珠分离，片段化至180nt的平均大小，通过随机六聚体初始反转录为cDNA，末端修复，3'A-尾，并与
Figure BDA0003795187100001666
索引的TruSeqTM衔接子连接。使用
Figure BDA0003795187100001667
TruSeqTM引物PCR扩增连接的cDNA片段，并在Agilent
Figure BDA0003795187100001668
DNA 7500芯片上检查纯化的PCR产物的质量和数量。在质量和数量评估之后，通过用双特异性核酸酶(DSN)(
Figure BDA0003795187100001669
莫斯科，俄罗斯)处理将100ng转录物文库标准化。通过添加200mM Hepes缓冲液完成标准化，随后进行热变性，并在68℃五个小时退火。将退火的文库用2μlDSN酶处理25分钟，根据制造商方案通过
Figure BDA00037951871000016610
柱进行纯化，并使用
Figure BDA00037951871000016611
适配子特异性引物扩增12个循环。用
Figure BDA00037951871000016612
XP珠(贝克曼基因组学公司(BeckmanGenomics)，丹佛市(Danvers)，MA)纯化最终产物，并在AAgilent
Figure BDA00037951871000016613
DNA 7500芯片上检查质量和数量。
根据
Figure BDA00037951871000016614
基因组分析仪IIx上的制造商方案对标准化的转录物文库进行测序。将每个文库与两个流动细胞泳道杂交，并使用Illumina克隆簇生成方法在
Figure BDA0003795187100001671
上扩增、封闭、线性化和引物杂交。在基因组分析仪IIx上完成测序，每个标准化文库产生六千万个75bp的配对末端读数。
针对通过来自对于PS-8582装配体的内部转录组的开放阅读框(ORF)的蛋白质序列，搜索通过LC-MS测序鉴定的IPD079Aa(SEQ ID NO:2)的肽序列(描述在实例3中)。这些肽与相应与IPD079Aa的转录物(SEQ ID NO:1)完全匹配。将这些编码序列用于设计以下引物：GATTACCATATGGCCCAAATAGAGC(SEQ ID NO:1249)和GCTAACTCGAGCTAGTCTAAATGACG(SEQ IDNO:1250)，以克隆IPD079Aa编码序列。使用HF
Figure BDA0003795187100001672
PCR试剂盒(ClontechTM，1290Terra Bella Ave.Mountain View，CA94043)通过聚合酶链式反应产生这种克隆，并使用
Figure BDA0003795187100001673
II试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fischer Scientific)，沃尔瑟姆(Waltham)，MA)作为模板，从来自垂枝石松的总RNA制备cDNA。通过测序确认克隆的序列。基于DNA和蛋白质测序，IPD079Aa多核苷酸序列显示为SEQ ID NO:1，并且IPD079Aa多肽序列显示为SEQ ID NO:2。
实例4-鉴定杀昆虫蛋白IPD079Ea针对来自钝头瓶尔小草(Ophioglossum pendulum)的根萤叶甲物种的活性
从如下钝头瓶尔小草(Ophioglossum pendulum)(L.)(Id.#PS-9145)，通过蛋白质纯化、质谱(MS)和PCR克隆鉴定杀昆虫蛋白质IPD079Ea(SEQ ID NO:56)。收集钝头瓶尔小草(Ophioglossum pendulum)(L.)(Id.#PS-9145)样品，在液N2中快速冷冻并储存在-80℃。在储存之后，将其在液N2温度用Geno/
Figure BDA0003795187100001674
球磨机(SPEX样品有限责任公司(SPEX SamplePrepLLC)，麦塔成(Metuchen)，新泽西州)研磨至精细的粉末。为了提取蛋白，向每5克鲜重组织中添加20ml的50mM Tris缓冲液(pH 8.0)、150mM KCl、2.5mM EDTA、1.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)和蛋白酶抑制剂混合物(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)，德国)。将该匀浆离心以去除细胞碎片，通过0.22μm过滤器过滤并使用10ml ZebaTM SpinDesalting柱(赛默科技公司(Thermo Scientific)，IL.)脱盐。
使用覆盖在基于琼脂的鞘翅目饮食(Southland Products Inc.，Lake Village，AR)上的脱盐蛋白提取物，以96孔板形式进行抗西方玉米根虫(WCRW)(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera))的体外生物测定。每个样品使用三个重复数目。在饮食的顶部允许样品干燥，并将五到八个新生昆虫置于处理过的板的每个孔中。在27℃孵育72小时之后，对幼虫死亡率或发育迟缓的严重程度进行评分。得分在数字上记录为死亡(3)、严重地生长迟缓(2)(很少或根本没有生长但活着，相当于一龄幼虫)、生长迟缓(1)(增长到二龄，但不等于对照)、或者标准(0)。使样品经受蛋白酶K和热处理导致活性丧失，表明样品本质上是蛋白质。生物测定结果显示在表2中。
表2
Figure BDA0003795187100001681
实例5-IPD079Ea同系物的纯化
蛋白质纯化方案如下所列，将10g的PS-9145植物材料研磨，并且如实例1中描述的将蛋白质提取和脱盐。将脱盐的材料应用至1ml GE HiTrapTM Q柱(GE医疗集团(GE)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西)。用50mM Tris(pH 8.0)中的0至0.7M NaCl线性100柱体积梯度从柱上洗脱蛋白质，并收集1.0ml级分。将通过体外生物测定(如上文描述)显示WCRW活性的洗脱级分合并，使用
Figure BDA0003795187100001691
3kD分子量截留过滤(密理博公司(Millipore)，比勒利卡(Billerica)，MA.)浓缩3倍至6倍。浓缩的级分在SDS-PAGE上分离，用
Figure BDA0003795187100001692
染色，切下约55kD染色条带并用胰蛋白酶消化以进行MS分析。
在蛋白质用胰蛋白酶消化后，通过质谱(MS)分析进行蛋白质测序和鉴定。在用
Figure BDA0003795187100001693
亮蓝G-250染色的LDS-PAGE凝胶上跑样之后获得用于MS鉴定的蛋白质。将这些目的条带从凝胶上切下，脱色，用二硫苏糖醇还原，然后用碘乙酰胺烷基化。用胰蛋白酶消化过夜后，将样品提交给液相色谱-质谱(LC-MS)分析。使用在QToFPremiereTM质谱仪(
Figure BDA0003795187100001694
米尔福德(Milford)，MA)上的电喷雾与NanoAcquityTM纳米-LC系统(
Figure BDA0003795187100001695
米尔福德(Milford)，MA)偶联来进行胰蛋白酶消化的肽的LC-MS/MS分析，用从2％乙腈、0.1％甲酸至60％乙腈、0.1％甲酸的梯度。使用蛋白质全球服务器(Protein Lynx GlobalServer)(
Figure BDA0003795187100001696
米尔福德(Milford)，MA)分析得到的LC-MS数据以产生DeNovo序列数据。
实例6-用在大肠杆菌中表达的纯化的IPD079和IPD094多肽进行鞘翅目测定
使用框架中的NdeI/XhoI限制性位点(具有N-末端6xHis标签，接着是凝血酶切割位点)将编码IPD079Aa多肽(SEQ ID NO:2)的IPD079Aa多核苷酸(SEQ ID NO:1)亚克隆到pET14b载体(Novagen)上。编码IPD079Aa(SEQ ID NO:2)的基因(SEQ ID NO:1)也用SEQ IDNO:154的正向引物和SEQ ID NO:155的反向引物扩增，用于连接pET28载体(具有N-末端6xHis标签，接着是大肠杆菌麦芽糖结合蛋白)(Duplay等人，(1984)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]259:10606-10613)。使用SEQ ID NO:1251的正向引物和SEQ ID NO:1252的反向引物，从来自钝头瓶尔小草的总RNA制备的cDNA扩增编码IPD079Ea多肽(SEQ ID NO:56)的IPD079Ea多核苷酸(SEQ ID NO:55)。使用Gibson组装克隆试剂盒(NEB)将所得PCR产物亚克隆到pET28载体(具有N-末端6xHis标签，接着是大肠杆菌麦芽糖结合蛋白)上。使用正向引物SEQ ID NO:1253和反向引物SEQ ID NO:1254，从来自龙舌兰卷柏(Selaginellavictoriae)的总RNA制备的cDNA扩增编码IPD094Aa多肽(SEQ ID NO:144)的IPD094Aa多核苷酸(SEQ ID NO:143)。将所得PCR产物亚克隆到pET28载体(具有N-末端6xHis标签，接着是大肠杆菌麦芽糖结合蛋白)上。将化学感受态的OverExpressTM C41(DE3)大肠杆菌细胞(Miroux B.等人，Journal of Molecular Biology[分子生物学杂志]260:289-298,1996)(Lucigen Corp.Middleton，WI53562)用含有相应IPD079基因插入物的pET质粒DNA转化用于重组蛋白表达。经转化的大肠杆菌细胞在37℃用卡那霉素选择生长过夜，然后接种到新鲜的2xYT培养基(1:25)中，并进一步生长至约0.8的光密度。通过添加0.3mM IPTG诱导蛋白质表达，并使这些细胞在16℃进一步生长16小时。根据制造商的方案，通过使用Ni-NTA琼脂糖(
Figure BDA0003795187100001701
德国)或直链淀粉(NEB)的固定化金属离子色谱纯化经大肠杆菌表达的蛋白质。将纯化的级分加载到用1xPBS缓冲液预平衡的PD-10脱盐柱(GE生命科学公司(GE LifeSciences)，匹兹堡，美国)上。将3mL的洗脱缓冲液装载到每个柱上，并从每个柱收集2.5mL的洗脱液。
对这些鞘翅目昆虫进行了一系列浓度的浓度测定，并计算了个体的50％死亡率的浓度(LC50)或50％抑制的浓度(IC50)。为了测量IPD079蛋白针对WCRW(玉米根萤叶甲)的杀昆虫活性，在每个96孔生物测定板中，使用20μl的经纯化的蛋白质样品与75μl的人工WCRW饮食(基于Bio-ServF9800B)混合来进行饮食掺入生物测定。向96孔板的每个孔中放入以相同剂量饲喂一天后的一只幼虫。将测定在25℃无光照下运行六(1+5)天，并且然后对死亡率和发育迟缓进行评分。为了测量IPD079蛋白针对NCRW(北方玉米根虫(Diabroticabarberi))的杀昆虫活性，在每个96孔生物测定板中，使用10μl的经纯化的蛋白质样品与50μl的人工WCRW饮食(基于Bio-Serv F9800B)混合来进行饮食掺入生物测定。向96孔板的每个孔中放入以相同剂量饲喂一天后的两只新生幼虫。将测定在25℃无光照下运行四(1+3)天，并且然后对死亡率和发育迟缓进行评分。利用氨基末端多组氨酸融合标签(NT His)或麦芽糖结合蛋白(MBP)融合，从大肠杆菌表达系统中表达和纯化的IPD079Aa(SEQ ID NO:2)、IPD079Ea(SEQ ID NO:56)和IPD094Aa(SEQ ID NO:144)对于的WCRW和NCRW的结果显示在表3中。
表3
Figure BDA0003795187100001711
还测定IPD079Aa多肽(SEQ ID NO:2)、IPD079Ea多肽(SEQ ID NO:54)和IPD094Aa多肽(SEQ ID NO:144)针对SCRW(斑点黄瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctata howardi))的结果。在每个96孔生物测定板(BD Falcon 353910)中，使用10μl的经纯化的蛋白质样品与50μl的人工SCRW饮食(基于Bio-ServF9800B)混合来进行生物测定。将可变数量的斑点黄瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctata howardi)新生虫(3至5只)置于96孔板的每个孔中。将测定在25℃无光照下运行四天，并且然后对死亡率和发育迟缓进行评分。在高达1250ppm的浓度的IPD094Aa(SEQ ID NO:144)对斑点黄瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctatahowardi)新生虫无活性。IPD079Aa被测定为具有50ppm的顶部剂量的IPD079Aa的澄清裂解物。IPD079多肽的数据显示在表4中。
表4
Figure BDA0003795187100001721
实例7具有在大肠杆菌中表达的纯化的IPD079多肽的鳞翅目测定
在96孔板中的人工饮食上进行鳞翅目取食测定。将经纯化的蛋白质与鳞翅目特异性人工饮食以10μl蛋白质至40ul饮食混合物的比例掺入。在每个孔放置两至五只新生幼虫，让其任意取食5天。结果表示为幼虫反应(如发育迟缓)呈阳性和/或死亡率。如果幼虫与正在取食仅施用上述缓冲液的饮食的阴性对照相似，那么结果表示为阴性。
在欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、棉铃虫(玉米穗虫(Helicoverpa zea))、黑切根虫(black cutworm)(小地老虎(Agrotis ipsilon)、和秋夜蛾(fall armyworm)(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))上测定IPD079Ea多肽(SEQ ID NO:56)。浓度高达2000ppm的IPD079Ea多肽(SEQ ID NO:56)针对鳞翅目物种的测定没有观察到活性。测定IPD079Aa多肽(SEQ ID NO:2)澄清裂解物针对上述昆虫以及另外地针对黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)和大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)。对于任何IPD079Aa同系物，在蛋白质浓度高达50ppm的情况下，没有观察到任何IPD079Aa同系物针对鳞翅目物种的活性。
实例8-鉴定IPD079Aa同系物
将IPD079Aa多肽(SEQ ID NO:2)的氨基酸系列用包括植物蛋白质序列的公共和DUPONT-PIONEER内部数据库进行BLAST搜索(基本局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool)；Altschul等人，(1993)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410；还参见ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，其可以使用www前缀访问)。在专有的DUPONT-PIONEER植物蛋白数据库中，将氨基酸序列与蛋白质进行比对。将IPD079Aa多肽(SEQ IDNO:2)的同系物在柔软马尾杉(Huperzia salvinioides)(Id.#PS-9141)和铜钱叶蓼石杉(Huperzia nummulariifolium)(Id.#PS-9151)中鉴定，并根据制造商的说明书使用
Figure BDA0003795187100001731
第一链合成系统(First-Strand Synthesis System)(英杰公司(Invitrogen))，随后使用HF
Figure BDA0003795187100001732
PCR试剂盒(ClontechTM，1290 Terra BellaAve.Mountain View，CA 94043)的聚合物酶链式反应，从来自柔软马尾杉(Huperziasalvinioides)(Id.#PS-9141)以及来自铜钱叶蓼石杉(Huperzia nummulariifolium)(Id.#PS-9151)的SEQ ID NO:1255和SEQ ID NO:1256的引物，使用SEQ ID NO:1257和SEQID NO:1258的引物通过反转录克隆。通过Zero
Figure BDA0003795187100001733
克隆(生命技术公司(LifeTechnology))，将所得PCR产物直接克隆至质粒载体
Figure BDA0003795187100001734
II-
Figure BDA0003795187100001742
中。在随机克隆上进行DNA测序。从柔软马尾杉(Huperzia salvinioides)(Id.#PS-9141)鉴定两个独特的IPD079多肽同系物(IPD079Ab(SEQ ID NO:4)和IPD079Ac(SEQ ID NO:6))，并且从铜钱叶蓼石杉(Huperzia nummulariifolium)(Id.#PS-9151)鉴定24个独特的IPD079同系物(IPD079Ad(SEQ ID NO:8)、IPD079Ae(SEQ ID NO:10)、IPD079Af(SEQ ID NO:12)、IPD079Ag(SEQ ID NO:14)、IPD079Ah(SEQ ID NO:16)、IPD079Ai(SEQ ID NO:18)、IPD079Aj(SEQ IDNO:20)、IPD079Ak(SEQ ID NO:22)、IPD079Al(SEQ ID NO:26)、IPD079Am(SEQ ID NO:28)、IPD079An(SEQ ID NO:30)、IPD079Ao(SEQ ID NO:32)、IPD079Ap(SEQ ID NO:36)、IPD079Aq(SEQ ID NO:38)、IPD079Ar(SEQ ID NO:40)、IPD079As(SEQ ID NO:44)、IPD079At(SEQ IDNO:46)、IPD079Au(SEQ ID NO:48)、IPD079Av(SEQ ID NO:50)、IPD079Aw(SEQ ID NO:52)、IPD079Ax(SEQ ID NO:54)、IPD079Ba(SEQ ID NO:24)、IPD079Bb(SEQ ID NO:34)、IPD079Bc(SEQ ID NO:42))。表5中显示了IPD079Aa同系物、来源材料、多核苷酸编码序列标识符和IPD079多肽序列标识符。表8a-8c显示了，基于Needleman-Wunsch算法，如在Needle程序(EMBOSStool套件)中实现的实例1、8和10的IPD079Aa同系物的总体对比(矩阵表的空白部分未示出)的成对的同一性关系的矩阵表。
表5
Figure BDA0003795187100001741
Figure BDA0003795187100001751
将IPD079Aa(SEQ ID NO:1)、IPD079Ab(SEQ ID NO:3)、IPD079Ac(SEQ ID NO:5)、IPD079Ad(SEQ ID NO:7)、IPD079Ae(SEQ ID NO:9)、IPD079Af(SEQ ID NO:11)、和IPD079Ba(SEQ ID NO:23)多核苷酸克隆至pET14b载体(Novagen)(具有6x His标签)或pCOLDTM 3载体(Clontech，1290 Terra Bella Ave.，Mountain View，CA 94043)用于在大肠杆菌中表达。在测试的构建体中，IPD079Aa多肽(SEQ ID NO:2)针对WCRW是可溶的以及有活性的；在测试的浓度下，IPD079Ab(SEQ ID NO:4)和IPD079Ac(SEQ ID NO:6)多肽针对WCRW是可溶的但没有活性的；IPD079Ad(SEQ ID NO:8)、IPD079Ae(SEQ ID NO:10)、IPD079Af(SEQ ID NO:12)、和IPD079Ba(SEQ ID NO:24)多肽是不可溶的。
BLAST搜索也鉴定来自龙舌兰卷柏(Selaginella victoriae)的SEQ ID NO:144的多肽(在本文中称为IPD094Aa)，其与IPD079Aa(SEQ ID NO:2)具有21％序列同一性，但基于穿孔素样同源性进行鉴定。将IPD094Aa多肽(SEQ ID NO:144)通过SEQ ID NO:143的多核苷酸编码。
实例9-鉴定IPD079Ea同系物
将IPD079Ea(SEQ ID NO:56)的同系物在钝头瓶尔小草(Id.#PS-9145)和二歧鹿角蕨(Platycerium bifurcatum)(Id.#PS-9135)中鉴定，并根据制造商的说明书(
Figure BDA0003795187100001761
第一链合成系统(First-Strand Synthesis System)，英杰公司(Invitrogen))，接着进行聚合酶链式反应(HF
Figure BDA0003795187100001762
PCR试剂盒(ClontechTM，1290Terra Bella Ave.Mountain View，CA 94043)，使用来自钝头瓶尔小草以及来自二歧鹿角蕨(Platycerium bifurcatum)的SEQ ID NO:1251和SEQ ID NO:1252的引物，使用SEQ ID:156和SEQ ID NO:1252的引物通过反转录克隆。使用Gibson
Figure BDA0003795187100001763
克隆试剂盒(纽英伦生物技术公司(New England Biolabs)，240县公路，伊普斯威奇(Ipswich)，MA 01938-2723)，将所得PCR产物亚克隆至pET28a载体(具有N-末端6x His标签，接着是大肠杆菌麦芽糖结合蛋白)上(Duplay等人(1984)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]259:10606-10613)。从钝头瓶尔小草(Id.#PS-9145)鉴定六个独特的IPD079Ea同系物(IPD079Ec(SEQ ID NO:60)、IPD079Ed(SEQ ID NO:62)、IPD079Ee(SEQ ID NO:64)、IPD079Ef(SEQ ID NO:66)、IPD079Eg(SEQ ID NO:68)、IPD079Eh(SEQ ID NO:70))，并且从二歧鹿角蕨(Platyceriumbifurcatum)(Id.#PS-9135)鉴定一个独特的IPD079Ea同系物(IPD079Eb(SEQ ID NO:58))。
表6中显示了IPD079Ea同系物、来源材料、多核苷酸编码序列标识符和IPD079多肽序列标识符。表9a-9c显示了，基于Needleman-Wunsch算法，如在Needle程序(EMBOSS tool套件)中实现的实例4、9和10的IPD079Ea同系物的总体对比(矩阵表的空白部分未示出)的成对的同一性关系的矩阵表。
表6
Figure BDA0003795187100001771
将电感受态OverExpressTM C41(DE3)大肠杆菌细胞(Miroux B.等人Journal ofMolecular Biology[分子生物学杂志]260:289-298,1996)(Lucigen Corp.Middleton，WI53562)用每个pET载体(含有IPD079Eb(SEQ ID NO:58)、IPD079Ec(SEQ ID NO:59)、IPD079Ee(SEQ ID NO:63)、或IPD079Ef(SEQ ID NO:65)基因插入物之一)转化用于重组蛋白表达。将转化的大肠杆菌细胞在37℃在3毫升的2x YT培养基中用卡那霉素选择生长过夜。将1毫升这种培养物用于接种1升的2x YT培养基。当培养物达到约0.8的光密度时，通过添加1mM IPTG诱导蛋白质表达。将细胞在16℃进一步生长16小时。通过离心收集细胞，并裂解在含有1/4X
Figure BDA0003795187100001781
II细菌蛋白提取试剂(生命技术公司(Life Technologies))的30微升20mM Tris(pH 8)中，该20mM Tris补充有Ready-LyseTM溶菌酶溶液(Epicentre)、OmniCleaveTM核酸内切酶(Epicentre，5602 Research Park Blvd.,套件200，Madison，WI53719)和蛋白酶抑制剂混合物Set V(EMD密理博公司(Millipore))。通过离心澄清裂解物。IPD079Ec(SEQ ID NO:59)基因在活性测定中不表达到足够高的水平。IPD079Eb(SEQ IDNO:58)、IPD079Ee(SEQ ID NO:64)和IPD079Ef(SEQ ID NO:66)多肽在WCRW测定中有活性。
实例10-通过5’和3’末端同一性鉴定IPD079同系物
为了鉴定另外的IPD079同系物，将实例1、4、8和9中鉴定的IPD079Aa和IPD079Ea的基因同系物的比对用于鉴定编码序列5'和3'末端附近的保守序列。在这些保守序列内设计了多个PCR引物。根据制造商的说明书，使用
Figure BDA0003795187100001782
第一链合成系统(First-StrandSynthesis System)(英杰公司(Invitrogen))，接着使用
Figure BDA0003795187100001783
High-Fidelity DNA聚合酶(纽英伦生物技术公司(New England Biolabs))的聚合酶链式反应，从钝头瓶尔小草(Id.#PS-9145)(使用引物79E_GS_F(SEQ ID NO:1264)、79_GS_R(SEQ ID NO:1265)、79E_F1(SEQ ID NO:1266)、79E_R1(SEQ ID NO:1267))，并从蓝石杉(Huperzia goebelii)(Id.#PS-9149)和龙骨马尾杉(Huperzia carinata)(Id.#PS-11847)(用引物F1(SEQ ID NO:1259)、F2(SEQ ID NO:1260)、F3(SEQ ID NO:1261)、R1(SEQ ID NO:1262)、R2(SEQ ID NO:1263))进行反转录。通过Zero
Figure BDA0003795187100001791
克隆(生命技术公司(Life Technology)和DNA测序，将所得PCR产物直接克隆至质粒载体
Figure BDA0003795187100001792
-Blunt
Figure BDA0003795187100001793
中。从蓝石杉(Huperzia goebelii)(Id.#PS-9149)和龙骨马尾杉(Huperzia carinata)(Id.#PS-11847)鉴定十二个独特的IPD079Aa同系物(IPD079Ay(SEQ ID NO:72)、IPD079Az(SEQ ID NO:74)、IPD079Bd(SEQ ID NO:76)、IPD079Be(SEQ ID NO:78)、IPD079Bf(SEQ ID NO:80)、IPD079Bg(SEQ ID NO:82)、IPD079Bh(SEQ ID NO:84)、IPD079Bi(SEQ ID NO:86)、IPD079Bj(SEQ IDNO:88)、IPD079Bk(SEQ ID NO:90)、IPD079Bl(SEQ ID NO:92)、IPD079Bm(SEQ ID NO:94))。从钝头瓶尔小草鉴定二十四个独特的IPD079Ea同系物(IPD079Ei(SEQ ID NO:96)、IPD079Ej(SEQ ID NO:98)、IPD079Ek(SEQ ID NO:100)、IPD079El(SEQ ID NO:102)、IPD079Em(SEQ ID NO:104)、IPD079En(SEQ ID NO:106)、IPD079Eo(SEQ ID NO:108)、IPD079Ep(SEQ ID NO:110)、IPD079Eq(SEQ ID NO:112)、IPD079Er(SEQ ID NO:114)、IPD079Es(SEQ ID NO:116)、IPD079Et(SEQ ID NO:118)、IPD079Eu(SEQ ID NO:120)、IPD079Ev(SEQ ID NO:122)、IPD079Ew(SEQ ID NO:124)、IPD079Ex(SEQ IDNO:126)、IPD079Ey(SEQ ID NO:128)、IPD079Ez(SEQ ID NO:130)、IPD079Eaa(SEQ ID NO:132)、IPD079Eab(SEQ ID NO:134)、IPD079Eac(SEQ ID NO:136)、IPD079Ead(SEQ ID NO:138)、IPD079Eae(SEQ ID NO:140)、IPD079Eaf(SEQ ID NO:142))。表7中显示了IPD079同系物、来源材料、多核苷酸编码序列标识符和IPD079多肽序列标识符。
用引物79AA_F-2(SEQ ID NO:1268)、79AA:5K_F-2(SEQ ID NO:1269)、79AA:2V:3N_F-2(SEQ ID NO:1270)、79AA_R(SEQ ID NO:1271)、79EA_F-2(SEQ ID NO:1272)、79EA:4K:5T_F-2(SEQ ID NO:1273)、79EA_R(SEQ ID NO:1274)扩增IPD079Ea同系物的编码序列，并通过Gibson
Figure BDA0003795187100001802
(纽英伦生物技术公司(New England Biolabs))亚克隆至pET28a载体(具有N-末端6x His标签，接着是大肠杆菌麦芽糖结合蛋白)(Duplay等人(1984)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]259:10606-10613)用于大肠杆菌表达。除了IPD079Bf(SEQ ID NO:80)、IPD079Bk(SEQ IDNO:90)、IPD079Bl(SEQ ID NO:92)、IPD079Bm(SEQ IDNO:92)和IPD079Ep(SEQ ID NO:110)，显示在表7中的IPD079Aa同系物和IPD079Ea同系物在测定的浓度可溶解地表达并针对WCRW具有活性。
表7
Figure BDA0003795187100001801
Figure BDA0003795187100001811
表8a
Figure BDA0003795187100001812
Figure BDA0003795187100001821
表8b
Figure BDA0003795187100001822
Figure BDA0003795187100001831
Figure BDA0003795187100001841
表8c
Figure BDA0003795187100001842
Figure BDA0003795187100001851
表9a
Figure BDA0003795187100001852
Figure BDA0003795187100001861
表9b
Figure BDA0003795187100001862
Figure BDA0003795187100001871
表9c
Figure BDA0003795187100001881
Figure BDA0003795187100001891
用每个pET载体(含有相应的IPD079基因插入物)转化电感受态OverExpressTM C41(DE3)大肠杆菌细胞(目录号60341，Lucigen Corp.，2905 Parmenter街道，Middleton，WI)用于重组蛋白表达。将转化的大肠杆菌细胞在37℃在3毫升的2x YT培养基中用卡那霉素选择生长过夜。将1毫升这种培养物用于接种1升的2x YT培养基。当培养物达到约0.8的光密度时，通过添加1mM IPTG诱导蛋白质表达。将细胞在16℃进一步生长16小时。通过离心收集细胞，并裂解在含有1/4X
Figure BDA0003795187100001892
II细菌蛋白提取试剂(生命技术公司(LifeTechnologies))的30微升20mM Tris(pH 8)中，该20mM Tris补充有Ready-LyseTM溶菌酶溶液(Epicentre)、OmniCleaveTM核酸内切酶(Epicentre)和蛋白酶抑制剂混合物Set V(EMD密理博公司(Millipore))。通过离心澄清这些裂解物。
将澄清的裂解物在饮食测定中运行以评估IPD079多肽对西方玉米根虫(WCRW)(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera)的幼虫的作用。使用饮食掺入和/或饮食覆盖生物测定程序进行WCRW生物测定。对于饮食覆盖测定，在96孔生物测定板(White Proxi-Plate，珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)目录号6006299)的每一个中，将15μL澄清的溶解产物局部应用至65μL修饰的人造WCRW幼虫饮食(Bio-Serv F9800B)上，然后风干。对于饮食掺入生物测定，在96孔生物测定板(White Proxi-Plate，珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)目录号6006299)的每一个中，将15μL澄清的裂解物与65μL修饰的人造WCRW幼虫饮食(Bio-ServF9800B)混合，然后风干持续短暂的时间。对于覆盖和饮食掺入生物测定方法，将可变数目的WCRW(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera))新生虫(3至10)置于96孔板的每个孔中。测定在27℃连续光照下运行三天，然后对死亡率和生长迟缓进行评分。对每个蛋白样品进行四到八次重复，取决于样品体积的可用性。在0-3刻度(0没有作用，1轻微生长迟缓，2严重生长迟缓，3死亡率)对四至八个重复的每个进行评分，使得对于每个样品的最高得分是12(四个重复测定)和24(八个重复测定)。平均得分值或累计得分值被用来区分活性。如果样品的得到≥1的平均分，则认为在澄清的裂解物中测试的蛋白质浓度下是有活性的。
实例11-鉴定植物穿孔素的HMM谱图
IPD079Aa(SEQ ID NO:2)和示例性的IPD079多肽家族的其他成员显示与具有PfamID#IPR020864的攻膜复合体/穿孔素(MACPF)域蛋白质的同源性(参考Pfam数据库：en.wikipedia.org/wiki/Pfam，其可以使用www前缀访问)。
通过使用BLAST和HMMSearch在来自靶标植物物种的转录物组装体的内部数据库中查询IPD079同系物和Pfam ID#IPR020864的蛋白质序列来鉴定植物穿孔素。穿孔素转录组HMM采样的翻译在全部六个框架中产生，翻译是从甲硫氨酸到终止密码子，具有>＝50个氨基酸的蛋白质大小。在所得翻译上重复HMMSearch以消除不正确的框架翻译。使用MEGA 6程序(分子进化遗传分析(Molecular Evolutionary Genetic Analysis)-Tamura K.等人(2013)Mol.Biol.Evol.[分子生物学与进化]30(12):2725-2729)使用软件MUSCLE(Edgar，Robert C.(2004)，Nucleic Acids Research[核酸研究]19；32(5):1792-7)比对如此确定的同系物。用MEGA 6程序和最大似然量法完成系统发育分析(Jones D.T.等人(1992).CompAppl Biosci[应用生物科学]8:275-282；Tamura K.等人(2013)Mol.Biol.Evol.[分子生物学与进化]30(12):2725-2729)。生成的树的分支被注释分为五个主要分支，并为每个分组进行子分配。
使用
Figure BDA0003795187100001911
3.0软件套件的HMMbuild模块(Finn,R.，Nucleic Acid Research[核酸研究]39:Web Server issue(Web服务器问题)W20-W37，2011)，基于多序列比对(MSA)，产生本公开的IPD079同系物、本公开的IPD094Aa(SEQ ID NO:144)的IPD079多肽家族的HMM谱，以及活性细菌谱AXMI-205(美国专利公开20110023184)。每个主要分支的代表被调整并用于建立HMM。HMM谱是多个序列比对的统计模型，甚至是单个序列的统计模型。它们捕获关于比对中的每一列的保守程度以及最可能存在的残基的位点特异性信息。将
Figure BDA0003795187100001912
(使用序型隐蔽马尔科夫模型的生物序列分析)用于搜索序列数据库中蛋白质序列的同系物，并进行蛋白质序列比对。
Figure BDA0003795187100001913
可用于使用单个查询序列搜索序列数据库，但当查询是序列家族的多序列比对时，它会变得特别有用。
Figure BDA0003795187100001914
为查询指定一个谱图，该谱图指定用于取代、插入和删除的位置特定的评分系统。
Figure BDA0003795187100001915
谱图是概率模型，称为“序型隐蔽马尔科夫模型”(HMM谱图)(Krogh等人，1994，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，235:1501-1531；Eddy，1998，Curr.Opin.Struct.Biol.[结构生物学新见]，6:361-365.；Durbin等人，蛋白质和核酸的概率模型(Probabilistic Models of Proteins andNucleic Acids.)剑桥大学出版社，英国剑桥，1998，Eddy，Sean R.，2010年3月，HMMER用户知道版本3.0，霍华德·休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Institute)，珍妮莉娅法姆研究学院(Janelia Farm Research Campus)，Ashburn VA，美国；美国专利公开US20100293118)。与BLAST、FASTA以及基于较早评分方法的其他序列比对和数据库搜索工具相比，因为
Figure BDA0003795187100001921
潜在的概率模型的强度，它的目标显著地更准确，更能够检测远端同系物。
与具有小于0.01的E值并且长度大于250个氨基酸的Pfam ID#IPR020864的HMM谱图匹配的所有蛋白质序列被认为是统计学显著地并且对应于基因家族。由于获得的所有统计学显著的蛋白质采样是植物穿孔素基因家族的成员，因此建议已知的活性细菌穿孔素的概况HMM对于优先考虑植物穿孔素的排序是特定的，并且鉴定植物穿孔素家族的其他成员。鉴定SEQ ID NO:158-1248的植物穿孔素家族成员。
实例12在WCRW的mCry3A抗性菌株中没有IPD079Aa的交叉耐药性
通过在mCry3A转基因玉米植物上选择WCRW来开发抗mCry3A(RR>92-fold)的WCRW菌株，其中该转基因玉米植物在根部六个选择(F3、F6、F7、F8、F10、和F12幼虫)>10,000ppm的总蛋白质下具有T0水平的mCry3A表达。在幼虫用于IPD079Aa(SEQ ID NO:2)的交叉抗性测试之前，在mCry3A转基因玉米植物上进行WCRW的另外选择，mCry3A在>30,000ppm的蛋白质在根中具有T0表达水平。通过如实例5中使用的相同的方法，使用WCRW饮食掺入生物测定来评估IPD079Aa(SEQ ID NO:2)对WCRW幼虫的影响。对昆虫死亡率和严重发育迟缓进行评分，并用于计算基于概率分析的抑制浓度(IC50和LC50)。抗性比率(RR)计算如下：RR＝(抗性WCRW的LC/IC50)/(易感WCRW的LC/IC50)。如表10所示，Cry3A抗性WCRW昆虫对IPD079Aa(SEQ ID NO:2)敏感。
表10
Figure BDA0003795187100001931
实例13作用方式
为了了解IPD079多肽毒性，通过体外竞争测定评估纯化的IPD079Aa(SEQ ID NO:2)和IPD079Ea(SEQ ID NO:56)与WCRW肠组织的特异性结合。根据Wolfersberger等人修改的方法(Comp Bioch Physiol[比较生物化学生理学]86A:301-308(1987))，使用氨基肽酶活性追踪富集，从三龄WCRW幼虫中分离中肠以制备刷状缘膜囊泡(BBMV)。BBMV代表昆虫中肠组织的上皮细胞衬里的顶膜组分，因此用作模拟系统，用于在摄食后，杀虫蛋白在肠内如何相互作用。
表达重组IPD079Aa(SEQ ID NO:2)和IPD079Ea(SEQ ID NO:56)，并使用氨基末端多组氨酸融合标签(6x His)从大肠杆菌表达系统中纯化。全长纯化的蛋白质用
Figure BDA0003795187100001933
488(生命技术公司(Life Technologies))标记，并使用缓冲液交换树脂(生命技术公司(Life Technologies)，A30006)按照制造商的建议将未掺入的荧光团与标记的蛋白质分离。在结合实验之前，通过凝胶密度测定对蛋白质进行定量，随后进行包括将BSA作为标准的SDS-PAGE分辨样品的Simply
Figure BDA0003795187100001932
(赛默科技公司(Thermo Scientific)染色。
结合缓冲液由50mM氯化钠、2.7mM氯化钾、8.1mM磷酸氢二钠和1.47mM磷酸二氢钾组成，pH 7.5。为了证明特异性结合并评估亲和性，将BBMV(5μg)与1nM Alexa-标记的IPD079Aa(SEQ ID NO:2)或IPD079Ea(SEQ ID NO:56)在100μL结合缓冲液中在室温孵育1小时，在增加浓度的未标记的IPD079Aa(SEQ ID NO:2)或IPD079Ea(SEQ ID NO:56)的存在和不存在。使用20,000g离心以沉淀BBMV以分离保留在溶液中的未结合的毒素。然后将BBMV沉淀用结合缓冲液洗涤两次以消除剩余的未结合的毒素。将最终的BBMV颗粒(具有结合的荧光毒素)溶于还原Laemmli样品缓冲液中，加热至100℃持续5分钟，并使用4％-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(生命技术公司(Life Technologies))经受SDS-PAGE。通过数字荧光成像系统(Image Quant LAS4000，GE医疗公司(GE Healthcare))测量来自每个样品的凝胶中Alexa标记的IPD079Aa(SEQ ID NO:2)或IPD079Ea(SEQ ID NO:56)的量。数字化的图像通过密度测量软件(Phoretix 1D，TotalLab,Ltd.)分析
基于将Alexa标记的IPD079Aa(SEQ ID NO:2)的结合降低50％所需的未标记蛋白的浓度(EC50值)，估计IPD079Aa(SEQ ID NO:2)对WCRW BBMV的表观亲和力。对于与WCRWBBMV(图3)结合的IPD079Aa(SEQ ID NO:2)，这个值约为1μM。
相似地，基于将Alexa标记的IPD079Ea(SEQ ID NO:56)的结合降低50％所需的未标记蛋白的浓度，估计IPD079Ea(SEQ ID NO:56)对WCRW BBMV的表观亲和力。IPD079Ea(SEQID NO:56)结合的EC50值约为1.1μM(图4)。
实例14-用于在植物中表达IPD079多肽的表达载体构建体
构建植物表达载体以包括含有编码IPD079Aa(SEQ ID NO:2)的两种不同基因设计中的一种和编码IPD079Ea(SEQ ID NO:56)的两种不同基因设计中的一种的转基因盒，在玉米泛素启动子控制下的与增强子元件结合。分别地，将这些所得构建体(PHP68039、PHP68040、PHP76130、和PHP76131)用于产生转基因玉米事件以测试通过IPD079Aa(SEQ IDNO:2)和IPD079Ea(SEQ ID NO:56)多肽的表达提供的针对玉米根虫的效力。
实例15-玉米的农杆菌介导的转化和转基因植物的再生
对于农杆菌介导的具有IPD079核苷酸序列的玉米的转化，使用Zhao的方法(美国专利号5,981,840和PCT专利公开号WO 1998/32326，其内容通过引用结合在此)。简而言之，从玉米中分离未成熟的胚，并且在特定条件下将胚与农杆菌悬浮液接触，借此该细菌能够将PHP68039、PHP68040、PHP76130、和PHP76131载体转移到至少一个未成熟的胚的至少一个细胞中(步骤1：侵染步骤)。在该步骤中，将未成熟胚胎浸泡在农杆菌悬液中，引发接种。使这些胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在侵染步骤后，可以在固体培养基上培养未成熟的胚。在此共同培养期之后，设想任选的“静置”步骤。在该静置步骤中，将这些胚在已知抑制农杆菌生长的至少一种抗生素的存在下孵育，而不添加植物转化子的选择剂(步骤3：静置步骤)。将这些未成熟的胚胎在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并用于经侵染的细胞的静置期。接着，在含有选择剂的培养基上培养经接种的胚胎，并且回收生长的经转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在含选择剂的固体培养基上培养这些未成熟胚胎，使经转化的细胞选择性生长。然后将愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，并使生长在选择培养基上或在固体培养基上培养的愈伤组织以再生植物。
为了检测叶组织中的IPD079蛋白，将4个冻干叶穿孔/样品粉碎并重新悬浮于含有0.1％Tween 20的100μL PBS(PBST)、含有1片/7mL完整的迷你蛋白酶抑制剂(罗氏公司1183615301)的1％β-巯基乙醇中。将悬浮液超声处理2分钟，并且然后在4℃、20,000g进行离心持续15分钟。向上清液等份1/3体积的3X
Figure BDA0003795187100001963
LDS样品缓冲液(InvitrogenTM，加利福尼亚州，美国)中，添加含有1片7mL完整迷你蛋白酶抑制剂的1％B-ME。将反应物在80℃加热10分钟，并且然后离心。将上清液样品按照制造商(InvitrogenTM)说明书装载在具有MES运行缓冲液的4％-12％Bis-Tris Midi凝胶上，并使用
Figure BDA0003795187100001962
装置(InvitrogenTM)转移到硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜在含有5％脱脂奶粉的PBST中孵育2小时，然后在PBST中亲和纯化的兔抗IPD079Aa中孵育过夜。将膜用PBST冲洗三次，并且然后在PBST中孵育15分钟，并且然后冲洗两次5分钟，然后孵育2小时在具有山羊抗兔HRP的PBST中持续3小时。使用ECL蛋白质印迹试剂(GE医疗集团，目录号RPN2106)和
Figure BDA0003795187100001961
Mr膜可以观察到所检测的蛋白质。为了检测根中的IPD079Aa蛋白，将根冻干，并且将每个样品2mg粉末重新悬浮于LDS中，添加含有1片/7mL完整迷你蛋白酶抑制剂的1％β-巯基乙醇。将反应在80℃下加热10分钟，并且然后在4℃、20,000g进行离心持续15分钟。将上清液样品按照制造商(InvitrogenTM)说明书装载在具有MES运行缓冲液的4％-12％Bis-Tris Midi凝胶上，并使用
Figure BDA0003795187100001964
装置(InvitrogenTM)转移到硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜在含有5％脱脂奶粉的PBST中孵育2小时，然后在PBST中亲和纯化的多克隆兔抗IPD079抗体中孵育过夜。膜用PBST冲洗三次，并且然后在PBST中孵育15分钟，并且然后冲洗两次5分钟，然后孵育2小时，在具有山羊抗兔HRP的PBST中持续3小时。使用ECLTM蛋白质印迹试剂(GE医疗集团，目录号RPN2106)和
Figure BDA0003795187100001965
Figure BDA0003795187100001966
Mr膜可以检测到抗体结合杀昆虫蛋白。
使用本领域已知的标准生物测定法测试杀昆虫蛋白表达阳性的转基因玉米植物的杀有害生物活性。这些方法包括例如根切除生物测定和全植物生物测定。参见，例如，美国专利申请公开号US 2003/0120054和国际公开号WO 2003/018810。
实例16-IPD079多肽事件的温室效力
图5显示了从PHP68039、PHP68040、PHP76130、和PHP76131构建体产生的事件的T0温室效力结果。相对于如通过保护根部免受西方玉米根虫影响所测量的阴性对照事件，观察到源自所有4个构建体的事件的效力。使用由Oleson等人，(2005)，[J.Econ Entomol.(经济昆虫学期刊)98(1):1-8]开发的方法，根据损伤的根的节点数测量根保护(CRWNIS＝玉米根虫节点损伤评分)。根损伤评分测量为从“0”到“3”，其中“0”表示无可见根损伤，“1”表示1个根损害节点，“2”表示2个节点或根损害，并且“3”表示3个节点的根损害的最大得分。中间得分(例如1.5)表示损害节点的额外分数(例如1.5个所损伤的节点)。图5显示，来自PHP68039、PHP68040、PHP76130、和PHP76131的大多数事件比具有<1.0的根虫损伤评分的阴性对照表现更好。
实例17-嵌合IPD079多肽
为了产生具有多样化序列的活性IPD079变体，通过多个PCR片段重叠组装(Gibson组装克隆试剂盒，纽英伦生物技术公司(New England Biolabs))产生IPD079Aa(SEQ IDNO:2)与IPD079Ea(SEQ ID NO:56)之间的嵌合体。构建总共3个嵌合体：表11显示交叉点，与IPD079Aa(SEQ ID NO:2)的％序列同一性和西方玉米根虫活性结果。命名为79嵌合体1(SEQID NO:1277)的嵌合体在其N末端以IPD079Aa序列开始，而命名为79嵌合体2(SEQ ID NO:1278)和79嵌合体3(SEQ ID NO:1275)的嵌合体在其N-末端以IPD079Ea序列开始。IPD079Aa(SEQ ID NO:2)、IPD079Ea(SEQ ID NO:56)、79嵌合体1(SEQ ID NO:1277)、79嵌合体2(SEQID NO:1278)、和79嵌合体3(SEQ ID NO:1276)的氨基酸序列比对显示在图6中。
表11
Figure BDA0003795187100001981
基于该比对的交换位置的个数显示在图6中。
对本公开的不同所示实施例的上述描述并不旨在是详尽的或者限制范围于所公开的精确形式。虽然为了说明目的而在此描述了具体实施例和实例，但是在本公开范围内，如相关领域的技术人员将认识到的，不同的等效修饰是可能的。本文提供的教导可以应用于除了上述实例之外的其他目的。根据上述教导，许多修改和变化是可能的，因此它们在所附权利要求书的范围内。
可以根据上述详细描述进行这些改变和其他改变。通常，在以下权利要求书中，所使用的术语不应被解释为将范围限制于说明书和权利要求书中公开的具体实施例。
背景技术、详细描述和实例中引用的每个文献(包括专利、专利申请、杂志文章、摘要、手册、书籍或其他公开内容)的全部公开内容通过引用以其整体结合在此。
就使用的数字(例如量、温度、浓度等)而言，已努力确保其准确性，但仍应允许有一些实验误差和偏差。除非另有说明，份为重量份，分子量为平均分子量；温度是摄氏度；并且压力为大气压或接近大气压。

Claims (10)

1.一种包含SEQ ID NO:2、64、66或SEQ ID NO: 144的氨基酸序列的重组杀昆虫多肽。
2.权利要求1的重组杀昆虫多肽，其中所述杀昆虫多肽连接至异源信号序列或转运序列。
3.权利要求1或2的重组杀昆虫多肽，其中所述杀昆虫活性是针对鞘翅目(Coleopteran)有害生物。
4.权利要求3的重组杀昆虫多肽，其中所述杀昆虫活性是针对根萤叶甲属(Diabrotica)物种。
5.权利要求4的重组杀昆虫多肽，其中所述杀昆虫活性是针对玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera)、斑点黄瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctata howardi)或北方玉米根虫(Diabroticabarberi)。
6.一种重组多核苷酸，其编码权利要求1的杀昆虫多肽。
7.一种重组多核苷酸，其编码权利要求2的杀昆虫多肽。
8.一种重组多核苷酸，其编码权利要求3的杀昆虫多肽。
9.权利要求6、7或8的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸是非基因组多核苷酸。
10.权利要求9的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸是cDNA。
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