DE69831145T2

DE69831145T2 - Sojabohnenpflanzen, welche samen mit veringertem gehalt an raffinose sacchariden und phytinsäure produzieren

Info

Publication number: DE69831145T2
Application number: DE69831145T
Authority: DE
Inventors: Dean William HITZ; Anthony Scott SEBASTIAN
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1997-04-08
Filing date: 1998-04-07
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2018-04-08
Also published as: CN1252098A; CA2281896A1; AR015801A1; HUP0001743A2; HUP0001743A3; AU7102898A; CA2281896C; WO1998045448A1; JP2001519665A; EP0973913A1; NZ500036A; DE69831145D1; BR9808484A; ES2246534T3; NO994884D0; EP0973913B1; KR20010006141A; ZA982961B; AU746521B2; NO994884L

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung ist das Gebiet der Molekularbiologie und Genetik von Pflanzen. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Sojaprotein- und Sojamehl-Produkte mit signifikant niedrigeren Gehalten an Raffinose, Stachyose und Phytinsäure und signifikant höheren Gehalten an Saccharose und anorganischem Phosphat als eine Funktion der Verwendung von Sojabohnenlinien mit einer erblichen, verminderten Kapazität zur Produktion von myo-Inositol-phosphat in ihren Samen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Raffinose-Saccharide stellen eine Gruppe von D-Galactose-enthaltenden Oligosacchariden von Saccharose dar, die in Pflanzen weit verbreitet sind. Raffinose-Saccharide sind dadurch gekennzeichnet, dass sie die allgemeine Formel O-α-D-Galactopyranosyl-(1→6)_n-α-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-fructofuranosid aufweisen, worin n = 1 bis n = 4 als Raffinose, Stachyose, Verbascose bzw. Ajugose bekannt sind. In Sojabohnensamen stellen Raffinose und Stachyose Raffinose-Saccharide dar, die in der größten Quantität vorliegen. Im Gegensatz dazu sind Verbascose und Ajugose unbedeutendere Komponenten und werden im Allgemeinen nicht durch die analytischen Standardverfahren nachgewiesen.
Umfangreiche botanische Erhebungen zum Auftreten von Raffinose-Sacchariden wurden in der wissenschaftlichen Literatur mitgeteilt [Dey, P. M. In Biochemistry of Storage Carbohydrates in Green Plants, Academic Press, London, (1985), S. 53–129]. Es besteht die Ansicht, dass Raffinose-Saccharide an zweiter Stelle gleich nach der Saccharose unter den nicht strukturellen Kohlenhydraten in Bezug auf die Fülle im Pflanzenreich vorkommen. Raffinose-Saccharide können tatsächlich, mindestens unter höheren Pflanzen, ubiquitär vorkommen. Raffinose-Saccharide akkumulieren sich in signifikanten Mengen im genießbaren Anteil von vielen wirtschaftlich signifikanten Nutzpflanzenspezies. Zu den Beispielen gehören die Sojabohne (Glycine max. L. Merrill), Zuckerrübe (Beta vulgaris), Baumwolle (Gossypium hirsutum L.), Canola (Brassica sp.) und alle bedeutenden genießbaren Leguminosen, einschließlich Bohnen (Phaseolus sp.), Kichererbsen (Cicer arietinum), Kuhbohnen (Vigna unguiculata), Mungbohnen (Vigna radiata), Erbsen (Pisum sativum), Linsen (Lens culinaris) und Lupinen (Lupinus sp.).
Obwohl sie in vielen Spezies in Fülle vorhanden sind, stellen Raffinose-Saccharide ein Hindernis für die effiziente Verwertung von einigen wirtschaftlich wichtigen Nutzpflanzenspezies dar. Raffinose-Saccharide werden von Tieren nicht direkt verdaut, hauptsächlich weil in ihrer Darmschleimhaut keine α-Galactosidase vorliegt (Gitzelmann und Auricchio. (1965) Pediatrics 36: 231–236; Rutloff et al. (1967) Nahrung. 11: 39–46]. Die Mikroflora im unteren Darmabschnitt ist ohne weiteres dazu in der Lage, die Raffinose-Saccharide zu fermentieren, was in der Ansäuerung des Darmes und der Bildung von Kohlendioxid, Methan und Wasserstoff resultiert [Murphy et al. (1972) J. Agr. Food Chem. 20: 813–817; Cristofaro et al. In Sugars in Nutrition, (1974) Kapitel 20, 313–335; Reddy et al. (1980) J. Food Science 45: 1161–1164]. Die resultierende Flatulenz kann die Verwendung von Leguminosen in der Ernährung von Tieren, einschließlich Menschen, weitgehend einschränken. Es ist bedauerlich, dass die Anwesenheit von Raffinose-Sacchariden die Verwendung von Sojabohnen in der Ernährung von Tieren, einschließlich Menschen, einschränkt, weil diese Spezies andernfalls eine ausgezeichnete Protein- und Faserquelle darstellt.
Die Sojabohne ist an die Maschinen und Einrichtungen zum Ernten, Lagern und Verarbeiten, die in vielen Teilen der Welt weithin zur Verfügung stehen, gut angepasst. In den USA allein wurden 1988 ca. 28 Millionen metrische Tonnen Mehl hergestellt [Oil Crops Situation and Outlook Report, Apr. 1989, U.S. Dept. of Agriculture, Economic Research Service]. Die Hülsen werden in der Regel entfernt, und das Öl wird dann mit Hexan in einem von mehreren Extraktionssystemen entfernt. Die verbleibenden entfetteten Flocken können dann für viele verschiedene gewerbliche Sojabohnenprodukte verwendet werden [Soy Protein Products, Characteristics, Nutritional Aspects and Utilization (1987) Soy Protein Council]. Im Vordergrund unter diesen steht hinsichtlich des Verwendungsvolumens Sojabohnenmehl, die Hauptquelle von Protein in als Tierfutter verwendeten Rationen, insbesondere denen für monogastrische Tiere, wie zum Beispiel Geflügel und Schweine.
Obwohl die Sojabohne eine ausgezeichnete pflanzliche Proteinquelle darstellt, gibt es mit ihrer Verwendung einhergehende Ineffizienzen, die auf die Anwesenheit von Raffinose-Sacchariden zurückzuführen zu sein scheinen. Im Vergleich zu Mais, dem anderen wichtigen Bestandteil in Tierrationen, ist die Bruttoenergieverwertung für Sojabohnenmehl gering [Potter und Potchanakorn. In: Proceedings World Soybean Conference III, (1984) 218–224]. Obwohl Sojabohnenmehl zum Beispiel ca. 6% mehr Bruttoenergie als gemahlener Gelbmais enthält, besitzt es ca. 40 bis 50% weniger verstoffwechselbare Energie, wenn es an Hühner verfüttert wird. Diese Ineffizienz der Bruttoenergieverwertung scheint nicht auf Probleme bei der Verdauung der Proteinfraktion des Mehls, sondern vielmehr auf die schlechte Verdauung des Kohlenhydratanteils des Mehls zurückzuführen sein. Es wurde berichtet, dass die Entfernung von Raffinose-Sacchariden aus Sojabohnenmehl durch Extraktion mit Ethanol zu einer großen Steigerung der verstoffwechselbaren Energie für Broiler führt [Coon, C. N. et al. In: Proceedings Soybean Utilization Alternatives, University of Minnesota, (1988) 203–211]. Die Entfernung der Raffinose-Saccharide war von einer erhöhten Verwertung der Cellulose- und Hemicellulosefraktionen des Sojabohnenmehl begleitet.
Viele verschiedene verarbeitete pflanzliche Proteinprodukte werden aus Sojabohnen hergestellt. Diese reichen von minimal verarbeiteten, entfetteten Gegenständen, wie zum Beispiel Sojabohnenmehl, grobem Maismehl und Mehlen zu hoch verarbeiteten Gegenständen, wie zum Beispiel Sojaprotein-Konzentraten und Sojaprotein-Isolaten. In anderen Sojaprotein-Produkten, wie zum Beispiel dem vollfetten Sojabohnenmehl, wird das Öl nicht extrahiert. Zusätzlich zu diesen verarbeiteten Produkten gibt es auch eine Anzahl von Spezialitätenprodukten, die auf herkömmlichen orientalischen Prozessen basieren, die sich die ganze Bohne als Ausgangsmaterial zunutze machen. Zu Beispielen zählen Sojamilch, Sojasoße, Tofu, Natto, Miso, Tempeh und Yuba.
Beispiele zur Verwendung von Sojaprotein-Produkten in humanen Nahrungsmitteln schließen Sojaprotein-Konzentrate, Sojaprotein-Isolate, texturiertes Sojaprotein, Sojamilch und Säuglingsnahrung ein. Die Einrichtungen und Verfahren zur Herstellung von Proteinkonzentraten und -isolaten aus Sojabohnen stehen weltweit zur Verfügung. So wurde zum Beispiel in WO 97/37547 ein Verfahren zur Herstellung eines mit Isoflavon angereicherten Sojaprotein-Produkts beschrieben. Eines der Probleme, denen sich die Hersteller von Sojaprotein-Konzentraten und -Isolaten gegenüber sehen, besteht in der Herausforderung der selektiven Reinigung des Proteins durch Entfernung der Raffinose-Saccharide. Erhebliche Ausrüstungs- und Betriebskosten entstanden aufgrund der Entfernung der in Sojabohnen vorhandenen großen Mengen an Raffinose-Sacchariden.
Die mit den Raffinose-Sacchariden einhergehenden Probleme und Kosten könnten durch die Verfügbarkeit von Genen, die eine Reduktion des Raffinose-Saccharidgehaltes von Sojabohnensamen verleihen, gesenkt oder eliminiert werden. Solche Gene könnten zur Entwicklung von Sojabohnenvarietäten mit inhärent reduziertem Raffinose-Saccharidgehalt verwendet werden. Sojabohnenvarietäten mit inhärent reduziertem Raffinose-Saccharidgehalt würden die von Sojaprotein-Produkten abgeleitete nutritive Qualität verbessern und die mit der Entfernung von Raffinose-Sacchariden einhergehenden Verarbeitungskosten reduzieren. Sojabohnenvarietäten mit niedrigem Raffinose-Saccharidgehalt wären für die Ernährung von Tieren und Menschen wertvoller als übliche Varietäten und würden der Menschheit eine vollere Verwertung der wünschenswerten nutritiven Qualitäten dieser genießbaren Leguminose erlauben.
myo-Inositol-hexaphosphat (auch als „Phytinsäure" bekannt) und Raffinose-Saccharide teilen sich in ihrer Synthese myo-Inositol als ein gemeinsames Intermediärprodukt [Ishitani, M. et al., (1996) The Plant Journal 9: 537–548]. Genau wie Raffinose-Saccharide stellt die Phytinsäure eine nahezu ubiquitäre Komponente von Bedecktsamern dar [Raboy, V. In: Inositol Metabolism in Plants (1990) Wiley-Liss, New York, S. 55–76]. Während Phytinsäure in der Regel 50 bis 70% des Gesamtphosphats in Samen, wie zum Beispiel Sojabohnen und Mais, ausmacht, steht dieses Phosphat monogastrischen Tieren nur unzureichend zur Verfügung. Zusätzlich zu seiner nur teilweisen Verdaulichkeit führt die Anwesenheit von Phytinsäure in Tienationen zur Exkretion anderer einschränkender Nährstoffe, wie zum Beispiel essenziellen Aminosäuren, Calcium und Zink [Mroz, Z. et al., (1994) J. Animal Sci. 72: 126–132; Fox et al., In: Nutritional Toxicology Vol. 3, Academic Press, San Diego (1989) S. 59–96]. Da Sojabohnenmehl einen bedeutenden Anteil vieler Tierfutterrationen darstellt, sollte ein Mehl mit herabgesetzten Mengen an Phytinsäure zusammen mit erhöhten Mengen von verfügbarem Phosphat zur verbesserten Futtereffizienz in Soja enthaltenden Rationen führen. Die enzymatische Behandlung von Sojabohnenmehl enthaltenden Rationen zur teilweisen Hydrolyse der Phosphatgruppen aus Phytinsäure verbessert sowohl die Phosphat-Verfügbarkeit als auch die Verfügbarkeit anderer einschränkender Nährstoffe [Mroz et al., vorstehend; Pen et al., (1993) Biotechnology 11: 811–814].
Erhebungen zu gewerblichem und wildem Sojabohnen-Keimplasma lassen erkennen, dass eine eingeschränkte genetische Variabilität für den Phytinsäuregehalt im Samen existiert [Raboy et al., (1984) Crop Science 24: 431–434]. Angesichts dieser Faktoren wird man erkennen, dass Sojabohnenpflanzen mit erblichem, im Wesentlichen reduzierten Raffinose-Saccharid- und Phytinsäurespiegeln in ihren Samen benötigt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Sojabohnenpflanze mit einem erblichen Phänotyp von (i) einem Phytinsäuregehalt im Samen von weniger als 17 μmol/g, (ii) einem kombinierten Raffinose- plus Stachyosegehalt im Samen von weniger als 14,5 μmol/g und (iii) einem Saccharosegehalt von größer als 200 μmol/g, wobei der Phänotyp auf eine verminderte Kapazität für die Synthese von myo-Inositol-1-phosphat in den Samen der Pflanzen zurückzuführen ist. Gegenstand der Erfindung sind auch von dieser Pflanze abgeleitete Samen.
Gegenstand dieser Erfindung ist insbesondere ein Nukleinsäurefragment, codierend eine myo-Inositol-1-phosphat-Synthase der Sojabohne oder sein Komplement, und ein chimäres Gen, umfassend dieses Nukleinsäurefragment oder ein Subfragment dieses Nukleinsäurefragments, das funktionsfähig mit geeigneten Regulationssequenzen verknüpft ist, worin die Expression des chimären Gens zu einer Abnahme der Expression eines nativen Gens führt, das eine myo-Inositol-1-phosphat-Synthase der Sojabohne codiert.
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungform ist ein isoliertes Nukleinsäurefragment, codierend eine mutierte myo-Inositol-1-phosphat-Synthase mit einer verminderten Kapazität für die Synthese von myo-Inositol-1-phosphat.
Eine noch andere erfindungsgemäße Ausführungsform ist eine Sojabohnenpflanze, die in ihrem Genom ein chimäres Gen aufweist, das ein Nukleinsäurefragment umfasst, codierend eine myo-Inositol-1-phosphat-Synthase der Sojabohne oder das Komplement des Nukleinsäurefragments, das funktionsfähig mit geeigneten Regulationssequenzen verknüpft ist, worin die Expression des chimären Gens zu einer Verminderung der Expression eines nativen Gens führt, das eine myo-Inositol-1-phosphat-Synthase der Sojabohne codiert.
Eine noch andere erfindungsgemäße Ausführungsform ist eine Sojabohnenpflanze, die für mindestens ein Gen homozygot ist, das eine mutierte myo-Inositol-1-phosphat-Synthase mit verminderter Kapazität für die Synthese von myo-Inositol-1-phosphat codiert, wobei das Gen einen erblichen Phänotyp von (i) einem Phytinsäuregehalt im Samen von weniger als 17 μmol/g, (ii) einem kombinierten Raffinose- plus Stachyosegehalt im Samen von weniger als 14,5 μmol/g und (iii) einem Saccharosegehalt im Samen von größer als 200 μmol/g verleiht.
Gegenstand der Erfindung sind auch die Samen und Proteinprodukte, die sich von den Samen und jeglichen der vorstehend beschriebenen Pflanzen ableiten.
Eine noch andere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein Verfahren zur Herstellung einer Sojabohnenpflanze mit einem erblichen Phänotyp von (i) einem Phytinsäuregehalt im Samen von weniger als 17 μmol/g, (ii) einem kombinierten Raffinose- plus Stachyosegehalt im Samen von weniger als 14,5 μmol/g und (iii) einem Saccharosegehalt im Samen von größer als 200 μmol/g, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Kreuzen der Sojabohnenlinie LR33 oder jedweder Sojabohnenpflanze, die in ihrem Genom ein chimäres Gen aufweist, umfassend ein Nukleinsäurefragment, codierend eine myo-Inositol-1-phosphat-Synthase der Sojabohne oder das Komplement des Nukleinsäurefragments, das funktionsfähig mit geeigneten Regulationssequenzen verknüpft ist oder eine Sojabohnenpflanze, die für mindestens ein Gen homozygot ist, codierend eine mutierte myo-Inositol-1-phosphat-Synthese mit verminderter Kapazität zur Synthese von myo-Inositol-1-phosphat, mit einer elitären Sojabohnenpflanze; und (b) Auswahl der Pflanzennachkommenschaft der Kreuzung von Schritt (a), die einen erblichen Phänotyp von (i) einem Phytinsäuregehalt des Samens von weniger als 17 μmol/g, (ii) einem kombinierten Raffinose- plus Stachyosegehalt des Samens von weniger als 14,5 μmol/g und (iii) einem Saccharosegehalt des Samens von größer als 200 μmol/g aufweisen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Sojabohnenproduktes umfassend (a) die Kreuzung einer agronomisch elitären Sojabohnenpflanze mit LR33 oder jedweder der hierin vorstehend beschriebenen Sojabohnenpflanzen; (b) Screening des Samens der aus Schritt (a) erhaltenen Pflanzennachkommenschaft auf (i) einen Phytinsäuregehalt des Samens von weniger als 17 μmol/g, (ii) einen kombinierten Raffinose- plus Stachyosegehalt des Samens von weniger als 14,5 μmol/g und (iii) einen Saccharosegehalt des Samens von größer als 200 μmol/g; und (c) Processing des in Schritt (b) ausgewählten Samens zum Erhalt des gewünschten Sojaprotein-Produkts.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Verfahren zur Verwendung einer Sojabohnenpflanze, die für mindestens ein Gen homozygot ist, codierend eine mutierte myo-Inositol-1-phosphat-Synthase, die eine verminderte Kapazität zur Synthese von myo-Inositol-1-phosphat aufweist, wobei das Gen einen erblichen Phänotyp von (i) einem Phytinsäuregehalt des Samens von weniger als 17 μmol/g, (ii) einem kombinierten Raffinose- plus Stachyosegehalt des Samens von weniger als 14,5 μmol/g und (iii) einem Saccharosegehalt des Samens von größer als 200 μmol/g zur Herstellung von Linien der Nachkommenschaft verleiht, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Kreuzung einer Sojabohnenpflanze, umfassend eine mutierte myo-Inositol-1-phosphat-Synthase mit verminderter Kapazität zur Synthese von myo-Inositol-1-phosphat mit jedwedem Sojabohnen-Elternteil, das nicht die Mutation umfasst, um einen F1-Hybrid zu ergeben; (b) Selbstung des F1-Hybrids für mindestens eine Generation; und (c) Identifizierung der Nachkommenschaft von Schritt (b), homozygot für mindestens ein Gen, codierend eine mutierte myo-Inositol-1-phosphat-Synthase mit verminderter Kapazität zur Synthese eines myo-Inositol-1-phosphats, wobei das Gen einen erblichen Phänotyp von (i) einem Phytinsäuregehalt des Samens von weniger als 17 μmol/g, (ii) einem kombinierten Raffinose- plus Stachyosegehalt des Samens von weniger als 14,5 μmol/g und (iii) einem Saccharosegehalt des Samens von größer als 200 μmol/g verleiht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN UND SEQUENZPROTOKOLLE
Die Erfindung kann anhand der Figur und Sequenzprotokolle, die einen Teil dieser Anmeldung bilden, besser verstanden werden. Die Sequenzprotokolle enthalten die aus drei Buchstaben bestehenden Codes für Aminosäuren wie nach 37 C.F.R. 1.822 definiert, die hierin unter Bezugnahme enthalten sind.
1. Glucose-Metabolismus zu Phytinsäure, Raffinose und Stachyose in Sojabohnensamen. Die gemeinsamen Cofaktoren ATP, ADP, UTP, UDP, Pyrophosphat und anorganisches Phosphat (Pi) sind nicht gezeigt. Die Enzyme sind anhand von Abkürzungen aufgelistet: Hexokinase (HK); Phosphoglucoisomerase (PGI); UDP-Glucosepyrophosphorylase (UDPGPP); UDP-Glucose-4'-Epimerase (UDPG 4'E)); myo-Inositol-1-phosphat-Synthase (MI 1-PS); myo-Inositol-1-Phosphatase (MI 1-Pase); myo-Inositol-1-phosphat-Kinase (MI 1-PK); Galactinol-Synthase (GAS); Saccharose-Synthase (SucS); Raffinose-Synthase (RS) und Stachyose-Synthase (SS).
SEQ ID NO: 1 stellt die 5'- bis 3'-Nukleotidsequenz der 1782 Basen der cDNA, codierend die myo-Inositol-1-phosphat-Synthase der im Clon p5bmi-1ps vorliegenden Wildtyp-Sojabohne dar.
SEQ ID NO: 2 stellt die aus 510 Aminosäuren bestehende Sequenz dar, die aus dem offenen Leserahmen von SEQ ID NO: 1 abgeleitet wird.
SEQ ID NO: 3 stellt die Nukleotidsequenz des stromaufwärtigen (5') Primers dar, der bei der Isolation der cDNA der myo-Inositol-1-phosphat-Synthase aus der Sojabohnen-Linie LR33 verwendet wird.
SEQ ID NO: 4 stellt die Nukleotidsequenz des stromabwärtigen (3') Primers dar, der bei der Isolation der cDNA der myo-Inositol-1-phosphat-Synthase aus der Sojabohnen-Linie LR33 verwendet wird.
SEQ ID NO: 5 stellt die Nukleotidsequenz der 1533 Basen von cDNA dar, codierend myo-Inositol-1-phosphat-Synthase von LR33, die im Clon LR±33-10 vorliegt.
SEQ ID NO: 6 stellt die Sequenz aus 510 Aminosäuren dar, die sich aus dem offenen Leserahmen in SEQ ID NO: 5 ableitet.
SEQ ID NO: 7 stellt die Nukleotidsequenz des stromaufwärtigen (5') Primers dar, der zur PCR-Amplifikation des Wildtyp-Allels verwendet wird, das myo-Inositol-1-phosphat-Synthase aus genomischen DNA-Proben codiert.
SEQ ID NO: 8 stellt die Nukleotidsequenz des stromaufwärtigen (5') Primers dar, der zur PCR-Amplifikation des LR33-Allels verwendet wird, das myo-Inositol-1-phosphat-Synthase aus genomischen DNA-Proben codiert.
BIOLOGISCHE HINTERLEGUNGEN
Die folgenden biologischen Materialien wurden unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, hinterlegt und tragen die folgenden Zugangsnummern:
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Im Zusammenhang mit dieser Offenbarung sollen eine Reihe von Begriffen verwendet werden. Wie hierin verwendet, versteht man unter „Sojabohne" die Spezies Glycine max, Glycine soja oder jedwede Spezies, die mit Glycine max sexuell kreuzkompatibel ist. Eine „Linie" stellt eine Gruppe von Pflanzen von ähnlicher Abstammung dar, die wenig oder keine genetische Variation zwischen Individuen für mindestens ein Merkmal aufweisen. Solche Linien können von einer oder mehr Generationen) der Selbstbestäubung und Selektion oder vegetativen Fortpflanzung von einem einzelnen Elternteil, einschließlich mittels Gewebs- oder Zellkulturverfahren geschaffen werden. Unter „Mutation" versteht man eine nachweisbare und erbliche genetische Veränderung (entweder spontan oder induziert), die nicht durch Segregation oder genetische Rekombination veranlasst wird. Unter „Mutant" versteht man ein Individuum oder eine Abstammung von Individuen, die eine Mutation besitzen. Eine „Population" stellt jedwede Gruppe von Individuen dar, die sich einen gemeinsamen Gen-Pool teilen. Erfindungsgemäß schließt dies M1-, M2-, M3-, M4-, F1- und F2-Populationen ein. Wie hierin verwendet, stellt eine „M1-Population" die Nachkommenschaft von Samen (und sich ergebenden Pflanzen) dar, die einem mutagenen Agens ausgesetzt wurden, während die „M2-Population" die Nachkommenschaft von selbstbestäubten M1-Pflanzen darstellt, die „M3-Population" die Nachkommenschaft von selbstbestäubten M2-Pflanzen darstellt und die „M4-Population" die Nachkommenschaft von selbstbestäubten M3-Pflanzen darstellt. Wie hierin verwendet, stellt eine „F1-Population" die Nachkommenschaft dar, die sich aus der Kreuzbestäubung einer Linie mit einer anderen Linie ergibt. Das hierin zur Erläuterung einer solchen Kreuzbestäubung verwendete Format ist „weibliches Elternteil·männliches Elternteil". Eine „F2-Population" stellt die Nachkommenschaft der selbstbestäubten F1-Pflanzen dar. Eine „F2-abgeleitete Linie" oder „F2-Linie" stellt eine Linie dar, die sich aus der Selbstbestäubung einer individuellen F2-Pflanze ergibt. Eine F2-abgeleitete Linie kann durch die sich anschließenden Generationen (F3, F4, F5 usw.) durch wiederholte Selbstbestäubung und Bulking von Samen aus Pflanzen von der F2-abgeleiteten Linie wiederholt werden.
Unter dem Begriff „Nukleinsäure" versteht man ein großes Molekül, das einsträngig oder doppelsträngig sein kann, sich aus Monomeren (Nukleotiden) zusammensetzt, die einen Zucker, ein Phosphat und entweder ein Purin oder Pyrimidin enthalten. Ein „Nukleinsäurefragment" stellt eine Fraktion aus einem bestimmten Nukleinsäuremolekül dar. Unter einem „Subfragment" versteht man einen angrenzenden Anteil eines Nukleinsäurefragments, das weniger als das gesamte Nukleinsäurefragment umfasst. Unter „komplementär" versteht man die spezifische Paarung von Purin- und Pyrimidinbasen, die Nukleinsäuren umfassen: Adeninpaare mit Thymin und Guaninpaare mit Cytosin. Folglich verweist das „Komplement" eines ersten Nukleinsäurefragments auf ein zweites Nukleinsäurefragment, dessen Sequenz von Nukleotiden komplementär zu der ersten Nukleinsäuresequenz ist.
In höheren Pflanzen stellt die Desoxyribonukleinsäure (DNA) das genetische Material dar, während Ribonukleinsäure (RNA) am Transfer der Information in DNA in Proteine beteiligt ist. Ein „Genom" stellt den gesamten Umfang des genetischen Materials dar, das in jeder Zelle eines Organismus enthalten ist. Unter dem Begriff „Nukleotidsequenz" versteht man die Sequenz von DNA- oder RNA-Polymeren, die ein- oder doppelsträngig sein können, optional synthetische, nicht natürliche oder veränderte Nukleotidbasen enthalten, die zur Inkorporation in DNA- oder RNA-Polymere fähig sind. Unter dem Begriff „Oligomer" versteht man kurze Nukleotidsequenzen, gewöhnlich bis zu 100 Basen lang. Wie hierin verwendet versteht man unter dem Begriff „homolog zu" die Verwandtschaft zwischen der Nukleotidsequenz von zwei Nukleinsäuremolekülen oder zwischen den Aminosäuresequenzen von zwei Proteinmolekülen. Wie vom Fachmann durchaus erkannt werden wird, werden Bestimmungen einer derartigen Homologie entweder mithilfe der DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung unter Stringenzbedingungen (Hames und Higgins, Hrsg. (1985) Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, Oxford, GB); oder durch den Vergleich von Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Nukleinsäuren oder Proteinen, wie zum Beispiel anhand des Verfahrens von Needleman et al. (J. Mol. Biol. (1970) 48: 443–453) bereitgestellt. Wie hierin verwendet, versteht man unter „im Wesentlichen ähnlichen Nukleotidsequenzen, die mehr als eine 90%ige Gesamtidentität auf der Nukleotidebene mit der Codierungsregion der beanspruchten Sequenz, wie zum Beispiel Gene und Pseudogene, die den Codierungsregionen entsprechen, aufweisen. Die hierin beschriebenen Nukleinsäurefragmente schließen Moleküle ein, die mögliche Variationen umfassen, sowohl anthropogen als auch natürlich, wie zum Beispiel, aber nicht begrenzt auf (a) die, die Basenänderungen beinhalten, die keine Änderung in einer codierten Aminosäure veranlassen oder (b) die Basenänderungen beinhalten, die eine Aminosäure verändern, sich aber nicht auf die funktionellen Eigenschaften des Proteins auswirken, das durch die DNA-Sequenz codiert ist, (c) die, die sich von Deletionen, Umordnungen, Amplifikationen, zufälliger oder kontrollierter Mutagenese des Nukleinsäurefragments ableiten und (d) selbst gelegentliche Nukleotidsequenzierungsfehler.
Unter „Gen" versteht man ein Nukleinsäurefragment, das ein spezifisches Protein exprimiert, einschließlich Regulationssequenzen, die der Codierungsregion vorausgehen (5' nicht codierend) und folgen (3' nicht codierend). Unter einem „nativen" Gen versteht man ein isoliertes Gen mit seinen wie in der Natur gefundenen eigenen Regulationssequenzen. Unter einem „chimären" Gen versteht man ein Gen, das heterogene Regulations- und Codierungssequenzen umfasst, die in der Natur nicht gefunden werden. Unter einem „endogenen" Gen versteht man ein natives Gen, das in der Regel in seiner natürlichen Stelle im Genom gefunden und nicht isoliert wird. Unter einem „Fremdgen" versteht man ein Gen, das in der Regel nicht im Wirtsorganismus gefunden wird, das aber durch Gentransfer eingeführt wird. Unter einem „Pseudogen" versteht man eine genomische Nukleotidsequenz, die ein funktionelles Enzym nicht codiert.
Unter „Codierungssequenz" versteht man eine DNA-Sequenz, die für ein spezifisches Protein codiert und die nicht codierende Sequenzen ausschließt. Sie kann eine „ununterbrochene Codierungssequenz" konstituieren, d. h. es mangelt ihr an einem Intron oder sie kann ein oder mehr Intron(e) einschließen, die durch entsprechende Spleißverbindungsstellen gebunden sind. Unter einem „Intron" versteht man eine Nukleotidsequenz, die im Primärtranskript transkribiert wurde, das aber durch Spaltung und Religation der RNA in der Zelle entfernt wird, um die mature mRNA zu schaffen, die in ein Protein translatiert werden kann.
Unter „Initiationscodon" und „Terminationscodon" versteht man eine Einheit aus drei unmittelbar benachbarten Nukleotiden in einer Codierungssequenz, die die Initiation bzw. Termination der Kette der Proteinsynthese (mRNA-Translation) spezifiziert. Unter „offenem Leserahmen" versteht man die Codierungssequenz, die von Intronen zwischen den Initiations- und Terminationscodons nicht unterbrochen ist, die eine Aminosäuresequenz codiert.
Unter „RNA-Transkript" versteht man das Produkt, das aus der RNA-Polymerase-katalysierten Transkription einer DNA-Sequenz entsteht. Wenn das RNA-Transkript eine perfekte Kopie der DNA-Sequenz darstellt, dann wird darauf als das Primärtranskript verwiesen oder es kann eine RNA-Sequenz darstellen, die sich vom posttranskriptionalen Processing des Primärtranskripts ableitet, und es wird dann darauf als die mature RNA verwiesen. Unter „Messenger-RNA (mRNA)" versteht man die RNA, die ohne Introne ist und die durch die Zelle in Protein translatiert werden kann. Unter „cDNA" versteht man eine doppelsträngige DNA, die sich von mRNA ableitet. Unter „Sense"-RNA versteht man ein RNA-Transkript, das die mRNA einschließt. Unter „Antisense"-RNA versteht man ein RNA-Transkript, das für den gesamten oder einen Teil eines Target-Primärtranskripts oder der mRNA komplementär ist und das die Expression eines Target-Gens durch Interferieren mit dem Processing, Transport und/oder der Translation seines Primärtranskripts oder der mRNA blockiert. Die Komplementarität einer Antisense-RNA kann mit jedwedem Teil des spezifischen Gentranskripts, d. h. an der 5' nicht codierenden Sequenz, der 3' nicht codierenden Sequenz, Intronen oder der Codierungssequenz, erfolgen. Wie hierin verwendet, kann die Antisense-RNA zusätzlich Regionen von Ribozymsequenzen enthalten, die die Wirksamkeit der Antisense-RNA zum Blockieren der Genexpression erhöhen. Unter „Ribozym" versteht man eine katalytische RNA und schließt Sequenz-spezifische Endoribonukleasen ein.
Wie hierin verwendet, versteht man unter „geeigneten Regulationssequenzen" Nukleotidsequenzen in nativen oder chimären Genen, die sich stromaufwärts (5') in, und/oder stromabwärts (3') zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren befinden, die die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente kontrollieren.
Unter „Promotor" versteht man eine DNA-Sequenz in einem Gen, gewöhnlich stromaufwärts (5') zu seiner Codierungssequenz, die die Expression der Codierungssequenz durch Bereitstellung der Erkennung für RNA-Polymerase und andere für die ordnungsgemäße Transkription erforderlichen Faktoren, kontrolliert. In artifiziellen DNA-Konstrukten können die Promotoren auch zum Transkribieren von Antisense-RNA verwendet werden. Promotoren können auch DNA-Sequenzen enthalten, die beim Binden von Proteinfaktoren beteiligt sind, die die Wirksamkeit der Transkriptionsinitiation als Response auf physiologische oder entwicklungsbezogene Bedingungen kontrollieren. Er kann auch Enhancer-Elemente enthalten. Unter einem „Enhancer" versteht man eine DNA-Sequenz, die die Promotor-Aktivität stimulieren kann. Es kann sich um ein dem Promotor innewohnendes Element oder um ein heterologes Element handeln, das zum Enhancing des Spiegels und/oder der Gewebespezifität eines Promotors beiträgt. Unter „konstitutiven Promotoren" versteht man die, welche die Genexpression in allen Geweben und jederzeit richten. Unter „gewebespezifischen" oder „entwicklungsspezifischen" Promotoren versteht man hierin die, welche die Genexpression fast ausschließlich in spezifische Gewebe, wie zum Beispiel Blätter oder Samen, oder an spezifische Entwicklungsstufen in einem Gewebe, wie zum Beispiel in der frühen bzw. späten Embryogenese, richten. Unter dem Begriff „Expression", wie hierin verwendet, versteht man die Transkription und stabile Akkumulation der Sense- (mRNA) oder der Antisense-RNA, die sich von dem/den erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment(en) ableiten, die zusammen mit dem Proteinapparat der Zelle zu veränderten Spiegeln der myo-Inositol-1-phosphat-Synthase führt. Unter „Antisense-Inhibition" versteht man die Produktion von Antisense-RNA-Transkripten, die zur Verhinderung der Expression des Target-Proteins fähig sind. Unter „Überexpression" versteht man die Produktion eines Genprodukts in transgenen Organismen, die über die Produktionsspiegel in normalen oder nicht transformierten Organismen hinausgehen. Unter „Cosuppression" versteht man die Expression eines Fremdgens, das eine weitgehende Homologie zu einem endogenen Gen aufweist, das in der Suppression der Expression von sowohl dem Fremd- als auch endogenen Gen resultiert. Unter „veränderten Spiegeln" versteht man die Produktion von (einem) Genprodukten) in transgenen Organismen in Mengen oder Proportionen, die sich von denen von normalen oder nicht transformierten Organismen unterscheiden. Gegenstand der Erfindung sind auch Vektoren, die erfindungsgemäße Nukleotidsequenzen, Wirtszellen, die mit erfindungsgemäßen Vektoren genetisch manipuliert sind und die Produktion von erfindungsgemäßen Polypeptiden durch rekombinante Verfahren einschließen. Unter „Transformation" versteht man hierin den Transfer eines Fremdgens in das Genom eines Wirtsorganismus und seine genetisch stabile Vererbung. Unter „fertil" versteht man Pflanzen, die zur sexuellen Fortpflanzung fähig sind.
Unter „Raffinose-Sacchariden" versteht man die Familie von Oligosacchariden mit der allgemeinen Formel O-α-D-Galactopyranosyl-(1→6)_n-α-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-fructofuranosid, worin n = 1 bis 4 darstellt. In Sojabohnensamen versteht man unter dem Begriff spezifischer die Mitglieder der Familie, die einen (Raffinose) und zwei (Stachyose) Galactosereste enthalten. Obwohl höhere Galacotsepolymere bekannt sind (z. B. Verbascose und Ajugose) liegt der Gehalt dieser höheren Polymere in Sojabohnen unter dem der Standard-Nachweisverfahren und trägt deshalb nicht signifikant zum Gesamt-Raffionose-Saccharidgehalt bei.
Unter „Pflanzen" versteht man photosynthetische Organismen, sowohl eukaryotische als auch prokaryotische, wohingegen der Begriff „höhere Pflanzen" auf eukaryotische Pflanzen verweist.
Gegenstand der Erfindung sind eine mutierte Form eines Sojabohnengens und Verfahren zur Verbesserung der Kohlenhydrat- und Phytinsäure-Zusammensetzung von Sojabohnensamen und sich davon herleitenden Produkten. Gegenstand der Erfindung sind Beispiele von einem Verfahren zur Identifikation von Mutationen in diesem Gen und die Verwendung abgeleiteter mutierter Sojabohnenlinien zur Reduktion des Raffinose-Saccharid- und Phytinsäuregehalts von Sojabohnensamen. Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur Verwendung der Gen-Silencing-Technologie und der Sojabohnen-Gensequenz für myo-Inositol-1-phosphat-Synthase, die erfindungsgemäß zur Reduktion des Raffinose-Saccharidgehalts in Sojabohnensamen entdeckt wurde.
Sich von den erfindungsgemäßen Pflanzen ableitende Samen exprimieren im Vergleich zu gewerblichen Varietäten einen verbesserten löslichen Kohlenhydratgehalt. Die Verbesserungen führen zu einem reduzierten Gesamtraffinose- plus Stachyosegehalt. Das Kohlenhydratprofil dieser Linien ist dramatisch unterschiedlich von den Profilen, die in elitären oder Keimplasmalinien gesehen werden, die in anderen Sojabohnenzuchtprogrammen verwendet oder durch andere dieser Programme produziert werden.
Es werden zwei separate Verfahren zur Produktion der erfindungsgemäßen neuen Sojabohnengene gelehrt. Der erste Ansatz markiert den ersten erfolgreichen Versuch zur Induktion einer Mutation, die einen niedrigen Raffinose- plus Stachyosegehalt verleiht. Dieser Ansatz führte zur Entdeckung von zwei bedeutenden Genen, von denen eines in dieser Erfindung ausführlicher beschrieben wird, das zur Entwicklung von Sojabohnenlinien verwendet werden kann, die im Vergleich zu jedweden zuvor berichteten Linien (hinsichtlich der Reduktion des kombinierten Raffinose- und Stachyosegehalts) überlegen sind. Der zweite Ansatz macht sich die erfindungsgemäß gelehrten Gensequenzen zunutze, die in transgenen Gen-Silencing-Verfahren zum Erreichen von Ergebnissen angewendet wurden, die denen ähnlich sind, die durch zufällige Mutagenese und Screening erhalten werden.
Die Anmelder haben initial versucht, mithilfe chemischer Mutagenese zufällige Mutationen in das Genom der Wildtyp-Sojabohnen einzuführen. Es wurde erfindungsgemäß NMU (N-Nitroso-N-methylharnstoff) als das mutagene Mittel eingesetzt, obwohl andere Mittel, von denen bekannt ist, dass sie die DNA-Struktur und Sequenz verändern, hätten verwendet werden können. Nach der NMU-Behandlung wurden die Sojabohnensamen für mehrere Generationen gesät und auf den gewünschten Phänotyp gescreent; von primärer Bedeutung war die Veränderung des Raffinose-Saccharidgehalts. Das initiale Screening von mutagenisierten Sojabohnen-Populationen gab zwei Linien, LR33 und LR28, zu erkennen, die einen niedrigen Raffinose-Saccharidgehalt aufzuweisen schienen (LR28 wird in der Weltpatentveröffentlichung WO93/07742 offenbart). Es wurde anhand der Analyse von drei nachfolgenden Generationen von durch Selbstbefruchtung produzierten LR33 nachgewiesen, dass der Phänotyp von LR33 mit niedrigem Raffinose-Saccharid erblich ist (Tabelle 1)
Der physiologische Defekt in LR33, der zum einzigartigen, von dieser Linie aufgewiesenen Phänotyp führt, wurde mittels Durchführung einer Reihe von eleganten genetischen und biochemischen Studien identifiziert und charakterisiert (siehe Beispiel 2, nachstehend). Es wurde gezeigt, dass der Defekt in LR33 sich genetisch und biochemisch von der Mutation in LR28 unterschied, die zum Phänotyp dieser Linie mit dem geringen Stachyosegehalt führt. Die Mutation in LR33 weist darüber hinaus eine größere Pleiotrophie als der Defekt in LR28 auf; die vorliegende Beschreibung weist nach, dass der LR33-Phänotyp nicht nur einen reduzierten Raffinose-Saccharidgehalt einschließt, sondern auch zu Veränderungen hinsichtlich der Phytinsäure, des anorganischen Phosphats und der Saccharose-Spiegel im Samen führt. Weitere Analysen bestätigten, dass sich die von LR33 allein herleitende genetische Information diesen einzigartigen Phänotyp an die Nachkommenschaft der Sojabohnenlinien verleihen konnte und dass das mutierte Gen oder die mutierten Gene in LR33 nicht einfach genetische Modifikanten darstellen, die die phänotypische Expression von sich von anderen mutierten Sojabohnenlinien ableitenden Genen verstärken.
Der durch LR33 und seine Nachkommenschaft nachgewiesene für den erblichen Phänotyp verantwortliche spezifische biochemische Defekt wurde identifiziert. Dies wurde durch Berücksichtigung der Biosynthese von Raffinose-Sacchariden und der Kontrolle von Phytinsäure- und anorganischen Phosphatspiegeln in Sojabohnensamen erreicht. Basierend auf diesen bekannten biosynthetischen Pfaden, identifizierten eine Reihe von biochemischen Studien und sich anschließende molekulargenetische Analysen einen Defekt in LR33-Samen als eine Änderung in der myo-Inositol-1-phosphat-Synthaseaktivität, die zu einer verminderten Kapazität bei der Synthese von myo-Inositol-1-phosphat führt.
Die Biosynthese von Raffinose und Stachyose wurde recht gut charakterisiert [siehe Dey, P. M. In: Biochemistry of Storage Carbohydrates in Green Plants (1985)]. Myo-Inositol-hexaphosphat oder Phytinsäure und Raffinose-Saccharide teilen sich myo-Inositol als ein gemeinsames Intermediärprodukt bei ihrer Synthese [Ishitani, M. et al. The Plant Journal (1996) 9: 537–548]. Beginnend mit Glucose als eine Kohlenstoffquelle ist der Pfad, der die Synthese von Phytinsäure, Raffinose und Stachyose in maturierenden Sojabohnensamen beschreibt, in 1 ersichtlich.
Durch die in 1 ersichtlichen Interkonversionen kann entweder Glucose oder Saccharose das Ausgangsmaterial für den Polyolanteil von Phytinsäure, alle die Hexosen, die zum Aufbau von Raffinose und Stachyose beitragen und der rezyklierte Anteil des Galactose-Donators zur Raffinose-Synthase und Stachyose-Synthase, myo-Inositol darstellen. Die Endprodukte dieser Interkonversionen die sich in maturen Wildtyp-Sojabohnensamen akkumulieren, sind in der Reihenfolge der Prominenz ihrer Peaks nach Masse, Saccharose, Stachyose, Phytinsäure und Raffinose.
Die kommittierte Reaktion der Raffinose-Saccharid-Biosynthese beinhaltet die Synthese von Galactinol (O-α-D-Galactopyranosyl-(1→1)-myo-inositol) aus UDP-Galactose und myo-Inositol. Bei dem Enzym, das diese Reaktion katalysiert, handelt es sich um die Galactinol-Synthase. Die Synthese von Raffinose und höheren Homologen in der Raffinose-Saccharid-Familie aus Saccharose wird durch die Galactosyltransferasen, Raffinose-Synthase und Stachyose-Synthase katalysiert.
Die Kontrolle über das Verhältnis dieser Endprodukte kann durch die Veränderung der Umwandlungsrate bei vielen der Enzym-katalysierten Schritte in 1 beeinflusst werden. Diese Kontrolle kann durch die Veränderung des Enzymexpressionspiegels oder durch die Veränderung der intrinsischen Aktivität des Enzyms beeinflusst werden. Die sich ergebende Mischung der Endprodukte, die aus dem modifizierten Pfad stammen, können dann sowohl neue Proportionen der ursprünglichen Endprodukte als auch neue Produktmischungen umfassen, die Akkumulationen von einigen der normalen Intermediärprodukte einschließen. Die genaue Mischung und Zusammensetzung hängt vom Enzym, dessen Aktivität verändert wurde, wie auch dem Grad dieser Veränderung ab.
Die Aktivität der sechs Enzyme myo-Inositol-1-phosphat-Synthase, myo-Inositol-1-Phosphatase, UDP-Glucose-4'-Epimerase, Galactinol-Synthase, Raffinose-Synthase und Stachyose-Synthase konnte reduziert werden, um entweder die Raffinose- oder die Stachyose-Synthese ohne Verminderung des Saccharosegehalts zu vermindern. Von diesen sechs konnte die Aktivität der drei Enzyme, die für die Raffinose- und Stachyose-Synthese einzigartig sind, ohne Verminderung des Phytinsäuregehalts vermindert werden. Nur die myo-Inositol-1-phosphat-Synthese scheint an der Synthese von allen drei Endprodukten beteiligt zu sein und kann deshalb, wenn seine Aktivität vermindert ist, die Menge von allen drei Endprodukten simultan ändern.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit zur simultanen Reduktion des Raffinose-Saccharid- und Phytinsäuregehalts und die Steigerung des Gehalts an Saccharose- und anorganischem Phosphat in Sojabohnensamen durch Reduktion der myo-Inositol-1-phosphat-Synthaseaktivität in den Zellen von Sojabohnensamen. Die vorliegenden Beispiele beschreiben die Generierung und Entdeckung einer Mutantenform dieses Enzyms, worin eine Punktmutation in der Nukleotidsequenz, die dieses Enzym codiert, in einer Aminosäuresubstitution resultiert, die wiederum die intrazelluläre Enzymaktivität senkt. Es ist dem Fachmann bekannt, dass andere Mutationen in der Codierungsregion für myo-Inositol-1-phosphat-Synthase zu verminderter Enzymaktivität und folglich zum vorliegenden Samen-Phänotyp führen können. Unter Verwendung gut bekannter Verfahren zur heterologen Genexpression und in vitro-Mutagenese und unter Einsatz der verschiedenen hierin beschriebenen Enzym-Assays könnte der Fachmann andere Mutationen in der Codierungsregion der myo-Inositol-1-phosphat-Synthase identifizieren, die ohne übermäßige Experimentierung in verminderter Enzymaktivität resultieren. Diese mutierten myo-Inositol-1-phosphat-Synthasegene könnten dann in das Sojabohnen-Genom eingeführt werden (siehe US-Patent Nr. 5,501,967) und zu den vorliegenden Phänotyp aufweisenden neuen Sojabohnenvarietäten führen.
Als Alternative können die Gen-Silencing-Verfahren, wie zum Beispiel die Antisense-Inhibitions-Technologie (US-Patent Nr. 5,107,065) und Cosuppression (US-Patent Nr. 5,231,020) zur Reduktion der Aktivität der intrazellulären myo-Inositol-1-phosphat-Synthase in den Zellen von Sojabohnensamen eingesetzt werden. Die vorliegende Beschreibung lehrt die Sequenz des Gens, codierend das myo-Inositol-1-phosphat-Synthase-Enzym der Wildtyp-Sojabohne. Der Fachmann wird ohne weiteres erkennen, wie er chimäre Gene, umfassend die gesamte oder einen Teil der Wildtyp-Sequenz oder weitgehend ähnliche Sequenzen zur Reduktion der Aktivität der myo-Inositol-1-phosphat-Synthase in Sojabohnensamen herstellen oder verwenden kann.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung die Identität, Charakterisierung und Manipulation eines Sojabohnen-Enzyms, das zur Veränderung des Gehalts an Raffinose-Saccharid, Saccharose, Phytinsäure und anorganischem Phosphat von Sojabohnensamen und folglich zu wertvollen und nützlichen Sojaprodukten führt. Wie hierin gelehrt, resultiert die Reduktion der Enzymaktivität von myo-Inositol-1-phosphat-Synthase durch jedwedes von mehreren Mitteln in Sojabohnensamen, die den vorliegenden Phänotyp aufweisen.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung ist weiter in den folgenden Beispielen definiert, in denen, sofern nicht anderweitig angegeben, alle Teile und prozentualen Anteile in Gewichtsteilen und prozentualen Gewichtsanteilen und die Grade in Celsius angegeben sind. Es ist zur Kenntnis zu nehmen, dass diese Beispiele, während sie die bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen anzeigen, lediglich anhand der Erläuterung gegeben sind. Aus der vorstehenden Besprechung und diesen Beispielen kann ein Fachmann nachprüfen und kann ohne aus dem Gedanken und dem Umfang davon zu kommen, verschiedene erfindungsgemäße Änderungen und Modifikationen vornehmen, um sie für verschiedene Verwendungszwecke und Bedingungen anzupassen. Die vorliegende Erfindung ist weiter durch die hinterlegten biologischen Materialien nicht im Umfang eingeschränkt, da die hinterlegten Materialien zur Bereitstellung von Erläuterungen der Materialien, aus denen viele Ausführungsformen hergeleitet werden können, beabsichtigt sind. Es ist beabsichtigt, dass alle solche Modifikationen in den Umfang der anhängenden Ansprüche fallen.
Die üblichen Verfahren der Molekularbiologie, wie zum Beispiel Bakterientransformation, Agarosegelelektrophorese von Nukleinsäuren und Polyacrylamid-Elektrophorese von Proteinen werden anhand der allgemeinen, sie beschreibenden Begriffe bezeichnet. Nähere Einzelheiten zur praktischen Ausführung dieser Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, werden ausführlich in [Sambrook, et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press] beschrieben. Auf verschiedene in den experimentellen Manipulationen verwendete Lösungen wird durch ihren Trivialnamen, wie zum Beispiel „SSC", „SSPE", „Dehnhardt-Lösung" usw. verwiesen. Die Zusammensetzung dieser Lösungen kann durch Bezugnahme auf Appendix B von Sambrook, et al. [vorstehend] gefunden werden.
BEISPIEL 1
ENTDECKUNG EINES SOJABOHNENGENS, DAS EINE VERBESSERTE KOHLENHYDRAT-ZUSAMMENSETZUNG VERLEIHT ASSAYS AUF DEN RAFFINOSE-SACCHARIDGEHALT
Die folgenden Assays wurden zur Analyse der Sojabohnensamen auf den Raffinose-Saccharidgehalt verwendet. Vor jeder der analytischen Messungen zur Bestimmung des Raffinose-Saccharidgehalts wurden die Samen mindestens eine Woche auf einen Feuchtigkeitsgehalt von ca. 8% lufttrocknen lassen und dann bei ca. 40 bis 50°C und 40% relativer Feuchte gelagert. Eigene Messungen der Erfinder von vielen solchen luftgetrockneten Proben wiesen darauf hin, dass der Feuchtigkeitsgehalt nicht signifikant von 8% (Bereich 7 bis 10%) variierte, wenn sie unter diesen Bedingungen gelagert wurden.
Für jeden individuellen Raffinose-Saccharid-Assay wurden in der Regel fünf bis zehn Sojabohnen von einer bestimmten Pflanze in einer Cyclotech 1093 Probenmühle (Tecator, Box 70 S-26301, Hogans, Schweden) zermahlen, die mit einem 100-Mesh-Sieb zum Erhalt eines Samenpulvers ausgerüstet war, das dann analysiert wurde. In den meisten Fällen wurde der Raffinose-Saccharidgehalt für Samen bestimmt oder von Produkten hergeleitet, die einen „Ist"-Werte-Feuchtigkeitsgehalt von ca. 8% aufweisen. In diesen Fällen wurden die „Ist"-Werte durch Dividieren der Messungen mit 0,92 auf eine Trockenbasis (db) umgewandelt. Zum Vergleich unter bestimmten Linien oder unter bestimmten Sojaproteinprodukten wurde das zermahlene Samenpulver in einen Umluftofen bei 45°C gebracht, bis die Proben vor der Analyse ein konstantes Gewicht (0% Feuchtigkeit) erreichten. Folglich befinden sich alle in dieser Beschreibung berichteten Raffinose-Saccharid-Messungen, sofern nicht anderweitig angegeben wird, auf einer allgemeinen Trockenbasis.
Drei Assays („enzymatisch", „TLC" und „HPLC") wurden wie nachstehend beschrieben zur Bestimmung des Raffinose-Saccharidgehalts von Sojabohnensamen verwendet. Alle drei wurden an Samenpulver durchgeführt, das sich vom vorstehend erwähnten Mahlverfahren herleitete.
Bei der Vorbereitung für die „enzymatischen" Assay wurden jeder Samenprobe nach dem Zermahlen ca. 30 mg des sich ergebenden Pulvers in Schraubverschlussröhrchen (13 × 100 mm) abgewogen, und es wurden 1,6 ml Chloroform und 1,4 ml Methanol:Wasser (4:3, v/v) zugefügt. Das genaue Pulvergewicht von jeder Probe wurde registriert und zum Bereinigen der folgenden Assay-Ergebnisse der Gewichtsunterschiede für Probe um Probe verwendet. Die Röhrchen wurden dann verschlossen, in Gestelle gegeben und auf einem Rotationschüttelgerät 60 min bei 1800 U/min bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach der Extraktion durfte sich der Inhalt der Röhrchen 15 min absetzen. Nach dem Absetzen wurde ein Aliquot von 15 μl der Phase von Methanol:Wasser in ein Well einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben und 20 min bei 45°C getrocknet. Die getrockneten Wells wurden als Reaktionsgefäße für den gekoppelten „enzymatischen" Assay, der α-Galactosidase und Galactosedehydrogenase einsetzte, wie zuvor beschrieben, verwendet [Schiweck und Busching, (1969) Zucker 22: 377–384; Schiweck und Busching, (1975) Zucker 28: 242–243; Raffinose-Nachweiskit, Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 428 167], mit Modifikationen der Assay-Bedingungen. Die Modifikationen des Assays schlossen die Zugabe von bovinem Serumalbumin (15 mg/ml) zum Assay und α-Galactosidase-Puffer ein, wobei die Temperatur und die Zeit der α-Galactosidase-Inkubation 30 min von Raumtemperatur auf 45°C und die Zeit der Galactosedehydrogenase-Inkubation von 20 min auf 60 min erhöht wurden und Stachyose anstelle von Raffinose für den α-Galactosidase-Standard verwendet wurde. Nach der Inkubation wurde die Absorption der Proben bei 340 nm an einem BIO-TEK^®, Modell EL340 Mikroplatten-Ablesegerät bestimmt. Die in den Proben vorliegende α-Galactosidmenge wurde mittels Vergleich mit bekannten Mengen des Stachyose-Standards bestimmt. Zur Erleichterung der Analyse von Tausenden von Proben, wurden die enzymatischen Assays einmal wiederholt. Linien, die im primären Assay einen niedrigen Raffinose-Saccharidgehalt aufzuweisen schienen, wurden anschließend in Dreifachbestimmung wiederholt, wobei – wenn ausreichend Material verfügbar war – mit dem zermahlenen Samen begonnen wurde. Linien, deren Zusammensetzung im zweiten Assay bestätigt wurde, wurden bis zur Maturität unter Feldbedingungen gezogen und Samen aus den im Feld gewachsenen Pflanzen wurden erneut bestimmt. In Fällen, in denen spezifischere Informationen über das Raffinose-Saccharid und das Galactinol-Profil erforderlich waren, wurden Linien mit niedrigem Raffinose-Saccharidgehalt, die anhand des enzymatischen Assays identifiziert wurden, mithilfe des HPLC-Assays (nachstehend beschrieben) erneut bestimmt.
Zur Erleichterung der raschen Selektion von Keimplasma mit geringem Raffinose-Saccharid wurde ein Dünnschichtchromatographie-Assay („TLC"-Assay) entwickelt. Für diesen Assay wurden ca. 60 mg zermahlenes Samenpulver in ein Teströhrchen mit Schraubverschluss (13 × 100 mm) gegeben, dem 1 ml 4:3 (v/v) Methanol:Wasser und 1 ml Chloroform zugefügt wurden. Die Röhrchen wurden verschlossen, in Gestelle gegeben und auf einem Rotationsschüttelgerät 60 min bei 25 U/min bei Raumtemperatur gemischt. Nach der Extraktion wurden die Röhrchen 5 min bei 2100 U/min zentrifugiert. Eine Probe von 4 μl wurde aus der Schicht von Methanol:Wasser entnommen und auf eine ,Baker' Preadsorbent/Channeled Silkalgel-DC-Platte mit einer analytischen Schicht von 250 mm gegeben. Die Proben wurden bei Raumtemperatur trocknen lassen, und die Platte wurde dann in ein TLC-Gefäß mit einer Lösung von Ethylacetat:Isopropanot:20% Essigsäure (in Wasser) von 3:4:4 (v/v/v) gegeben. Die Lösung konnte sich in den analytischen Kanälen 10 cm hochsaugen, zu welchem Zeitpunkt die Platte entfernt und unter einem Abzug luftgetrocknet wurde. Die Platte wurde dann mit Analin-diphenylamin-Reagens zur Identifikation der Kohlenhydrate in der Probe besprüht. Dieses Reagens wurde durch Mischen von 1 ml Anilin mit 100 ml Aceton, 1 g Diphenylamin und 10 ml Phosphorsäure hergestellt. Die Platte wurde dann zum Trocknen 15 min in einen Ofen von 100°C gegeben und entfernt und vor dem Ablesen der analytischen Kanäle abkühlen lassen. Der Stachyose- und Raffinosegehalt in den Sojabohnenproben wurde durch Vergleich mit dem in reinen Standards gesehenen Elutionsmuster bestimmt.
Ein Hochleistungsanionenaustausch-Chromatographie-/gepulster ampero-metrischer Assay, auf den hierin als auf den „HPLC"-Assay verwiesen wird, wurde zur Bestimmung der Gehalts individueller Raffinose-Saccharide (z. B. Stachyose und Raffinose), Galactinol und zur Bestätigung der Ergebnisse von entweder der enzymatischen oder TLC-Assays verwendet. Die Bedingungen für das Zermahlen und die Extraktion des Samens waren mit denen identisch, die für den vorherigen „enzymatischen" Assay verwendet wurden. Es wurde ein Aliquot von 750 μl der wässrigen Phase entfernt und unter reduziertem Druck bei 80°C getrocknet. Das getrocknete Material wurde dann in 2 ml Wasser aufgelöst und 30 sec kräftig gemischt. Es wurde ein Aliquot von 100 μl entfernt und auf 1 ml mit Wasser verdünnt. Die Probe wurde wieder gründlich gemischt und dann 3 min bei 10 000 × g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde eine Probe von 20 μl auf einer Dionex^TM PA1-Säule unter Verwendung von 150 mM NaOH bei 1,3 ml/min bei Raumtemperatur analysiert. Der Dionex^TM PAD-Detektor wurde mit E1 = 0,05 V, E2 = 0,60 V und E3 = –0,60 V und einem Ausgangsbereich von 3 mA verwendet. Galactinol, Glucose, Fructose, Saccharose, Raffinose, Stachyose und Verbascose wurden alle unter den chromatographischen Bedingungen gut getrennt. Der Kohlenhydratgehalt der Proben wurde durch Vergleich mit authentischen Standards bestimmt.
Die von den Kohlenhydrat-Analysen erhaltenen Ergebnisse wurden unter Verwendung der Software SuperANOVA (Abacus Concepts, Inc., 1984 Bonita Avenue, Berkeley, CA 94704) der Varianzanalyse unterzogen. Wenn angemessen, wurde Fisher's Protected LSD als der Post-hoc-Test zum Vergleich der Mittelwerte verwendet. In anderen Vergleichen wurden die Mittelwerte für statistisch signifikant gehalten, wenn die durch ihre Standardfehler (SEMs) definierten Bereiche nicht überlappten. In Fällen, in denen die Mittelwerte des Raffinose-Saccharids mit dem Mittelwert einer Kontrolllinie verglichen wurden, wurde ein Mittelwert für signifikant niedriger gehalten als der der Kontrolle, wenn dieser Mittelwert mindestens drei Standardabweichungen unter dem Mittelwert der Kontrolle lag.
MUTAGENESE UND SELEKTION VON MUTANTEN
Circa 130 000 Samen (22,7 kg) von LR13 (einer Linie, die weitgehend mit der Williams 82 identisch ist) wurden in 150 l Leitungswasser unter kontinuierlicher Belüftung für eine Dauer von acht Stunden eingeweicht. Belüftung wurde durch Pumpen von Luft durch ein Standard-Aquarium, in das „Luftsteine" auf den Boden des Einweichgefäßes gegeben wurden, erreicht. Imbibierte Samen wurden ablaufen lassen und in 98 l einer Lösung aus 2,5 mM N-Nitroso-N-methylharnstoff (NMU), gepuffert bei pH 5,5, mit 0,1 M Phosphatpuffer unter kontinuierlicher Belüftung transferiert. Die Samen blieben 3 Stunden in der NMU-Lösung und wurden dann einer Reihe von Spülungen unterzogen, um den restlichen NMU auszuziehen. Für die erste Spülung wurden die behandelten Samen 1 min in 45 l Leitungswasser transferiert. Für die zweite Spülung wurden die Samen eine Stunde unter kontinuierlicher Belüftung in 45 l frisches Leitungswasser transferiert. Für die dritte Spülung wurden die Samen zwei Stunden unter kontinuierlicher Belüftung in 45 l frisches Leitungswasser transferiert. Für die vierte Spülung wurden die Samen unter kontinuierlicher Belüftung in 45 l frisches Leitungswasser transferiert. Eine Hälfte der Samen wurde nach zwei Stunden aus der vierten Spülung entfernt (Subpopulation 1), während die andere Hälfte der Samen nach fünf Stunden aus der vierten Spülung entfernt wurde (Subpopulation 2). Nach der Entfernung aus der vierten Spülung wurde exogenes Wasser von den Samen ablaufen lassen, und sie wurden auf Kartonstücken zum Abtrocknen für eine Stunde in der Sonne ausgebreitet. Die imbibierten M1-Samen wurden dann in Reihen, 46 cm auseinander, bei einer Dichte von ca. 14 Samen pro ft in den Reihen und einer Tiefe von 2,5 cm im Feld gepflanzt (Isabela, Puerto Rico, USA).
Zwei aus M2-Samen bestehende Pools (aus den Subpopulationen 1 und 2) wurden in großer Menge aus den M1-Pflanzen geerntet. Circa 40 000 M2-Samen aus der Subpopulation 1 und 52 000 M2-Samen aus der Subpopulation 2 wurden in Isabela, Puerto Rico, USA, gepflanzt. In jeder Subpopulation wurden fünf Schoten von jeweils 3 000 M2-Pflanzen geerntet und gesammelt („bulked"), um eine Bulk-M3-Samenpopulation zu erhalten. Die M3-Bulks wurden bei Isabela, Puerto Rico gepflanzt. Bei Maturität wurden Samen aus 5000 M3-Pflanzen zum Erhalt von 5000 M3:4-Linien von jeder Subpopulation individuell geerntet.
Während des Winters von 1991 wurden insgesamt mindestens 8 000 M3:4-Linien zum Messen des Gehalts an Raffinose-Sacchariden unter Verwendung des vorstehend beschriebenen enzymatischen Verfahrens gescreent. Beim initialen Screening wurden zwei Linien mit verminderten Gesamtraffinose-Sacchariden identifiziert, die sich in einer zweiten, selbstbefruchteten Generation erblich erwiesen. Eine von diesen als L33 bezeichneten Linien wies im Vergleich zu elitären Sojabohnen-Kultivaren, die als Kontrollen in der gleichen Umgebung gezogen wurden, reduzierte Stachyose- wie auch Raffinosespiegel auf. Im Vergleich zu den durchschnittlichen Werten für drei elitäre Kultivare, die in der gleichen Umgebung gezogen wurden, war der Stachyosegehalt von LR33 statistisch signifikant geringer. Der lösliche Kohlenhydratgehalt von „bulked" Samen, die von selbstbefruchteten Linien geerntet wurden, die sich von LR33 für drei Generationen ableiteten, ist in Tabelle 1 ersichtlich. TABELLE 1

¹N.B. Nicht bestimmt

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Die sich anschließenden Linien (1ST-83, 2ST-88 und 3ST-101) leiteten sich alle durch Selbstbestäubung von LR33 her. Jede dieser Linien wies einen niedrigeren Stachyosegehalt als die Kontrolllinien auf.
BEISPIEL 2
IDENTIFIKATION DES FÜR DEN PHÄNOTYP VON LR33 MIT NIEDRIGEM RAFFINOSE-SACCHARIDGEHALT VERANTWORTLICHEN PHYSIOLOGISCHEN DEFEKTS GENETISCHE KREUZUNGEN UNTER VERWENDUNG VON LR33 ALS EIN ELTERNTEIL MIT NIEDRIGEM RAFFINOSE-SACCHARIDGEHALT
In einer Bemühung um die weitere Reduktion des Gesamtraffinose-Saccharidgehalts von Sojabohnensamen wurden genetische Kreuzungen zwischen LR33 und LR28 vorgenommen. Linie LR28 wird in der Weltpatentveröffentlichung WO93/07742 beschrieben. Es wurde, um es kurz zu fassen, in einem Screening-Verfahren auch eine Linie mit kombinierter niedriger Raffinose plus Stachyose entdeckt, die der in Beispiel 1 beschriebenen sehr ähnlich ist. Der geringe Raffinose- und Stachyosegehalt ist von einer Generation zur nächsten konsistent. Außerdem ist der Galactinolgehalt der maturen Samen von Linie LR28 und Linien, die sich von ihrer Kreuzung mit anderen Eltern ableiten, im Vergleich zu Wildtyp-Sojabohnensamen erheblich erhöht.
F1-Pflanzen von der Kreuzung von LR33 und L28 wurden gezogen und selbstbestäubt, um die segregierende F2-Nachkommenschaft zu produzieren. Samen von sich von LR28 herleitenden Linien, elitäre Kultivare und die segregierende Population, die sich aus der Kreuzung von LR28 und LR33 ergibt, wurden in der gleichen Umgebung gepflanzt. F2:3-Samen wurden von jeder F2-Pflanze geerntet und unter Verwendung des vorstehend beschriebenen enzymatischen Assays auf den α-Galactosidgehalt gescreent. Selektionen von α-Galactosid mit niedrigem Gehalt aus dem vorläufigen Screening wurden zum Erhalt vollständiger Raffinose-Saccharid-Profile dem HPLC-Assay zugeführt. Kohlenhydrat-Profile aus den typischen Linien, die auf einen niedrigen Gesamt-α-Galactosidgehalt ausgewählt wurden, sind in Tabelle 2 ersichtlich. TABELLE 2

¹N.B. Nicht bestimmt

^–1

5ST-1441, 5ST-1434 und 5ST-1309 leiteten sich alle von der Kreuzung von LR33 mit LR28 her. Während die Linie 5ST-1441 dem LR33-Elternteil sehr ähnlich ist, weisen die Linien 5ST-1434 und 5ST-1309 überraschenderweise einen viel niedrigeren Raffinose- und Stachyosegehalt als eine der beiden Elternlinien auf und enthalten nicht den für die Linie LR28 charakteristischen erhöhten Galactinolspiegel.
IN VITRO-ASSAY DER AKTIVITÄT VON ENZMMEN IM RAFFINOSE-SACCHARID-PFAD
In den angelegten Studien zum Auffinden der Ursache des unerwarteten Raffinose-, Stachyose- und Galactinol-Phänotyps, der in einigen sich von der Kreuzung von LR33 mit LR28 herleitenden Linien beobachtet wurde, wurden mehrere Enzymaktivitäten und Metabolit-Pools in Sojabohnensamen gemessen, die knapp vor dem physiologisch maturen Stadium während der Periode der schnellen Raffinose-Saccharid-Biosynthese geerntet wurden. Die Samen wurden aus den Schoten entfernt, die gerade begonnen hatten, gelb zu werden. Samen aus diesen Schoten, die auch ihre grüne Farbe verloren oder gerade begannen, selbst gelb zu werden, wurden zum Assay auf die letzten drei Enzyme in der Raffinose-Saccharid-Biosynthese gewählt (siehe 1).
Die Samen wurden aus den Schoten entfernt, zum Erhalt des Frischgewichts gewogen, dann in einem Mörser in zehn Volumina 50 mM HEPES-NaOH-Puffer, pH 7, der auch in 2-Mercaptoethanol 5 mM war, zermahlen. Die zermahlenen Proben wurden 10 min bei 10 000 × g zentrifugiert, und der Überstand wurde mittels einer Passage durch Sephadex G-25, die im Zermahlpuffer äquilibriert wurde, entsalzt.
Für den Assay der Galactinol-Synthase wurden 10 μl des entsalzten Extraktes 90 μl des HEPES-Puffer, pH 7, zugefügt, der auch 20 mM in myo-Inositol, 10 mM in Dithiolthreitol, 1 mM in MnCl₂ und 1 mM in UDP-[¹⁴C]-Galactose (1,25 μCi μmol^–1) war. Das Assay-Gemisch wurde 10 min bei 25°C inkubiert, dann durch Zufügen von 400 μl Ethanol gestoppt. Zu den gestoppten Reaktionen wurden 200 μl Dowex AG-1 × 8 Anionenaustauschharz (BioRAD) zugefügt, und das Gemisch wurde 25 min geschüttelt. Das Harz wurde durch Zentrifugation entfernt und der Überstand wurde zur Szintillationszählung verwendet. Die nicht anionische Radioaktivität wurde als ein Maß der Galactinol-Synthese genommen.
Für den Assay der Raffinose-Synthase und Stachyose-Synthase wurden 50 μl des entsalzten Extrakts 50 μl des 25 mM HEPES-Puffers bei pH 7 zugefügt, der auch 10 mM in Dithiothreitol, 10 mM in Galactinol und 40 mM in Saccharose für den Assay der Raffinose-Synthase oder 40 mM in Raffinose für den Assay der Stachyose-Synthase war. Nach 1-stündiger Inkubation bei 25°C wurden die Reaktionen durch das Zufügen von 40 μl Ethanol gestoppt und dann zum Präzipitieren der Proteine 1 min in ein kochendes Wasserbad gegeben. Die Reaktionsgemische wurden zum Klären zentrifugiert, der Überstand wurde durch ein Filter von 0,22 Mikron gegeben und dann unter Vakuum auf trockenen Zustand reduziert. Der Rückstand wurde wieder in 0,5 ml Wasser aufgelöst und 20 μl wurden aus dem Dionex HPLC-System, wie vorstehend für die Quantifizierung von Raffinose und Stachyose beschrieben, getrennt. Die Ergebnisse eines unter Verwendung von Samen durchgeführten Experiments, die von im Feld gewachsenen Pflanzen im August 1994 geerntet wurden, sind in Tabelle 3 ersichtlich.
TABELLE 3
Von den drei zur Raffinose- und Stachyose-Synthese kommittierten Enzymen zeigt nur die Raffinose-Synthase eine deutliche Abnahme der Aktivität in den mutierten Linien mit niedrigem Raffinose-Saccharidgehalt im Vergleich mit dem Wildtyp. Eine Mutation, die eine verminderte Aktivität der Raffinose-Synthase herbeiführt, ist mit der Position des Enzyms im biosynthetischen Pfad und der Akkumulation von Galactinol, das in Linien beobachtet wurde, welche nur LR28 als Quelle des Phänotyps mit dem geringen Raffinose-Saccharidgehalt tragen, konsistent. Galactinol und Saccharose sind die beiden Substrate für die Raffinose-Synthase, und beide Metaboliten akkumulieren in LR28 enthaltende Linien (siehe 1 und Tabelle 2).
Trotz der erhaltenen niedrigeren Stachyose-, Raffinose- und Galactinol-Spiegel, wenn die LR33-Linien mit LR28 gekreuzt wurden, handelt es sich bei der durch die LR28-Mutation verliehene reduzierte Raffinose-Synthase-Aktivität um die einzige veränderte Aktivität. Während es sich bei der verminderten Aktivität der Galactinol-Synthase um einen wahrscheinlichen Kandidaten für die Läsion in der LR33-Linie aufgrund des verminderten Galactinolgehalts, der durch die Mutation bei Kombination mit LR28 verliehen wurde, zu handeln schien, liegt in der gemessenen in vitro-Aktivität dieses Enzyms keine Verminderung vor.
ASSAY DES FREIEN MYO-INOSITOLGEHALTS VON MATURIERENDEN SOJABOHNENSAMEN
Während bei der Kreuzung von LR33 mit LR28 keine Verminderung der Galactinol-Synthase in vitro vorlag, wurde die Möglichkeit, dass die in vivo-Aktivität von Galactinol-Synthase in maturierenden Samen von sich von LR33 ableitenden Linien durch die Verfügbarkeit eines seiner Substrate begrenzt ist, geprüft. Die Bereitstellung von UDP-Galactose zur Galactinol-Synthase könnte durch Mutationen in der UDP-Glucose-4'-Epimerase vermindert sein und die Bereitstellung von myo-Inositol könnte durch die Mutation, die entweder ihre Synthese bewirkt oder die spezifische Phosphatase, die die freie Inositolform produziert, begrenzt sein (1). Der myo-Inositol-Pool wurde durch Testen auf den freien Gesamt-myo-Inositolgehalt im Wildtyp-Samen und sich von LR33 ableitenden Samen geprüft. Drei Sojabohnenlinien, ein Wildtyp-Kultivar A2872 und zwei sich von LR33 × LR28 ableitende Linien, 5ST-1434 und 5ST-1309 wurden in einem Phytotron unter 16-h-Tagen mit einem Tag/Nacht-Temperaturregime von 30°C/22°C gezogen. Die Samen wurden aus den Schoten genommen, die gerade begannen, gelb zu werden und selbst von einem sehr hellen Grün nach Gelb umschlugen. Drei Samen von jeder Linie wurden in 8 ml 80%igem Ethanol zermahlen. Das Gemisch wurde 15 min bei 12 000 × g zentrifugiert und der Überstand in eine 50 ml fassende Flasche dekantiert. Die Extraktion wurde zweimal wiederholt und die Überstände kombiniert. Die kombinierten Überstände wurden unter einem Vakuum bei 40°C auf trockenen Zustand reduziert und die Rückstände in 1 ml Wasser aufgelöst. Die wieder aufgelösten Extrakte wurden anhand der Passage durch 3 ml Mischbettionenaustauschharz (BioRad AG501 × 8) deionisiert und der Durchfluss plus 4 ml des Wachswassers wurden wieder auf Trockene reduziert. Der Rückstand wurde wieder in 500 μl Wasser aufgelöst, und ein Aliquot von 70 μl wurde mittels HPLC auf einer Zorbax-Aminosäule (DuPont) eluiert bei 1 ml min^–1 mit 70% Acetonitril, getrennt. Zucker im Säuleneluat wurden durch den Differenzialrefraktionsindex nachgewiesen. Die Trennung von Standardgemischen aus Saccharose und myo-Inositol zeigten, dass Inositol später auflief und nur teilweise von der Saccharose getrennt wurde. Zur Analyse der Samenextrakte wurden nach dem Saccharose-Peak 1 ml Eluat zur Reinjektion auf dem in Beispiel 1 beschriebenen Dionex PAD-System eingeschlossen. Im Dionex-System lief myo-Inositol ziemlich vor der Saccharose auf und konnte sauber von der die Zorbax Aminosäulenfraktion kontaminierenden Saccharose getrennt werden. Im Vergleich zu externen Standards von myo-Inositol enthielten die 5-μl-Injektion der Linie 2872 des Wildtyps 3,2 nmol myo-Inositol, während 5-μl-Injektionen von 5ST-1434 und 5ST-1309 0,39 bzw. 0,23 nmol enthielten.
Zur weiteren Charakterisierung des Unterschieds des Gehalts an freiem myo-Inositol des Wildtyps und sich von LR33 herleitenden Samen wurde ein zweites Experiment durchgeführt. Sieben einzelne Samen aus einer zweiten Kontrollinie (2242) und aus der sich von der LR33 herleitenden Linie 5ST-1434 wurden gemäß der vorstehend beschriebenen Maturitätskriterien geerntet. Die Samen wurden individuell gewogen, in 1,5 ml fassende Mikrofugenröhrchen gegeben, mit einem Spatel zerdrückt, auf Trockeneis gefroren und lyophilisiert. Der Trockenrückstand wurde gewogen und 1 ml 80%iges Methanol, das 1 μmol Trehalose enthielt, wurde zugefügt, um als ein myo-Inositol-Retentionsmarker auf der Zorbax-Aminosäule und als ein interner Standard zu wirken. Das Extraktionsmedium wurde 1 h bei 60°C erhitzt, erneut mit einem kleinen Mörser im Mikrofugenröhrchen zermahlen und zum Pelletieren des unlöslichen Materials zentrifugiert. Der Überstand wurde an ein zweites Mikrofugenröhrchen transferiert, das ca. 100 μl Mischbettharz enthielt, das Gemisch wurde kurz geschüttelt und 20 μl der Lösung über dem Harz wurden entfernt und unter Vakuum bis zum trockenen Zustand gebracht. Der Rückstand wurde erneut in 110 μl Gesamtvolumen aufgelöst und 55 μl wurden, wie vorstehend beschrieben, auf den Zorbax-Aminosäulendurchlauf injiziert. Der Trehalose-Peak wurde eingeschlossen und 20 μl der Säulenfraktion wurden auf das Dionex-System reinjiziert. Der myo-Inositol-Peak wurde durch Vergleich mit dem internen Trehalose-Standard quantifiziert. Der Mittelwert ± Standardabweichung für den myo-Inositolgehalt des Wildtyps betrug 2,18 ± 0,98 μmol (g Trockengewicht)^–1, während die 5ST-1434-Samen 0,77 ± 0,32 μmol (g Trockengewicht)^–1 enthielten. Beide Experimente wiesen darauf hin, dass Samen, die die LR33-Mutation tragen, während der Periode der schnellen Raffinose-Saccharid-Synthese weniger myo-Inositol enthalten. In keinem der beiden Experimente war der Gesamt-myo-Inositol-Pool vollkommen abwesend. Solche Experimente können jedoch nur den Gesamtsamen-Pool der Metaboliten messen, und myo-Inositol weist andere Schicksale auf, die seine Verwendung durch die Galactinol-Synthase weiter einschränken könnten (3).
WIRKUNG VON MYO-INOSITOL-PERFUSION AUF DIE IN VIVO-MARKIERUNG VON RAFFINOSE-SACCHARIDEN
Um sicherzustellen, ob die beobachtete Verminderung des Gehalts an freiem myo-Inositol des sich von Samen herleitenden LR33 die Ursache des verminderten Raffinose-Saccharidgehalts bei der Maturität darstellen könnte oder nicht, wurden während der Durchführung von Fütterungsstudien Gewebeschnitte angefertigt. Jeweils vier Samen aus der Wildtyp-Linie 2242 und von der LR33 abgeleiteten Linie 5ST-1434 wurden anhand des vorstehend beschriebenen Maturitätskriteriums geerntet. Die Samenhüllen wurden entfernt und die Kotyledonen in 5 mM Kaliumphosphat-Puffer bei pH 5,5 gespült, dann in ca. 1 mm messende Schnitte geschnitten und wieder mit Puffer gespült. Die Gewebeschnitte wurden in zwei Gruppen aufgeteilt. Eine Gruppe wurde in Kaliumphosphatpuffer eingetaucht und die zweite Gruppe wurde in den Kaliumphosphatpuffer, enthaltend 50 mM myo-Inositol eingetaucht. Die Gewebeschnitte wurden Vakuuminfiltriert und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Vorinkubationsperiode wurde jeder Gruppe 5 μCi ¹⁴C-Glucose zugefügt und das Gewebe wurde wieder Vakuum-infiltriert. Aus jeder Gruppe wurden 2 h und 8 h nach Zufügen der markierten Glucose zehn Gewebsschnitte entnommen. Die Gewebeschnitte wurden in ein tariertes 1,5 ml fassendes Mikrofugenröhrchen gegeben, um das Frischgewicht zu erhalten, und in 300 μl 80%igem Methanol zermahlen. Die Röhrchen wurden zentrifugiert, der Überstand wurde in ein zweites Röhrchen entfernt, die Extraktion wurde weitere zwei Male wiederholt und die Überstände wurden kombiniert. Die kombinierten Überstände wurden unter Vakuum zum trockenen Zustand reduziert, in 50% Acetonitril wieder aufgelöst und auf dem Zorbax Amino-HPLC-System getrennt. Die Fraktionen wurden zur Szintillationszählung in 15-Sekunden-Intervallen durch die Region des Chromatogramms, enthaltend Glucose, Saccharose, Raffinose und Galactinol und in 1-Minuten-Intervallen durch die Region, enthaltend Stachyose, gesammelt. Die radioaktiven Fraktionen, die den Zucker-Standardpeaks entsprachen, wurden zur Analyse gruppiert. Die Ergebnisse werden als Prozent der Radiomarkierung in den vier Zuckern des Produkts in Tabelle 4 ausgedrückt.
TABELLE 4
Sowohl Wildtyp- als auch 5ST-1434-Gewebeschnitte wandeln die Markierung von zugefügter ¹⁴C-Glucose in Saccharose und dann in Galactinol, Raffinose und Stachyose um. Ohne das Zufügen von exogenem myo-Inositol wandelt die Linie, enthaltend die LR33-Mutation (5ST-1434), im Vergleich zur Wildtyp-Linie (58,9% nach 8 h) sehr wenig Markierung in die Raffinose-Saccharide (20,5% nach 8 h) um.
Beide Genotypen sprechen auf exogenes myo-Inositol durch Umwandlung von mehr der an die Raffinose-Saccharid-Zucker bereitgestellten Markierung an. Mit dem Zufügen von myo-Inositol werden die beiden Genotypen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die bereitgestellte Markierung zuerst in Galactinol und dann in Raffinose und Stachyose umzuwandeln, im Wesentlichen gleich. Die Umwandlungsrate wird im Vergleich zur nicht infundierten Kontrolle selbst in der Wildtyp-Linie erhöht.
Es scheint, dass die Bereitstellung von myo-Inositol an Galactinol-Synthase immer eine Begrenzung für die Rate darstellt, bei der Raffinose und Stachyose synthetisiert werden können. Das Vorliegen der LR33-Mutation macht diese Begrenzung viel größer.
Das Markierungsmuster ist insofern überraschend, dass keine Ansammlung der Markierung in Galactinol auftritt, wie man es erwarten würde, wenn die LR28-Mutation in der Raffinose-Synthase bei der Verlangsamung des Flusses durch diesen Schritt in den kombinierten Mutantenlinien noch wirksam wäre. Während erwartet werden kann, dass das Zufügen von myo-Inositol den Fluss durch die Galactinol-Synthase an Galactinol erhöht, sollte sich die Markierung dort aufgrund der verminderten Aktivität der Raffinose-Synthase akkumuliert haben. Die Abwesenheit dieser Akkumulation stellt entweder die Wirksamkeit oder die Anwesenheit der LR28-Mutation in dieser Linie in Frage.
EINFLUSS DER LR33-MUTATION AUF DIE PHYTINSÄURE IM SAMEN UND DIE ANORGANISCHEN PHOSPHATSPIEGEL
Die vorstehenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich die LR33-Mutation vor dem freien myo-Inositol im in 1 gezeigten Pfad befindet. Zur weiteren Begrenzung des möglichen Ortes der Mutation wurden andere Metaboliten in diesem Anteil des Pfades gemessen.
Da Sojabohnensamen Phytinsäure bei Spiegeln von 20 bis 30 μmol g^–1 bei Maturität enthalten und da 50 bis 70% des Gesamtsamenphosphats in Phytinsäure enthalten ist [Raboy et al, (1984) Crop Science 24: 431–434], schien es möglich zu sein, dass sich auf die myo-Inositol-Synthese auswirkende Mutationen sich auch auf die Spiegel der Phytinsäure- und des anorganischen Phosphats im Samen auswirken könnten. Die Phytinsäure- und anorganischen Phosphatspiegel in drei Sojabohnenlinien des Wildtyps und drei Linien, die die LR33-Mutation enthalten, wurden in Trockensamen durch eine Modifikation des von Raboy [vorstehend] beschriebenen Verfahrens bestimmt. Circa zwanzig Samen von jeder Linie wurden in einer kleinen Prallmühle zermahlen und 100 mg des sich ergebenden Pulvers wurden in ein 15 ml fassendes Schraubverschlussröhrchen abgewogen. 5 ml 0,4 N HCl mit 0,7 M Na₂SO₄ wurden dem Pulver zugefügt und das Gemisch wurde über Nacht auf einer Schaukelplattform geschüttelt. Die Röhrchen wurden bei 3900 × g 15 min zentrifugiert und 2 ml des Überstandes wurden in ein zweites Glasröhrchen entfernt. Zwei ml Wasser und 1 ml 15 mM FeCl₂ wurden zugefügt und die Röhrchen wurden 20 min in einem kochenden Wasserbad erhitzt. Die Röhrchen wurden wie vorstehend zur Präzipitation des Eisen:Phytinsäure-Komplexes zentifugiert und der Überstand wurde verworfen. Die Pellets wurden in 2 ml 0,2 N HCl resuspendiert und 10 min im kochenden Wasserbad erhitzt. Das Präzipitat wurde wieder durch Zentrifugation entfernt und in 2 ml 5 mM EDTA resuspendiert.
15 μl der EDTA-Suspension wurden zur feuchten Veraschung zum Erhalt von Phytinsäure-Phosphat genommen. Zu jedem Röhrchen, enthaltend das Aliquot von 15 μl, wurden 10 μl einer 10%igen Lösung aus Calciumnitrat zugefügt. Das Wasser wurde verdampfen lassen und der Rückstand wurde in einer Flamme erhitzt, bis im Röhrchen weiße Asche zurückblieb. Die Asche wurde in 0,3 ml 0,5 N HCl aufgelöst und 20 bis 30 min bei 90°C erhitzt. Saures Molybdat-Reagens (0,7 ml 0,36% Ammoniummolybdat und 1,42% Ascorbinsäure in 0,86 N Schwefelsäure) wurden zugefügt und die Farbe konnte sich während 1 h vor dem Ablesen bei 820 nm entwickeln.
Anorganisches Phosphat wurde durch Zufügen von 0,3 ml 0,5 N HCl und 0,7 ml des Phosphat-Farbreagens zu Aliquoten zu entweder 20 ml oder 40 ml des initialen Extrakts von 5 ml bestimmt. Zur gleichen Zeit wurden auch Kaliumphosphat-Standards entwickelt. Das Experiment wurde dreimal wiederholt und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 ersichtlich.
TABELLE 5
Die LR33-Mutation verursacht auch eine Verminderung des Phytinsäurespiegels im Samen (ausgedrückt als Phosphat in der Phytinsäurefraktion) von ca. dem 2fachen mit einer gleichzeitigen Steigerung des anorganischen Phosphatgehalts im Samen von ca. dem 15- bis 25fachen in Abhängigkeit vom genetischen Hintergrund, in dem die Mutation enthalten ist. Basierend auf dem Pfad in 1 werden der verminderte Phytinsäuregehalt zusammen mit dem gesteigerten freien myo-Inositolgehalt am wahrscheinlichsten von einer Mutation verursacht, welche die Aktivität der myo-Inositol-1-phosphat-Synthase vermindert.
Die genaue Ursache der Steigerung des anorganischen Phosphatgehaltes ist nicht bekannt, es wurde jedoch seit langem angenommen, dass die Phytinsäure als eine Phosphatspeicherform in Samen und anderen Teilen der Pflanze funktioniert. Es ist möglich, dass wenn die bevorzugte Speicherplattform (myo-Inositol) nicht verfügbar ist, eintretendes anorganisches Phosphat keinem anderen bedeutenden Schicksal unterliegt und sich einfach akkumuliert.
BEISPIEL 3
IDENTIFIKATION DES SAMEN-PHÄNOTYPS DER HOMOZYGOTEN LR33-LINIE
Es wurden mehrere zusätzliche Sojabohnenlinien auf anorganisches Phosphat im Samen analysiert. Es wurden 100 mg zermahlener Samen mit 1 ml heißem Wasser extrahiert und zum Entfernen der unlöslichen Masse zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 100 μl Methylenchlorid zur Entfernung des Lipidmaterials extrahiert und der Rest des wässrigen Extrakts wurde auf 10% mit Trichloressigsäure hergestellt. Die Lösung wurde zur Entfernung des Proteins zentrifugiert und 5 μl des Überstandes wurden wie in Beispiel 2 beschrieben auf anorganisches Phosphat analysiert. In Tabelle 6 sind die Ergebnisse von diesen Assays ersichtlich.
TABELLE 6
Alle die Linien, welche die LR28-Mutation allein enthalten, weisen anorganische Phosphatspiegel auf, die mit den Wildtyp-Kontrollen vergleichbar sind. Linie 5ST-1441 leitete sich von LR33 (Beispiel 2 vorstehend) ab und weist die mittelgradige Stachyose-Reduktion auf, die ursprünglich mit der Mutation assoziiert war. 5ST-1441 weist nur einen geringgradig erhöhten anorganischen Phosphatgehalt auf. Trotz der Tatsache, dass keines der beiden Elternteile hoch an anorganischem Phosphat ist, weisen all die sich von der Kreuzung von LR33 mit LR28 ableitenden Linien erheblich erhöhte anorganische Phosphatspiegel auf.
Der Phänotyp der Linie 5ST-1441 des intermediären anorganischen Phosphats, der nur die LR33-Mutation enthält, war unerwartet. Dies kann darauf hinweisen, dass sowohl die LR28- als auch die LR33-Mutation anwesend sein müssen, um den Phänotyp mit der niedrigen Phytinsäure/dem hohen anorganischen Phosphat zu produzieren. Wenn jedoch die beiden Mutationen faktisch in den strukturellen Genen, codierend die beiden Aktivitäten, die vermindert zu sein scheinen, vorliegen, sind sie im Stoffwechselpfad nicht auf eine Weise miteinander verwandt, die eine Additivwirkung auf die Änderung der Phytinsäuresynthese vorschlagen würde. Wenn sich die Mutation in LR33 entweder auf die freie oder Gesamt-myo-Inositol-Produktion auswirkt, sollte sie allein für den Phänotyp der niedrigen Phytinsäure- und den sich ergebenden hohen Phosphatgehalt verantwortlich sein.
Eine alternative Erklärung könnte darin bestehen, dass die Linie 5ST-1441 nicht homozygot für die LR33-Mutation ist, und dass die Analyse des Bulk-Samens nur den durchschnittlichen Phänotyp für den Wildtyp, den homozygoten Mutanten und heterozygoten Samen ergibt. Zur Prüfung dieser Möglichkeit wurden 13 einzelne Samen aus der Bulk-Probe von 5ST-1441-Samen gewogen, zermahlen und mit heißem Wasser extrahiert. Protein wurde nicht präzipitiert und das anorganische Phosphat wurde wie zuvor gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 ersichtlich.
TABELLE 7
Die mit den Buchstaben d, j und l versehenen Samen weisen ca. um das 3fache mehr anorganisches Phosphat auf als die übrigen zehn analysierten Samen. Das Verhältnis nähert sich dem von einer segregierten Population von Samen erwarteten, worin der mutierte Phänotyp mit hohem anorganischem Phosphatgehalt rezessiv ist und auf die Wirkung eines einzelnen Gens zurückzuführen ist. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden 20 Samen aus der Bulk-Probe von 5ST-1441 6 h in Wasser bei Raumtemperatur imbibiert. Überschüssiges Wasser wurde weggetupft und eine Probe der Kotyledonen am Ende, das sich am weitesten von der embryonischen Achse entfernt befindet, wurde abgeschnitten. Die Gewebestücke wurden gewogen, in 1,5 ml fassende Mikrofugenröhrchen gegeben und in ausreichend 70%igem Methanol zermahlen, um 10 mg Frischgewicht pro 100 μl extrahiertem Volumen zu geben. Im Überstand nach dem Zentrifugieren vorhandenes Phosphat wurde wie vorstehend beschrieben gemessen und die Ergebnisse sind in Tabelle 8 ersichtlich.
TABELLE 8
Samen 4, 7, 11, 16 und 20 wurden in einem Phytotron in Töpfe gepflanzt. Samen 7, 11, 16 und 20 überlebten und wurden bis zur Maturität unter den in Beispiel 2 beschriebenen Wachstumsbedingungen gezogen. Bulk-Samen aus den maturen Pflanzen und zwei Wildtyp-Kontrollen (A2872) wurden nach dem Trocknen geerntet und 20 Samen von jeder Pflanze wurden lose zur Analyse von löslichen Kohlenhydraten und Phytinsäure unter Verwendung der in Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahren zermahlen. Der Gesamtphytinsäuregehalt im Samen wurde als der (Phytinsäure-Phosphatgehalt)/6 berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 ersichtlich.
TABELLE 9
Während der lösliche Kohlenhydrat-Phänotyp der aus dem Samen Nummer 7 (LR33-7) gezogenen Pflanze der sehr ähnlich ist, die der LR33-Mutation wie in Tabelle 1 gezeigt zugeschrieben wird, weisen die anderen Pflanzen viel niedrigere Spiegel der Raffinose-Saccharide und viel höhere Saccharose-Spiegel auf. Diese Spiegel des löslichen Kohlenhydrats sind sehr ähnlich denen des Phänotyps, der einigen Pflanzen in der Mutantenkombination LR28 × LR33 in Tabelle 2 zugeschrieben wird. Die wahrscheinlichste Erklärung für diese Diskrepanz ist die, dass der analysierte Bulk-Samen, um die Daten in Tabelle 1 zu geben, von Pflanzen kamen, die für die LR33-Mutation anstelle der Pflanzen, die für die Mutation homozygot sind, segregieren. Wenn Pflanzen, die für die Mutation homozygot sind, ausgewählt werden, wie dies im Falle von Pflanzen 11, 16 und 20 in diesem Beispiel getan wurde, wird der echte homozygote Samen-Phänotyp beobachtet. Die vorherige Annahme, dass sowohl die LR28- als auch die LR33-Mutationen zur Produktion der Kombination von niedriger Raffinose, Stachyose und Galactinol vorhanden sein mussten, war inkorrekt. Während Linien, die homozygot für die LR33-Mutation sind, nicht von der Selbstung der ursprünglich identifizierten Mutantenlinie erhalten wurden, wurden sie von Segreganten erhalten, die sich aus der Kreuzung von dieser Linie mit LR28 ergaben. Während einige der Nachkommenschaft von der Kreuzung möglicherweise beide Mutationen enthalten, ist der Phänotyp von der LR33-Mutation dem gegenüber dominant, der aus der LR28-Mutation entsteht. Diese Dominanz stammt primär aus der Stelle der LR33-Mutation stromaufwärts im Kohlenstoffstrom von der LR28-Mutation (siehe 1 und Beispiel 2).
Der Grund, dass der homozygote LR33-Phänotyp schwer zu erreichen blieb, kann auf Keimungsprobleme zurückzuführen sein, denen mit der ursprünglichen Mutantenlinie begegnet wurde. Unter Bulk-Feldsegregationsbedingungen könnte der Verlust von 25% (die Fraktion, die für die Mutation homozygot gewesen wäre) des gepflanzten Samens aus der Selbstung von LR33 versäumt worden sein. Geerntete Pflanzen von der Bulk-Population wären dann an Homozygoten depletiert worden, aber das mutierende Gen würde im heterozygoten Zustand in der Population beibehalten. Wir vermuten, dass Auskreuzen zu einem genetischen Hintergrund, das dienlicher ist, um LR33-Homorygoten zu erlauben, unter Feldbedingungen aufzulaufen, die Erholung des Homozygoten ermöglichte. Dass die initialen Auskreuzungen zu Linien, die eine andere Mutation im biosynthetischen Pfad des Raffinose-Saccharids trugen, erfolgten, war gegenüber der ursprünglichen Absicht der Kreuzung zufällig und weder für den überlegenen Phänotyp noch für das verbesserte Auflaufen im Feld ursprünglich wesentlich.
Die LR33-Mutation ist folglich zur Produktion von Sojabohnenpflanzen in der Lage, die Samen mit weniger als 5 μmol Stachyose pro Gramm Samen, weniger als 20 μmol Raffinose pro Gramm Samen, mehr als 200 μmol Saccharose pro Gramm Samen und weniger als 10 μmol Phytinsäure-Phosphat pro Gramm Samen produzieren.
BEISPIEL 4
GEHALT AN LÖSLICHEM KOHLENHYDRAT UND PHYTINSÄURE EINER SOJABOHNENLINIE, ENTHALTEND DIE LR33-MUTATION
Die Linien LR33 und L28 mit niedrigem Raffinose-Saccharid wurden gekreuzt und segregierende F2-Pflanzen wurden auf niedrige Spiegel von Raffinose, Stachyose und Galactinol im Samen der F2-Pflanzen mittels des in Beispiel 1 beschriebenen HPLC-Assays ausgewählt. Sich von dieser Kreuzung ableitende ausgewählte Linien wurden dann zu elitären Kultivar-Eltern gekreuzt und die Nachkommenschaft dieser Kreuzungen wurden in der F2-Generation durch das gleiche Verfahren ausgewählt. Unter diesen Linien, die niedrige Raffinose-Saccharid-Spiegel enthalten, wurden mehrere zum Advancement basierend auf den agronomischen Merkmalen der vegetativen Pflanze gewählt. Eine derartige Linie, bezeichnet als 4E76, wurde anschließend zu einem anderen elitären Sojabohnen-Kultivar testgekreuzt, und einzelne Samen aus der sich aus dieser Kreuzung herleitenden geselbsteten F1-Pflanze wurden auf lösliche Kohlenhydrate und auf den anorganischen Phosphatgehalt analysiert. Die Samen fielen in zwei Klassen, diejenigen mit sehr niedrigen anorganischen Phosphat- und Wildtyp-Spiegeln von Raffinose plus Stachyose und eine kleinere Klasse von Samen mit erhöhten Spiegeln von anorganischem Phosphat und sehr niedrigen Spiegeln von Raffinose plus Stachyose. Das Verhältnis dieser beiden Klassen kam dem Verhältnis von 3:1 sehr nahe, das von der rezessiven LR33-Mutation erwartet wird. Es lag kein Hinweis für eine Segregation von LR28 vor, bei dem es sich um eine andere Mutation handelt, die sich auf die Raffinose-Saccharide, die in der ursprünglichen Kreuzung vorlagen, auswirkte. Linie 4E76 stellte folglich die LR33-Mutation in einem ausgewählten elitären Kultivar-Hintergrund dar. Diese Linie wurde in insgesamt neun Umgebungen über zwei Jahre zusammen mit ausgewählten elitären Kontrolllinien für die Kohlenhydratanalyse gezogen. Ein begrenzterer Probenset aus drei Umgebungen wurde auf den Phytinsäuregehalt analysiert. Die Kohlenhydrat-Daten sind in Tabelle 10 ersichtlich und die Phytinsäure-Daten in Tabelle 11.
TABELLE 10
TABELLE 11
Im Vergleich zu elitären Sojabohnen-Kultivaren, die für gewerbliche Sojabohnen typisch sind, ist die sich von LR33 ableitende Linie bezogen auf die Masse des Gesamtraffinose-Saccharids pro Gramm Samengewicht um das 8- bis 9fache niedriger. Die Masse von Phytinsäure ist auch um ca. 40% vermindert.
Im Vergleich zu elitären Sojabohnen-Kultivaren, waren die sich von LR33 herleitenden Linien bezogen auf die Masse von sowohl Raffinose als auch Stachyose niedriger. Während der Raffinosegehalt nur geringgradig niedriger als die in elitären Linien gesehenen Werte ist, ist der Stachyosegehalt sehr erheblich reduziert. Es ist bekannt, dass die nachteilige Wirkung des Raffinose-Saccharid-Gehalts der Sojabohne auf die Energieverwertungseffizienz, wenn Sojabohnenmehl an monogastrische Tiere verfüttert wird, auf die schlechte Verdaulichkeit der α-Galactosid-Bindung zurückzuführen ist. Demzufolge stellt eine Verminderung des kombinierten Raffinose- plus Stachyosegehalts eine angemessene Maßnahme zur erhöhten Verdaulichkeit dar. Diese Messung kann faktisch die Wirkung des vorliegenden Phänotyps sogar unterschätzen, da Stachyose zwei Mole der α-Galactosid-Bindung pro Mol Zucker enthält.
Es ist bekannt, dass der absolute Raffinose-Saccharid-Gehalt von maturen Sojabohnen als Antwort auf Umweltfaktoren variiert. Die Wirkung der Mutation, die in sich von LR33 herleitenden Linien anwesend ist, ist von ausreichender Größe, um den kombinierten Raffinose- plus Stachyose-Gehalt dieser Linien unter 14,5 μmol/g Samengewicht abzusenken und sollte immer weit unterhalb dem in der gleichen Umgebung gezogenen Sojabohnen des Wildtyps bleiben.
Es ist auch bekannt, dass der Phytinsäuregehalt von maturen Sojabohnensamen als Antwort auf Umweltfaktoren, primär aufgrund der Variationsgrade des im Boden verfügbaren Phosphats, variiert. Nochmals, die in sich von LR33 ableitenden Linien vorliegende Mutation erhält einen Gesamtphytinsäuregehalt im Samen von unter 17 μmol/g über alle Wachstumsumgebungen hinweg aufrecht.
BEISPIEL 5
MOLEKULARE IDENTIFIKATION DER LR33-MUTATION
Der Hinweis aus der Analyse von Metaboliten in den sich von LR33 ableitenden und in Beispiel 2 ersichtlichen Linien deuten stark darauf hin, dass die LR33-Mutation zu einer Abnahme der Fähigkeit des Samens zum Produzieren von myo-Inositol führt.
In Pflanzen ebenso wie in anderen Organismen wird myo-Inositol einzig und allein über einen Pfad produziert, der mit der Umwandlung von Glucose-6-phosphat in myo-Inositol-1-phosphat in einer durch myo-Inositol-1-phosphat-Synthase katalysierten Reaktion beginnt und mit der Hydrolyse des 1-Phosphats durch eine spezifische myo-Inositol-phosphat-Phosphatase endet (siehe 1; Loews, F. A. In: Inositol Metabolism in Plants (1990) Wiley-Liss, New York, S. 13–19). Da die Phytinsäure als ihren wahrscheinlichen Präkursor myo-Inositol-1-phosphat besitzt und da der Spiegel der Phytinsäure durch die LR33-Mutation abnimmt, waren das Gen und das Genprodukt für die myo-Inositol-phosphat-Synthase sowohl in Wildtyp- als auch LR33-mutierten Pflanzen charakterisiert.
cDNA-CLONIERUNG DER MYO-INOSITOL-1-PHOSPHAT-SYNTHASE DER WILDTYP-SOJABOHNE
Eine cDNA-Bibliothek wurde wie folgt hergestellt. Sojabohnenembryos (jeweils ca. 50 mg Frischgewicht) wurden aus ihren Schoten entfernt und in flüssigem Stickstoff gefroren. Die gefrorenen Embryos wurden in Anwesenheit von flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zermahlen und dann durch Homogenisation im Polytron extrahiert und zur Anreicherung auf Gesamt-RNA anhand des Verfahrens von Chirgwin et al. ((1979) Biochemistry 18: 5294–5299) fraktioniert.
Die Nukleinsäurefraktion wurde auf Poly-A⁺-RNA durch Leiten der Gesamt-RNA durch eine Oligo-dT-Cellulosesäule und Eluieren der Poly-A⁺-RNA mit Salz wie von Goodman et al. ((1979) Meth. Enzymol. 68: 75–90) beschrieben. cDNA wurde aus der gereinigten Poly-A⁺-RNA unter Verwendung des cDNA-Synthesesystems (Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD) und nach den Anleitungen des Herstellers synthetisiert. Die sich ergebende doppelsträngige DNA wurde durch Eco-RI-DNA-Methylase (Promega) vor dem Füllen in ihre Enden mit T4-DNA-Polymerase (Bethesda Research Laboratory) und stumpf-endiger Ligation an phosphorylierte Eco-RI-Linkers unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Pharmacia) methyliert. Die doppelsträngige DNA wurde mit Eco-RI-Enzym aufgeschlossen, mittels der Passage durch eine Gelfiltrationssäule (Sepharose CL-4B) von überschüssigen Linkers getrennt und an den Lambda-ZAP-Vektor (Stratagene) gemäß den Anleitungen des Herstellers ligiert. Die ligierte DNA wurde unter Verwendung des Gigapack^TM-Packung-Extrakts (Stratagene) gemäß den Anleitungen des Herstellers in den Phagen gepackt. Die sich ergebende cDNA-Bibliothek wurde nach den Anleitungen von Stratagene amplifiziert und bei –80°C gelagert.
Die cDNA-Phagen-Bibliothek wurde nach den Anleitungen im Handbuch zum Lambda-ZAP-Clonierungskit (Stratagene) zum Infizieren von Zellen von E. coli XL1 verwendet und es wurden insgesamt ca. 300 000 Plaque-bildende Einheiten auf sechs Petrischalen (150 mm Durchmesser) ausplattiert.
Es wurden zweifache Lifts von den Platten auf Nitrocellulose-Filter (Schleicher & Schüll, Keene, NH) vorgenommen. Die Filter wurden in 25 ml Hybridisierungspuffer, bestehend aus 6 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung, 0,5% SDS, 5% Dextransulfat und 0,1 mg/ml denaturierter Lachsspermien-DNA (Sigma Chemical Co.) 2 h bei 60°C vorhybridisiert.
Die blockierten Filter wurden dann an eine radiomarkierte Sonde, hergestellt aus einer cDNA von Arabidopsis thaliana hybridisiert, die dann als eine myo-Inositol-1-phosphat-Synthase durch Homologie zur myo-Inositol-1-phosphat-Synthase der Hefe identifiziert wurde [Johnson, M. A. (1994) Plant Physiol. 105: 1023–1024]. Der Arabidopsis-Clon wurde vom Arabidopsis Biological Resource Center, DNA Stock Center, 1060 Cannack Road, Columbus, OH 43210-1002, Clon-Nummer 181C18T7113E9T7 erhalten. Das cDNA-Insert von 1,2 kB wurde aus der Vektor-DNA mittels Aufschluss mit Sal I und Not I, gefolgt von Agarosegel-Reinigung des DNA-Fragments entfernt. Das gereinigte Fragment wurde mit [³²P]-dCTP mit einem Zufallsprimer-Markierungskit markiert (Bethesda Research Laboratory). Die Filter wurden über Nacht unter den gleichen Bedingungen, wie sie für die Vorhybridisierung beschrieben wurden, hybridisieren lassen. Überschüssiger Radiomarker wurde in 0,6 × SSC, enthaltend 0,1% SDS aus den Filtern gewaschen. Zwei Waschgänge von jeweils ca. 10 min in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 60°C wurden dann appliziert, um nicht spezifisch gebundene Marker zu entfernen, und die Filter wurden zur Belichtung eines fotografischen Films in einer Exposition über Nacht verwendet. Es wurden ca. 200 positive Signale beobachtet. Sechs wurden durch Exzision des Bereichs um das Signal herum gereinigt, der Phage erneut plattiert und wie vorstehend erneut gescreent. Es wurden zwei Clone zu Phagmiden exzidiert und zur Infektion von E. coli verwendet, um unter Verwendung der vom Hersteller beschriebenen Protokolle Plasmidclone zu erhalten (Stratagene). Von den beiden Clonen wurde ein als p5bmi-1-ps bezeichneter unter Verwendung der Methodologie und der Ausrüstung von Applied Biological Instruments sequenziert. Die Nukleotidsequenz des cDNA-Inserts in p5bmi-1-ps wird in SEQ ID NO: 1 gezeigt und die abgeleitete Aminosäuresequenz durch diese Sequenz in SEQ ID NO: 2 codiert.
cDNA-CLONIERUNG VON MYO-INOSITOL-1-PHOSPHAT-SYNTHASE AUS IMMATUREN SAMEN VON LR33-SOJABOHNEN
Samen aus den mit 11, 16 und 20 nummerierten und in Beispiel 3 beschriebenen LR33-Pflanzen (siehe Tabelle 8) wurden zu ca. 50% durch die Samenfüllperiode geerntet, aus der Schote entfernt und gefroren bei –80°C gelagert. Zur mRNA-Isolation wurden 2 g des gefrorenen Samens aus der „bulked" Samenpopulation in flüssigem Stickstoff in einem Mörser zermahlen.
Das gefrorene Pulver wurde wieder in 10 ml Total-RNA-Extraktionspuffer, der aus 10 mM Tris-HCl, pH 9, 10 mM EDTA, 0,5% CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid), 0,8 M NaCl, 1% 2-Mercaptoethanol und 2% Polyvinylpyrrolidon bestand, zermahlen. Das Wasser für alle Reagenzien wurde 30 min mit 0,05% Diethylpyrocarbamat behandelt und dann autoklaviert. Die Gewebeaufschlämmung wurde in ein 15 ml Polypropylenröhrchen transferiert und 15 min bei 5 500 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Miracloth (Calbiochem) in ein zweites Polypropylenröhrchen passieren lassen und es wurden 0,3 Volumen Chloroform zugefügt. Die Phasen wurden durch Zentrifugation 10 min bei 5 500 × g getrennt und die obere Phase in ein anderes Polypropylenröhrchen transferiert, dem 1,5 Volumen 10 mM Tris-HCl, pH 9, 10 mM EDTA, 0,5% CTAB und 0,1% 2-Mercaptoethanol zugefügt wurden. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Nukleinsäuren durch Zentrifugation 20 min bei 5500 × g präzipitiert.
Die Nukleinsäuren wurden erneut in 0,4 ml 1 M NaCl, enthaltend 0,1% 2-Mercaptoethanol aufgelöst. Nach der Extraktion mit einem Volumen von 1:1 Phenol:Chloroform wurden die Nukleinsäuren mit zwei Volumen Ethanol präzipitiert.
mRNA wurde aus dieser Nukleinsäurefraktion unter Verwendung des mRNA-Reinigungskits von Pharmacia gereinigt. Circa 12 μg mRNA wurden erhalten. 13 ng der polyadenylierten mRNA wurden als Matrize zur Amplifikation von Oligo-dT unter Verwendung eines GeneAmp^® RNA-PCR-Kits (Perkin Elmer Cetus, Teile Nr. N808-0017) verwendet. Die reverse Transkriptase-Reaktion wurde 30 min bei 42°C laufen lassen. Für die PCR-Amplifikation wurde Vent^TM DNA-Polymerase (New England Biolabs) für die DNA-Polymerase substituiert, die vom Kit-Hersteller geliefert wurde, und es wurden zusätzliche 2 μl 100 mM Magnesiumsulfat zu jeder 100-μl-Reaktion zugefügt. Der 5'-Primer wies die in SEQ ID NO: 3 gezeigte Sequenz auf und besteht aus Basen 57 bis 77 in SEQ ID NO: 1 mit den zusätzlichen Basen 5'-GGGAATTCCATATG-3', die zugefügt werden, um eine Nde I-Stelle im Primer mit acht zusätzlichen 5'-Basen zu codieren, um die Restriktionsenzymaktivität gegen die Sequenz zu verstärken.
Der 3'-Primer wies die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Sequenz auf und besteht aus dem reversen Komplement von Basen 1566 bis 1586 in SEQ ID NO: 1 mit den zusätzlichen Basen 5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGC-3', die zugefügt wurden, um eine Not I-Stellen im Primer und zehn zusätzliche Basen bereitzustellen, um den Restriktionsaufschluss zu verstärken. Die PCR-Reaktion wurde 35 Zyklen bei einer Annealing-Temperatur von 52°C und einer Verlängerungszeit von 1,5 min laufen lassen. Es wurde ein Produkt aus ca. 1550 Basenpaaren erhalten und mittels Passage durch ein Amicon 50 Mikrofugenfilter, gefolgt von der Extraktion mit einem gleichen Volumen von 1:1 Phenol:Chloroform, Extraktion der oberen Schicht der Phenol:Chloroform-Trennung mit einem Volumen Chloroform und Präzipitation mit Ethanol, gereinigt. 5 μg des sich ergebenden reinen PCR-Produktes wurde über Nacht bei 37°C mit Nde I wie auch Not I aufgeschlossen. Der Restriktionsenzym-Aufschluss wurde anhand des vorstehend beschriebenen Extraktionsverfahrens mit Phenot:Chloroform deproteinisiert und in 2 g pET24aT7-Expressionsvektor (Novogen) ligiert, der auch mit Nde I und Not I aufgeschlossen und mit alkalischer Phosphatase aus dem Darm von Kälbern zur Hydrolyse der terminalen Phosphate behandelt wurde. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation elektrokompetenter Zellen von E. coli DH 10B verwendet, und es wurden Transformanten durch Züchten auf Platten, enthaltend 30 mg l^–1 Kanamycin, ausgewählt. Es wurden 18 Einzelkolonien von der Transformationsplatte entnommen und in 100 μl steriles Wasser gegeben. 40 μl der Zellmischung wurden als die DNA-Matrize in einem PCR-Reaktionslauf mit Tag^TM Polymerase (Perkin Elmer) unter Verwendung der Primer und PCR-Bedingungen, die initial zur Isolation des cDNA-Inserts verwendet wurden, verwendet. Sechs Kolonien dienten als Matrize zur Amplifikation eines Produkts der richtigen Größe. Die übrigen 60 μl der Zellmischung aus diesen Clonen wurden in einer Kultur über Nacht gezüchtet, und aus jedem Clon wurden Plasmid-DNA-Präparate hergestellt. Das gereinigte Plasmid von jedem der sechs Clone wurde zur Transformation von elektrokompetenetn Zellen von E. coli DE 3 verwendet.
FUNKTIONELLE EXPRESSION DER MYO-INOSITOL-1-PHOSPHAT-SYNTHASE AUS DEN WILDTYP- UND LR33-SOJABOHNEN IN E. COLI
Die myo-Inositol-1-phosphat-Synthase der Wildtyp-Sojabohne wurde durch PCR-Amplifikation von p5bmi-1-ps unter Verwendung der Primer in SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 und die vorstehend für das Clonieren der myo-Inositol-1-phosphat-Synthase von LR33 aus der reversen transkribierten mRNA beschriebenen PCR-Amplifikation und das Clonierungsprotokoll in den pET24aT7-Expressionsvektor platziert. In diesem Fall wurden Plasmid-Präparationen aus neun DH 10B-Clonen, von denen gezeigt wurde, dass sie Plasmid mit dem cDNA-Insert enthalten, gepoolt und zur Transformation von elektrokompetenten Zellen von E. coli DE 3 verwendet.
Kanamycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt und sechs wurden zur Inokulation von Übernachtkulturen gewählt. Die Übernachtkulturen wurden bei 30°C in LB-Medium mit 30 mg l^–1 Kanamycin gezüchtet, wurden um das 2fache mit frischem Medium verdünnt, erlaubt, für 1 h wieder zu wachsen, und durch Zufügen von Isopropyl-thiogalactosid zu einer 1 mM Endkonzentration induziert.
Die Zellen wurden nach 3 h durch Zentrifugation geerntet und in 50 μl 50 mM Tris-HCl bei pH 8,0, enthaltend 0,1 mM DTT und 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, resuspendiert. Eine kleine Menge 1 mm großer Glasperlen wurden zugefügt und das Gemisch wurde dreimal für ca. fünf Sekunden, jedes Mal mit einem Mikrosonden-Sonicator beschallt. Das Gemisch wurde zentrifugiert und die Proteinkonzentration des Überstandes wurde bestimmt. 1 μg Protein aus der löslichen Fraktion von jeder Clon-Kultur wurde mithilfe von SDS-PAGE getrennt. Kulturen, die eine zusätzliche Proteinbande von ca. 60 kD bezogen auf die Masse produzierten, wurden für den Aktivitätsassay gewählt.
Für den Assay wurde [¹³P]-Glucose-6-phosphat durch die Hexokinase-katalysierte Phosphorylierung von Glucose unter Verwendung von [³³P]-γ-ATP als der Phosphat-Donator hergestellt. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung durch eine SEP-PAC C18-Säule (Millipore Corp., Milford, MA) laufen lassen, die zuerst mit 80% Methanol und dann Wasser gewaschen wurde. Der Säulendurchlauf zusammen mit zusätzlichen 0,5 ml wurde gesammelt und durch eine SEP-PAC SAX-Säule laufen lassen, die dann mit 1 ml 80%igem Methanol gewaschen wurde. Das [³³P]-Glucose-6-phosphat wurde mit 2 ml 0,02 N HCl in 80% Methanol eluiert. 40 μl 1 M Tris-Base wurde zugefügt und das Methanol wurde unter Vakuum entfernt. Die Konzentration von Glucose-6-phosphat der restlichen Lösung wurde durch seine Umwandlung in 6-Phosphoglucuronsäure durch Glucose-6-phosphat-dehydrogenase bestimmt. Das in der Reaktion produzierte NADPH wurde durch Absorption bei 340 nm quantifiziert.
10 μl der Zellextrakte wurden 30 min bei 37°C in 100 μl Reaktionen, bei denen es sich um 2 mM in Glucose-6-phosphat (57 334 dpm Gesamt-³³P), 0,1 mM in NAD und 15 mM in Ammoniumacetat handelt. Die Reaktionen wurden auf 90°C zum Präzipitieren des Proteins erhitzt und zum Klären zentrifugiert. 47 μl des Überstandes wurden auf eine Dionex^TM PA-1-Säule gegeben, die bei 0,9 ml min^–1 mit 0,1 N NaOH und 0,1 N Natriumacetat lief. Standards aus myo-Inositol-1-phosphat eluierten von 8 bis 10 min nach der Injektion und 1-min-Fraktionen der getrennten Reaktionsmischungen wurden über diesen Zeitbereich zur Szintillationszählung entnommen. Die Radioaktivität in den Peak-Fraktionen wurde zum Erhalt der Umwandlung von Glucose-6-phosphat in myo-Inositol-1-phosphat summiert und die Ergebnisse für eine Kontrollkultur von E. coli DE 3, enthaltend einen leeren pET24aT7-Vektor und zwei Clone, enthaltend die cDNA der myo-inositol-1-phosphat-Synthase sind in Tabelle 12 ersichtlich.
TABELLE 12
In dem wie gelaufenen Assay verwendeten beide cDNA-enthaltende Clone im Wesentlichen das gesamte verfügbare Substrat und waren deshalb um mehr als das 35fache aktiver als die Kontrolllinie. Das myo-Inositol-1-phosphat-Synthase-Gen der Sojabohne ist deshalb zur Produktion eines funktionellen Enzyms in E. coli in der Lage.
Der Clon Nummer 1 der myo-Inositol-1-phosphat-Synthase der Wildtyp-Sojabohne (Soja-Clon1) und drei Clone der myo-Inositol-1-phosphat-Synthase von LR33 wurden zur wie vorstehend beschriebenen Proteinexpression gezüchtet. 5 μg des Proteins aus dem löslichen Zellextrakt aus jedem Clon wurden mithilfe von SDS-PAGE getrennt. LR33-Clon Nummer 10 (LR33-10) produzierte ein lösliches Protein von 60 kD in weitgehend der gleichen Fülle wie der Wildtyp-Clon Nummer 1. 4 μg Protein aus jedem der beiden Extrakte wurde auf myo-Inositol-1-phosphat-Synthase-Aktivität mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens unter Verwendung einer 100 μl Reaktion, die aus 3 μm in NAD und 90 μm in Glucose-6-phosphat bestand, bestimmt. Die spezifische Aktivität der myo-Inositol-1-phosphat-Synthase des Wildtyps betrug unter diesen Bedingungen 1,5 nmol min^–1 mg Protein^–1, während die spezifische Aktivität der sich von LR33 abgeleiteten myo-Inositol-1-phosphat-Synthase 0,16 nmol min^–1 mg Protein^–1 betrug.
NUKLEOTIDSEQUENZ DER cDNA, CODIEREND DIE MYO-INOSITOL-1-PHOSPHAT-SYNTHASE VON LR33
Die Nukleotidsequenz des cDNA-Inserts in Clon LR33-10 (enthaltend das Nukleinsäurefragment, codierend die myo-Inositol-1-phosphat-Synthase von LR33) wurde unter Verwendung des Stammes von E. coli DH 10 dieses Clons als die Plasmidquelle und der DNA-Sequenzierung wie für den Wildtyp-Clon beschrieben bestimmt. Die Nukleotidsequenz wird in SEQ ID NO: 5 und die abgeleitete Aminosäuresequenz wurde aus dem offenen Leserahmen von diesem Clon in SEQ ID NO: 6 erhalten. SEQ ID NO: 5 unterscheidet sich durch die Änderung eines einzelnen Basenpaars von G zu T im codierenden Strang an der Basennummer 1241 von SEQ ID NO: 1. Die Änderung führt zu einer Änderung der Aminosäurenummer 396 von Lysin in der Wildtyp-Sequenz (SEQ ID NO: 2) zu Asparagin in der Aminosäuresequenz von LR33 (SEQ ID NO: 6).
Zur Bestätigung, dass sich die Basenänderung mehr aus einer Änderung im LR33-Genom als einem PCR-generierten Fehler ergab, der während des Clonierens der myo-Inositol-1-phosphat-Synthase von LR33 aufgetreten sein könnte, wurden zwei PCR-Primer-Sets vorbereitet. Der Wildtyp-Primer (SEQ ID NO: 7) und der LR33-Primer (SEQ ID NO: 8) wurden zum Amplifizieren der genomischen DNA verwendet, die aus trockenen Samen des Sojabohnen-Kultivars A2872 und aus der Sojabohnenlinie LR33, Clonnummer 16 hergestellt wurde (siehe Tabelle 8). Der in SEQ ID NO: 4 beschriebene PCR-Primer wurde als der allgemeine Antisense-Strang-Primer verwendet. Bei Annealingtemperaturen von 62°C oder 64°C und 35 Zyklen Annealing und Verlängerung produzierte nur der Wildtyp-Primer ein PCR-Produkt, wenn A2872-DNA als eine Matrize verwendet wurde und produzierte nur der Primer ein Produkt, der der LR33-Sequenz entspricht, wenn LR33-DNA als Matrize verwendet wurde.
Zur weiteren Kontrolle der Spezifität der Primer zum Nachweis der Mutation wurde DNA aus sechs einzelnen Pflanzen hergestellt, die aus Samen des in Beispiel 3 (siehe Tabelle 8) segregierenden LR33-Clons Nummer 7 gezogen wurden. Von sechs getesteten Pflanzen aus der segregierenden Population ergaben zwei DNA, die als Matrize für beide Primer wirkte, drei ergaben DNA, die nur mit dem Wildtyp-Primer als ein Primer wirkte und eine ergab DNA, die nur mit dem LR33-Primer ein Produkt produzierte.
Hierbei handelt es sich um die erwarteten Ergebnisse aus einer Population, die Heterozygote, enthaltend einen Wildtyp und eine mutierte Kopie des Gens, enthält.
Aus den Metaboliten-Daten und den Sequenz-Daten folgerten wir, dass der beobachtete Samen-Phänotyp mit sehr niedrigen Gesamtraffinose-Saccharid-Zuckern, sehr hoher Saccharose und niedriger Phytinsäure alle auf die einzelne Basenänderungsmutation zurückzuführen sind, die durch den Vergleich der in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 gezeigten Wildtyp- und LR33-Sequenzen beschrieben sind.
BEISPIEL 6
TRANSFORMATION VON SOJABOHNEN ZUM ERREICHEN VON GEN-SILENCING DER MYO-INOSITOL-1-PHOSPHAT-SYNTHASE UND DES ASSOZIIERTEN SAMEN-PHÄNOTYPS KONSTRUKTION VON VEKTOREN ZUR TRANSFORMATION VON GLYCINE MAX ZUR REDUZIERTEN EXPRESSION VON MYO-INOSITOL-1-PHOSPHAT-SYNTHASE BEI DER ENTWICKLUNG VON SOJABOHNENSAMEN
Plasmide, enthaltend die Antisense- oder Sense-orientierte cDNA-Sequenz von myo-Inositol-1-phosphat-Synthase-der Sojabohne unter Kontrolle des Promotors des Sojabohnen-Kunitz-Trypsin-Inhibitors 3 (KTi3) [Jofuku und Goldberg, (1989) Plant Cell 1: 1070–1093], des Promotors des Samenspeicherproteins (Phaseolin) von Phaseolus vulgaris 7S [Sengupta-Gopalan et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3320–3324; Hoffman et al., (1988) Plant Mol. Biol. 11: 717–729] und des Promotors des β-Conglycinins der Sojabohne [Beachy et al., (1985) EMBO J. 4: 3047–3053] werden konstruiert. Die Konstruktion von Vektoren, die die cDNA von myo-Inositol-1-phosphat-Synthase der Sojabohne unter der Kontrolle dieser Promotoren exprimieren, wird durch die Verwendung der folgenden Plasmide erleichtert: pML70, pCW108 und pCW109A.
Der pML70-Vektor enthält den KTi3-Promotor und die KTi3-3'-untranslatierte Region und wurde von dem gewerblich erhältlichen Vektor pTZ18R (Pharmacia) über die intermediären Plasmide pML51, pML55, pML64 und pML65 abgeleitet. Ein Bst BI/Eco RI-Fragment von 2,4 kb des kompletten KTi3-Gens der Sojabohne [Jofuku und Goldberg vorstehend], das alle 2039 Nukleotide von der 5'-untranslatierten Region und 390 Basen der Codierungssequenz des KTi3-Gens, die am Eco RI-Ort enden, der den Basen 755 bis 761 der in Jofuku et al. (1989) Plant Cell 1: 427–435, beschriebenen Sequenz entspricht, enthält, wurde in die Acc I/Eco RI-Orte von pTZ18R zur Schaffung des Plasmids pML51 ligiert. Das Plasmid pML51 wurde mit Nco I geschnitten, unter Verwendung von Klenow gefüllt und erneut ligiert, um einen Nco I-Ort in der Mitte der 5'-untranslatierten Region des KTi3-Inserts zu zerstören, was im Plasmid pML55 resultiert. Das Plasmid pML55 wurde teilweise mit Xmn I/Eco RI aufgeschlossen, um ein Fragment von 0,42 kb freizusetzen, das den Basen 732 bis 755 der vorstehend aufgeführten Sequenz entspricht, die verworfen wurde. Ein synthetischer Xmn I/Eco RI-Linker, der einen Nco I-Ort enthält, wurde durch Herstellung eines Dimers von komplementären synthetischen Oligonukleotiden, bestehend aus der Codierungssequenz für einen Xmn-I-Ort (5'-TCTTCC-3') und einem Nco I-Ort (5'-CCATGGG-3'), direkt gefolgt von einem Teil eines Eco RI-Orts (5'-GAAGG-3') konstruiert. Die Xmn I- und Nco I/Eco RI-Orte wurden durch eine kurze intervenierende Sequenz (5'-ATAGCCCCCCAA-3') verknüpft. Dieser synthetische Linker wurde in die Xmn I/Eco RI-Orte des Fragments von 4,94 kb zur Schaffung des Plasmids pML64 ligiert. Die 3'-untranslatierte Region des KTi3-Gens wurde von der in Jofuku et al., [vorstehend] beschriebenen Sequenz mittels Standard-PRC-Protokollen (Perkin Elmer Cetus, GeneAmp PCR-Kit) unter Verwendung der Primer ML51 und ML52 amplifiziert. Der Primer ML 51 enthielt die 20 Nukleotide, die den Basen 1072 bis 1091 der vorstehend angegebenen Sequenz mit dem Zusatz von Nukleotiden entsprechen, die Eco RV-(5'-GATATC-3'), Nco I-(5'-CCATGG-3'), Xba I-(5'-TCTAGA-3'), Sma I (5'-CCCGGG-3') und Kpn I-(5'-GGTACC-3') Orte an den 5'-Enden des Primers entsprechen. Primer L52 enthielt das exakte Komplement der Nukleotide, die den Basen 1242 bis 1259 der vorstehend angegebenen Sequenz entsprechen mit dem Zusatz der Nukleotide, die Sma I-(5'-CCCGGG-3'), Eco RI-(5'-GAATTC-3'), Bam HI-(5'-GGATCC-3') und Sal I-(5'-GTCGAC-3') Orten an den 5'-Enden des Primers entsprechen. Das PCR-amplifizierte 3'-Ende des KTi3-Gens wurde in die Nco I/Eco RI-Orte von pML64 ligiert, um das Plasmid pML65 zu schaffen. Ein synthetischer multipler Clonierungsort-Linker wurde durch Herstellung eines Dimers aus komplementären synthetischen Oligonukleotiden konstruiert, die aus der Codierungssequenz für Pst I-(5'-CTGCA-3'), Sal I-(5'-GTCGAC-3'), Bam HI-(5'-GGATCC-3') und Pst I-(5'-CTGCA-3') Orte bestehen. Der Linker wurde in den Pst I-Ort (direkt 5' an die KTi3-Promotor-Region) von pML65 zur Schaffung des Plasmids pML70 ligiert.
Der pCW108-Vektor enthält den Bohnen-Phaseolin-Promotor und die 3'-untranslatierte Region und leitete sich vom gewerblich erhältlichen pUC18-Plasmid (Gibco-BRL) über Plasmide AS3 und pCW104 ab. Plasmid AS3 enthält 495 Basenpaare des Phaseolin-Promotors (7S-Samenspeicherprotein) der Bohne (Phaseolus vulgaris), beginnend mit 5'-TGGTCTTTTGGT-3', gefolgt von den gesamten 1175 Basenpaaren der 3'-untranslatierten Region des gleichen Gens [siehe Sequenz-Beschreibungen in Doyle et al., (1986) J. Biol.; Chem. 261: 9228–9238 und Slightom et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1897–1901; eine weitere Sequenzbeschreibung kann in der Weltpatentveröffentlichung WO911/3993], die in den Hind III-Ort von pUC18 cloniert wurde, gefunden werden. Die zusätzlichen Clonierungsorte der multiplen Clonierungsregion von pUC18 (Eco RI, Sph I, Pst I und Sal I) wurden durch Aufschluss mit Eco RI und Sal I, Ausfüllen der Enden mit Klenow und erneutes Ligieren, um das Plasmid pCW 104 zu ergeben. Ein neuer multipler Clonierungsort wurde zwischen 495 bp des 5'-Phaseolins und 1175 bp des 3'-Phaseolins durch Insertieren eines Dimers der komplementären synthetischen Oligonukleotide, bestehend aus der Codierungssequenz für einen Nco I-Ort (5'-CCATGG-3'), gefolgt durch drei Füllerbasen (5'-TAG-3'), der Codierungssequenz für einen Sma I-Ort (5'-CCCGGG-3'), den letzten drei Basen eines Kpn I-Ortes (5'-TAC-3'), einem Cytosin und der Codierungssequenz für einen Xba I-Ort (5'-TCTAGA-3') zur Schaffung des Plasmids pCW108, herbeigeführt. Dieses Plasmid enthält einzigartige Nco I-, Sma I-, Kpn I- und Xba I-Orte direkt hinter dem Phaseolin-Promotor.
Der Vektor pCW109A enthält die β-Conglycinin-Promotorsequenz der Sojabohne und die 3'-untranslatierte Region des Phaseolins und stellt eine modifizierte Version von Vektor pCW109 dar, der sich von dem gewerblich erhältlichen Plasmid pUC18 (Gibco-BRL) ableitete. Der Vektor pCW109 wurde durch Insertieren in den Hind III-Ort des Clonierungsvektors pUC18 einer 5' nicht codierenden Region aus 555 bp (enthaltend die Promotor-Region) des β-Conglycinin-Gens, gefolgt von der multiplen Clonierungssequenz, enthaltend die Restriktionsendonuklease-Orte für Nco I, Sma I, Kpn I und Xba I, wie für pCW108 vorstehend beschrieben, dann 1174 bp der 3'-untranslatierten Region des Bohnen-Phaseolins in den Hind III-Ort (vorstehend beschrieben) hergestellt.
Die verwendete β-Conglycinin-Promotor-Region stellt aufgrund der Unterschiede an 27 Nukleotid-Positionen ein Allel des veröffentlichten β-Conglycinin-Gens dar [Doyle et al., (1986) J. Biol. Chem. 261: 9228–9238]. Eine weitere Sequenzbeschreibung dieses Gens kann in der Weltpatentveröffentlichung WO91/13993 gefunden werden.
Diese drei Nukleinsäurekonstruktionen konstituieren Samen-spezifische Expressionsvektoren mit Expression über eine breite Periode der Entwicklung hinweg, einschließlich der Periode der myo-Inositol-Synthese für die sich anschließende Umwandlung in Phytinsäure. Die Insertion der in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 beschriebenen Sequenzen in diese Vektoren wird durch die in Beispiel 5 vorstehend beschriebenen PCR-Verfahren erleichtert. Die PCR-Primer, die zu den gewählten Regionen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 komplementär sind, können mit zusätzlichen Basen, die die Erkennungssequenzen der Restriktionsendonukleasen konstituieren, die unter denen ausgewählt werden, die auch in den multiplen Clonierungssequenzen schneiden, wobei die den Promotorsequenzen von pML70, pCW108 und PCW109 folgen, synthetisiert. Die Platzierung der Restriktionsorte kann so gewählt werden, um die Orientierung des Nukleotidfragments von der myo-Inositol-1-phosphat-Synthase der Sojabohne in die Sense-Orientierung zu richten, um entweder eine Überexpression oder Cosuppression zu erreichen oder in die Antisense-Orientierung, um Unterexpression zu erreichen.
TRANSFORMATION VON SOMATISCHEN EMBRYOKULTUREN DER SOJABOHNE UND REGENERATION VON SOJABOHNENPFLANZEN
Die folgenden Stocklösungen und Medien werden zur Unterstützung des Wachstums von Sojabohnengeweben in vitro verwendet:
STOCKLÖSUNGEN:
MEDIEN:
Embryogene Sojabohnensuspensionskulturen werden in 35 ml flüssigem Medium (SB55 oder SBP6) auf einem Rotationsschüttler, 150 U/min, bei 28°C mit gemischter Neon- und Glühlampenbeleuchtung bei einem 16:8 h Tag/Nacht-Rhythmus aufrechterhalten. Die Kulturen werden alle vier Wochen durch Inokulation von ca. 35 mg Gewebe in 35 ml flüssigem Medium subkulturiert.
Embryogene Sojabohnensuspensionskulturen können mit samenspezifischen Expressionsvektoren, enthaltend entweder die Sense- oder Antisense-orientierte myo-Inositiol-1-phosphat-Synthase anhand des Verfahrens des „Particle Gun Bombardment" transformiert werden (siehe Kline et al. (1987) Nature (London) 327: 70). Für diese Transformationen wird ein Biolistic^TM PDS1000/HE-Instrument (Helium-Retrofit) verwendet.
Zu 50 ml einer 60 mg/ml Goldpartikelsuspension (1 μm) wird reihenfolglich Folgendes zugefügt: 5 μl DNA (1 μg/μl), 20 μl Spermidin (0,1 M) und 50 μl CaCl₂ (2,5 M). Die Partikelpräparation wird 3 min gerührt, in einer Mikrofuge 10 sec geschleudert und der Überstand entfernt. Die mit DNA beschichteten Partikel werden dann einmal in 400 μl 70% Ethanol gewaschen und in 40 μl wasserfreiem Ethanol resuspendiert. Die DNA-/Partikelsuspension wird jeweils 1 sec lang dreimal beschallt. 5 μl der mit DNA beschichteten Goldpartikel werden auf jedes Makro-Carrier-Disk geladen.
Circa 300–400 mg einer vier Wochen alten Suspensionskultur wird in eine leere Petrischale (60 × 15 mm) gegeben und die restliche Flüssigkeit mit einer Pipette aus dem Gewebe entfernt. Für jedes Transformationsexperiment wurden in der Regel ca. 5–10 Platten mit Gewebe bombardiert. Der Membranrupturdruck wird auf 1000 psi eingestellt und die Kammer wird auf ein Vakuum von 28 in. Quecksilber evakuiert. Das Gewebe wird ca. 3,5 in von dem Rückhaltesieb entfernt platziert und dreimal bombardiert. Nach der Bombardierung wird das Gewebe zurück in die Flüssigkeit gegeben und wie vorstehend beschrieben kultiviert.
Elf Tage nach der Bombardierung wird das flüssige Medium mit frischem SB55, enthaltend 50 mg/ml Hygromycin, ausgetauscht. Danach wird das Selektivmedium wöchentlich aufgefrischt. Sieben Wochen nach der Bombardieung kann grünes, transformiertes Gewebe beobachtet werden, das aus nicht transformiertem nekrotischem embryogenen Clusters wächst. Isoliertes grünes Gewebe wird entfernt und in individuelle Flaschen zum Generieren neuer, clonisch propagierter transformierter embryogener Suspensionskulturen inokuliert. Folglich wird jede neue Linie als unabhängiges Transformationereignis behandelt. Diese Suspensionen können dann als Suspensionen von Embryos aufrechterhalten werden, die in einer immaturen Entwicklungsstufe durch Subkultur geclustert oder durch Maturation und Keimung individueller somatischer Embryos in ganze Pflanzen regeneriert werden.
Transformierte embryogene Cluster werden aus der flüssigen Kultur entfernt und auf ein Agarfestmedium (SB103), das keine Hormone oder Antikörper enthält, gegeben. Die Embryos werden acht Wochen bei 26°C mit gemischter Neon- und Glühlampenbeleuchtung bei einem 16:8 h Tag/Nacht-Rhythmus kultiviert. Während dieser Periode können individuelle Embryos aus den Clustern entfernt und auf verschiedenen Stufen der Embryo-Entwicklung analysiert werden. Nach acht Wochen werden somatische Embryos zur Keimung geeignet. Zur Keimung werden acht Wochen alte Embryos aus dem Maturationsmedium entfernt und in leeren Petrischalen 1 bis 5 Tage getrocknet. Die getrockneten Embryos werden dann in SB71-1-Medium gepflanzt, wo ihnen erlaubt wird, unter den gleichen wie vorstehend beschriebenen Beleuchtungs- und Keimungsbedingungen zu keimen. Gekeimte Embryos können dann in sterile Erde transferiert werden und zwecks Samensammlung bis zur Maturität wachsen.
Während sie sich im globulären Embryozustand in flüssiger Kultur, wie vorstehend beschrieben, befinden, enthalten somatische Sojabohnen-Embryos sehr geringe Mengen Triacylglycerol oder Speicherproteine, die für maturierende, zygote Sojabohnenembryos typisch sind. In diesem Entwicklungsstadium liegt das Verhältnis von Gesamttriacylglycerid zu polarem Gesamtlipid (Phospolipide und Glycolipid) bei ca. 1:4, wie dies für zygote Sojabohnenembryos im Entwicklungsstadium, von dem die somatische Embryokultur initiiert wurde, typisch ist. Auch auf der globulären Stufe sind die mRNAs für die prominenten Samenproteine (α'-Subeinheit von β-Conglycinin, Kunitz-Trypsin-Inhibitor 3 und Sojabohnensamen-Lectin) weitgehend abwesend. Beim Transfer an hormonfreies Medium, um die Differenzierung in den maturierenden somatischen Embryozustand, wie hierin vorstehend beschrieben, zu ermöglichen, wird Triacylglycerol zur reichhaltigsten Lipidklasse. mRNAs für die α'-Subeinheit von β-Conglycinin, den Kunitz-Trypsin-Inhibitor 3 und das Sojabohnensamen-Lectin werden auch zu sehr reichhaltigen Messages in der Gesamt-mRNA-Population. In dieser Hinsicht verhält sich das somatische Sojabohnenembryo-System sehr ähnlich zu maturierenden zygoten Sojabohnenembryos in vivo. Während der frühen Maturationsperiode sind die wichtigsten löslichen Kohlenhydrate, die in den somatischen Embryos vorliegen, Saccharose, Glucose und Maltose (die während der Maturationsphase zugeführten Zucker). Wenn die somatischen Embryos maturieren und beginnen gelb zu werden, werden sowohl Raffinose als auch Stachyose gebildet. Auch in dieser Hinsicht ist der Phänotyp der somatischen Embryos den zygoten Embryos sehr ähnlich, während sie durch die späten Stadien der Samenentwicklung gehen. Folglich sollte die Selektion auf Embryos, die mit samenspezifischen Expressionsvektoren transformiert werden, welche die Expression der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 beschriebenen Nukleotidsequenzen in entweder der Sense- oder Antisense-Orientierung richten und die eine reduzierte Menge an Raffinose und Stachyose produzieren, zur Regeneration maturer, fertiler Sojabohnenpflanzen führen, die Samen mit dem gleichen Phänotyp tragen.
SEQUENZPROTOKOLL
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13bis)
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13bis)
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORCANISM (PCT Rule 13bis)

Claims

Sojabohnenpflanze, homozygot für mindestens ein Gen, das eine mutierte myo-Inositol-1-phosphat-Synthase codiert, wobei das Gen eine Mutation in der Sequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist, wobei die mutierte myo-Inositol-1-phosphat-Synthase im Vergleich zu einer myo-Inositol-1-phosphat-Synthase des Wildtyps eine reduzierte enzymatische Aktivität aufweist, wobei das Gen einen erblichen Phänotyp von (i) einem Phytinsäuregehalt im Samen von weniger als 17 μmol/g, (ii) einem kombinierten Raffinose- plus Stachyose-Gehalt im Samen von weniger als 14,5 μmol/g und (iii) einem Saccharose-Gehalt im Samen von größer als 200 μmol/g verleiht, vorausgesetzt dass die Pflanze nicht LR33 (hinterlegt bei der ATCC unter Zugangs-Nr. 97988) darstellt.
Sojabohnenpflanze nach Anspruch 1, worin das Gen die Sequenz von SEQ ID NO: 5 aufweist oder das Gen eine mutierte myo-Inositol-1-phosphat-Synthase von SEQ ID NO: 6 codiert.
Sojabohnenpflanze, die den Phänotyp der Sojabohnenpflanze nach Anspruch 1 aufweist, umfassend ein chimäres Gen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (i) Einem chimären Gen, das ein isoliertes Nukleinsäurefragment umfasst, codierend eine myo-Inositol-1-phosphat-Synthase von SEQ ID NO: 2 der Sojabohne oder das Komplement des Nukleinsäurefragments, codierend eine myo-Inositol-1-phosphat-Synthase von SEQ ID NO: 2 der Sojabohne, funktionsfähig verknüpft mit geeigneten Regulationssequenzen, worin die Expression des chimären Gens, im Vergleich zu einer Sojabohne, die kein chimäres Gen aufweist, in reduzierter enzymatischer Aktivität eines nativen Gens, codierend eine myo-Insitol-1-phosphat-Synthase der Sojabohne, resultiert; und (ii) einem chimären Gen, das ein Subfragment eines isolierten Nukleinsäurefragments umfasst, codierend eine myo-Inositol-1-phosphat-Synthase von SEQ ID NO: 2 der Sojabohne oder das Komplement eines Subfragments eines isolierten Nukleinsäurefragments, codierend eine myo-Inositol-1-phosphat-Synthase von SEQ ID NO: 2 der Sojabohne, worin die Expression des chimären Gens, im Vergleich zu einer Sojabohne, die kein chimäres Gen aufweist, in reduzierter enzymatischer Aktivität eines nativen Gens, codierend eine myo-Inositol-1-phosphat-Synthase der Sojabohne, resultiert.
Samen der Sojabohnenpflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin genannter Samen (i) einen Phytinsäuregehalt im Samen von weniger als 17 μmol/g, (ii) einen kombinierten Raffinose- plus Stachyosegehalt im Samen von weniger als 14,5 μmol/g und (iii) einen Saccharosegehalt im Samen von größer als 200 μmol/g enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Sojaprotein-Produkts, umfassend die Verarbeitung der Samen nach Anspruch 4, um das gewünschte Sojabohnen-Proteinprodukt zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung eines Sojaprotein-Produktes, das aus Samen einer Sojabohnenpflanze, homozygot für mindestens ein Gen, das eine mutierte myo-Inositol-1-phosphat-Synthase codiert, die im Vergleich zu einer myo-Inositol-1-phosphat-Synthase des Wildtyps eine reduzierte enzymatische Aktivität aufweist, erhältlich ist, wobei das Gen einen erblichen Phänotyp von (i) einem Phytinsäuregehalt im Samen von weniger als 17 μmol/g, (ii) einem kombinierten Raffinose- plus Stachyosegehalt im Samen von weniger als 14,5 μmol/g und (iii) einem Saccharosegehalt im Samen von größer als 200 μmol/g verleiht, umfassend: (a) Kreuzen einer agronomisch elitären Sojabohnenpflanze mit LR33 (hinterlegt bei der ATCC unter Zugangs-Nr. 97988) oder jedweder der Sojabohnenpflanzen nach Anspruch 1 oder 3; (b) Screening des Samens von der aus Schritt (a) erhaltenen Pflanzennachkommenschaft auf (i) einen Phytinsäuregehalt im Samen von weniger als 17 μmol/g, (ii) einen kombinierten Raffinose- plus Stachyosegehalt im Samen von weniger als 14,5 μmol/g und (iii) einen Saccharosegehalt von größer als 200 μmol/g; und (c) Verarbeitung des in Schritt (b) ausgewählten Samens, um das gewünschte Sojaprotein-Produkt zu erhalten.