JP2001519665A - ラフィノースサッカリドおよびフィチン酸のレベルが低下している種子を生産する大豆植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、大豆種子のラフィノースサッカリド、スクロース、フィチン酸、および向きリン酸含有量を変化させ、そのため価値ありかつ有用な大豆製品をもたらす大豆酵素の同定、特徴決定、および操作に関する。本発明は、他の大豆系統と比較すると、発達中の種子の組織中でのミオイノシトール １−リン酸の合成のための能力が減少している大豆系統を含む。本明細書に教示されるように、複数の手段の内のいずれかによるミオイノシトール １−リン酸シンターゼ酵素活性の低減によりこの表現型を提示する大豆種子がもたらされる。

Description

【発明の詳細な説明】 ラフィノースサッカリドおよびフィチン酸のレベルが低下している種子を生産す る大豆植物 発明の分野 本発明は植物の分子生物学および遺伝学の分野に関する。一層具体的には本発 明は、種子中のミオイノシトール １−リン酸の生産についての能力が遺伝可能 な状態で減少している大豆系統の使用の関数としてラフィノース、スタキオース 、およびフィチン酸の含有量が有意に低く、そしてスクロースおよび無機リン酸 の含有量が有意に高い大豆蛋白質および荒粉製品に関する。 発明の背景 ラフィノースサッカリドは、植物では広域に分布するスクロースのＤ−ガラク トース含有性オリゴサッカリドの一群である。ラフィノースサッカリドは、一般 式Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）_n−α−Ｄ−グルコピラノシル −（１→２）−β−Ｄ−フルクトフラノシドを有し、かつｎ＝１からｎ＝４であ る場合には、それぞれラフィノース、スタキオース、バーバスコース、およびア ジュゴースとして知られることに特徴がある。大豆種子ではラフィノースおよび スタキオースが最大量で存在するラフィノースサッカリドである。対照的に、バ ーバスコースおよびアジュゴースは主要でない構成成分であり、一般的には標準 的分析法によっては検出されない。 ラフィノースサッカリドの存在についての広域にわたる植物学的調査が科学的文 献に報告されている［Ｄａｙ，Ｐ．Ｍ．Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ Ｇｒｅｅｎ Ｐｌａｎ ｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ，（１９８５）ｐｐ５３− １２９］。ラフィノースサッカリドは植物界での量の多さに関して非構造性炭水 化物中、スクロースの次ぎにくると考えられる。事実ラフィロースサッカリドは 、少なくとも高等な植物の中では広汎に存在し得る。ラフィロースサッカリドは 経済的に重要な多くの作物種の食用部分に大量蓄積する。その例には、大豆（グ リシン マックス Ｌ．メリル（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ．Ｍｅｒｒｉｌｌ ））、テンサイ（ベタ ブルガリス（Ｖｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））、綿花（ ゴシッピウム ヒルステゥム Ｌ．（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ ．）、カノーラ（ブラッシカ エスピー（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．））、な らびにインゲン豆（ファセオルス エスピー（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｓｐ．）） ヒヨコマメ（キケル アリエティヌム（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ））、 ササゲ（ビグナ ウングイクラタ（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ））、 ヤエナリ（ビグナ ラディアタ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ））、エンドウマ メ（ピスム サティブム（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ））、ヒラマメ（レンズ クリナリス（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ））、およびハウチマメ（ルピヌ ス エスピー（Ｌｕｐｉｎｕｓ ｓｐ．））を含む全ての主要食用マメ科作物が ある。 多くの種に豊富に存在するものの、ラフィノースサッカリドは幾つかの経済的 に重要な作物種の効率的な利用の障害となっている。ラフィノ ースサッカリドは動物により直接消化されず、その主な理由はα−ガラクトシダ ーゼが腸粘膜に存在しないためである［Ｇｉｔｚｅｌｍａｎｎ ａｎｄ Ａｕｒ ｉｃｃｈｉｏ．（１９６５）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ３６：２３１−２３６；Ｒ ｕｔｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９６７）Ｎａｈｒｕｎｇ．１１：３９−４６］ 。しかしながら、腸下部中のミクロフローラは容易にラフィロースサッカリドを 発酵させることができ、それにより腸の酸化、ならびに二酸化炭素、メタン、お よび水素の生産がもたらされる［Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｊ． Ａｇｒ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．２０：８１３−８１７；Ｃｒｉｓｔｏｆａｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｓｕｇａｒｓ ｉｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、（１９７４）Ｃ ａｐｔｅｒ ２０，３１３−３３５；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ（１９８０）Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４５：１１６１−１１６４］。結果として生じる鼓 腸により、ヒトを含む動物用食品におけるマメ科植物の使用がひどく制限され得 る。ラフィノースサッカリドの存在がヒトを含む動物の食事中での大豆の使用を 制限してしまうことは残念であり、なぜならそれ以外の点ではこの種は蛋白質お よび繊維の優れた源であるためである。 大豆は、世界中の多くの地域で広く利用できる収穫、貯蔵、および処理用の機 械および施設によく適用する。米国だけでもおおよそ２８００万メートルトンの 荒粉が１９８８年に生産された［Ｏｉｌ Ｃｒｏｐｓ Ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ａ ｎｄ Ｏｕｔｌｏｏｋ Ｒｅｐｏｒｔ、Ａｐｒ、１９８９、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒ ｖｉｃｅ］。典型的には籾殻を取り除き、そしてその後に幾つかの抽出系の内の 一つでヘキサン を用いて油を抽出する。残りの脱脂されたフレークをその後に多種多様の商業用 大豆蛋白質製品用に用いることができる［Ｓｏｙ Ｐｒｏｔｅ ｉｎ Ｐｒｏｄ ｕｃｔｓ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ａｓｐ ｅｃｔｓ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ（１９８７）Ｓｏｙ Ｐｒｏｔｅｉ ｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ］。最も重要なこととして、これらの中で大量に用いられて いるのは大豆荒粉であり、これは動物のえさ、特に家禽類および豚のような単胃 動物のためのものに用いられる食料中の主要蛋白質源である。 大豆は優れた植物性蛋白質源であるものの、ラフィノースサッカリドの存在の ためにその使用が非効率性なものになっている。動物の餌中の別の主要成分であ るトウモロコシに比べ、大豆荒粉についての総エネルギー利用率は低い［Ｐｏｔ ｔｅｒ ａｎｄ Ｐｏｔｃｈａｎａｋｏｒｎ．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｗｏｒｌｄ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ＩＩＩ、（１９８４）２ １８−２２４］。例えば、大豆荒粉は、挽いたイエローコーン（ｙｅｌｌｏｗ ｃｏｒｎ）と比較すると約６％高い総エネルギーを含むものの、ニワトリに餌を 与える最の代謝可能なエネルギーは約４０〜５０％少なくなる。この総エネルギ ー利用率の非効率性は、その荒粉の蛋白質分画の消化の際の問題に起因するので はなく、むしろその荒粉の炭水化物の消化不良に起因するように思われる。エタ ノール抽出による大豆荒粉からのラフィノールサッカリドの除去により、ブロイ ラーについての代謝可能なエネルギーがかなり増加することが報告されている［ Ｃｏｏｎ、Ｃ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｓｏｙｂｅａ ｎ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ ｙ ｏｆ Ｍ ｉｎｎｅｓｏｔａ、（１９８８）２０３−２１１］。ラフィノースサッカリドの 除去は大豆荒粉のセルロース系誘導体およびヘミセルロース系誘導体の利用率増 加に関連していた。 多種多様の加工植物性蛋白質製品は大豆から製造される。これらの製品は、例え ば大豆荒粉、グリット（ｇｒｉｔｓ）、および小麦粉のような最小限の加工を施 した脱脂品目から、大豆蛋白質濃縮物および大豆蛋白質単離物のような一層高度 の加工を施した品目にまでわたる。他の大豆蛋白質製品では、油は抽出されず、 その一例は全脂肪大豆粉である。これらの加工製品に加え、インゲン豆全体を出 発物質として利用する伝統的な東洋的（Ｏｒｉｅｎｔａｌ）加工法に基づく多数 の特製品も存在する。その例としては、豆乳、醤油、豆腐、納豆、味噌、テンペ 、およびユバがある。 ヒトの食物における大豆蛋白質の使用の例には、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白 質単離物、植物性大豆蛋白質、豆乳、および乳児用調合乳がある。大豆からの蛋 白質濃縮物および単離物を生産するための設備および方法は全世界で利用可能と なっている。大豆濃縮物および単離物の生産者が直面している問題の一つはラフ ィノースサッカリドから蛋白質のみを選択的に精製するという努力目標である。 大豆中に存在する大量のラフィノースサッカリドを除去する結果、かなりの装置 と運営費用が必要となる。 ラフノースサッカリドに関連する問題および費用は、大豆種子のラフィノース サッカリドの含有量を減少させる遺伝子利用を通して減少もしくは除去すること ができる。このような遺伝子を用いて、本質的にラフィノースサッカリド含有量 が減少している大豆品種を開発することができ る。本質的にラフイノースサッカリド含有量が減少している大豆品種は派生大豆 蛋白質製品の栄養品質を改善し、そしてラフィノースサッカリドの除去に関連す る加工費用を低減する。低ラフィノースサッカリド大豆品種は動物およびヒトの 食事用の通常の品種よりも価値が高く、そして人間がこの食用豆果の所望される 栄養特製を一層完全に利用することを可能にする。 ミオイノシトール六リン酸（「フィチン酸」としても知られている）とラフィ ノースサッカリドは、両者の合成中の共通中間体としてミオイノシトールを共有 している[Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．、（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｌａ ｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ９：５３７−５４８]。ラフィノースサッカリド同様、 フィチン酸は被子植物種子のほぼ偏在的な構成成分である［Ｒａｂｏｙ，Ｖ．Ｉ ｎ：Ｉｎｏｓｉｔｏｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ（１９９０ ）Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ５５−７６］。フィチン酸は 典型的には、例えば大豆やトウモロコシのような種子中の全リン酸の内の５０〜 ７０％を占める一方で、こういったリン酸は単胃動物には不十分にしか利用され ない。部分的に消化可能であるのみであることに加え、動物の食料中のフィチン 酸の存在により、例えば必須アミノ酸、カルシウム、および亜鉛のような他の限 定された栄養素の排出がもたらされる［Ｍｒｏｚ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，（１９９ ４）Ｊ．Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉ．７２：１２６−１３２；Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ． 、Ｉｎ：Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３、Ａｃａ ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９８９）ｐｐ．５９−９６］ 。大豆荒粉は多くの動物餌用食料の主要部分であるため、フィチン酸の量 が減少していると共に利用可能なリン酸の量が増加している荒粉により、大豆含 有性食料中の食料供給効率性が改善されるはずである。事実、大豆含有性食料を 酵素で処理してフィチン酸からのリン酸基を部分的に加水分解することにより、 リン酸の利用率と他の限定された栄養素の利用率の両方ともが改善する［Ｍｒｏ ｚ ｅｔ ａｌ．、上述；Ｐｅｎ ｅｔ ａｌ．、（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ １１：８１１−８１４］。 商業用および野生の大豆生殖質の調査により、種子のフィチン酸含有量を遺伝 的に変化させる際には制限が伴うことが示されている［Ｒａｂｏｙ ｅｔ ａｌ ．、（１９８４）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４：４３１−４３４］。これら の要素を考え合わせると、種子におけるラフィノースサッカリドおよびフィチン 酸のレベルが遺伝的、実質的に減少している大豆植物が必要とされることは明ら かである。 発明の要約 本発明は、（ｉ）種子のフィチン酸含有量が１７μモル／ｇを下回り、（ｉｉ ）種子のラフィノースとスタキオースとの合計含有量が１４．５μモル／ｇを下 回り、そして（ｉｉｉ）種子のスクロース含有量が２００μモル／ｇを上回る遺 伝性表現型を有する大豆植物に関し、その表現型はその植物の種子中のミオイノ シトール １−リン酸の合成についての能力の減少に由来する。本発明は更には 、この植物に由来する種子にも関する。 一層具体的には本発明は、大豆のミオイノシトール １−リン酸シンターゼを コードする単離された核酸断片もしくはその相補物、ならびに 適切な調節配列に操作可能に連結されるこの核酸断片もしくはこの核酸断片の亜 断片を含むキメラ遺伝子（この場合、このキメラ遺伝子の発現により、大豆ミオ イノシトール １−リン酸シンターゼをコードする本来の遺伝子の発現が減少す る）に関する。 本発明の他の態様は、ミオイノシトール−１−リン酸の合成のための能力が減 少している突然変異体ミオイノシトール １−リン酸シンターゼをコードする単 離された核酸断片である。 本発明のさらに別の態様は、そのゲノム中に、適切な調節配列に操作可能に連 結される大豆ミオイノシトール １−リン酸シンターゼをコードする核酸断片も しくはその核酸断片の相補物を含むキメラ遺伝子を有する（この場合、このキメ ラ遺伝子の発現により、大豆ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼをコード する本来の遺伝子の発現が減少する）大豆植物である。 本発明のさらに別の態様は、ミオイノシトール １−リン酸の合成についての 能力が減少している突然変異体ミオイノシトール １−リン酸シンターゼをコー ドする少なくとも一つの遺伝子についてホモ接合体である大豆植物であって、そ の遺伝子により（ｉ）種子のフィチン酸含有量が１７μモル／ｇを下回り、（ｉ ｉ）種子のラフィノースとスタキオースとの合計含有量が１４．５μモル／ｇを 下回り、そして（ｉｉｉ）種子のスクロース含有量が２００μモル／ｇを上回る 遺伝性表現型が付与される。 本発明はさらに、先に記載される植物の内のいずれかのものの種子およびその ような種子に由来する蛋白質産物にも関する。 本発明のさらに別の態様は、（ｉ）種子のフィチン酸含有量が１７μ モル／ｇを下回り、（ｉｉ）種子のラフィノースとスタキオースとの合計含有量 が１４．５μモル／ｇを下回り、そして（ｉｉｉ）種子のスクロース含有量が２ ００μモル／ｇを上回る遺伝性表現型を有する大豆植物を作成するための方法に 関し、その方法は、（ａ）大豆系統ＬＢ３３、もしくはそのゲノム内に、適切な 調節配列に操作可能に連結される大豆ミオイノシトール １−リン酸シンターゼ をコードする核酸断片もしくはその核酸断片の相補物を含むキメラ遺伝子を有す るいずれかの大豆植物、またはミオイノシトール １−リン酸の合成についての 能力が減少している突然変異体ミオイノシトール １−リン酸シンターゼをコー ドする少なくとも一つの遺伝子についてホモ接合体である大豆植物を、えり抜き の大豆植物と交雑させること；および（ｂ）（ｉ）種子のフィチン酸含有量が１ ７μモル／ｇを下回り、（ｉｉ）種子のラフィノースとスタキオースとの合計含 有量が１４．５μモル／ｇを下回り、そして（ｉｉｉ）種子のスクロース含有量 が２００μモル／ｇを上回る遺伝性表現型を有する段階（ａ）の交雑子孫植物を 選択することを含む。 本発明はさらには、（ａ）農業経済学的にえり抜きの大豆植物を、記述の大豆 植物の内のいずれかと交雑させること；（ｂ）（ｉ）１７μモル／ｇを下回る種 子のフィチン酸含有量、（ｉｉ）１４．５μモル／ｇを下回る種子のラフィノー スとスタキオースとの合計含有量、および（ｉｉｉ）２００μモル／ｇを上回る 種子のスクロース含有量について段階（ａ）から取得される子孫植物の種子をス クリーニングすること；および（ｃ）段階（ｂ）で選択された種子を処理して所 望される大豆蛋白質製品を取得することを含む、大豆蛋白質製品を生産するため の方法を態様とする。 最後に本発明は、ミオイノシトール １−リン酸の合成についての能力が減少し ている突然変異体ミオイノシトール １−リン酸シンターゼをコードする少なく とも一つの遺伝子についてホモ接合体である大豆植物を用いる方法を態様とし、 その遺伝子により（ｉ）種子のフィチン酸含有量が１７μモル／ｇを下回り、（ ｉｉ）種子のラフィノースとスタキオースとの合計含有量が１４．５μモル／ｇ を下回り、そして（ｉｉｉ）種子のスクロース含有量が２００μモル／ｇを上回 る遺伝性表現型が付与され、その方法は（ａ）ミオイノシトール １−リン酸の 合成についての能力が減少している突然変異体ミオイノシトール １−リン酸シ ンターゼを含む大豆植物をその突然変異を含まないいずれかの大豆親と交雑させ てＦ１ハイブリッドを取得すること；（ｂ）少なくとも一世代につきそのＦ１ハ イブリッドを自家授粉させること；および（ｃ）ミオイノシトール １−リン酸 の合成についての能力が減少している突然変異体ミオイノシトール １−リン酸 シンターゼをコードする少なくとも一つの遺伝子についてホモ接合性である段階 （ｂ）の子孫を同定することを含み、その遺伝子により（ｉ）１７μモル／ｇを 下回る種子のフィチン酸含有量、（ｉｉ）１４．５μモル／ｇを下回る種子のラ フィノースとスタキオースとの合計含有量、および（ｉｉｉ）２００μモル／ｇ を上回る種子のスクロース含有量という遺伝性表現型が付与される。 図面の簡単な説明および配列表 本発明は、本出願の一部を形成する図面および配列表から一層完全に理解され 得る。この配列表は、引用により本明細書に取り込まれる３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１ ．８２２に特定されるアミノ酸のための３文字コー ドを含む。 図１。大豆種子中のフィチン酸、ラフィノース、およびスタキオースへのグル コース代謝。共通の補因子であるＡＴＰ、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ピロリン酸 （ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｖｅ）、および無機リン（Ｐｉ）は図示されない。酵 素は略称により列挙される：ヘキソキナーゼ（ＨＫ）；ホスホグルコイソメラー ゼ（ＰＧＩ）；ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＵＤＰＧＰＰ）；ＵＤＰ グルコース４’エピメラーゼ（ＵＤＰＧ４’Ｅ）；ミオイノシトール １−リン 酸シンターゼ（ＭＩ １−ＰＳ）；ミオイノシトール １−ホスファターゼ（Ｍ Ｉ １−Ｐａｓｅ）；ミオイノシトール １−リン酸キナーゼ（ＭＩ １−ＰＫ ）；ガラクチノールシンターゼ（ＧＡＳ）；スクロースシンターゼ（ＳｕｃＳ） ；ラフィノースシンターゼ（ＲＳ）；およびスタキオースシンターゼ（ＳＳ）。 配列番号１は、クローン ｐ５ｂｍｉ−１ｐｓ中に存在する野生型大豆ミオイ ノシトール １−リン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡの１７８２塩基からな る５’−３’ヌクレオチド配列である。 配列番号２は、配列番号１の読み取り枠から推定された５１０アミノ酸配列で ある。 配列番号３は、大豆系統ＬＲ３３からのミオイノシトール １−リン酸シンタ ーゼｃＤＮＡの単離の際に用いられる上流（５’）プライマーのヌクレオチド配 列である。 配列番号４は、大豆系統ＬＲ３３からのミオイノシトール １−リン酸シンタ ーゼｃＤＮＡの単離の際に用いられる下流（３’）プライマーのヌクレオチド配 列である。 配列番号５は、クローンＬＲ３３−１０に存在するＬＲ３３ミオイノシトール １−リン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡの１５３３塩基のヌクレオチト配 列てある。 配列番号６は、配列番号５の読み取り枠から推定される５１０アミノ酸配列で ある。 配列番号７は、ゲンムＤＮＡ試料からのミオイノシトール １−リン酸シンタ ーゼをコードする野生型対立遺伝子のＰＣＲ増幅のために用いられる上流（５’ ）プライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号８は、ゲノムＤＮＡ試料からのミオイノシトール １−リン酸シンタ ーゼをコードするＬＲ３３対立遺伝子のＰＣＲ増幅のために用いられる上流（５ ’）プライマーのヌクレオチド配列である。 生物学的寄託物 以下の生物学的材料はブダペスト条約の条項に従い、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａ ｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ ２０８５２に寄託して あり、そして以下の受託番号を保持している： 詳細な記述 本開示の文脈では多数の用語が使用される。本明細書に用いられる際 には「大豆」は、種グリシン マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、グリシン ソジャ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ）、もしくはグリシンマックス（Ｇｌｙｃ ｉｎｅ ｍａｘ）と性的交雑適合性を示すいずれかの種を意味する。「系統」は 、少なくとも一つの特徴について個体間にほとんどもしくは全く遺伝的変異を示 さない類似の親子関係の植物の群である。このような系統は、一回もしくは複数 回の自家授粉生殖および選択、または組織培養もしくは細胞培養技術によるもの を含む単一の親からの栄養繁殖により作成されてよい。「突然変異」は、隔離も しくは遺伝子組換えによりもたらされるのではない検出可能かつ遺伝性の遺伝子 変化（自律性もしくは誘導性のいずれか）を意味する。「突然変異体」は、突然 変異を保持する個体もしくは個体の系統を意味する。「集団」は、共通の遺伝子 プールを共有する個体のいずれかのグループである。本発明では、これにはＭ１ 、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｆ１、およびＦ２集団が含まれる。本明細書で用いられる 場合には、「Ｍ１集団」は突然変異誘発剤に露出してある種子（および得られる 植物）の子孫である一方で、「Ｍ２集団」は自家授粉したＭ１植物の子孫であり 、「Ｍ３集団」は自家授粉したＭ２植物の子孫であり、そして「Ｍ４集団」は自 家授粉したＭ３植物の子孫である。本明細書で用いられる際には「Ｆ１集団」は 、ある系統と別の系統の他家授粉によりもたらされる子孫である。このような他 家授粉を説明するために本明細書で用いられるフォーマットは「雌型親＊雄型親 」である。「Ｆ２集団」は、自家授粉させたＦ１植物の子孫である。「Ｆ２由来 系統」もしくは「Ｆ２系統」は、個別のＦ２系統の自家授粉によりもたらされる 系統である。Ｆ２由来系統は、前記Ｆ２由来系統の植物の自家授粉およびそのよ うな植物からの種子のバルキン グ（ｂｕｌｋｉｎｇ）を反復することにより後の世代（Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５ナド） を通して継代することができる。 用語「核酸」は、糖、リン酸、およびプリンもしくはピリミジンのいずれかを 含む単量体（ヌクレオチド）からなる、一本鎖もしくは二本鎖であることができ る巨大分子を意味する。「核酸断片」は、所定の核酸分子の分画である。「亜断 片」は、全体の核酸断片よりは少ないものを含む核酸断片の連続部分を意味する 。「相補的」は、核酸を含むプリンとピリミジンの特異的対合を意味し：アデニ ンはチミンと対合し、そしてグアニンはシトシンと対合をする。従って第一核酸 断片の「相補物」は、ヌクレオチド配列が第一核酸配列に相補的な第二核酸断片 を意味する。 高等植物ではデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は遺伝物質である一方で、リボ核酸 （ＲＮＡ）はＤＮＡ中の情報の蛋白質への移転に関わる。「ゲノム」は、ある生 物体の各細胞内に含まれる遺伝物質の全体物である。用語「ヌクレオチド配列」 は、一本鎖もしくは二本鎖であることができ、場合によってはＤＮＡもしくはＲ ＮＡ中に取り込ませることができる合成、非天然、もしくは改変させたヌクレオ チド塩基を含むＤＮＡもしくはＲＮＡポリマーの配列を意味する。用語「オリゴ マー」は、通常最高１００塩基長までの短いヌクレオチド配列を意味する。本明 細書に用いられる際には用語「相同の」は、２つの核酸分子のヌクレオチド配列 の間、もしくは２つの蛋白質分子のアミノ酸配列の間に関連性があることを意味 する。このような相同性の評価は、当業者にはよく理解されているストリンジェ ントな条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーショ ンのいずれかによるか（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｅｄｓ．（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉ ｄｉｓａｔｉｏｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）；またはＮ ｅｅｄｌｅｍａｎら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７０）４８：４４３−４５ ３）の方法によるような２つの核酸もしくは蛋白質の間の配列類似性の比較によ り提供される。本明細書で用いられる際には「実質的に類似する」は、例えばコ ーディング領域に対応する遺伝子および疑遺伝子のような特許請求される配列の コーディング領域とヌクレオチドレベルで９０％を上回る総体的同一性を有する ヌクレオチド配列を意味する。本明細書に記載される核酸断片は人工的および天 然の両方である可能な変種を含む分子を含み、これは例えば、次のものに制約さ れる訳ではないが、（ａ）コードされるアミノ酸に変化を生じない塩基変化に関 与するもの、または（ｂ）アミノ酸は変化させるが、ＤＮＡ配列によりコードさ れる蛋白質の機能特性には影響を及ぼさないもの、（ｃ）核酸断片の欠失、再編 成、増幅、ランダムもしくは調節された突然変異誘発に由来するもの、および（ ｄ）時折でも生じるヌクレオチド配列エラーである。 「遺伝子」は、コーディング領域の前にくる（５’−非コーディング）および 後にくる（３’−非コーディング）調節配列を含む特異的蛋白質を発現する核酸 断片を意味する。「固有の」は、天然に見いだされる自己の調節配列とともに単 離された遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」は、天然には見いだされない異種 調節配列およびコーディング配列を含む遺伝子を意味する。「内因性」遺伝子は 、通常はゲノム中の天然の位置に見いだされ、そして単離されない天然の遺伝子 を意味する。「外来性」遺伝子は、宿主生物内には通常見いだされないが遺伝子 移入により 導入される遺伝子を意味する。「疑遺伝子」は、機能性酵素をコードしないゲノ ムヌクレオチド配列を意味する。 「コーディング配列」は、特異的蛋白質をコードし、そして非コーディング配 列を除外するＤＮＡ配列を意味する。これは「中断されないコーディング配列」 、すなわちイントロンを欠失する配列を構築することがあってよいか、あるいは 適切なスプラス部位と連結する一つもしくは複数のイントロンを含んでよい。「 イントロン」は、初期転写物に転写され、しかし蛋白質に翻訳され得る成熟した ｍＲＮＡを作成するために細胞内ではＲＮＡの開裂および再連結を通して除去さ れるヌクレオチド配列である。 「開始コドン」および「停止コドン」は、蛋白質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の各々 開始および鎖停止を特定するコーディング配列中の３つの隣接するヌクレオチド の単位を意味する。「読み取り枠」は、アミノ酸配列をコードする、開始コドン と停止コドンとの間のイントロンにより中断されないコーディング配列を意味す る。 「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼによる触媒反応を受け る転写によりもたらされる産物を意味する。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な コピーである場合には、これは初期転写物として引用されるか、あるいは初期転 写物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡ配列であってよく、そしてその後に それは成熟ＲＮＡとして引用される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は 、イントロンを有すさず、そして細胞により蛋白質へと翻訳され得るＲＮＡを意 味する。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに由来する二本鎖ＤＮＡを意味する。「セン ス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ 」は、 標的初期転写物もしくはｍＲＮＡの全てもしくは部分に相補的であり、そしてそ の初期転写物もしくはｍＲＮＡのプロセシング、輸送、および／または翻訳を中 断することにより標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写物を意味する。アンチ センスＲＮＡの相補性は、特異的遺伝子転写物のいずれかの部分、すなわち５’ 非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロン、もしくはコーディ ング配列に対するものであってよい。それに加え、本明細書で用いられる場合に は、アンチセンスＲＮＡは、遺伝子発現を遮断するためにアンチセンスＲＮＡの 効力を増加させるリボザイム配列の領域を含んでよい。「リボザイム」は、触媒 性ＲＮＡを意味し、そして配列特異的エンドリノヌクレアーゼを含む。 本明細書に用いられる場合には「適切な調節配列」は、本発明の核酸断片の発 現を調節する、本発明の核酸断片の上流（５’）、その中、および／または下流 （３’）に位置する固有もしくはキメラ遺伝子中のヌクレオチド配列を意味する 。 「プロモーター」は、通常そのコーディング配列の上流（５’）の遺伝子中の ＤＮＡ配列を意味し、これは適切な転写に必要とされるＲＮＡポリメラーゼおよ び他の因子にとっての認識を提供することによりコーディング配列の発現を調節 する。人工ＤＮＡ構築物では、プロモーターを用いてアンチセンスＤＮＡを転写 することもできる。プロモーターは、生理学的もしくは発生的条件に対応して転 写開始の効率を調節する蛋白質因子の結合に関与するＤＮＡ配列をも含むことが あってよい。これはまた、エンハンサー因子をも含んでよい。「エンハンサー」 は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列である。それはプロモ ーターの内在因子であるか、あるいはプロモーターのレベルおよび／また は組織特異性を冗進させる目的で挿入された異種因子であってよい。「構造性プ ロモーター」は、全組織中での遺伝子発現をいつでも指令するものを意味する。 本明細書に引用される「組織特異的」もしくは「発達特異的」プロモーターはそ れぞれ、例えば葉や種子のような特異的組織中か、あるいは例えば初期胚形成も しくは後期胚形成のような組織中の特異的発達段階にほぼ独占的に遺伝子発現を 指令するものである。用語「発現」は、本明細書に用いられる場合には、細胞の 蛋白質製造装置と組合わさって、ミオイノシトール １−リン酸シンターゼのレ ベルの変化をもたらす本発明の核酸断片（一つもしくは複数）に由来するセンス （ｍＲＮＡ）もしくはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を意味する。 「アンチセンス阻害」は、標的蛋白質の発現を妨害することができるアンチセン スＲＮＡ転写物の生産を意味する。「過剰発現」は、正常もしくは形質転換され ていない生物内での生産のレベルを上回るトランスジェニック生物中での遺伝子 産物の生産を意味する。「共抑制」は、外来性遺伝子および内因性遺伝子の両方 の発現の抑制をもたらす内因性遺伝子に対する実質的相同性を有する外来性遺伝 子の発現を意味する。「変化されたレベル」は、正常もしくは形質転換していな い生物のものとは異なる量もしくは比率でのトランスジェニック生物体における 遺伝子産物（一つもしくは複数）の生産を意味する。本発明は更には、本発明の ヌクレオチド配列を含むベクター、本発明のベクターで遺伝子工学的に作成され る宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの生産にも関する。 「形質転換」は本明細書では、宿主生物体のゲノム内への外来性遺伝子の移入お よびその遺伝子的に安定な遺伝形質を意味する。「受精（結実）能力のある」は 、性的に繁殖することが可能な 植物を意味する。 「ラフィノースサッカリド」は、一般式Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（ １→６）_n−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−フルクトフラノ シド（式中、ｎ＝１〜４）のオリゴサッカリドのファミリーを意味する。大豆種 子ではこの用語は、一つ（ラフィノース）および二つ（スタキオース）ガラクト ース残基を含むファミリーのメンバーを一層具体的に意味する。より高級なガラ クトースポリマーも知られているものの（例えば、バーバスコースおよびアジュ ゴース）、大豆中のこれら高級ポリマーの含有量は標準検出法以下であり、そし てそのため総体的ラフィノースサッカリド含有量には有意には寄与しない。 「植物」は、真核生物および原核生物の両方である光合成性生物を意味し、こ の場合、用語「高等植物」は真核生物植物を意味する。 本発明は、大豆遺伝子の突然変異型、ならびに大豆種子および派生製品の炭水 化物およびフィチン酸組成を改良するための方法を提供する。本発明は、この遺 伝子中の突然変異を同定し、そして大豆種子のラフィノースサッカリドおよびフ ィチン酸含有量を減少させるために派生突然変異体大豆系統を使用するための方 法の例を教示する。本発明は更には、遺伝子サイレンシング技術（ｇｅｎｅ ｓ ｉｌｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の使用方法、および大豆種子中のラ フィノースサッカリド含有量を低減させるために本発明中に発見されたミオイノ シトール１−リン酸シンターゼについての大豆遺伝子配列をも教示する。 本発明の植物に由来する種子は、市販されている品種と比較すると改善された 可溶性炭化水素含有量を示す。この改善により、ラフィノースとスタキオースの 総計含有量の減少がもたらされる。これらの系統の炭 水化物の特色は、他の大豆品種改良プログラムで用いられるもしくはそれにより 生産される極上系統もしくは生殖質系統に見られる特色とは劇的に異なっている 。 本発明の新規大豆遺伝子を生産する２つの個別の方法が教示される。最初の方 法では、ラフィノースとスタキオースの総計含有量を低下させる突然変異の導入 という試みに初めての成功を収めている。この方法により２つの主要遺伝子の発 見がもたらされ、その２つの遺伝子の内の一つの詳細についてが本発明に記載さ れており、これをこれまでに報告されてきたいずれかの系統よりも秀れた（ラフ ィノースとスタキオースの総計含有量を低下させるという点では）大豆系統を開 発するのに用いることができる。第二の方法では、本発明において教示される遺 伝子配列を利用し、この配列がランダム突然変異誘発およびスクリーニングを通 して取得されるものに類似する結果を達成するために特異的遺伝子サイレンシン グのトランスジェニック法に適用される。 本出願人はまず、化学的突然変異誘発により野生型大豆のゲノム中にランダム 突然変異誘発を導入する道を模索した。本発明は突然変異誘発剤としてＮＭＵ（ Ｎ−ニトロ−Ｎ−メチル尿素）を利用したが、ＤＮＡ構造および配列を変化させ ることが知られる他の作用物質も用いることができたであろう。ＮＭＵ処理の後 に大豆種子を数世代にわたって作付けし、そして所望される表現型についてのス クリーニングを行うが；この際、最も重要なことは、ラフィノースッサカリド含 有量の変化であった。突然変異誘発させた大豆集団の初期スクリーニングにより ラフィノースサッカリドが低下していると思われる２系統、すなわちＬＲ３３お よびＬＲ２８が得られた（ＬＲ２８は国際公開第ＷＯ９３／０７７４２ に開示されている）。ＬＲ３３の低ラフィノースサッカリド表現型は、自家授粉 により生産されるＬＲ３３の３つの連続した世代の分析により遺伝可能であるこ とが証明された（表１）。 この系統により提示される独特な表現型をもたらすＬＲ３３中の生理学的欠損 は、一連の秀でた遺伝的および生化学的研究を実施することにより同定および特 徴決定された（例えば、以下の実施例２を参照されたい）。ＬＲ３３における欠 陥は、この系統の低スタキオース表現型をもたらすＬＲ２８中の突然変異から遺 伝的および生化学的に顕著であることが示された。それに加え、ＬＲ３３中の突 然変異はＬＲ２８における欠陥よりも大きな多面発現性を示し；本明細書は、Ｌ Ｒ３３表現型はラフィノースサッカリド含有量が低いばかりでなく、種子中のフ ィチン酸、無機リン、およびスクロースレベルの変化ももたらすことを示す。更 なる分析により、ＬＲ３３のみにより得られる遺伝情報が、大豆の子孫系統にこ の独特な表現型を付与し、そして突然変異体遺伝子もしくはＬＲ３３中の遺伝子 は他の大豆突然変異体系統に由来する遺伝子の表現型発現を促進させる単なる遺 伝子変更因子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）ではないことが確認された 。 ＬＲ３３およびその子孫により示される遺伝可能な表現型の原因となる特異的 生化学的欠損が同定されている。これは、大豆種子中でのラフィノースサッカリ ドの生合成、ならびにフィチン酸と無機リンレベルの調節を考慮することにより 達成された。これら既知の生化学的経路に基づくと、一連の生化学的研究および その後の分子遺伝学的分析により、ミオイノシトール １−リン酸の合成につい ての能力の減少をもたらすミオイノシトール １−リン酸シンターゼ活性の変化 としてのＬＲ３３種 子中での欠損が同定された。 ラフィノースおよびスタキオースの生合成についての特徴はかなり詳しく決定 されている［Ｄａｙ，Ｐ．Ｍ．Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｔｏ ｒａｇｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ Ｇｒｅｅｎ Ｐｌａｎｔｓ（１ ９８５）、を参照されたい］。ミオイノシトール六リン酸もしくはフィチン酸と ラフィノースサッカリドは、その合成の際の共通中間体としてミオイノシトール を共有している［Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ ｏｕｒｎａｌ（１９９６）９：５３７−５４８］。炭素源としてのグルコースか ら開始する、成熟している最中の大豆種子中でのフィチン酸、ラフィノース、お よびスタキオースの合成を説明する経路が図１に示される。 図１に示される相互変換により、グルコースもしくはスクロースのいずれかが フィチン酸のポリオール部分、ラフィノースおよびスタキオースを構成するヘキ ソースの全て、ならびにラフィノースシンターゼおよびスタキオースシンターゼ に対するガラクトース供与体であるミオイノシトールの再循環部分についての出 発物質になり得る。成熟した野生型大豆種子中に蓄積するこれらの相互変換物の 最終生成物は、量的に顕著な順では、スクロース、スタキオース、フィチン酸、 およびラフィノースとなる。 ラフィノースサッカリド生合成の主反応は、ＵＤＰガラクトースおよびミオイ ノシトールからのガラクチノール（Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→１ ）−ミオイノシトール）の合成を必要とする。この反応の触媒反応を行う酵素は ガラクチノールシンターゼである。スクロースからのラフィノース、およびラフ ィノースサッカチドファミリー中の 高度に類似する同族体の合成の触媒反応は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、 ラフィノースシンターゼ、およびスタキオースシンターゼにより行われる。 これらの最終生成物の比率の制御は、図１の酵素触媒段階の内の多くのもので の転換率を変化させることにより影響を受けることがあってよい。この制御は、 酵素発現レベルを変化させることによるか、もしくはその酵素の固有の活性を変 化させることにより影響を受け得る。変更を受けた経路からもたらされる最終生 成物から得られる混合物は、もともとの最終生成物に加え、通常の中間体の内の 幾つかのものを含める新規生成物混合物を含むことがあってよい。厳密な混合物 および組成は、活性が変化させられてしまっている酵素と、その変化の程度の両 方に依存する。 ６つの酵素である、ミオイノシトール １−リン酸シンターゼ、ミオイノシト ール １−ホスファターゼ、ＵＤＰ−グルコース４’エピメラーゼ、ガラクチノ ールシンターゼ、ラフィノースシンターゼ、およびスタキオースシンターゼの活 性は、スクロース含有量を減少させることなくラフィノースもしくはスタキオー スのいずれかの合成を減少させるために減少させることができる。これら６つの 内、ラフィノースとスタキオースの合成に特有な３つの酵素の活性はフィチン酸 含有量を減少させることなく減少させることができる。ミオイノシトール １− リン酸シンターゼのみが３つ全ての最終生成物の合成に関わっていると思われ、 そしてそのためその活性が減少する際には３つ全ての最終生成物の量を変化させ ることがあってよい。 本発明は、大豆種子中の細胞内のミオイノシトール １−リン酸シン ターゼ活性を減少させることにより、同時に大豆種子中のラフィノースサッカリ ドとフィチン酸含有量を減少させ、かつスクロースと無機リン含有量を増加させ る能力を教示する。これらの実施例は、この酵素をコードするヌクレオチド配列 内の点突然変異がアミノ酸置換をもたらし、そしてそれが次には細胞内酵素活性 を低下させるこの酵素の突然変異体形態の作成法および発見を記述する。ミオイ ノシトール １−リン酸シンターゼについてのコーディング領域内での他の突然 変異が酵素活性の減少をもたらし、そしてそのため本種子表現型をもたらす事が できることは当業者によく知られている。異種遺伝子発現およびインビトロ突然 変異誘発のよく知られる技術を用い、そして本明細書に記載される多種多様の酵 素アッセイを利用することで、当業者は不適当な実験を行う事なく酵素活性の減 少をもたらすミオイノシトール １−リン酸シンターゼコーディング領域内の別 の突然変異を同定する事ができるだろう。その後には、これらの突然変異を誘発 させたミオイノシトール １−リン酸シンターゼ遺伝子を大豆ゲノム内に導入し （米国特許第５，５０１，９６７号を参照されたい）、そして本表現型を提示す る新規大豆品種をもたらすことができる。 別法では、例えばアンチセンス阻害技術（米国特許第５，１０７，０６５号） および共抑制（米国特許第５，２３１，０２０号）のような遺伝子サイレンシン グ技術を利用して、大豆種子の細胞内の細胞内ミオイノシトール １−リン酸シ ンターゼ活性を減少させてもよい。本明細書は、野生型大豆ミオイノシトール １−リン酸シンターゼ酵素をコードする遺伝子の配列を教示する。当業者は、大 豆種子中のミオイノシトール １−リン酸シンターゼ活性を減少させる野生型配 列もしくは実質的 に類似する配列の全てもしくは部分を含むキメラ遺伝子の作成方法および使用方 法は容易に理解できるであろう。 従って本発明は、大豆種子のラフィノースサッカリド、スクロース、フィチン 酸、および無機リン含有量の変化をもたらし、そしてそのことにより貴重かつ有 用な大豆製品をもたらす大豆酵素の同定、特徴決定、および操作法に関する。本 明細書に教示されるように、幾つかの手段の内のいずれかによるミオイノシトー ル １−リン酸シンターゼ酵素活性の減少により、本表現型を提示する大豆種子 がもたらされる。 実施例 本発明は以下の実施例で更に明確になり、そして特に他に記載がない限りこれ らの実施例では全ての割合およびパーセンテージは重量によるものであり、そし て温度は摂氏である。これらの実施例は本発明の好ましい態様を示すものの、説 明の方法のみとして与えられることが理解されるべきである。先の論議およびこ れらの実施例から当業者は、本発明を様々な使用および条件に適用させるための 本発明の変法および変更法を確認することができるとともに、本発明の精神およ び範囲から逸脱することなくそれらを作成することができる。その上、本発明は 寄託されている生物学的材料により範囲を限定されることはなく、なぜなら寄託 された材料は、多くの態様が派生してきてよい材料の説明を提供を意図するもの であるためである。このような変法全ては添付される請求の範囲の範囲内に含ま れる。 例えば、細菌の形質転換、核酸のアガロースゲル電気泳動、および蛋白質のポ リアクリルアミド電気泳動のような分子生物学の通常の技術が、 それらを記述する一般的用語により引用される。当業者にはよく知られているこ れらの技術の実践法の詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に詳しく記載されている。実験操作に用いられる様々な溶 液は、例えば「ＳＳＣ」、「ＳＳＰＥ」、「デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」等のような一般名称により引用される。これらの溶 液の組成は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．［上述］の付属表Ｂに対する引用 により見いだされるだろう。 実施例１ 炭水化物組成を改善させる大豆遺伝子の発見ラフィノースサッカリド含有量についてのアッセイ 以下のアッセイを用いてラフィノースサッカリド含有量について大豆種子を分 析した。ラフィノースサッカリド含有量の決定のための各分析測定の前に、種子 を少なくとも一週間の間、約８％の水分量になるまで空気乾燥させ、そしてその 後に約４０〜５０℃および４０％の相対湿度下に貯蔵した。このように空気乾燥 させた試料の本発明者自身の測定値により、これらの条件下で貯蔵した際には含 水量は８％とは有意に異ならなかった（７〜１０％の範囲）。 各個別のラフィノースサッカリドアッセイについては、典型的には所定の植物 からの５〜１０の大豆を、１００メッシュふるいを装着したシクロテック１０９ ３サンプルミル（Ｃｙｃｌｏｔｅｃｈ １０９３ Ｓ ａｍｐｌｅ Ｍｉｌｌ）（Ｔｅｃａｔｏｒ、Ｂｏｘ ７０ Ｓ−２６３０１、Ｈ ｏｇａｎａｓ社、Ｓｗｅｄｅｎ）中で挽いて種子粉末を取得し、その後にこれを 分析した。大抵の場合、ラフィノースサッカリド含有量は約８％の「そのまま」 の含水量を含む種子または派生産物について測定した。このような場合、「その まま」の値は、測定値を０．９２で割ることにより乾燥ベースの値（ｄｒｙ ｂ ａｓｉｓ）（ｄｂ）に変換した。所定の系統もしくは所定の大豆蛋白質製品間で の比較のためには、挽いた種子粉末を、分析前に試料が定常重量（０％水分）に 達するまで４５℃の強制循環熱風炉内に入れた。従って、本明細書内に報告され る全てのラフィノースサッカリド測定値は他に特別な記載がない限りは一般的な 乾燥基準のものである。 以下に記載されるように、３つのアッセイ（「酵素アッセイ」、「ＴＬＣ」、 および「ＨＰＬＣ」）を用いて大豆種子のラフィノースサッカリド含有量を決定 した。３つ全てのアッセイとも後に記載する粉砕プロセスから得られる種子粉末 について実施された。 「酵素」アッセイについての準備段階では、各種子試料の粉砕後に得られる約 ３０ｍｇの粉末を１３×１００ｍｍのスクリューキャップ付きチューブ内に計量 し入れ、そして１．６ｍＬのクロロホルムおよび１．４ｍＬのメタノール：水（ ４：３、ｖ／ｖ）を添加した。各試料の厳密な粉末重量を記録し、そしてそれを 用いて試料について後に得られるアッセイ結果を試料の重量の違いに対して調整 した。その後にチューブのキャップを閉じ、ラックに入れ、そしてロータリーシ ェーカー上で６０分間、１８００ｒｐｍ、室温で震盪させた。取り出した後、チ ューブの内容物を１５分間沈降させた。沈降後、メタノール：水相の内の１５μ Ｌのア リコートを９６穴マイクロタイタープレートのウエルに入れ、そして４５℃で２ ０分間乾燥させた。乾燥させたウエルを、アッセイ条件の改変物を伴う、以前に 記載されたα−ガラクトシダーゼとガラクトースデヒドロゲナーゼとを用いる連 結「酵素」アッセイ（ｃｏｕｐｌｅｄ”ｅｎｚｙｍａｔｉｃ”ａｓｓａｙ）［Ｓ ｃｈｉｗｅｃｋ ａｎｄ Ｂｕｓｃｈｉｎｇ，（１９６９）Ｚｕｃｋｅｒ ２２ ：３７７−３８４；Ｓｃｈｉｗｅｃｋ ａｎｄ Ｂｕｓｃｈｉｎｇ，（１９７５ ）Ｚｕｃｋｅｒ ２８：２４２−２４３；Ｒａｆｆｉｎｏｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉ ｏｎ Ｋｉｔ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧＭＢＨ、カタログ 番号４２８ １６７］用の反応容器として用いた。アッセイの改変事項には、ウ シ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）（１５ｍｇ／ ｍＬ）のアッセイおよびα−ガラクトシダーゼ緩衝液への添加、α−ガラクトシ ダーゼインキュベーションの温度を室温から４５℃へ上昇させること、そしてα −ガラクトースデヒドロゲナーゼのインキュベーション時間を２０分から３０分 に増加させること、ならびにα−ガラクトシド標準用にはラフィノースの代わり にスタキオースを用いることを含む。インキュベーション後、試料の３４０ｎｍ での吸光度を、ＢＩＯ−ＴＥＫ（商標）Ｍｏｄｅｌ ＥＬ３４０Ｍｉｃｒｏｐｌ ａｔｅリーダーで決定した。試料中に存在するα−ガラクトシドの量を、既知の 量のスタキオース標準の量との比較により決定した。多数の試料の分析を容易に するためには、酵素アッセイをもう一度反復して試験した。初回アッセイからラ フィノースサッカリド含有量が低下していると思われた系統はその後に、十分な 材料が利用可能である場合には挽いた種子から初めて３重検査として再アッセイ した。その 組成が二次アッセイで確認された系統を野外条件下で成熟するまで成長させ、そ してその野外成長させた植物からの種子を再度アッセイにかけた。ラフィノース サッカリドおよびガラクチノールの特性について一層特異的な情報が必要とされ る場合には、酵素アッセイにより同定された低ラフィノースサッカリド系統をＨ ＰＬＣアッセイ（以下に記載される）を用いて再アッセイした。 低ラフィノースサッカリド生殖細胞質の迅速選択を容易にするために、薄層ク ロマトグラフィー「ＴＬＣ」アッセイを開発した。このアッセイのためには約６ ０ｍｇの挽いた種子粉末を１３×１００ｍｍのスクリューキャップ付きチューブ 内に入れ、そこに１ｍＬの４：３（ｖ／ｖ）メタノール：水および１ｍＬのクロ ロホルムを添加した。チューブのキャップを閉じ、ラックに入れ、そしてロータ リーシェーカー内で６０分、２５ｒｐｍ、室温で混合した。取り出した後、この チューブを２１００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。４μＬの試料をメタノー ル：水層から取り出し、そして２５０ｍｍの分析層を持つ２０×２０ｃｍの「Ｂ ａｋｅｒ」シリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ）事前吸着／チャンネル型（ｃｈ ａｎｎｅｌｅｄ）ＴＬＣプレートにかけた。試料を室温で乾燥させ、そしてその 後にこのプレートを、酢酸エチル（Ｅｔｈｙｌ Ａｃｅｔａｔｅ）：イソプロパ ノール（Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）：２０％酢酸（Ａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ）（ 水中）の３：４：４（ｖ／ｖ／ｖ）溶液と共にＴＬＣタンク内に入れた。この溶 液を分析用チャンネルに１０ｃｍ分浸透させ、この時点でプレートを取り出し、 そして換気フード内で空気乾燥させた。その後にこのプレートにアニリン−ジフ ェニルアミン試薬を噴霧して試料中の炭水化物を同定した。この試薬は、１ｍＬ のアニリ ンを１００ｍＬのアセトン、１グラムのジフェニルアミン、および１０ｍＬのリ ン酸と混合することにより調製した。その後にこのプレートを１００℃のオーブ ン内に１５分間入れて乾燥させそして取り出し、そして冷ましてから分析用チャ ンネルの値を計測した。大豆試料中のスタキオースおよびラフィノース含有量は 純粋な標準中に見られる溶離パターンに対する比較により評価した。 本明細書では「ＨＰＬＣ」アッセイとして引用される高速アニオン交換クロマ トグラフィー／パルス電流アッセイを、個別のラフィノースサッカリド（例えば 、スタキオースおよびラフィノース）、ガラクチノールの含有量を決定し、そし て酵素アッセイもしくはＴＬＣアッセイのいずれかの結果を確認するために用い た。種子を粉砕および抽出する条件は、以前の「酵素」アッセイについて用いら れたものと同一であった。水層の内の７５０μＬのアリコートを取り出し、そし て８０℃での減圧下で乾燥させた。その後に、乾燥させた物質を２ｍＬの水に溶 解し、そして３０秒間激しく混合させた。１００ｍＬのアリコートを取り出し、 そして水で１ｍＬになるまで希釈した。この試料を再度完全に混合し、そしてそ の後に３分間、１０，０００×ｇでの遠心分離にかけた。遠心分離の後、２０μ Ｌの試料を、１．３ｍＬ／分、室温で１５０ｍＭ ＮａＯＨを用いるＤｉｏｎｅ ｘ（商標）ＰＡＩカラムで分析した。Ｄｉｏｎｅｘ（商標）ＰＡＤ検出機を、Ｅ １＝０．０５ｖ、Ｅ２＝０．６０ｖ、およびＥ３＝−０６０ｖ、そして３ｍＡの 出力範囲で用いた。ガラクチノール、グルコース、フルクトース、スクロース、 ラフィノース、スタキオース、およびバーバスコースはこのクロマトグラフィー 条件で良く分離した。この試料中の炭水化物含有量は真の標準に対する比較によ り決 定した。 炭水化物分析により得られた結果を、ソフトウエアーであるＳｕｐｅｒＡＮＯＶ Ａ（Ａｂａｃｕｓ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｉｎｃ．，１９８４Ｂｏｎｉｔａ Ａｖ ｅｎｕｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ ９４７０４）を用いる分散分析に供した。 適切である場合には、フィッシャーの保護ＬＳＤ（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ Ｐｒｏｔ ｅｃｔｅｄ ＬＳＤ）を、平均値の比較のためのこの後の検査として用いた。他 の比較を行う際には、標準誤差（ＳＥＭ）により特定される範囲が重複しない場 合には平均値は統計学的に有意であるとみなした。ラフィノースサッカリドの平 均値を対照系統の平均値と比較する場合には、前記平均値が対照平均値のものの 少なくとも標準偏差の３倍を下回る場合、その平均値は対照のものよりも有意に 低いと見なした。突然変異誘発および突然変異体の選択 ＬＲ１３（Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２と本質的には同一な系統）の約１３０，００ ０個の種子（２２．７ｋｇ）を１５０Ｌの水道水中、８時間の連続通気条件下で 浸した。通気は、浸透用容器の底に設置した標準的水槽用「エアーストーン（ａ ｉｒｓｔｏｎｅ）」を通して空気をポンプ輸送することにより達成した。水を吸 収した種子の排水を行い、そして０．１Ｍリン酸緩衝液でｐＨ５．５に緩衝化さ せた９８Ｌの２．５ｍＭ Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＮＭＵ）溶液に連続 通気下で移した。種子はＮＭＵ溶液中に３時間寝かせておき、そしてその後に残 存するＮＭＵを浸出させるために何度もすすいだ。最初のすすぎについては、処 理した種子を４５Ｌの水道水に１分間移した。二度目のすすぎについては 種子を４５Ｌの新鮮な水道水に１時間の連続通気下で移した、三度目のすすぎに ついては、種子を２時間の連続通気下で４５Ｌの新鮮な水道水に移した。４度目 のすすぎについては、種子を連続通気下で４５Ｌの新鮮な水道水に移した。種子 の内の半分のものを２時間後には４度目のすすぎ液から取り出す一方で（亜集団 １）、もう半分の種子は５時間後に４度目のすすぎ液から取り出した（亜集団２ ）。４度目のすすぎ液から取り出した後には種子の外部に存在する水分の排水を 行い、そしてボール紙の上に広げて１時間、日当たりで乾燥させた。水を吸収し たＭ１種子はその後、４６ｃｍの間隔を空けて一列に、一列中の１フィート当た り約１４個の種子の密度、および２．５ｃｍの深さで植え込んだ（Ｉｓａｂｅｌ ａ，Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ、ＵＳＡ）。 ２プール分のＭ２種子（亜集団１および２からのもの）をＭ１植物からバルク として収穫した。亜集団１からの約４０，０００個のＭ２種子および亜集団２か らの５２，０００個のＭ２種子をＩｓａｂｅｌａ，Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ、Ｕ ＳＡ、に植え込んだ。各亜集団内では、３，０００個のＭ２植物各々から５つの 豆果を収穫し、そしてそれをまとめてバルクＭ３種子亜集団を取得した。Ｍ３バ ルクをＩｓａｂｅｌａ，Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ、ＵＳＡ、に植え込んだ。成熟 時に、５０００本のＭ３植物からの種子を個別に収穫して、各亜集団から５００ ０個のＭ３：４系統を取得した。 １９９１年の冬の間に少なくとも総計８，０００個のＭ３；４系統のスクリー ニングを行って、先に記載される酵素法を用いてラフィノースサッカリドの含有 量を測定した。初回スクリーニングでは、総計ラフィノースサッカリド量が減少 している２系統が同定され、これは第二自家 授粉世代に遺伝可能であることが判明した。ＬＲ３３と表示されるこの系統の内 の一つは、同一環境下で対照として生育させたえり抜きの大豆栽培品種との比較 ではスタキオースとラフィノースの両方共のレベルが減少していた、同一環境下 で生育させた３つのえり抜きの栽培品種についての平均値との比較では、ＬＲ３ ３のスタキオース含有量は統計的に有意に低かった。３世代分についてＬＲ３３ から取得された自家授粉系統から収穫され、バルクとして取り扱った種子の可溶 性炭水化物含有量が表１に示される。 表１ 系統ＬＲ３３の自家授粉により取得される大豆系統の成熟した種子中の可溶性炭 水化物 （全ての値は、μモルｇ^-1で表される） ¹Ｎ.Ｄ．検出されず 後に生じる系統（１ＳＴ−８３、２ＳＴ−８８、および３ＳＴ−１０１）は全て ＬＲ３３の自家授粉により取得された。これらの系統の各々のものは対照系統よ りも低いスタキオース含有量を示した。実施例２ ＬＲ３３の低ラフィノースサッカリド表現型の原因となる生理学的欠陥の同定低ラフィノースサッカリド親としてＬＲ３３を用いる遺伝的交雑 大豆種子の総計ラフィノースサッカリド含有量をさらに低減させるための試み として、ＬＲ３３とＬＲ２８との間での遺伝的交雑を行った。系統ＬＲ２８は国 際公開第ＷＯ９３／０７７４２号に開示されている。簡潔に記載すると、これは 、実施例１に記載されるものに非常に類似するスクリーニング手法で発見された ラフィノースとスタキオースの両方が低くなっている系統でもある。低ラフィノ ース／スタキオース含有量は、一つの世代から次の世代までの間に一貫して見ら れた。それに加え、系統ＬＲ２８および別の親との交雑によりＬＲ２８から得ら れた系統の成熟した種子のガラクチノール含有量発見された野生型大豆種子と比 較するとかなり上昇する。 ＬＲ３３とＬＲ２８の交雑からのＦ１植物を生育および自家授粉させて分離Ｆ ２子孫を作成した。ＬＲ２８に由来する系統、えり抜きの栽培品種、およびＬＲ ２８とＬＲ３３との交雑から得られる分離集団の種子を同一環境下で植え込んだ 。Ｆ２：３種子を各Ｆ２植物から収穫し、そして先に記載された酵素アッセイを 用いてα−ガラクトシド含有量についてスクリーニングした。予備スクリーニン グからの低α−ガラクトシド選択物をＨＰＬＣアッセイかけて完全なラフィノー スサッカリド特性を取得した。α−ガラクトシドの低総含有量について選択され た典型的 系統からの炭水化物特性が表２に示される。 表２ 系統ＬＲ２８およびＬＲ３３の交雑およびその後のよりすぐりの栽培品種に対す る戻し交雑から得られる大豆系統の成熟した種子内の可溶性炭水化物（ＬＲ３３ および５ＳＴ−１００３（ＬＲ２８由来系統）は交雑親の例として含まれ；２２ ４２はよりすぐりの栽培品種対照として含まれる。） （全ての値は、μモルｇ^-1で表される） ¹Ｎ.Ｄ．検出されず ５ＳＴ−１４４１、５ＳＴ−１４３４、および５ＳＴ−１３０９は全てＬＲ２８ 交雑によりＬＲ３３から取得された。系統５ＳＴ−１４４１はＬＲ３３親に非常 に似通っているものの、驚くことに系統５ＳＲ−１４３４および５ＳＴ−１３０ ９はいずれの親系統よりもラフィノースとスタキオースの両方が一層低くなって おり、かつ系統ＬＲ２８の上昇したガラクチノールレベルという性質を持たない 。ラフィノースサッカリド経路における酵素活性のインビトロアッセイ ＬＲ２８交雑によりＬＲ３３から得られる幾つかの系統において観察される予 期せぬラフィノース、スタキオース、およびガラクチノール表現型の原因を見い だすために設計された研究では、幾つかの酵素活性および代謝物プールを、迅速 なラフィノースサッカリド生合成の期間中、生理学的成熟段階に入る直前に収穫 した大豆種子中で測定した。種子を、黄色くなり始めた豆果から取り出した。緑 色を失いかけてもいるか、もしくはそれ自体が黄色くなり始めたばかりの豆果か らの種子を、ラフィノースサッカリド生合成における最後の３つの酵素のアッセ イ用に選択した（図１を参照されたい）。 種子を豆果から取り出し、重量測定をして生重量を取得し、その後にすり鉢中 で挽き、そして１０倍容量の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７緩衝液（ これはさらに、５ｍＭ ２−メルカプトエタノールをも含む）中ですりつぶした 。挽いた試料を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離にかけ、そしてその上清を 、粉砕用緩衝液中で平衡化させてあるセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ− ２５を通過させることにより脱塩させた。 ガラクチノールシンターゼのアッセイについては、１０μＬの脱塩抽出物を、 ９０μＬのｐＨ７ ＨＥＰＥＳ緩衝液（これはさらに、２０ｍＭ ミオイノシト ール、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＭｎＣｌ₂、および１ｍＭ Ｕ ＤＰ−［¹⁴Ｃ］ガラクトース（１．２５μＣｉ μモル^-1をも含む）に添加した 。このアッセイ混合物を１０分間、２５℃でインキュベートし、そしてその後に ４００μＬのエタノールの添加により停止させた。この停止させた反応物に対し 、２００μＬＲの Ｄｏｗｅｘ ＡＧ−１×８アニオン交換樹脂（ＢｉｏＲＡＤ）を添加し、そして この混合物を２５分間震盪させた。この樹脂を遠心分離により除去し、そして上 清をシンチレーション計測のために取り出した。非アニオン性放射活性をガラク チノール合成の測定値とした。 ラフィノースシンターゼおよびスタキオースシンターゼのアッセイについては 、５０μＬの脱塩抽出物を、５０μＬの２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７） （これはさらに、ラフィノースシンターゼのアッセイ用には１０ｍＭ ジチオス レイトール、１０ｍＭ ガラクチノール、および４０ｍＭ スクロースをも含み 、あるいはスタキオースシンターゼのアッセイのためには４０ｍＭのラフィノー スをも含む）に添加した。１時間、２５℃でのインキュベーションの後、この反 応を４０μＬのエタノールの添加により停止させ、そしてその後に沸騰水浴中に １分間入れて蛋白質を沈殿させた。この反応混合物を遠心分離にかけて清澄化し 、その上清を０．２２ミクロンのフィルターに通し、そしてその後に減圧乾固（ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｏ ｄｒｙｎｅｓｓ ｕｎｄｅｒ ｖａｃｕｕｍ）させた。 この残渣を、０．５ｍＬの水中に再溶解し、そして２０μＬを、ラフィノースお よびスタキオースの定量化について先に記載する要領でＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ システム上で分離させた。１９９４年８月に野外で成長させた植物から収穫した 種子を用いて実施された実験の結果が表３に示される。 表３ ３つの大豆系統の種子が黄色くなる際のガラクチノールシンターゼ、ラフィノー スシンターゼ、およびスタキオースシンターゼの活性（野生型 対照は系統１９２３である。酵素活性は、このアッセイ条件下では、一時間あた りに新鮮な種子のグラム当たりに生産される産物のμモルとして表示される。） ラフィノースおよびスタキオース合成のみに大きく関わるこの３つの酵素の内、 ラフィノースシンターゼのみが、野生型と比較する際にはこの突然変異体、すな わち低ラフィノースサッカリド系統における活性の明らかな減少を示す。ラフィ ノースシンターゼの活性減少を生じる突然変異は、生合成経路におけるその酵素 の位置、および低ラフィノースサッカリド表現型の源としてＬＲ２８のみを保持 する系統において観察されるガラクチノールの蓄積と一致する。ガラクチノール とスクロースとはラフィノースシンターゼにとっての２つの基質であり、そして 両者はＬＲ２８含有性系統中に蓄積する（図１および表２を参照されたい）。 ＬＲ３３系統をＬＲ２８系統との交雑した場合には、得られるスタキオース、 ラフィノース、およびガラクチノールが低レベルであるにもかかわらず、ＬＲ２ ８突然変異により付与される減少したラフィノースシンターゼ活性は活性の変化 にしか過ぎなかった。減少したガラクチノールシンターゼ活性は、ＬＲ２８と組 み合わせた際に突然変異により付与される減少したガラクチノール含有量に起因 するＬＲ３３系統内での病変についての候補物の可能性が高いと思われたものの 、その酵素のイン ビトロ活性に関しては測定値に減少は見られない。成熟しつつある大豆種子の遊離ミオイノシトール含有量のアッセイ ＬＲ２８交雑によってはＬＲ３３中でのインビトロでのガラクチノールシンタ ーゼの減少は生じなかったものの、ＬＲ３３に由来する系統の成熟しつつある種 子内でのガラクチノールシンターゼのインビボ活性が、その基質の内の一つの有 用性により制約を受けるという可能性についての確認を行った。ガラクチノール シンターゼに対するＵＤＰ−ガラクトースの供給は、ＵＤＰ−グルコース ４’ エピメラーゼの突然変異により減少することがあり、そしてミオイノシトールの 供給は、そのシンターゼもしくは遊離イノシトール形態を生産する特異的ホスフ ァターゼのいずれかに影響を及ぼす突然変異により制限され得る（図１）。ミオ イノシトールプールは、野生型およびＬＲ３３に由来する種子中の総計遊離ミオ イノシトール含有量についてのアッセイを行うことにより確認した。３つの大豆 系統、すなわち一つの野生型栽培品種Ａ２８７２、および２つのＬＲ３３×ＬＲ ２８−由来系統である５ＳＴ−１４３４と５ＳＴ−１３０９を生育用室内で、１ ６時間の日中時間、および３０℃／２２℃の昼夜温度条件下で生育させた。丁度 黄色になり始め、そしてそれ自体非常に明るい緑色から黄色へと変化しつつある 豆果から種子を取り出した。各系統からの３個の種子を、８ｍｌの８０％メタノ ール中で挽いた。この混合物を１２，０００×ｇで１５分間遠心分離にかけ、そ して上清を５０ｍＬのフラスコにデカンテーションした。この抽出作業を二度繰 り返し、そして上清をあわせた。合わせた上清を４０℃で減圧乾固し、そして残 渣を１ｍＬの水に再溶解した。再溶解した抽出物を、３ ｍＬの混合床型イオン交換樹脂（ＢｉｏＲａｄ ＡＧ５０１×８）に通して脱塩 し、そして素通り部分に４ｍＬの洗浄液が加わったものを再度乾固させた。この 残渣を５００μＬの水に再溶解し、そして７０μＬのアリコートを、７０％アセ トニトリルを用いて１ｍＬ／分で溶出させるＺｏｒｂａｘ Ａｍｉｎｏカラム（ Ｄｕｐｏｎｔ社）でのＨＰＬＣにより分離させた。カラム溶離液中の糖は示差屈 曲率により検出した。スクロースとミオイノシトールとの標準混合物の分離によ り、イノシトールは後になって出現し、そして部分的にのみスクロースから分離 されることが示された。種子抽出物の分析については、スクロースピークの後の １ｍＬの溶離液を、実施例１に記載されるＤｉｏｎｅｘ ＰＡＤシステムでの再 注入用に捕獲した。Ｄｉｏｎｅｘシステムではミオイノシトールはスクロースの かなり前に出現し、そしてスクロースが混入しているＺｏｒｂａｘ Ａｍｉｎｏ カラム分画とは明らかに分離された。ミオイノシトールの外部標準との比較によ り、野生型２８２７系統からの５μＬ注入物は３．２ｎモルのミオイノシトール を含む一方で、５ＳＴ−１４１３および５ＳＴ−１３０９からの５μＬ注入物は それぞれ０．３９および０．２３ｎモルを含んでいた。 野生型およびＬＲ３３由来の種子の遊離ミオイノシトール含有量の違いの特徴 を更に詳細に決定する目的で第二の実験を実施した。第二対照系統（２２４２） およびＬＲ３３由来系統である５ＳＴ−１４１３からの７つの個別の種子を、先 に記載される成熟基準に従って収穫した。個の種子の重量を個別に計量し、そし て１．５ｍＬのミクロフュージチューブ内に入れ、スパチュラで粉砕し、ドライ アイス上で凍結させ、そして凍結乾燥させた。乾燥させた残渣の重量を測定し、 そして１ｍＬの８ ０％メタノール（これは１μモルのトレハロースを含む）を添加して、Ｚｏｒｂ ａｘアミノカラムにおけるミオイノシトール保持マーカーとして、そして内部標 準として利用した。抽出用培地を１時間、６０℃に加熱し、マイクロフイージチ ューブ内で小さな乳棒を用いて再度挽き、そして遠心分離にかけて不溶性物質を ペレットにした。上清を、約１００μＬの混合床樹脂を含む第二ミクロフュージ チューブに移し、その混合物を簡単に震盪させ、そして樹脂の上の溶液２０μＬ を取り出し、そして減圧乾固させた。この残渣を総計１１０μＬの容積に再溶解 し、そして５５μＬを、先に記載されるＺｏｒｂａｘ Ａｍｉｎｏカラム工程中 に注入した。トレハロースピークを捕獲し、そして２０μＬのカラム分画をＤｉ ｏｎｅｘシステムに再注入した。ミオイノシトールピークをトレハロース内部標 準に対して比較することにより定量化した。野生型ミオイノシトール含有量につ いての平均値±標準偏差は２．１８±０．９８μモル／（ｇ乾燥重量）であった 一方で、５ＳＴ−１４３４種子は０．７７±０．３２μモル／（ｇ乾燥重量）を 含んでいた。両方の実験により、ＬＲ３３突然変異を保持する種子は、迅速なラ フィノースサッカリド合成の期間中に含むミオイノシトールの量が少なめである ことが示される。いずれの実験においても総計ミオイノシトールプールは完全に 非存在ではなかった。しかしながらこのような実験では代謝産物の総計種子プー ルが測定され得るのみであり、そしてミオイノシトールにはガラクチノールシン ターゼにより更にその使用が制約されるという別の運命も存在する（図１）。ラフィノースサッカリドをインビボラベルする際のミオイノシトール灌 流の効果 ＬＲ３３由来の種子の遊離ミオイノシトール含有量の減少が観察されたことが 成熟時でのラフィノースサッカリド含有量の減少の原因となっているのかどうか を確認する目的で、組織切片供給試験を実施した。野生型系統２２４２とＬＲ３ ３由来の系統５ＳＴ−１４１３からの各４づつの種子を、先に記載される成熟基 準に従って収穫した。種皮を取り除き、そして子葉を５ｍＭリン酸カリウム緩衝 液（ｐＨ５．５）中ですすぎ、そしてその後に約１ｍｍの切片にスライスし、そ して再度緩衝液ですすいだ。この組織切片を２つのグループに分けた。一つ目の グループはリン酸カリウム緩衝液中に浸し、そして第二のグループは、５０ｍＭ ミオイノシトールを含むリン酸カリウム緩衝液中に浸した。この組織切片を吸引 浸潤（ｖａｃｕｕｍ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ）させ、そして室温で３０分間イ ンキュベートした。予備インキュベーション期間の後、５μＣｉの¹⁴Ｃ−グルコ ースを各グループに添加し、そして組織を再度吸引浸潤（ｖａｃｕｕｍ−ｉｎｆ ｉｌｔｒａｔｅｄ）させた。各グループからの１０枚の組織切片を、ラベル化さ せたグルコースの添加後、２時間目および８時間目に取り出した。これらの組織 切片を、タールを塗ってある（ｔａｒｒｅｄ）１．５ｍＬミクロフュージチュー ブに入れて生の重量を取得し、そして３００μＬの８０％メタノール中で挽いた 。このチューブを遠心分離にかけ、上清を第二チューブに取り出し、この抽出を 更にもう２回繰り返し、そして上清を合わせた。合わせた上清を減圧乾固し、５ ０％のアセトニトリル中に再溶解し、そしてＺｏｒｂａｘアミノＨＰＬＣシステ ムで分離した。分画を、グルコース、スクロース、ラフィノース、およびガラク チノールを含むクロマトグラムの領域全体 にわたり１５秒の間隔で、そしてスタキオースを含む領域全体では１分の間隔で シンチレーション計測用に回収した。糖の標準ピークに対応する放射活性分画を 分析用に分類した。この結果は、表４における４つの生成物の糖中の放射ラベル のパーセントとして表される。 表４ ミオイノシトールとの予備インキュベーションありおよびなしの条件での対照お よびＬＲ３３由来系統についてのスクロース、ガラクチノール、ラフィノース、 およびスタキオースからなる糖組み合わせ物におけるラベルのパーセンテージと して表される各糖中の放射ラベル 野生型および５ＳＴ−１４３４組織切片の両方は供給された¹⁴Ｃ−グルコース からのラベルをスクロースに、そしてその後にはガラクチノール、ラフィノース 、およびスタキオースに転換する。外からのミオイノシトールの添加がなければ 、ＬＲ３３突然変異を含む系統（５ＳＴ−１４３４）は、野生型系統（８時間目 で５８．９％）と比較すると非常に少量のラベルのみをラフィノースサッカリド （８時間目で２０．５％）に転換するに過ぎない。両方の遺伝型とも、より多く の供給ラベルをラフィノースサッカリド糖に転換することで外来性ミオイノシト ールに応 答する。ミオイノシトールを添加すると、この２つの遺伝型は、供給ラベルをま ずガラクチノールに転換し、そしてその後にラフィノースとスタキオースに転換 する能力に関しては本質的に同等となる。転換速度は、非浸透対照と比較すると 、野生型系統でさえ上昇する。 ガラクチノールシンターゼへのミオイノシトールの供給は常に、ラフィノース およびスタキオースが合成され得る速度の制約となることは明らかである。ＬＲ ３３突然変異の存在によりその制約が一層大きくなる。 ラベル化パターンはガラクチノールにおけるラベルの蓄積が全く存在しないと いう点では驚くべきものであり、このようなパターンはラフィノースシンターゼ におけるＬＲ２８突然変異が組み合わせ突然変異体系統ではその段階を通過する 流れをゆっくりにさせるという点で依然として効果的であれば予期されたであろ うものである。ミオイノシトールの添加がガラクチノールシンターゼを通しての ガラクチノールへの流れを増加させることが予想され得る一方で、ラベルはラフ ィノースシンターゼの活性低減に起因してそこに蓄積するはずであった。そのよ うな蓄積が存在しないことにより、この系統内でのＬＲ２８突然変異の効率もし くは存在のいずれかが疑問点となっている。種子のフィチン酸および無機リン酸レベルに対するＬＲ３３突然変異の影響 先の結果により、ＬＲ３３突然変異は図１に示される経路中、遊離ミオイノシ トールの前に存在することが示唆される。突然変異の可能性部位を更に限定する ためには、経路のその部分の別の代謝産物の測定を行った。 大豆種子は成熟時には２０〜３０μモル／ｇのレベルでフィチン酸を含んでお り、そして種子の総計リン酸の内の５０〜７０％がフィチン酸に含まれるため［ Ｒａｂｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４：４３ １−４３４］、ミオイノシトール合成に影響を及ぼす突然変異は、種子のフィチ ン酸および無機リン酸レベルにも影響を及ぼして良い可能性が強いと考えられる 。３つの野生型大豆系統およびＬＲ３３突然変異を含む３つの系統中のフィチン 酸および無機リン酸のレベルを乾燥させた種子で、Ｒａｙｂｏｙ［上述］により 記載される方法の改変法によりアッセイした。各系統からのおおよそ２０の種子 を低衝撃微粉砕機内で挽き、そして得られた粉末の内の１００ｍｇを１５ｍＬの スクリューキャップチューブ内に計量し入れた。０．７Ｍ Ｎａ₂ＳＯ₄を含む５ ｍＬの０．４Ｎ ＨＣｌをその粉末に添加し、そしてその混合物をロッカープラ ットフォーム（ｒｏｃｋｅｒ ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で一晩震盪した。このチュ ーブを３９００×ｇで１５分間遠心し、そして２ｍＬの上清を取り出して第二の ガラスチューブに入れた。２ｍＬの水および１ｍＬの１５ｍＭ ＦｅＣｌ₂を添 加し、そしてそのチューブを２０分間、沸騰水浴槽中で加熱した。このチューブ を先の要領での遠心分離にかけて鉄：フィチン酸複合体を沈降させ、そして上清 を棄却した。ペレットを２ｍＬの０．２Ｎ ＨＣｌ中に再懸濁させ、そして１０ 分間、沸騰水浴槽中で加熱した。沈降物を再度遠心分離により取り出し、そして ２ｍＬの５ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁した。 １５μＬのＥＤＴＡ懸濁物を、フィチン酸リン酸（ｐｈｙｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を取得する目的での湿式灰化のために取り出した。１５μ Ｌのアリコートを含む各チューブに１０μＬの硝酸カ ルシウムの１０％溶液を添加した。水を蒸発させ、そして残渣を白色灰がチュー ブ内に残るまで火炎中で加熱した。この灰を０．３ｍＬの０．５Ｎ ＨＣｌ中に 再溶解し、そして９０℃で２０〜３０分間加熱した。モリブデン酸試薬（０．７ ｍＬの０．８６Ｎ 硫酸中の０．３６％モリブデン酸アンモニウムおよび１．４ ２％アスコルビン酸）を添加し、そして色を１時間発色させてから８２０ｎｍで の比色計測を行った。 無機リン酸は、０．３ｍｌの０．５Ｎ ＨＣｌおよび０．７ｍＬのリン酸色試 薬を、もともと５ｍＬであった抽出物の２０もしくは４０μＬのアリコートの内 のいずれかに添加することにより決定した。リン酸カリウム標準を同時に発色さ せた。この実験は３回繰り返し、そしてその結果が表５に示されている。 表５ μモル リン酸 ｇ^-1として表示される無機リン酸およびフィチン酸としての種 子リン酸（値は、２回を上回る回数の反復試験を行う場合には平均値±標準偏差 であるか、あるいは２回の反復試験を行った場合には平均値となっている） ＬＲ３３突然変異は更には、その突然変異が含まれる遺伝的バックグラウンド に依存して約１５〜２５倍の種子無機リン酸含有量の増加を付随し、約２倍の種 子フィチン酸レベル（フィチン酸分画中のリン酸として表現される）の減少を引 き起こす。図１の経路に基づくと、遊離ミオイノシトール含有量の低下を伴うフ ィチン酸含有量の減少は、ミオイノシトール １−リン酸シンターゼの活性を減 少させる突然変異によりもたらされる可能性が最も高いように思われる。 無機リン酸含有量の増加の正確な原因は判明していないものの、フィチン酸分 画は種子およびその植物の他の部分内のリン酸貯蔵形態として機能するように仮 定されて長い。好ましい貯蔵用プラットフォーム（ミオイノシトール）が利用で きない場合には、移入してくる無機リン酸には他に取り得る主立った運命は存在 せず、単に蓄積する。 実施例３ ホモ接合性ＬＲ３３系統の種子表現型の同定 幾つかの追加的大豆系統を、種子の無機リン酸について分析した。１００ｍｇ の挽いた種子を、１ｍＬの温水で抽出し、そして遠心分離にかけて不溶性物質を 除去した。上清を１００μＬの塩化メチレンで抽出して脂質物を除去し、そして 水性抽出物の残りの部分をトリクロロ酢酸で１０％にした、この溶液を遠心分離 にかけて蛋白質を除去し、そして５μＬの上清を、実施例２に記載される要領で 無機リン酸に関して分析した。表６にはこれらのアッセイの結果が示される。表６ 野生型、ＬＲ２８、ＬＲ３３、およびＬＲ２８×ＬＲ３３大豆植物からの種子の 無機リン酸含有量（μモルｇ^-1） ＬＲ２８突然変異を単独で含む全ての系統は野生型対照に等しい無機リン酸レ ベルを有する。系統５ＳＴ−１４４１はＬＲ３３に由来しており（先の実施例２ ）、そしてスタキオースの中程度の減少はもともとその突然変異に関連していた 。５ＳＴ−１４４１では無機リン酸含有量の上昇はわずかのみであった。いずれ の親も無機リン酸値が高いという事実にも拘わらず、ＬＲ３３のＬＲ２２による 交雑から得られた全ての系統では無機リン酸のレベルがかなり上昇していた。 ＬＲ３３突然変異のみを含む系統５ＳＴ−１４４１の中間的無機リン酸表現型 は予期せぬものであった。低フィチン酸／高無機リン酸表現型を生じるためには ＬＲ２８とＬＲ３３突然変異の両方が存在している必 要があることが示唆されて良い。しかしながらこの２つの突然変異が実際に、減 少している用に思われる２つの活性をコードする構造遺伝子内に存在する場合に は、これらの突然変異は、フィチン酸合成の変化に相加的影響を及ぼすことが示 唆される様式でこの代謝経路に関与しているのではない。ＬＲ３３中の突然変異 が、遊離もしくは総計ミオイノシトール生産のいずれかに影響を及ぼす場合には 、この突然変異単独が低フィチン酸およびその結果得られる高無機リン酸表現型 の原因となっているはずである。 別の説明は、系統５ＳＴ−１４４１はＬＲ３３突然変異に関してはホモ接合性 ではなく、そしてバルクでの種子の分析によっては野生型、ホモ接合性突然変異 、およびヘテロ接合性種子についての平均的表現型のみが示されるというもので あってよい。この可能性を調査するためには、５ＳＴ−１４４１種子のバルク試 料からの１３個の個別の種子の重量測定をし、挽き、そして温水で抽出した。蛋 白質は沈殿させず、そして無機リン酸を以前の要領で測定した。この結果を表７ に示す。表７ 系統５ＳＴ−１４４１からの１３の個別の種子についてのおおよその無機リン酸 含有量（μモルｇ^-1）（この試料中に蛋白質が存在するため、実際の値は表６の 結果と比較すると高くなっている） ｄ、ｊ、およびｌの文字で表示される種子は、分析した残りの１０個の種子と 比較すると約３倍多い無機リン酸を含む。この比率は、高無機リン酸の突然変異 体表現型が劣勢であり、そして単一遺伝子の作用に起因して、種子の分離された 集団から予想されるものに近い。この仮説を確認するためには、５ＳＴ−１４４ １のバルク試料からの１２個の種子を水中に室温で６時間浸した。余分な水を吸 い取らせて除去し、そして胚子軸から離れた末端にある子葉の試料を切り落とし た。この組織片の重量測定を行い、１．５ｍＬのミクロフュージチューブ内に入 れ、そして十分量の７０％メタノール中で挽いて１００μＬの抽出容量あたり１ ０ｍｇの生重量とした。遠心分離後に存在する上清中のリン酸は先の要領で測定 し、そしてその結果を表８に示す。 表８ 系統５ＳＴ−１４４１からの種子の分離集団からの２０個の後生種の無機リン酸 含有量（結果は１ｇの生重量当たりのμモル（μモルｇｆｗｔ^-1）として表示さ れる） 種子４、７、１１、１６、および２０を成長室中の鉢に植え込んた。 種子７、１１、１６、および２０は生き延び、そして実施例２に記載さ れる成長条件下で成熟するまで成長した。成熟した植物および２つの野生型対照 （Ａ２８７２）からのバルクの種子を乾燥後に収穫し、そして各植物からの２０ 個の種子をバルクとして、可溶性炭水化物およびフィチン酸の分析のため、実施 例１および２に記載される方法を用いて挽いた。種子の総計フィチン酸含有量は （フィチン酸リン酸含有量）／６として算出した。結果が表９に示される。 表９ ＬＲ３３突然変異を保持しかつ部分的種子分析の際の無機リン酸の上昇について 選択された種子の分離集団からの４本の植物ならびに２本の対照植物についての 可溶性炭水化物含有量およびフィチン酸含有量（μモルｇ^-1として表示される） （フィチン酸の値は２回の反復試験の平均値である。） 種子番号７（ＬＲ３３−７）から生育した植物の可溶性炭水化物表現型は表１ に示されるＬＲ３３突然変異によるものに非常に類似している一方で、他の植物 はラフィノースサッカリドのレベルが一層低くなっており、そしてスクロースレ ベルが一層高くなっている。これらの可溶性炭水化物レベルは、表２の突然変異 体組み合わせ物ＬＲ２８×ＬＲ３３ における幾つかの植物による表現型に非常に類似している。この矛盾について最 も可能性が高いとして考えられる説明は、表１のデータを出すために分析された バルク種子が、ＬＲ３３突然変異についてはホモ接合性である植物であるよりは むしろＬＲ３３突然変異については分離された植物からきたものであったという ことである。この実施例の植物１１、１６、および２０の事例においてなされた ように、その突然変異についてホモ接合性である植物が選択される場合には、真 のホモ接合性植物表現型が観察される。低ラフィノース、スタキオース、および ガラクチノールの組み合わせ物を生産するためにはＬＲ２８とＬＲ３３突然変異 の両方が存在する必要があったという以前の仮説は間違っていた。ＬＲ３３突然 変異についてホモ接合性である系統は、もともと同定された突然変異体の自家授 粉からは取得されなかった一方で、それらはその系統のＬＲ２８との交雑から生 じる分離集団から取得された。交雑の子孫の内の幾つかは恐らく両方の突然変異 を含んでいるであろう一方で、ＬＲ３３突然変異からの表現型はＬＲ２８突然変 異から生じるものに対しては優性となる。この優性形質は元来、ＬＲ２８突然変 異からの炭素供給の上流にあるＬＲ３３突然変異の位置から派生している（実施 例１および実施例２を参照されたい）。 ホモ接合性ＬＲ３３表現型がつかみ所がないままであることの理由は、もとも との突然変異体系統が遭遇している発芽の問題に起因して良い。バルクでの野外 分離条件下では、自家授粉ＬＲ３３から植え付けた種子の内の２５％の喪失（突 然変異についてホモ接合性であったであろう部分）が消失していたであろう。バ ルク集団から収穫した植物は、その後にはホモ接合体としては涸渇していたであ ろうが、突然変異体遺伝子は ヘテロ接合体状態としてはその集団中で保持されたであろう。野外条件でＬＲ３ ３ホモ接合体を出現させるための伝導力が一層高い遺伝子バックグラウンドへの 異系交雑によりホモ接合体の再生が可能になったと我々は推測している。初回の 異系交雑はラフィノースサッカリド生合成経路中に他の突然変異を保持する系統 に対するものであり、これはその交雑のもともとの意図にしてみれば二次的なこ とであり、そして優れた表現型もしくは改善された田畑の出現のいずれにも重要 ではない。 ＬＲ３３突然変異は従って、種子のグラムあたり５μモルを下回るスタキオー ス、種子のグラム当たり２０μモルを下回るラフィノース、種子のグラムあたり ２００μモルを上回るスクロース、および種子のグラムあたり１０μモルを下回 るフィチン酸リン酸を有する種子を生産する大豆植物を生産することが可能であ る。 実施例４ ＬＲ３３突然変異を含む大豆系統の可溶性炭水化物およびフィチン酸含有量 低ラフィノースサッカリド系統であるＬＲ３３およびＬＲ２８を交雑させ、そ して分離させたＦ２植物を、実施例１に記載されるＨＰＬＣアッセイによるＦ２ 植物の種子中の低レベルのラフィノース、スタキオース、およびガラクチノール について選択した。その後にこの交雑から取得され選択された系統をよりすぐり の栽培品種親と交雑させ、そしてそれらの交雑物の子孫を同一の過程によりＦ２ 世代として選択した。低レベルのラフィノースサッカリドを含むこれらの系統中 、幾つかのものを栄養植物の農業経済学的特徴に基づき、更に進んだ調査用に選 択した。４Ｅ ７６と表示されるこのような系統の一つはその後に他のよりすぐりの大豆栽培品 種と試験的に交雑させ、そしてこの交雑から得られる自家授粉Ｆ１植物からの個 別の種子を、可溶性炭水化物および無機リン酸含有量について分析した。これら の種子は、非常に無機リン酸が低くかつ野生型レベルのラフィノースおよびスタ キオースを有するものと、無機リン酸のレベルが上昇しておりかつラフィノース とスタキオースのレベルが非常に低い小さめの種類の種子という２つの種類に分 類された。これら２つの種類の比率は劣勢ＬＲ３３突然変異に期待される３：１ の比率に非常に近かった。ラフィノースサッカリドに影響を及ぼす他の突然変異 であり、もともとの交雑の際の親であったＬＲ２８の分離を示す証拠は存在しな かった。従って、系統４Ｅ７６は選択されたよりすぐりの栽培品種バックグラウ ンド中のＬＲ３３突然変異を示す。この系統を、炭水化物分析用に選択されたよ りすぐりの照合用系統と共に２年間にわたり、総計で９つの環境下で生育させた 。３つの環境からの一層限定された試料セットをフィチン酸含有量について分析 した。この炭水化物データを表１０に示し、そしてフィチン酸データを表１１に 示す。表１０ ＬＲ３３含有性系統４Ｅ７６および１３のよりすぐりの栽培品種照合用物のスタ キオース、ラフィノース、およびスクロース含有量についての平均値、標準偏差 （ＳＤ）、および平均値の２標準偏差（２ＳＤ）（全ての値はμモルｇ^-1種子重 量で表示される。） 表１１ ＬＲ３３含有性系統４Ｅ７６およびよりすぐりの栽培品種照合用物Ａ２８７２の フィチン酸含有量についての平均値、標準偏差、および平均値の２標準偏差（全 ての値はμモルｇ^-1種子重量で表示される。） 商品化されている典型的な大豆であるよりすぐりの大豆栽培品種との比較の際 には、ＬＲ３３由来系統では種子の重量のグラム当たりの総計ラフィノースサッ カリドの量が８倍〜９倍低くなる。フィチン酸の量も約４０％減少する。 よりすぐりの大豆栽培品種との比較に際しては、ＬＲ３３由来系統ではラフィ ノースおよびスタキオースの両方の量が低くなる。ラフィノース含有量はよりす ぐりの系統に見られる値より若干低めな程度であるに過ぎないが、スタキオース 含有量は非常に大きく減少する。大豆荒粉を単胃動物に給餌する際のエネルギー 使用効率における大豆ラフィノースサッカリド含有量の有害効果は、α−ガラク トシド結合の消化率が低いことに起因することが知られている。従って、ラフィ ノースとスタキオースの合計含有量の減少は、消化率が上昇していることの大ま かな測定値になる。事実、この測定はその表現型の効果を過小評価することがあ ってよく、というのもスタキオースは糖のモル当たり２モルのα−ガラクトシド 結合を含むためである。 成熟した大豆の絶対ラフィノースサッカリド含有量は環境因子に応答して変化 することが知られている。ＬＲ３３由来系統中に存在する突然変異の効果は、こ のような系統のラフィノースとスタキオースとの合計含有量を１４．５μモル／ ｇ種子重量以下にさせるに十分な大きさのものであり、そしてこの値は同一環境 で生育させた野生型大豆のものを常時はるかに下回ったままでいるはずである。 成熟した大豆種子のフィチン酸含有量も環境因子に応答して変化することが知 られており、これは主に土壌内で利用できるリン酸レベルに変化があるために生 じる。再度記載するが、ＬＲ３３由来系統中に存在す る突然変異は総計フィチン酸含有量を、全成育環境にわたり１７μモル／ｇ以下 に維持する。 実施例５ ＬＲ３３突然変異の分子レベルでの同定 実施例２に示されるＬＲ３３由来系統中の代謝産物の分析からの証拠により、 ＬＲ３３突然変異がミオイノシトールを生産する種子の能力を減少させる原因で あることが強く示唆される。 植物ならびに他の生物ではミオイノシトールは、ミオイノシトール１−リン酸 シンターゼによる触媒反応を受ける反応におけるグルコース−６−リン酸のミオ イノシトール １−リン酸への変換に始まり、そして特異的ミオイノシトール− リン酸ホスファターゼによる１−リン酸の加水分解に終わる経路によってのみ生 産されるに過ぎない（図１を参照されたい；Ｌｏｅｗｓ，Ｆ．Ａ．Ｉｎ：Ｉｎｏ ｓｉｔｏｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ（１９９０）Ｗｉｌｅ ｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ １３−１９］）。フィチン酸の前駆体 は恐らくミオイノシトール １−リン酸であろうし、そしてフィチン酸レベルは ＬＲ３３突然変異により減少するため、ミオイノシトール−リン酸シンターゼの 遺伝子および遺伝子産物の特徴決定を野生型およびＬＲ３３突然変異体植物の両 方において行った。野生型大豆ミオイノシトール １−リン酸シンターゼのｃＤＮＡクローニング ｃＤＮＡライブラリーを以下のように作成した。大豆胚芽（各々約５ ０ｍｇの生の重量）をその豆果から取り出し、そして液体窒素中で凍結した。凍 結させた胚芽を液体窒素の存在下で微細粉末になるまで挽き、そしてその後にポ リトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）での均一化により抽出し、そしてＣｈｉｒｇｗｉ ｎら（（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−５２９９）の 方法により全ＲＮＡについて濃縮する目的で分画化を行った。 この核酸分画を、全ＲＮＡをオリゴ−ｄＲセルロースカラムを通し、そしてポ リＡ⁺ ＲＮＡをＧｏｏｄｍａｎら（（１９７９）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ ．６８：７５−９０）により記載される要領で溶出することによりポリＡ⁺ Ｒ ＮＡについて濃縮した。ｃＤＮＡを、精製したポリＡ⁺ ＲＮＡから、ｃＤＮＡ シンセシスシステム（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍ Ｄ）および製造業者の手順書を用いて合成した。得られる二本鎖ＤＮＡを、Ｅｃ ｏ ＲＩ ＤＮＡメチラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によりメチル化し、その後にそ の末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ社）で充填し、そして平滑末端をリン酸化ＥｃｏＲＩリンカ ーに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて連結させた。この二 本鎖ＤＮＡをＥｃｏＲＩ酵素で消化し、余剰なリンカーからゲル濾過カラム（セ ファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂ）を通すことにより分離させ、そ して製造業者の手順書に従ってラムダＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社 ）に連結させた。連結させたＤＮＡを、製造業者の手順書に従ってＧｉｇａｐａ ｃｋ（商標）パッケージングエクストラクト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用い てファージ内にパケージングした。得られるｃＤＮＡライブラリーをＳｔｒａｔ ａｇｅｎｅ社の手順書により増幅し、そして−８０℃に保存した。 ラムダＺＡＰクローニングキットマニュアル（Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ Ｃｌｏ ｎｉｎｇ Ｋｉｔ Ｍａｎｕａｌ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内の手順書に従 い、ｃＤＮＡファージライブラリーを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１細胞 を感染させ、そして総計でおおよそ３００，０００プラーク形成単位を６枚の１ ５０ｍｍ直径ペトリ皿上でプレート培養した。 プレートから二重にプラークを拾いあげてニトロセルロースフィルター（Ｓｃ ｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）に移した。このフ ィルターを、６×ＳＳＰＥ、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、０ ．５％ ＳＤＳ、５％硫酸デキストラン、および０．１ｍｇ／ｍｌの変性サケ精 子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社）からなる２５ｍＬのハイ ブリダイゼーション用緩衝液中、６０℃で２時間予備ハイブリダイゼーションさ せた。 その後に遮断させたフィルターを、イーストのミオイノシトール １−リン酸 シンターゼとの相同性によりミオイノシトール １−リン酸シンターゼとして同 定されている［Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ａ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉ ｏｌ．１０５：１０２３−１０２４］アラビドプシス サリアナ（Ａｒａｂｉｄ ｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのｃＤＮＡから作成された放射ラベル化プ ローブにハイブリダイズさせた。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ク ローンを、ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏ ｕｒｃ ｅ Ｃｅｎｔｅｒ、ＤＮＡ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、１０６０ Ｃａｒｍａ ｃｋ Ｒｏａｄ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ ４３２１０−１００２、クローン番 号１８１Ｃ１８Ｔ７１１３Ｅ９Ｔ７から取得した。 １．２ｋＢ ｃＤＮＡ挿入断片を、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでの消化、ならびに その後のＤＮＡ断片のアガロースゲル精製によりベクターＤＮＡから取り出した 。精製した断片をランダムプライマーラベリングキット（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）で［³²Ｐ］ｄＣＴＰでラベルした。 このフィルターを、予備ハイブリダイゼーションについて記載されたものと同一 の条件下で一晩ハイブリダイズさせた。余剰なラベルを、０．１％ ＳＤＳを含 む０．６×ＳＳＣ中でフィルターから洗い落とした。その後に、０．２×ＳＳＣ 、０．１％ ＳＤＳ中での各約１０分間の２度の洗浄を適用させて非特異的結合 ラベルを除去し、そしてそのフィルターを用いて一晩の露出で写真用フィルムに 露出させた。おおよそ２００の陽性シグナルが観察された。６つのものをそのシ グナル周辺の領域の切り出しにより精製し、ファージを再度プレート培養し、そ して先の要領で再度スクリーニングにかけた。２つのクローンをファゲミドにす るまで切除し、そしてこれを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を感染させ、製造業 者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）により記載されるプロトコールを用いてプラスミ ドクローンを取得した。この２つのクローンの内、ｐ５ｂｍｉ−ｌ−ｐｓと表示 される一つのものの配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｓｔ ｒｕｍｅｎｔｓの方法および装置を用いて決定した。ｐ５ｂｍｉ−ｌ−ｐｓ内の ｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列を配列番号１に示し：そしてその配列によ りコードされ、演繹されたアミノ酸配列を配列番号２ に示す。ＬＲ３３大豆の未成熟種子からのミオイノシトール １−リン酸シンターゼのｃ ＤＮＡクローニング １１、１６、および２０と番号づけされ、そして実施例３に記載されるＬＲ３ ３植物（表８を参照されたい）からの種子を、種子充実期（ｓｅｅｄ ｆｉｌｌ ｉｎｇ ｐｅｒｉｏｄ）中におおよそ５０％収穫し、種果から取り出し、そして −８０℃に凍結保存した。ｍＲＮＡ単離のためには、バルク種子集団からの２ｇ の凍結種子を液体窒素中、乳鉢と乳棒とで挽いた。 この凍結粉末を再度、１０ｍＬの全ＲＮＡ抽出物緩衝液（これは１０ｍＭ Ｔ ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＣＴＡＢ（臭化セチル トリメチル アンモニウム）、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１％ ２−メルカプトエタ ノール、および２％ポリビニルピロリドンからなる）中で挽いた。全試薬につい ての水は０．０５％ジエチルプロカーバメートで３０分間処理し、そしてその後 にオートクレーブにかけた。この組織スラリーを１５ｍＬポリプロピレンチュー ブに移し、そして５，５００×ｇで１５分間遠心分離にかけた。上清をミラクロ ス（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を通して第二ポリプロピ レンチューブ内に入れ、そして０．３倍容量のクロロホルムを添加した。この相 を５，５００×ｇで１０分間の遠心分離により分離し、そして上層を別のポリプ ロピレンチューブに移し、そこに１．５倍容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＣＴＡＢ、および０．１％ ２− メルカプトエタノールを添加した。室温 での３０分間のインキュベーションの後、この核酸を５，５００×ｇで２０分間 の遠心分離により沈殿させた。 この核酸を、０．１％ ２−メルカプトエタノールを含む０．４ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌ中に再溶解した。１倍容量の１：１ フェノール：クロロホルムでの抽 出後、核酸を２倍容量のエタノールで沈殿させた。 ｍＲＮＡは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社からのｍＲＮＡ精製キットを用いてこの核 酸分画から精製した。約１２μｇのｍＲＮＡが取得された。１３ｎｇのポリアデ ニル化ｍＲＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ（商標）ＲＮＡ−ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉ ｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社、パーツ番号Ｎ８０８−００１７）を用いてオリ ゴ−ｄＴからの増幅用の鋳型として用いた。逆転写酵素反応を３０分間、４２℃ で作動させた。ＰＣＲ増幅については、Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を、キット製造業者により供給さ れるＤＮＡポリメラーゼの代用品とし、そして追加的に２μＬの１００ｍＭ硫酸 マグネシウムを各１００ｍＬ反応物に添加した。５’プライマーは配列番号３に 示される配列を有し：そして配列番号１の塩基５７〜７７からできており、その 配列に対する制限酵素の活性を上昇させる目的での８個の追加的な５’塩基と共 に、プライマー中にＮｄｅＩ部位をコードさせる目的で追加的塩基５’−ＧＧＧ ＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧ−３’が付加されていた。 ３’プライマーは配列番号４に示す配列を有し、そして配列番号１中の塩基１ ５６６〜１５８６の逆相補配列を含んでできており、制限酵素消化を上昇させる 目的での１０個の追加的な５’塩基と共に、プライマー中にＮｏｔＩ部位を提供 する目的で追加的塩基５’−ＡＡＧＧＡＡ ＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’が付加されていた。このＰＣＲ反応を５２℃の アニーリング温度および１．５分の伸長時間で３５周期作動させた。約１５５０ 塩基対からなる産物が得られ、そしてＡｍｃｏｎ５０ミクロフュージフィルター を通過させる作業、およびその後の同容量の１：１ フェノール：クロロホルム での抽出、フェノール：クロロホルム分離の上層の１倍容量のクロロホルムでの 抽出、およびエタノールでの沈降により精製した。得られる清浄なＰＣＲ産物の 内の５μｇを一晩、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩの両方で３７℃で消化した。この制 限酵素消化物の脱蛋白質化を、先に記載されるフェノール：クロロホルム抽出過 程により行い、そして、予めＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化してあり、そしてウ シ腸のアルカリ性ホスファターゼで処理して末端リン酸とハイブリダイズさせて あるｐＥＴ２４ａＴ７発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）２μｇ内に連結させた 。この連結混合物を用いてエレクトコンピテントＤＨ １０Ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏ ｌｉ ）細胞を形質転換させ、そして形質転換体を、３０ｍｇ ｌ^-1カナマイシン を含むプレート上での成長により選択した。この形質転換体プレートからの１８ の単独コロニーを拾いあげ、そして１００μＬの滅菌水中に入れた。この細胞混 合物の内の４０μＬ分を、このｃＤＮＡ挿入断片の単離にもともと用いられたプ ライマーおよびＰＣＲ条件を用いてＴａｑ（商標）ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ ｅｌｍｅｒ社）を用いるＰＣＲ反応作業の際のＤＮＡ鋳型として用いた。６つ のコロニーは正しいサイズの産物を増幅させるための鋳型として作用した。これ らのコロニーからの細胞混合物の内の残りの６０μＬを一晩の培養で増殖させ、 そしてプラスミドＤＮＡ調製物を各クローンから作成した。この６つの各クロー ンから精製されたプラスミド を用いてエレクトロコンピテントＤＥ３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換 させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での野生型およびＬＲ３３大豆からのミオイノシトー ル １−リン酸シンターゼの機能的発現 野生型大豆ミオイノシトール １−リン酸シンターゼを、配列番号３および配 列番号４におけるプライマー、ならびに逆転写させたｍＲＮＡからのＬＲ３３ミ オイノシトール １−リン酸シンターゼをクローニングするために先に記載され るＰＣＲ増幅およびクローニングプロトコールを用いるｐ５ｂｍｉ−ｌ−ｐｓの ＰＣＲ増幅によりｐＥＴ２４ａＴ７発現ベクター内に挿入した。この場合、その ｃＤＮＡ挿入断片と共にプラスミドを含むことが示された９つのＤＨ１０Ｂクロ ーンからのプラスミド調製物をプールし、そしてこれを用いてエレクトロコンピ テントＤＥ３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換させた。 カナマイシン耐性コロニーを選択し、そして６つを、一晩培養物の接種用に選 択した。３０℃、３０ｍｇ ｌ^-1カナマイシンを含むＬＢ培地中で増殖させた一 晩培養物を新鮮培地で２倍に希釈し、１時間再増殖させ、そして１ｍＭの最終濃 度になるまでイソプロピル−チオガラクトシドを添加することによる誘導をかけ た。 細胞を３時間後、そして０．１ｍＭ ＤＴＴおよび０．２ｍＭフッ化フェニル メチルスルホニルを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０の５０μＬ中 に再懸濁させた後に遠心分離により回収した。少量の１ｍｍガラスビーズを添加 し、そしてこの混合物を、各時マイクロプローブソニケーターで約５秒間、３回 のソニケーションにかけた。この混合 物を遠心分離にかけ、そして上清の蛋白質濃度を決定した。各クローン培養物の 可溶性分画の１μｇの蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。約６０キロダ ルトンの大きさの追加的蛋白質バンドを生産する培養物を活性アッセイ用に選択 した。 アッセイ用には［³³Ｐ］グルコース−６−リン酸を、リン酸ドナーとして［³³ Ｐ］−γ−ＡＴＰを用いてグルコースのヘキソキナーゼによる触媒反応を受ける リン酸化により調製した。室温に３０分おいた後、その反応混合物を、予めまず ８０％メタノールで、そして次に水で洗浄してあるＳＥＰ−ＰＡＣ Ｃ１８カラ ム（ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ Ｃｏｒｐ．社Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を通した。追加 的な０．５ｍＬ部分と一緒にしたこのカラム素通り分画を回収し、そしてＳＥＰ −ＰＡＣ ＳＡＸカラムに通し、これをその後に１ｍＬの８０％メタノールで洗 浄した。［³³Ｐ］グルコース−６−リン酸は８０％メタノール中の２ｍＬの０． ２Ｎ ＨＣｌで溶離させた。４０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を添加し、そしてメ タノールを減圧留去した。残りの溶液のグルコース−６−リン酸濃度は、グルコ ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによる６−ホスホグルクロン酸への転化によ り決定した。この反応により生産されるＮＡＤＰＨは３４０ｎｍでの吸光度によ り定量した。 １０μＬの細胞抽出物を３７℃で３０分、１００μＬ反応物（これは２ｍＭ グルコース−６−リン酸（５７，３３４ｄｐｍトータル³³Ｐ）、０．１ｍＭ Ｎ ＡＤ、および１５ｍＭ 酢酸アンモニウムである）中でインキュベートした。こ の反応物を９０℃に加熱して蛋白質を沈降させ、遠心分離にかけて清澄化させた 。この上清の内の４７μＬを、０．９ｍｌ分^-1で、０．１Ｎ ＮａＯＨおよび０ ．１Ｎ 酢酸ナトリウム で操作するＤｉｏｎｅｘ（商標）ＰＡ−１カラムにかけた。ミオイノシトール １−リン酸の標準は注入後８〜１０分目に溶出し、そして分離された反応混合物 の１分毎の分画をその時間の範囲全体にわたり採取してシンチレーションカウン ターにかけた。ピーク分画中の放射活性の総計値を出してグルコース−６−リン 酸のミオイノシトール−１−リン酸への転化率を取得し、そして空のｐＥＴ２４ ａＴ７ベクターを含む一つの対照大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥ３培養物および大 豆ミオイノシトール １−リン酸シンターゼｃＤＮＡを含む２つのクローンに関 する結果を表１２に示す。 表１２ ３つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞培養物抽出物についての比活性（μモル ミ オイノシトール １−リン酸により分^-1ｍｇ蛋白質^-1が生産される）（Ｓｏｙ Ｃｌｏｎｅ １および２は大豆ミオイノシトール１−リン酸シンターゼを含む一 方で、対照は空のプラスミドを含む。） 作動させたアッセイでは、ｃＤＮＡ含有性クローンは本質的には全ての利用可 能な基質を用い、そしてそのため対照系統と比較すると３５倍を上回る倍率で活 性が高くなっていた。従って大豆ミオイノシトール１−リン酸シンターゼ遺伝子 は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に機能性酵 素を生産することができる。 野生型大豆ミオイノシトール １−リン酸シンターゼクローン番号１（Ｓｏｙ Ｃｌｏｎｅ １）および３つのＬＲ３３ミオイノシトール１−リン酸シンター ゼクローンを先に記載される要領で蛋白質発現用に増殖させた。各クローンから の可溶性細胞抽出物からの５μｇの蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ＬＲ ３３クローン番号１０（ＬＲ３３−１０）は可溶性で６０キロダルトンの蛋白質 を本質的には野生型クローン番号１と同一の量で生産した。２つの抽出物の各々 のものからの４μｇの蛋白質を、先に記載される方法により、１００μＬ反応物 （これは３μｍ ＮＡＤおよび９０μｍ グルコース−６−リン酸を含む）を用 いてミオイノシトール １−リン酸シンターゼについてアッセイした。野生型ミ オイノシトール １−リン酸シンターゼの比活性はこれらの条件下では１．５ｎ モル分^-1ｍｇ蛋白質^-1であった一方で、ＬＲ３３由来のミオイノシトール １− リン酸シンターゼの比活性は０．１６ｎモル分^-1ｍｇ蛋白質^-1であった。ＬＲ３３ミオイノシトール １−リン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡのヌク レオチド配列 クローンＬＲ３３−１０（ＬＲ３３ミオイノシトール １−リン酸シンターゼ をコードする核酸断片を含む）中のｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列を、プ ラスミド源としてそのクローンのＤＨ１０Ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、および 野生型クローンについて記載されたＤＮＡ配列決定法を用いて決定した。このヌ クレオチド配列が配列番号５に示され、そしてそのクローンの読み取り枠から得 られる演繹されたアミノ酸 配列が配列番号６に示される。配列番号５は、塩基番号１２４１のコーディング 鎖中のＧのＴへの単一塩基対変化のため配列番号１とは異なっている。この変化 により、野生型配列（配列番号２）のリシンからＬＲ３３アミノ酸配列（配列番 号６）のアスパラギンへの変化がもたらされる。 塩基の変化が、ＬＲ３３ミオイノシトール １−リン酸シンターゼのクローニ ングの間に起こってしなったかもしれないＰＣＲが原因のエラーよりはむしろＬ Ｒ３３ゲノム内での変化により生じる事を確認するために、２セットのＰＣＲプ ライマーを調製した。野生型プライマー（配列番号７）およびＬＲ３３プライマ ー（配列番号８）を用いて、ダイズ栽培品種Ａ２８７２の乾燥種子、および大豆 系統ＬＲ３３クローン番号１６（表８を参照されたい）から調製したゲノムＤＮ Ａを増幅した。配列番号４に記載されるＰＣＲプライマーを共通のアンチセンス 鎖プライマーとして用いた。６２℃もしくは６４℃でのアニーリング温度、およ び３５周期のアニーリングおよび伸長の際には、Ａ２８７２ ＤＮＡを鋳型に使 用する場合には野生型プライマーのみがＰＣＲ産物を生産し、そしてＬＲ３３ ＤＮＡを鋳型として用いた場合にはＬＲ３３配列に対応するプライマーのみが産 物を生産した。 突然変異を検出するためのプライマーの特異性を更に詳細に検査するためには 、ＤＮＡを、実施例３に記載される分離ＬＲ３３クローン番号７系統（表８を参 照されたい）の種子から成長させた６本の個別の植物から調製した。分離集団か ら検査した６本の植物の内の２本は両方のプライマー用の鋳型として作用するＤ ＮＡを生じ、３本は野生型プライマーのみとのプライマーとして作用するＤＮＡ を生じ、そして一本はＬＲ ３３プライマーによってのみ産物を生産した。これらは、その遺伝子の一本の野 生型コピーおよび一本の突然変異体コピーを含むヘテロ接合体を含む集団から予 想される結果である。 代謝産物データおよび配列データから我々は、ラフィノースサッカリド糖の総 計値が非常に低く、スクロースが非常に高く、そしてフィチン酸が低い種子表現 型の所見は全て、配列番号１および配列番号５に示される野生型およびＬＲ３３ 配列の比較により説明される単一塩基変化突然変異に起因することを結論づけた 。 実施例６ ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼの遺伝子サイレンスおよび関連する種 子表現型を達成するための大豆の形質転換発達段階中の大豆種子中のミオイノシトール １−リン酸シンターゼの発現を低 減させるためのグリシン マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）の形質転換のた めのベクターの構築 アンチセンスもしくはセンスを標的とする大豆ミオイノシトール １−リン酸 シンターゼｃＤＮＡ配列を、大豆Ｋｕｎｉｔｚ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉ ｔｏｒ３（ＫＴｉ３）プロモーター［Ｊｏｆｕｋｕ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ 、（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：１０７９−１０９３］、ファセオル ス ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）７Ｓ種子保存蛋白質 （ファセオリン）プロモーター［Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ ｅｔ．ａ ｌ．、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３ ３２０−３３２４；Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．、（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：７１７−７２９］、および大豆β−コングリシニンプ ロモーター［Ｂｅａｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４．３ ０４７−３０５９］の制御下に含むプラスミドを構築する。これらのプロモータ ーの制御下で大豆ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼ ｃＤＮＡを発現す るベクターの構築は、以下のプラスミド：ｐＭＬ７０、ｐＣＷ１０８、およびｐ ＣＷ１０９Ａの使用により促進される。 ｐＭＬ７０ベクターはＫＴｉ３プロモーターおよびＫＴｉ３ ３’非翻訳領域 を含み、そして商品として入手可能なベクターｐＴＺ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ社）から中間体プラスミドｐＭＬ５１、ｐＭＬ５５、ｐＭＬ６４、およびｐＭ Ｌ６５を通して取得された。５’非翻訳領域の全２０３９ヌクレオチド、ならび にＪｏｆｕｋｕ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：４２ ７−４３５、に記載される配列の塩基７５５〜７６１に相当するＥｃｏＲＩ部位 で終了するＫＴｉ３遺伝子のコーディング配列の内の３９０塩基を含む完全な大 豆ＫＴｉ３遺伝子［Ｊｏｆｕｋｕ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、上述］の２．４ ｋｂのＢｓｔＢＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＴＺ１８ＲのＡｃｃＩ／ＥｃｏＲＩ部 位内に連結させてプラスミドｐＭＬ５１を作成した。このプラスミドｐＭＬ５１ をＮｃｏＩで切断し、クレノウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ）を用いて充填し、そして再 度連結させてＫＴｉ３挿入断片の５’非翻訳領域の中央に位置するＮｃｏＩ部位 を破壊してプラスミドｐＭＬ５５をもたらした。このプラスミドｐＭＬ５５をＸ ｍｎ Ｉ／ＥｃｏＲＩで部分消化して先に引用される配列の塩基７３２〜７５５に 相当する０．４２ ｋｂの断片を放出させ、これを棄却した。ＮｃｏＩ部位を含む合成ＸｍｎＩ／Ｅ ｃｏ ＲＩリンカーを、ＸｍｎＩ部位（５’−ＴＣＴＴＣＣ−３’）およびＮｃｏ Ｉ部位（５’−ＣＣＡＴＧＧＧ−３’）のためのコーディング配列、ならびにそ の直後に続くＥｃｏＲＩ部位の部分（５’−ＧＡＡＧＧ−３’）からなる相補性 合成オリゴヌクレオチドのダイマーを作成することにより構築した。ＸｍｎＩお よびＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位を短い介入配列（５’−ＡＴＡＧＣＣＣＣＣＣＡ Ａ−３’）と連結させた。この合成リンカーを４．９４ｋｂ断片のＸｍｎＩ／Ｅ ｃｏ ＲＩ部位と連結させてプラスミドｐＭＬ６４を作成した。ＫＴｉ３遺伝子の ３’非翻訳領域をＪｏｆｕｋｕ ｅｔ ａｌ．［上述］に記載される配列から、 プライマーＭＬ５１およびＭＬ５２を用いる標準ＰＣＲプロトコール（Ｐｅｒｋ ｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲキット）により増幅 した。プライマーＭＬ５１は、先に引用される配列の塩基１０７２〜１０９１に 相当する２０ヌクレオチドに加え、そのプライマーの５’末端のＥｃｏＲＶ（５ ’−ＧＡＴＡＴＣ−３’）、ＮｃｏＩ（５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’）、ＸｂａＩ （５’−ＴＣＴＡＧＡ−３’）、ＳｍａＩ（５’−ＣＣＣＧＧＧ−３’）、およ びＫｐｎＩ(５’−ＧＧＴＡＣＣ−３’)部位に対応するヌクレオチドを含んでい た。プライマーＭＬ５２は、先に引用される配列の塩基１２４２〜１２５９に相 当するヌクレオチドの厳密な相補物に加え、そのプライマーの５’末端のＳｍａ Ｉ（５’−ＣＣＣＧＧＧ−３’）、ＥｃｏＲＩ（５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’）、Ｂａｍ ＨＩ（５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’）、およびＳａｌＩ（５’−ＧＴＣＧＡ Ｃ−３’）部位に相当するヌクレオチドを含んでいた。ＫＴｉ３遺伝子のＰＣＲ 増幅させた３’末端をｐＭＬ６４ のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位に連結させてプラスミドｐＭＬ６５を作成した。合 成多重クローニング部位リンカーは、ＰｓｔＩ（５’−ＣＴＧＣＡ−３’）、Ｓ ａｌ Ｉ（５’−ＧＴＣＧＡＣ−３’）、ＢａｍＨＩ（５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’ ）、およびＰｓｔＩ（５’−ＣＴＧＣＡ−３’）部位のためのコーディング配列 からなる相補性合成オリゴヌクレオチドのダイマーを作成することにより構築し た。このリンカーをｐＭＬ６５のＰｓｔＩ部位（ＫＴｉ３プロモーター領域の直 ぐ隣にあたる５’側）に連結させてプラスミドｐＭＬ７０２を作成した。 ｐＣＷ１０８ベクターは、インゲンマメのファセオリンプロモーターおよび３ ’非翻訳領域を含み、そして市販品として入手可能なｐＵＣ１８プラスミド（Ｇ ｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）から、プラスミドＡＳ３およびｐＣＷ１０４を介して取得 した。プラスミドＡＳ３は、５’−ＴＧＧＴＣＴＴＴＴＧＧＴ−３’から出発し 、そしてその後にｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ部位内にクローン化された同一遺 伝子の３’非翻訳領域の全１１７５塩基対［Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．、（１９ ８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８−９２３８、およびＳｌｉｇ ｈｔｏｍ ｅｔ ａｌ．、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ８０：１９８７−１９０１、の配列記載を参照されたい；更に別の配 列記載は、国際公開第ＷＯ９１１／３９９３号に見いだされてよい］が続くイン ゲンマメ（ファセオルス ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ））のファセオリン（７Ｓ種子保存蛋白質）プロモーターの内の４９５塩基対を 含む。ｐＵＣ１８多重クローニング部位（ＥｃｏＲＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ）お よびＳａｌＩ）の追加的クローニング部位は、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩでの消 化、その 末端のクレノウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ）での充填、および連結により除去してプラ スミドｐＣＷ１０４を取得した。新規の多重クローニング部位を、５’ファセオ リンの４９５ｂｐと３’ファセオリンの１１７５ｂｐとの間に、ＮｃｏＩ部位（ ５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’）のためのコーディング配列、およびその後に続く３ つのフィラー塩基（５’−ＴＡＧ−３’）、ＳａｍＩ部位用のコーディング配列 （５’−ＣＣＣＧＧＧ−３’）、ＫｐｎＩ部位の最後３つの塩基（５’−ＴＡＣ −３’）、システインおよびＸｂａＩ部位のためのコーディング配列（５’−Ｔ ＣＴＡＧＡ−３’）からなる相補性合成オリゴヌクレオチドのダイマーを挿入す ることにより作成してプラスミドｐＣＷ１０８を作成した。このプラスミドは非 反復のＮｃｏＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、およびＸｂａＩ部位をファセオリンプロ モーターのすぐ後ろに含む。 ベクターｐＣＷ１０９Ａは、大豆β−コングリシニンプロモーター配列および ファセオリン３’非翻訳領域を含み、そして市販品として入手可能なｐＵＣ１８ （Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）から取得されたベクターｐＣＷ１０９の改編板である 。ベクターｐＣＷ１０９は、クローニングベクターｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ 部位内にβ−コングリシニン遺伝子の５５５ｂｐ ５’非コーディング領域（プ ロモーター領域を含む）およびその後に、先のｐＣＷ１０８について記載したＮ ｃｏ Ｉ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、およびＸｂａＩについての制限エンドヌクレアー ゼ部位を含む多重クローニング配列を挿入し、そしてその後にＨｉｎｄＩＩＩ部 位（先に記載される）内に共通のエンドウマメ ファセオリン３’非翻訳領域の 内の１１７４ｂｐを挿入することにより作成した。 用いられたβ−コングリシニンプロモーター領域は、２７のヌクレオ チド位置が異なっているため、発表されたβ−コングリシニン遺伝子［Ｄｏｙｌ ｅ ｅｔ ａｌ．、（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８− ９２３８］の対立遺伝子となっている。この遺伝子の更に詳細な記載は国際公開 第ＷＯ９１／１３９９３号に見いだされてよい。 これら３つの核酸構築物は、フィチン酸へのその後の転化のためのミオイノシ トール合成の期間を含む広域な発達期間にわたる発現を伴う種子特異的発現ベク ターを構築する。これらのベクター内への配列番号１および配列番号５に記載さ れる配列の挿入は、先の実施例５に記載されるＰＣＲ法により促進される。配列 番号１もしくは配列番号５の選択された領域に相補的なＰＣＲプライマーは、ｐ ＭＬ７０、ｐＣＷ１０８、およびｐＣＷ１０９のプロモーター配列の後に続く多 重クローニング配列内でも切断を行うものの中から選択された制限エンドヌクレ アーゼの認識配列を構築する付加的塩基を伴って合成されてよい。制限部位の配 置は、大豆ミオイノシトール １−リン酸シンターゼからのヌクレオチド断片の 方向を、過剰発現もしくは同時発現のいずれかを達成する目的ではセンス方向に 、あるい過小発現を達成するためにはアンチセンス方向に向けさせるよう指令す るように選択されてよい。体細胞大豆胚芽培養物の形質転換および大豆植物の再生 以下の保存用溶液および培地が大豆組織のインビトロでの生育を支持するのに 用いられた：保存溶液 ： 培地： 大豆胚形成性懸濁培養物を３５ｍＬの培地（ＳＢ５５もしくはＳＢＰ６）中、 ロータリーシェーカー、１５０ｒｐｍ、内、２８℃で、そして１６：８時間の日 中／夜間スケジュールでの蛍光および白熱光の混合光下で維持する。培養物は、 おおよそ３５ｍｇの組織を３５ｍＬの液体培地中に接種することにより４週間毎 に継代培養する。 大豆胚形成性懸濁培養物は、センスもしくはアンチセンス方向に向いているミ オイノシトール １−リン酸シンターゼのいずれかを含む種子特異的発現ベクタ ーで、パーティクルガン衝撃法（Ｋｌｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔ ｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０、を参照されたい）により形質転換しても よい。ＤｕＰｏｎｔ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（商標）ＰＤＳ１０００／ＨＥ装置（ ヘリウムレトロフィット）をこれらの形質転換に用いる。 ５０ｍＬの６０ｍｇ／ｍＬ １μｍゴールド粒子懸濁液を添加する（以下の順 序）：５μＬ ＤＮＡ（１μｇ／μＬ）、２０μＬ スペルミジン（０．１Ｍ） 、および５０μｌ ＣａＣｌ₂（２．５Ｍ）。この粒子懸濁物を３分間震盪させ 、ミクロフュージ内で１０秒間遠心にかけ、そして上清を除去する。その後にＤ ＮＡコーティングした粒子を４００μＬの７０％エタノール中で一度洗浄し、そ して４０μＬの絶対エタノール中に再懸濁させる。ＤＮＡ／粒子懸濁物を各回１ 秒間、３回超音波処理にかける。５μＬのＤＮＡコーディングゴールド粒子を、 その後に各マイクロキャリアディスク上にのせる。 約３００〜４００ｍｇの４週間懸濁培養物を空の６０×１５ｍｍペトリ皿上に 置き、そして残存する液体をピペットでペトリ皿から除去する。各形質転換実験 用には、約５〜１０プレートの組織を通常の様式で衝撃 法にかけた。膜破壊圧を１０００ｐｓｉに設定し、そしてチャンバーを２８イン チ水銀の真空状態になるまで脱気した。組織を、保持用スクリーンから約３．５ インチ離れた所に設置し、そして３度の衝撃法にかける。衝撃をかけた後には組 織を液体中に戻し、そして先に記載される要領で培養する。 衝撃後１１日目には液体培地を、５０ｍｇ／ｍＬのヒグロマイシンを含む新鮮 なＳＢ５５と交換する。その後には選択培地を毎週交換する。衝撃後７週間目に は、形質転換されておらず、壊死した胚芽クラスターから生育している緑色の形 質転換組織が観察されてよい。単離された緑色組織を取り出し、そして個別のフ ラスコに接種して新規のクローンとして継代される形質転換胚形成性懸濁培養物 を取得する。従って各新規系統は個別の形質転換品目として取り扱われる。これ らの懸濁物をその後には、継代培養を通して未成熟な発達段階でクラスターを形 成する胚芽か、あるいは個別の体細胞胚芽の成熟および発芽により完全な植物へ と再生する胚芽の懸濁液として維持することができる。 形質転換させた胚形成性クラスターを液体培養物から取り出し、そしてホルモ ンもしくは抗生物質は全く含まない固形アガー培地（ＳＢ１０３）上に乗せた。 胚芽を８週間、２６℃で、そして１６：８時間の日中／夜間スケジュールでの蛍 光および白熱光の混合光下で培養する。この期間中、個別の胚芽をクラスターか ら取り出し、そして胚芽発育の様々な段階での分析を行うことができる。８週間 後には体細胞胚芽は発芽に適切な状態となる。発芽させるには、８週間目の胚芽 を成熟培地から取り出し、そして空のペトリ皿中で１〜５日間乾燥させる。その 後には、乾燥させた胚芽をＳＢ７１−１培地中でプレート培養し、そこではそれ らの胚芽は先に記載されたものと同一の光および発芽条件下で発芽することがで きる。その後に、発芽した胚芽を滅菌土壌に移し、そして種子収集の目的で成熟 するまで成長させる。 先に記載される液体培養物中の球状胚芽状態では体細胞大豆胚芽は、成長段階 にある接合子大豆胚芽に典型的に見られるトリグリセロールもしくは貯蔵蛋白質 は非常に少量のみ含んでいる。この発達段階では、総計極性脂質（ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ）（リン脂質および糖脂質）に対する総計トリグリセリドの比率は約 ４：１であり、これは体細胞胚芽培養を開始した発育段階での接合子大豆胚芽に は典型的に見られるものと同一である。球状段階でも同様に、主要な種子蛋白質 （β−コングリシニンのα’−サブユニット、クニッツ トリプシン インヒビ ター ３（Ｋｕｎｉｔｚ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ３）、および 大豆種子レクチン（Ｓｏｙｂｅａｎ Ｓｅｅｓ Ｌｅｃｔｉｎ））のためのｍＲ ＮＡは本質的には非存在となる。先に記載される成熟過程にある体細胞胚芽段階 への分化を可能にさせるためにホルモン非含有培へ移す際には、トリグリセロー ルは脂質の内でも最多量の種類の脂質となる。同様に、β−コングリシニンのα ’−サブユニット、クニッツ トリプシン インヒビター ３（Ｋｕｎｉｔｚ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ３）、および大豆種子レクチン（Ｓｏｙ ｂｅａｎ Ｓｅｅｓ Ｌｅｃｔｉｎ）のためのｍＲＮＡは、全ｍＲＮＡ集団中で も非常に量の多いメッセージとなる。これに関連し、体細胞大豆胚芽系は、イン ビボでの成熟途中の接合子大豆胚芽に非常に類似する動態をとる。初期成熟期間 中では、体細胞胚芽中に存在する主要可溶性炭水化物はスクロース、グルコース 、およびマルトースである（これらは成熟期中に供給さ れる糖である）。体細胞胚芽が成熟し、そして黄色くなり始める際に、ラフィノ ースおよびスタキオースの両方が形成される。これに関しても同様に、体細胞胚 芽の表現型は、種子発育の後期段階を通過する際には配偶子胚芽に非常に類似す る。従って、センスもしくはアンチセンスのいずれかの方向で、配列番号１もし くは配列番号５に記載されるヌクレオチド配列の発現を指令する種子特異的発現 ベクターで形質転換させ、そしてラフィノースおよびスタキオースの生産量が低 下している胚芽についての選択により、同一表現型を有する種子を実らせる、成 熟して生殖能のある大豆植物の再生が可能となるはずである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，Ｉ Ｄ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 大豆ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼをコードする単離された 核酸断片。 ２． コードされる大豆ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼのアミノ酸 配列が実質的には、配列番号２に記載されるアミノ酸配列に類似する、請求の範 囲１の核酸断片。 ３． 適切な調節配列に操作可能に連結される請求の範囲１の核酸断片もしく は請求の範囲１の核酸断片の相補物を含み、その発現により大豆ミオイノシトー ル−１−リン酸シンターゼをコードする本来の遺伝子の発現を減少させるキメラ 遺伝子。 ４． 適切な調節配列に操作可能に連結される請求の範囲１の核酸断片の亜断 片もしくは請求の範囲１の核酸断片の亜断片の相補物を含み、その発現により大 豆ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼをコードする本来の遺伝子の発現を 減少させるキメラ遺伝子。 ５． ミオイノシトール−１−リン酸の合成についての能力が減少している突 然変異体ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼをコードする単離された核酸 断片。 ６． コードされる突然変異体ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼのア ミノ酸配列が実質的には配列番号５に記載されるアミノ酸配列に類似する、請求 の範囲５の核酸断片。 ７． ミオイノシトール １−リン酸の合成についての能力が減少している突 然変異体ミオイノシトール １−リン酸シンターゼをコードする少なくとも一つ の遺伝子についてはホモ接合性であり、その遺伝子が 、（ｉ）１７μモル／ｇを下回る種子フィチン酸含有量、（ｉｉ）１４．５μモ ル／を下回るラフィノースとスタキオースの総計種子含有量、ならびに（ｉｉｉ ）２００μモル／ｇを上回る種子スクロース含有量という遺伝可能な表現型を付 与するが、ただしその植物がＬＲ３３ではない大豆植物。 ８． 請求の範囲７の大豆植物の種子。 ９． （ｉ）請求の範囲３のキメラ遺伝子； （ｉｉ）請求の範囲４のキメラ遺伝子；および （ｉｉｉ）請求の範囲５の核酸断片； からなる群より選択されるメンバーを含み、（ｉ）１７μモル／ｇを下回る種子 フィチン酸含有量、（ｉｉ）１４．５μモル／を下回るラフィノースとスタキオ ースの総計種子含有量、ならびに（ｉｉｉ）２００μモル／ｇを上回る種子スク ロース含有量という遺伝可能な表現型を有するが、ただしその植物がＬＲ３３で はない大豆植物。 １０． 請求の範囲９の大豆植物の内のいずれかの種子。 １１． （ｉ）１７μモル／ｇを下回る種子フィチン酸含有量、（ｉｉ）１４ ．５μモル／を下回るラフィノースとスタキオースの総計種子含有量、ならびに （ｉｉｉ）２００μモル／ｇを上回る種子スクロース含有量という遺伝可能な表 現型を有する大豆植物を作成するための： （ａ）ＬＲ３３もしくは請求の範囲９の大豆植物の内のいずれかを、よりすぐ りの大豆植物と交雑させること；および （ｂ）（ｉ）１７μモル／ｇを下回る種子フィチン酸含有量、（ｉｉ）１４． ５μモル／を下回るラフィノースとスタキオースの総計種子含有量、ならびに（ ｉｉｉ）２００μモル／ｇを上回る種子スクロース含 有量という遺伝可能な表現型を有する段階（ａ）の交雑の子孫植物を選択するこ と、 を含む方法。 １２． ミオイノシトール １−リン酸の合成のための能力が減少している突 然変異体ミオイノシトール １−リン酸シンターゼをコードする少なくとも一つ の遺伝子についてホモ接合性であり、その遺伝子が、（ｉ）１７μモル／ｇを下 回る種子フィチン酸含有量、（ｉｉ）１４．５μモル／を下回るラフィノースと スタキオースの総計種子含有量、ならびに（ｉｉｉ）２００μモル／ｇを上回る 種子スクロース含有量という遺伝可能な表現型を付与する大豆植物の種子から取 得される大豆蛋白質製品。 １３． 請求の範囲８の大豆種子の加工処理により取得される大豆蛋白質製品 。 １４． 請求の範囲１０の大豆種子の加工処理により取得される大豆蛋白質製 品。 １５． ミオイノシトール １−リン酸の合成のための能力が減少している突 然変異体ミオイノシトール １−リン酸シンターゼをコードする少なくとも一つ の遺伝子についてホモ接合性であり、その遺伝子が、（ｉ）１７μモル／ｇを下 回る種子フィチン酸含有量、（ｉｉ）１４．５μモル／を下回るラフィノースと スタキオースの総計種子含有量、ならびに（ｉｉｉ）２００μモル／ｇを上回る 種子スクロース含有量という遺伝可能な表現型を付与する大豆植物の種子から取 得される大豆蛋白質製品を生産するための： （ａ）ＬＲ３３もしくは請求の範囲９の大豆植物の内のいずれかを、 よりすぐりの大豆植物と交雑させること； （ｂ）（ｉ）１７μモル／ｇを下回る種子フィチン酸含有量、（ｉｉ）１４． ５μモル／を下回るラフィノースとスタキオースの総計種子含有量、ならびに（ ｉｉｉ）２００μモル／ｇを上回る種子スクロース含有量という遺伝可能な表現 型を有する段階（ａ）の交雑の子孫植物をスクリーニングすること；および （ｃ）所望される大豆蛋白質製品を取得するために段階（ｂ）で選択された種 子を加工処理すること、 を含む方法。 １６． ミオイノシトール １−リン酸の合成のための能力が減少している突 然変異体ミオイノシトール １−リン酸シンターゼをコードする少なくとも一つ の遺伝子についてホモ接合性であり、その遺伝子が、（ｉ）１７μモル／ｇを下 回る種子フィチン酸含有量、（ｉｉ）１４．５μモル／を下回るラフィノースと スタキオースの総計種子含有量、ならびに（ｉｉｉ）２００μモル／ｇを上回る 種子スクロース含有量という遺伝可能な表現型を付与する大豆植物の種子を用い るための： （ａ）ミオイノシトール １−リン酸の合成のための能力が減少している突然 変異体ミオイノシトール １−リン酸シンターゼを含む大豆植物を、その突然変 異を含まないいずれかの大豆親と交雑させてＦ１ハイブリッドを取得すること； （ｂ）少なくとも一世代についてＦ１ハイブリッドを自家授粉させること；お よび （ｃ）ミオイノシトール １−リン酸の合成のための能力が減少している突然 変異体ミオイノシトール １−リン酸シンターゼをコードする 少なくとも一つの遺伝子についてホモ接合性であり、その遺伝子が、（ｉ）１７ μモル／ｇを下回る種子フィチン酸含有量、（ｉｉ）１４．５μモル／を下回る ラフィノースとスタキオースの総計種子含有量、ならびに（ｉｉｉ）２００μモ ル／ｇを上回る種子スクロース含有量という遺伝可能な表現型を付与する段階（ ｂ）の子孫を同定すること、 を含む方法。