KR20010006141A - 라피노스 사카라이드 및 파이트산 함량이 감소된 종자를 생산하는 대두 식물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대두 종자의 라피노스 사카라이드, 슈크로스, 파이트산 및 무기 인산염 함량을 변화시키는 대두 효소의 확인, 특성화 및 제조, 또한 대두 생성물에 관한 것이다. 본 발명은 다른 대두 계통의 종자와 비교하여 발아된 종자의 조직내 미오-이노시톨-1-인산염 합성능이 감소된 대두 계통을 포함한다. 본 명세서에서 교시하는 바와 같이, 임의의 몇몇 수단에 의하여 미오-이노시톨-1-인산염 신타제의 효소 활성을 감소시킴으로써 본 발명의 표현형을 나타내는 대두 종자를 생산할 것이다.
Description
＜발명의 배경＞
본 발명은 식물 분자 생물학 및 유전학 분야에 속한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 종자내 미오-이노시톨-1-인산염의 유전적 감소 생성능을 갖는 대두 계통을 사용함으로써 상당히 낮은 함량의 라피노스, 스타키오스 및 파이트산, 및 상당히 높은 함량의 슈크로스 및 무기 인산염을 갖는 대두 단백질, 및 곡분 생성물에 관한 것이다.
＜발명 배경＞
라피노스 사카라이드는 식물내에 널리 분포되어 있는 슈크로스의 D-갈락토시다제-함유 올리고사카라이드군이다. 라피노스 사카라이드는 0-α-D-갈락토피라노실-(1→6)n-α-D-글루코피라노실-(1→2)-β-D-프럭토푸라노시드의 일반식을 갖는 것을 특징으로 하고, 여기서, n=1 내지 n=4는 각각 라피노스, 스타키오스, 베르바스코스 및 아주고스로 알려져 있다. 대두 종자내 라피노스 및 스타키오스는 가장 많이 존재하는 라피노스 사카라이드이다. 반대로, 베르바스코스 및 아주고스는 미량 성분이고, 일반적으로 표준 분석 방법으로 검출되지 않는다.
라피노스 사카라이드를 생성하는 다양한 식물에 대한 조사는 기술 문헌 [Dey, P. M. In Biochemistry of storage Carbohydrate in Green Plant, Academic Press, London, (1985) pp 53-129]에 보고되어 있다. 라피노스 사카라이드는 식물계내 풍부함의 측면에서 볼 때 비구조적 탄수화물 중 슈크로스에 이어 두번째인 것으로 생각된다. 사실상, 라피노스 사카라이드는 적어도 고등 식물이면 어디에나 존재할 수 있다. 라피노스 사카라이드는 경제적으로 중요한 많은 식용 농작물에 대량 축적되어 있다. 예를 들면, 대두(Glycine max L. Merrill), 사탕무 (Beta vulgaris), 목화 (Gossypium hirsuium L.), 카놀라종(Brassica sp.) 및 강남콩 (Phaseolus sp.), 이집트콩(Cicer arietinum), 광저기 (Vigna unguiculata), 멍(mung)콩 (Vigna radiata), 완두콩(Pisum sativum), 렌즈콩(Lens culinaris) 및 루피너스종(Lupinus sp.)를 포함하는 모든 주요 콩과 작물이다.
많은 종류에서 풍부하게 존재하지만, 라피노스 사카라이드는 경제적으로 중요한 몇몇 농작물의 효율적인 이용에 장애가 된다. 주로, 장점막에는 갈락토시다제가 존재하지 않기 때문에 라피노스 사카라이드가 동물에 의해서 직접 소화되지 않는다(기트젤만(Gitzelmann) 및 오리키오(Auricchio)의 문헌[Pediatrics 36:231-236; Rutloff et al. (1967) Nahrung. 11:39-46(1965)]). 그러나, 장내 하부에 존재하는 미생물은 라피노스 사카라이드를 쉽게 발효시킬 수 있어, 장의 산성화 및 이산화탄소, 메탄 및 수소를 생성한다(머피(Murphy) 등의 문헌[J. Agr. Food Chem. 20:813-817(1972);크리스토파로(Cristofaro) 등의 문헌[In Sugars in Nutrition, (1974) Chapter 20.313-335; 레디(Reddy) 등의 문헌[J. Food Science 45:1161-1164(1980)]). 이로 인한 헛배부름 때문에, 사람 식이를 포함하여 동물에게 콩과 식물 사용을 엄격하게 제한할 수 있다. 라피노스 사카라이드류가 다르게는 휼륭한 단백질 및 섬유 공급원이기 때문에 이들의 존재가 사람 식이를 포함한 동물에게 대두 사용을 제한한다는 것은 유감스러운 일이다.
대두는 수확, 저장 및 가공을 위한 기계 및 설비에 매우 적당하여 세계 각국에서 널리 이용할 수 있다. 미국에서만도, 1988년에 곡분 약 2800 만톤이 생산되었다(문헌[Oil Crops Situation and Outlook Report, Apr. 1989, U.S. Dept. of Agriculture, Economic Research Service]). 전형적으로, 껍질을 제거한 후, 몇몇 추출 시스템 중 하나에서 핵산으로 오일을 추출하였다. 그 후, 남는 탈지 플레이크는 다양한 시판용 대두 단백질 생성물에 사용될 수 있다(문헌[Soy Protein Products Characteristics, Nutritional Aspects and Utilization (1987) Soy Protein Council]). 이들 중 가장 중요한 것은 대두 곡분이고, 이는 동물 사료, 특히, 가금 및 돼지와 같은 한 개의 위를 갖는 동물용 사료에 사용되는 단백질 주요 공급원이다.
대두가 식물성 단백질의 휼륭한 공급원임에도 불구하고. 라피노스 사카라이드의 존재로 인하여 이의 사용에 관련하여 비효율성이 있다. 옥수수와 비교하여, 동물 식이에 있어서 다른 주요 성분, 즉, 대두 곡분에 대한 총에너지 이용율은 낮다(포터(Potter) 및 포차나콤(Potchanakom)의 문헌[Proceedings World Soy Conference III, (1984) 218-224]). 예를 들어, 대두 곡분은 토황색 옥수수 보다 약 6% 많은 총에너지를 함유하고 있지만, 닭에게 먹였을 때 약 40 내지 50 % 미만의 대사가능한 에너지를 얻는다. 총에너지 이용율의 비효율성은 곡분의 단백질 분획의 분해 문제 때문에 나타나는 것이 아니라 오히려 곡분 중의 탄수화물 부분의 열등한 분해로 인하여 나타난다. 에탄올 추출에 의하여 대두 곡분로부터 라피노스 사카라이드를 제거함으로써 브로일러(broiler)에 대한 대사가능한 에너지의 큰 증가를 나타내었다(쿤, 씨.엔.(Coon, C. N.) 등의 [Proceedings Soybean Utilization Alternatives, University of Minnesota, (1988) 203-211])고 보고하고 있다. 라피노스 사카라이드의 제거는 대두 곡분의 셀룰로스성 및 헤미셀룰로스성 분획의 이용성 증가와 관련이 있다.
대두로부터 다양한 가공 식물성 단백질 생성물이 생산된다. 여기에는 최소 가공된 탈지품, 예를 들어, 대두 곡분, 그릿 및 밀곡분 보다 고도로 가공된 품목, 예를 들어, 대두 단백질 농축물 및 대두 단백질이 있다. 다른 대두 단백질 생성물에서 오일은 예를 들어, 미추출의 완전 지방 대두 밀곡분이다. 이들 가공 생성물 이외에, 또한 출발 물질로서 콩 전체를 이용하는 전통지향적인 많은 가공법을 기초로 하는 특이한 생성물이 있다. 예로는 대두 우유, 대두 소스, 토푸(tofu), 나토(natto), 미소(miso), 템페(tempeh) 및 유바(yuba)이 있다.
사람의 식품 중 대두 단백질 생성물을 사용한 예로는 대두 단백질 농축물, 대두 단백질 단리물, 감촉성 대두 단백질, 두유 및 이유식이 있다. 대두로부터 단백질 농축물 및 단리물을 생산하는 설비 및 방법은 널리 이용가능하다. 대두 단백질 농축물 및 단리물의 제조자가 직면한 문제점 중 하나가 라피노스 사카라이드로부터 단백질을 선별적으로 정제 제거하는 것이다. 많은 장치 및 작업 비용은 대두내 존재하는 대량의 라피노스 사카라이드 제거의 결과로서 발생한다.
라피노스 사카라이드와 관련된 문제점 및 비용은 대두 종자내 라피노스 사카라이드 함량을 감소시키는 유전자의 이용을 통하여 감소시키거나 없앨 수 있다. 이러한 유전자를 사용하여 유전적으로 라피노스 사카라이드 함량을 감소시킨 대두 변종을 개발할 수 있다. 유전적으로 라피노스 사카라이드 함량을 감소시킨 대두 변종은 유도된 대두 단백질 생성물의 영양적 품질을 향상시키고, 라피노스 사카라이드의 제거와 관련된 가공 비용을 감소시킬 수 있다. 동물 및 사람 식이를 위하여 저함량 라피노스 사카라이드 대두 변종은 통상적인 변종보다 가치가 있으며, 인류로 하여금 이러한 식용 콩의 바람직한 영양 품질을 보다 충분히 이용할 수 있게 한다.
미오-이노시톨 헥사포스페이트(또한 "파이트산"으로 공지되어 있음) 및 라피노스 사카라이드는 그들의 합성에 있어서 미오-이노시톨을 공동 중간체로서 공유한다(이쉬타니, 엠 등의 문헌[Plant Journal 9:53 7-548(1996)]). 라피노스 사카라이드와 같이, 파이트산은 속씨식물 종자내 널리 편재하는 성분이다(라보이, 브이(Raboy, V.) 등의 문헌[Inositol Metabolism in Plants (1990) Wiley-Liss, New York, pp 55-761]). 파이트산은 전형적으로 대두 및 옥수수와 같은 종자내 총 인산염의 50 내지 70%에 달하며, 인산염은 한 개의 위를 갖는 동물에게는 단지 낮은 이용성을 갖는다. 부분적으로 분해되는 것 이외에, 동물 식량중 파이트산의 존재는 필수 아미노산, 칼슘 및 아연과 같은 다른 제한 영양소를 분비시킨다(므로즈, 제트.(Mroz, Z.)등의 문헌[J. Animals Sci. 72:126-132(1994)]: 폭스(Fox) 등의 문헌[Nutritinal Toxicology VoL 3, Academic Press, San Diego (1989) pp. 59-961]). 대두 곡분은 많은 동물 사료 식량의 주요한 부분을 차리하고 있기 때문에 이용가능한 인산염 함량이 증가되면서 파이트산 함량이 감소된 곡분은 대두 함유 식량에서 사료의 효율성을 개선시킨다. 사실상, 파이트산으로부터 인산염기를 부분적으로 가수분해시키기 위해서 대두 곡분 함유 식량의 효소 처리는 인산염 이용성 및 다른 제한 영양소의 이용성 모두 향상시킨다(므로즈 등의 상기 문헌 및 ; 펜(Pen) 등의 문헌[Biotechnology 1 1:811-8141(1993)].
시판용 및 야생 대두 생식세포질 조사 결과 종자의 파이트산 함량에 있어서 제한된 유전적 다양성이 존재하는 것을 보였다(라보이 등의 문헌[Crop Science 24:431-434(1984)]). 이러한 인자에서 볼 때, 종자내 라피노스 사카라이드 및 파이트산 함량이 유전적으로 크게 감소된 대두 식물이 요구되는 것이 분명하다.
＜발명의 요약＞
본 발명은 (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 갖는 대두 식물에 관한 것이고, 상기 표현형은 식물 종자내 미오-이노시톨-1-인산염 합성능의 감소로 인한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 식물로부터 유도된 종자에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 대두 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는, 단리된 핵산 단편 또는 상보물, 및 적합한 조절 서열에 작동가능하게 결합된 핵산 단편 또는 이러한 핵산 단편의 소단편을 포함하는 키메라 유전자에 관한 것이고, 키메라 유전자의 발현은 대두 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 고유 유전자의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 미오-이노시톨-1-인산염의 합성능이 감소된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 단리된 핵산 단편에 관한 것이다.
그러나, 본 발명의 또다른 실시태양은 게놈내 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는, 적합한 조절 서열에 작동가능하게 결합된 핵산 단편 또는 핵산 단편의 상보물을 포함하는 키메라 유전자를 가지며, 키메라 유전자의 발현이 대두 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 고유 유전자의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 대두 식물에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시태양 (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 부여하고, 미오-이노시톨-1-인산염 합성능이 감소된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자에 대하여 동형접합체인 대두 식물에 관한 것이다.
본 발명은 종자 및 상기 임의의 식물 종자로부터 유래된 단백질 생성물에 관한 것이다.
그러나, 본 발명의 또다른 실시태양은
(a) 대두 계통 LR33 또는 그의 게놈내에 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는, 적합한 조절 서열에 작동가능하게 결합된 핵산 단편 또는 핵산 단편의 상보물을 포함하는 키메라 유전자를 갖는 임의의 대두 식물 또는 미오-이노시톨-1-인산염 합성능이 감소된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자에 대하여 동형접합체인 대두 식물과 우량 대두 식물을 교배시키는 단계; 및
(b) (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스이 총 함량 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 갖는 단계 (a)의 교배종의 자손 식물을 선별하는 단계
로 이루어지는, (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 갖는 대두 식물의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
(a) 농업적 우량 대두 식물을 LR33 또는 상기 서술한 임의의 대두 식물과 교배시키는 단계;
(b) (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형에 대하여 단계 (a)의 교배종의 자손 식물을 선별하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 선별된 종자를 가공 처리하여 목적하는 대두 단백질 생성물을 얻는 단계
를 포함하는 대두 단백질 생성물의 제조 방법에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은
(a) 미오-이노시톨-1-인산염 합성능이 감소된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 포함하는 대두 식물과, 변이를 포함하지 않는 임의의 대두 양친을 교배시켜 F1 잡종을 생산하는 단계;
(b) F1 잡종을 1 세대 이상 동안 자가수분시키는 단계; 및
(c) 미오-이노시톨-1-인산염 합성능이 감소된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자(상기 유전자는 (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 부여함)에 대하여 동형접합체인 단계 (b)의 자손을 찾아내는 단계
로 이루어지는, 미오-이노시톨-1-인산염 합성능이 감소된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자(상기 유전자는 (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 부여함)에 대하여 동형접합체인 대두 식물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
＜도면의 간단한 설명과 서열 목록＞
본 발명은 출원의 일부를 이루는 도면 및 서열 목록으로부터 보다 완전히 이해할 수 있을 것이다. 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된 37 C.F.R. 1.822에서 정의된 바와 같이, 서열 목록은 아미노산에 대하여 3개의 문자 코드를 포함한다.
도 1은 대두 종자내 파이트산, 라피노스 및 스타키오스에 대한 글루코스 대사를 나타낸다. 공동 보조-인자, ATP, ADP, UTP, UDP, 피로포스파브 및 무기 인산염(Pi)은 도시되어 있지 않다. 효소는 약어로 기록한다:
헥소키나제(HK); 포스포글루코이소머라제(PGI); UDP글루코스피로포스포릴라제(UDPGPP); UDP글루코스 4' 에피머라제 (UDPG 4'E); 미오-이노시톨-1-인산염 신타제(MI 1-PS); 미오-이노시톨-1-포스파타제 (MI I-P아제); 미오-이노시톨-1-인산염 키나제(MI 1-PK); 갈락티놀 신타제 (GAS);슈크로스 신타제 (SucS); 라피노스 신타제 (RS); 및 스타키오스 신타제 (SS).
서열 번호 1은 클론 p5bmi-1ps에 존재하는 야생형 대두 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 cDNA의 1782 개 염기의 5' 내지 3' 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 2는 서열 번호 1의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 유도된 510 개의 아미노산 서열이다.
서열 번호 3은 대두 계통 LR33으로부터 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 cDNA의 단리에 사용되는 업스트림(5') 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 4는 대두 계통 LR33으로부터 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 cDNA의 단리에 사용되는 다운스트림(3') 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 5는 클론 LR33-10내 존재하는 LR33 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 코딩 cDNA의 1533 개 염기의 뉴클레오티드 서열이다. .
서열 번호 6은 서열 번호 5의 오픈 리딩 프레임으로부터 유도된 510 개의 아미노산 서열이다.
서열 번호 7은 게놈성 DNA 시료로부터 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 코딩 야생형 대립 유전자의 PCR 증폭에 사용되는 업스트림 (5') 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 8은 게놈성 DNA 시료로부터 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 코딩 LR33 대립 유전자의 PCR 증폭에 사용되는 업스트림 (5') 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
＜생물학적 기탁＞
하기 생물학적 물질 부다페스트 조약에 의해 미국 20852 매릴랜드주 록크빌 파크로운 드라이브 12031 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection(ATCC))에 기탁하고, 하기 승인 번호를 얻었다.
| 명칭 | 물질 | 승인 번호 | 기탁일 |
| LR33 | 종자 | ATCC 97988 | 1997년 4월 17일 |
| 4E76 | 종자 | ATCC 97971 | 1997년 4월 4일 |
| p5bmi-lps | 플라스미드 | ATCC 97970 | 1997년 4월 4일 |
＜상세한 설명＞
본 명세서와 관련하여 많은 용어가 사용될 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "대두"는 글리신 맥스(Glycine max)종, 글리신 소자(Glycine soja) 또는 글리신 맥스와 유성적으로 교배가능한 임의의 종류를 말한다. "계통"은 하나 이상의 형질에 대하여 개체간에 유전적 변이가 거의 나타나지 않거나 없는 유사 계통의 식물군이다. 이러한 계통은 조직 또는 세포 배양 기술에 의해 동일한 양친으로부터 1 대 이상의 자가수분 및 선별 또는 식물 번식에 의해서 형성될 수 있다. "변이"는 격리(segregation) 또는 유전자 조합에 의해서 유발되지 않는, 검출가능하고 유전가능한 유전자 변화(자발 또는 유도)를 말한다. "돌연변이"는 변이를 일으키는 개체 또는 개체들의 계통을 말한다. "집락"은 공통의 유전자 풀(pool)을 공유하는 개체들의 임의의 군이다. 본 발명에서 예를 들면, M1, M2, M3, M4, F1 및 F2 집락이 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "M1 집락"은 변이 유발제에 노출된 종자 (및 생성 식물)의 자손이고, "M2 집락"은 자가수분된 M1 식물의 자손이며, "M3 집락"은 자가수분된 M2 식물의 자손이고, "M4 집락"은 자가수분된 M3 식물의 자손이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이,"F1 집락"은 하나의 계통을 다른 계통과 교배 수분(cross pollination)시킴으로써 생성되는 자손이다. 이러한 교배 수분을 나타내는데 있어서 본 명세서에서 사용되는 포맷은 "수컷 양친*암컷 양친"이다. "F2 집락"은 자가수분된 F1 식물의 자손이다. "F2-유도 계통" 또는 "F2 계통"은 각 F2 식물을 자가 수분시킴으로써 생성되는 계통이다. F2-유도 계통은 반복적인 자가 수분과, F2-유도 계통 식물 종자의 증가에 의한 후속 세대(F3, F4, F5 등)을 통하여 번식될 수 있다.
"핵산"이라는 용어는 슈가, 인산염 및 푸린 또는 피리미딘 중의 하나를 함유하는 단량체(뉴클레오티드)로 이루어진, 단일 스트랜드 또는 이중 스트랜드일 수 있는 큰 분자를 말한다. "핵산 단편"은 일정 핵산 분자의 분획이다. "소단편"은 전체 핵산 단편보다 적은, 핵산 단편의 인접 부분을 말한다. "상보물"은 핵산을 포함하는 퓨린 및 피리미딘 염기의 특이적 쌍, 예를 들면 티미딘과 아데닌쌍 및 사이토신과 구아닌쌍을 말한다. 따라서, 제1 핵산 단편의 "상보물"은 뉴클레오티드 서열이 제1 핵산 서열과 상보적인 제2 핵산 단편을 말한다.
고등 식물에서, 데옥시리보핵산 (DNA)은 DNA 정보를 단백질에 전달하는데 있어서 리보핵산 (RNA)이 관련된 유전자 물질이다. "게놈"은 유기체 각 세포에 포함된 총체적인 유전자 물질이다. "뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 DNA 또는 RNA 중합체 중으로 삽입가능한 임의로, 합성, 비천연 또는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함하여, 단일- 또는 이중-스트랜드일 수 있는 DNA 또는 RNA 중합체 서열을 말한다. "올리고머"라는 용어는 보통 100 개 이하의 염기 길이를 갖는 짧은 뉴클레오티드 서열을 말한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "상동"이라는 말은 2 개의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열; 또는 단백질 분자 2 개의 아미노산간의 관련성을 말한다. 이러한 상동성 평가는 당업자가 잘 알 수 있는 엄격한 조건하에 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화 중 하나에 의해서(문헌[Hames and Higgins, Eds. (1985) Neucreic acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, U.K.); 또는 예를 들어, 니들만(Needleman) 등의 문헌[J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453]의 방법에 의한 2 개의 핵산 또는 단백질 간의 서열 유사성의 비교에 의해서 평가된다. "실질적으로 유사한"이라는 말은 코딩 부위에 상응하는 유전자 및 가짜 유전자와 같이, 청구된 서열의 코딩 부위와 뉴클레오티드 수준에서 전체적인 상동성이 90 %를 넘는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 본 명세서에서 기재된 핵산 단편은 이에 제한된 것은 아니지만, (a) 코딩된 아미노산을 변화시키지 않는 염기 변화에 관련된 것, 또는 (b) 아미노산을 변형시키는 염기 변화에 관련되지만 DNA 서열에 의해서 코딩된 단백질의 관능적 특성에 영향을 주지 않는 것, (c) 핵산 단편의 삭제, 재배열, 증폭, 램덤 또는 조절된 변이 생성으로부터 유도된 것, 및 (d) 수시의 뉴클레오티드 서열화 에러의 가능한 합성 및 천연 변이를 갖는 분자를 포함한다.
"유전자"라는 용어는 조절 서열 전방(5'논-코딩) 또한 후방(3'논-코딩) 코딩 부위를 포함하는 특이 단백질을 발현하는 핵산 단편을 말한다. "고유" 유전자는 자연계에서 발견되는 그 자체의 조절 서열을 갖는 단리된 유전자를 말한다. "키메라 유전자"는 자연계에서 발견되지 않는 이종의 조절 및 코딩 서열을 포함하는 유전자를 말한다. "내생" 유전자는 게놈내 그의 고유 위치에서 정상적으로 발견되며 단리되지 않는 유전자를 말한다. "외래" 유전자는 숙주 유기체내에서 정상적으로 발견되지 않지만, 유전자 전달에 의해서 도입되는 유전자를 말한다. "가짜-유전자"는 기능 효소를 코딩하지 않는 게놈성 뉴클레오티드 서열을 말한다.
"코딩 서열"은 특이 단백질을 코딩하는, 논-코딩 서열을 제외한 DNA 서열을 말한다. 이는 "비간섭된 코딩 서열"을 구성하거나 즉, 인트론이 결손되어 있거나, 적당한 스프라이스(splice) 접합에 의해서 결합된 1 개 이상의 인트론을 포함할 수 있다. "인트론"은 1 차 전사물에서 전사되지만, 단백질로 번역될 수 있는 성숙 mRNA을 제작하기 위해서 세포내 RNA의 분해 및 재결합을 통하여 제거되는 뉴클레오티드 서열이다.
"개시 코돈" 및 "종결 코돈"은 단백질 합성(mRNA 번역)의 개시 및 사슬 종결 각각을 구체화하는 코딩 서열내 3 개의 인접 뉴클레오티드 단위를 말한다. "오픈 리딩 프레임"은 아미노산 서열을 코딩하는 개시 및 종결 코돈 사이의 인트론에 의해서 비간섭된 코딩 서열을 말한다.
"RNA 전사물"는 DNA 서열의 RNA 중합 효소 촉매된 전사로부터 생성되는 생성물이다. RNA 전사물이 DNA 서열의 완전한 복사물인 경우, 이를 1차 전사물로 부르고, 또는 1차 전사물의 후전사 과정으로부터 유도된 RNA 서열일 수도 있고, 후에는 성숙 RNA이라고 부른다.
"메신저 RNA (mRNA)"는 인트론이 없고, 세포에 의해서 단백질로 번역될 수 있는 RNA이다. "cDNA"는 mRNA로부터 유도된 이중-스트랜드 DNA를 말한다. "센스(센스)" RNA는 mRNA를 포함하는 RNA 전사물을 말한다. "안티센스 RNA"는 그의 1차 전사물 또는 mRNA의 프로세싱, 이동 및(또는) 번역을 방해함으로써 목적 유전자의 발현을 차단하는 모든 또는 부분 표적 1차 전사물 또는 mRNA에 상보적인 RNA 전사물을 말한다. 안티센스 RNA는 특이 유전자 전사물의 임의 부분 즉, 5' 논-코딩 서열, 3' 논-코딩 서열, 인트론 또는 코딩 서열과 상보적일 수도 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 안티센스 RNA은 유전자 발현을 차단하는 안티센스 RNA의 효율성을 증가시키는 리보자임 서열 부위를 포함할 수 있다. "리보자임"은 촉매 RNA이고, 서열-특이 엔도리보뉴클레아제를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "적합한 조절 서열"은 본 발명의 핵산 단편에 대하여 업스트림 (5'), 내부 및(또는) 다운스트림 (3')에 위치한 고유 또는 키메라 유전자내 뉴클레오티드 서열을 말하고, 본 발명의 핵산 단편의 발현을 조절한다.
"프로모터"는 통상적으로, 그의 코딩 서열에 대하여 업스트림 (5')의 유전자내 DNA 서열을 말하고, 이는 적당한 전사에 요구되는 RNA 중합 효소 및 다른 인자에 대한 인식을 제공하여 코딩 서열의 발현을 조절한다. 인조 DNA 제작에서 프로모터는 또한 안티센스 RNA를 번역하는데 사용된다. 프로모터는 또한 생리적 또는 발달적 조건에 따라서 전사 개시의 효율성을 조절하는 단백질 인자의 결합과 관련된 DNA 서열을 포함한다. 또한, 이는 인핸서(enhancer) 요소를 포함한다. "인핸서"는 프로모터 활성을 촉진시킬 수 있는 DNA 서열이다. 이는 프로모터의 농도 및(또는) 조직-특이성을 증가시키기 위하여 삽입되는, 프로모터 또는 이종 요소의 내부 성분이다. "구성 프로모터"는 모든 조직내에서 유전자 발현을 항상 지시한다. 본 명세서에서 언급되는 "조직 특이" 또는 "발달-특이" 프로모터는 잎 또는 종자와 같은 특정 조직에 거의 중점적으로, 또는 초기 또는 말기 배아생성과 같은 조직내 각 특정 발달 단계에서 유전자 발현을 지시한다. "발현"이라는 용어는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 발명의 핵산 단편(s)으로부터 유도된 센스(MRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정된 축적으로 세포의 단백질 기구와 함께 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 농도를 변화시켜 생산하는 것을 말한다. "안티센스 억제"는 목적 단백질의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 RNA 전사물의 생산을 말한다. "과다발현"은 정상 또는 비-형질변환 유기체에서 생산 수준을 넘는, 유전자 이식 유기체의 유전자 생성물 생산을 말한다. "공동억제"는 내생 유전자에 대하여 실질적 상동성을 갖는 외래 유전자의 발현을 말하며, 이는 외래 및 내생 유전자 모두의 발현을 억제한다. "변형 정도"는 정상 또는 비형질변환된 유기체의 것과 상이한 양 또는 비율로 유전자 이식 유기체내 유전자 생성물을 생성하는 것을 말한다. 본 발명은 또한 본 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터로 유전자 조작한 숙주 세포, 및 본 발명의 폴리펩티드 생산에 관한 것이다. 본 명세서에서 "형질변환"은 외래 유전자 및 그의 유전적으로 안정한 유전성을 숙주 유기체의 게놈으로 전달하는 것을 말한다. "번식종(Fertile)"은 유성적으로 번식할 수 있는 식물을 말한다.
"라피노스 사카라이드"는 0-α-D-갈락토피라노실-(1→6)n-α-D-글루코피라노실-(1→2)-β-D-프럭토푸라노시드의 일반식(여기서, n= 1 내지 4임)을 갖는 올리고사카라이드의 종류를 말한다. 대두 종자에서 상기 용어는 보다 구체적으로는, 1 개의 (라피노스) 및 2 개의 (스타키오스) 갈락토시다제 잔사를 포함하는 종류를 말한다. 고급 갈락토시다제 중합체(예를 들어, 베르바스코스 및 아주고스)가 공지되어 있지만, 대두내 이들 고급 중합체의 함량은 검출 표준량 이하이므로, 총 라피노스 사카라이드 함량에는 크게 기여하지 않는다.
"식물"은 광합성 유기체, 진핵 및 원핵 모두를 말하고, "고급 식물"은 진핵 식물을 말한다.
본 발명은 대두 유전자의 변이형, 및 대두 종자 및 유도 생성물의 탄수화물 및 파이트산 조성을 개선시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 이들 유전자내 변이를 확인하고, 대두 종자의 라피노스 사카라이드 및 파이트산 함량을 감소시키기 위하여 유도 변이 대두 계통을 사용하는 방법을 예시하고 있다. 본 발명은 또한 대두 종자내 라피노스 사카라이드 함량을 감소시키기 위하여 유전자 사일런스 기술을 사용하는 방법, 및 본 발명에서 발견되는 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 위한 대두 유전자 서열을 교시하고 있다.
본 발명의 식물로부터 유도된 종자는 시판용 여러 종류와 비교하여 개선된 가용성 탄수화물 함량을 발현한다. 상기 개선으로 인하여 총 라피노스 및 스타키오스 함량이 감소된다. 이러한 계통의 탄수화물 프로파일은 다른 대두 육종 프로그램에 의해서 사용되거나, 생성된 우량 또는 생식세포 계통에서 나타나는 프로파일과 크게 다르다.
본 발명의 신규 대두 유전자를 생산하는 2 가지 별도의 방법을 교시하고 있다. 제1 방법은 저함량의 라피노스 및 스타키오스를 부여하는 변이를 유도하는 제1의 성공적인 시도를 특징으로 한다. 이 방법에서 2 개의 주요 유전자를 발견하였고, 그 중 하나는 본 발명에 상세하게 설명되어 있고, 이전에 보고된 임의의 계통보다 더 우수한 대두 계통(총 라피노스 및 스타키오스 함량을 감소시키는 측면에서)을 발달시키는데 사용될 수 있다. 제2의 방법은 랜덤 변이 생성 및 스크리닝을 통하여 얻어진 것과 유사한 결과를 얻기 위하여 특정 유전자 사일런싱의 유전자 이식 방법에 사용되는, 본 발명에 교시된 유전자 서열을 이용한다.
본 출원인은 화학적 변이 생성에 의한 야생형 대두 게놈내 랜덤 변이를 도입하고자 하였다. DNA 구조 및 서열을 변경시키기 위하여 공지된 다른 제제를 사용할 수도 있었지만, 본 발명은 변이 유발제로서 NMU (N-니트로소-N-메틸우레아)를 사용하였다. NMU 처리 후, 대두 종자를 몇 세대 동안 파종하고, 목적하는 표현형에 대하여 스크리닝하였고, 여기서 라피노스 사카라이드 함량의 변화가 가장 중요하였다. 변이 대두 집락의 초기 스크리닝에서 2 개의 계통, 즉 LR33 및 LR28이 저함량의 라피노스 사카라이드 (LR28은 국제 특허 공보 W093/07742에 기재되어 있음)를 나타내는 것으로 밝혀졌다. LR33의 저함량 라피노스 사카라이드 표현형은 자가 번식에 의해서 생성된 LR33의 후속 3 세대의 분석에 의해서 비유전성인 것으로 입증되었다(표 1).
이러한 계통에 의해 나타나는 독특한 표현형을 생성하는 LR33의 생리학적 결함을 일련의 유전적 및 생화학적 고도 연구를 수행하여 찾아내고 특성화하였다(하기 실시예 2 참조). LR33의 결함은 이 계통에서 저함량 스타키오스 표현형을 생성한다는 점에서 LR28 변이와는 유전적 및 생화학적으로 구별되는 것으로 나타났다. 더우기, 상기 LR33 변이는 LR28의 결함보다 더 큰 다면 작용을 나타내었고, 본 명세서에는 LR33 표현형이 라피노스 사카라이드 함량을 감소시킬 뿐 아니라 종자의 파이트산, 무기 인산염 및 슈크로스 농도를 변화시키는 것으로 나타나 있다. 추가 분석으로, LR33 단독으로부터 유도된 유전적 정보가 이러한 자손 대두 계통에 대하여 이러한 독특한 표현형을 부여할 수 있다는 것과, LR33의 변이 유전자 또는 유전자가 다른 변이 대두 계통으로부터 유도된 유전자 표현형 발현을 증가시키는 단순한 유전적 개질제가 아님을 확인하였다.
LR33 및 그의 자손에 의해서 보여진 유전적 표현형을 책임지고 있는 특정 생화학적 결함이 확인되었다. 이는 대두 종자내 라피노스 사카라이드의 생합성 및 파이트산 및 무기 인산염 농도를 조절함으로써 달성되었다. 이러한 공지된 생합성 경로를 근거로 하여, 일련의 생화학적 연구 및 후속 분자의 유전자 분석 결과, LR33 종자내 결함은 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 활성의 변화로서 확인되었고, 이는 미오-이노시톨-1-인산염의 합성능의 감소를 나타내게 된다.
라피노스 및 스타키오스의 생합성은 데이. 피. 엠(Dey, P. M.)의 문헌[Biochemistry of Storage Carbohydrate in Green Plants (1985)]에 잘 특성화되어 있다. 미오-이노시톨 헥사인산염 또는 파이트산 및 라피노스 사카라이드는 이들의 합성에서 공동 중간체로서 미오-이노시톨을 공유한다(이쉬타니, 엠(Ishitani,M) 등의 문헌[Plants Joumal(1996)9:537-548]. 글루코스를 탄소 공급원으로 출발하여 성숙하고 있는 대두 종자내 파이트산, 라피노스 및 스타키오스의 합성을 설명하는 경로를 도 1에 나타낸다.
도 1에 나타난 상호 전환 반응에 의해서 글루코스 또는 슈크로스 중 하나가 파이트산의 폴리올 부분, 라피노스 및 스타키오스를 제조하는 모든 헥소스, 및 라피노스 신타제 및 스타키오스 신타제에 대한 갈락토시다제 제공자의 재순환 부분, 미오-이노시톨을 위한 출발 물질일 수 있다. 성숙, 야생형 대두 종자내 축적되는 이러한 상호 전환의 최종 생성물은 질량 순으로 슈크로스, 스타키오스, 파이트산 및 라피노스이다.
라피노스 사카라이드 생합성에 사용된 반응은 UDP-갈락토시다제 및 미오-이노시톨로부터 갈락티놀 (0-α-D-갈락토피라노실-(1→1)-미오-이노시톨) 합성을 포함한다. 이러한 반응을 촉매하는 효소는 갈락티놀 신타제이다. 슈크로스로부터 라피노스 및 라피노스 사카라이드류 중 고급 동족체의 합성은 갈락토실트랜스퍼라제 라피노스 신타제 및 스타키오스 신타제에 의해서 촉매된다.
이러한 최종 생성물의 비율에 대한 조절은 도 1의 많은 효소 촉매 단계에서 전환 속도를 변화시켜 영향을 줄 수 있다. 이러한 조절은 효소 발현 수준을 변화시키거나 효소의 고유 활성을 변화시킴으로서 영향을 줄 수 있다. 이 때, 변형된 경로로부터 생성되는 최종 생성물의 혼합물은, 정상적인 중간체의 얼마간 축적을 포함하는 신규 생성물의 혼합물 뿐 아니라 본래 최종 생성물을 새로운 비율로 포함할 수 있다. 이 혼합물 및 조성물은 활성이 변화된 효소 및 변화 정도에 따라서 다를 것이다.
6 종 효소, 즉, 미오-이노시톨-1-인산염 신타제, 미오-이노시톨-1-포스파타제, UDP-글루코스 4' 에피머라제, 갈락티놀 신타제, 라피노스 신타제 및 스타키오스 신타제는 슈크로스 함량의 감소없이 라피노스 또는 스타키오스 합성 중 하나를 감소시키는 활성을 저하시킬 수 있다. 이들 6 종 중, 라피노스 및 스타키오스 합성에 특이적인 3 개의 효소는 파이트산 함량의 감소없이 활성을 저하시킬 수 있다. 단지 미오-이노시톨-1-인산염 신타제만이 3 개 모든 최종 생성물의 합성에 관련되는 것으로 보이고, 따라서, 그의 활성이 감소될 경우, 3 개 모든 최종 생성물의 양을 동시에 변화할 수 있다.
본 발명은 대두 종자 세포내 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 활성을 감소시킴으로써 대두 종자내 라피노스 사카라이드 및 파이트산 함량을 감소시키는 동시에 슈크로스 및 무기 인산염 함량을 증가시키는 능력을 교시하고 있다. 본 실시예는 세포내 효소 활성을 저하시키는 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열내 점(point) 변이가 아미노산 치환을 일으키는 효소 변이형의 세대 및 형태의 발견을 서술하고 있다. 미오-이노시톨-1-인산염 신타제에 대한 코딩 부위내 다른 변이는 효소적 활성에 감소를 일으킴으로써 본 발명의 종자 표현형을 생성한다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있는 것이다. 널리 공지된 이종 유전자 발현 및 시험관내 변이 생성 기술, 및 본 명세서에 기재된 다양한 효소 분석을 사용하여, 당업자는 불필요한 실험없이 효소 활성을 감소시키는 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 코딩 부위를 찾아낼 수 있었다. 그 후, 이러한 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 유전자를 대두 게놈내로 도입하여(미국 특허 제5,501,967호) 본 표현형을 나타내는 신규 대두 변종을 생성할 수 있었다.
별법으로, 안티센스 억제 기술(미국 특허 제5,107,065) 및 공동억제(미국 특허 제5,231,020호)와 같은 유전자 사일런싱 기술을 사용하여 대두 종자 세포내 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 활성을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에는 야생형 대두 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 효소를 코딩하는 서열을 교시하고 있다. 당업자는 대두 종자내 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 활성을 감소시키는 야생형의 서열, 또는 실질적으로 유사한 서열 모두 또는 일부를 포함하는 키메라 유전자의 제조 방법 및 이용 방법을 쉽게 이해할 것이다.
따라서, 본 발명은 대두 종자의 라피노스 사카라이드, 슈크로스, 파이트산 및 무기 인산염 함량을 변화시키는 대두 효소의 확인, 특성화 및 제조에 관한 것이고, 이는 가치있고 유용한 대두 생성물을 생성하게 한다. 본 명세서에서 교시하는 바와 같이, 임의의 몇몇 수단에 의한 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 효소 활성은 대두 종자로 하여금 본 발명의 표현형을 나타내게 한다.
추가로, 본 발명은 하기 실시예로 정의되며, 여기서 모든 부 및 백분율은 달리 언급이 없는 한 중량이고, 도는 섭씨이다. 본 발명의 바람직한 실시태양을 나타내는 이러한 실시예는 단시 예시를 위한 것임을 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터 당업자는 본 발명의 목적 및 범위에서 벗어나지 않고, 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 다양한 용도 및 조건에 적용시킬 수 있다. 또한, 기탁된 물질은 수많은 실시태양으로부터 유도될 수 있는 물질을 예시하기 위한 것이므로, 기탁된 생물학적 물질에 의해서 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다. 이러한 모든 변형은 첨부된 청구항의 범위내에 속하는 것이다. 세균의 형질변환, 핵산의 아가로스겔 전기영동 및 단백질의 폴리아크릴아미드 전기영동과 같은 통상적인 분자 생물학 기술은 이들을 설명하는 통상적인 용어를 사용한다. 당업자에게 널리 공지된 이러한 기술의 세부적인 방법은 삼브룩(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 상세히 기재되어 있다. 실험 제조에 사용되는 다양한 용액은 "SSC", "SSPE", "덴하르트(Denhardt) 용액" 등의 통상명으로 불린다. 이들 용액의 조성물은 삼브룩의 문헌 부록 B를 참고하면 알 수 있다.
＜실시예 1＞
＜개선된 탄수화물 조성을 부여하는 대두 유전자의 발견＞
＜라피노스 사카라이드 함량 분석＞
하기 분석을 사용하여 라피노스 사카라이드 함량에 대하여 대두 종자를 분석하였다. 라피노스 사카라이드 함량 결정을 위한 각 분석 측정에 앞서, 종자를 1 주 이상 동안 약 8%의 수분 함량으로 공기 건조시킨 후, 약 40 내지 50 ℃, 40% 상태 습도에서 저장하였다. 발명자들이 많은 이러한 공기-건조시킨 시료를 측정한 결과, 이러한 조건에서 저장시 수분 함량은 8%에서 크게 변화하지 않았다(7 내지 1O%).
각 개별적 라피노스 사카라이드 분석에 대하여 전형적으로는, 일정 식물로부터 5 내지 10 종의 대두를 100 메쉬 스크린을 장치한 시클로테크(Cyclotech) 1093 시료 밀(Mill) (Tecator, Box 70 S-26301, Hoganas, Sweden)에서 갈아서 종자 분말을 얻은 후 분석하였다. 대부분의 경우에, 라피노스 사카라이드 함량은 약 8%의 "특질(as is)" 수분 함량을 함유하는 종자 또는 유도 생성물에 대하여 측정하였다. 이 경우, 측정값을 0.92로 나눔으로써 "특질"값을 건조물 기재(db)로 전환시켰다. 특정 계통 또는 특정 대두 단백질 생성물 간의 비교를 위하여, 분석 전에 시료가 일정 중량 (O% 수분)에 달할 때까지 분쇄된 종자 분말을 45 ℃의 강압 공기 오픈 중에 넣었다. 따라서, 본 명세서에 보고된 모든 라피노스 사카라이드 측정값은 달리 특별한 것이 없는 한, 통상적인 건물을 기준으로 한 것이다.
하기 기재한 바와 같이, 3 개 분석 ("효소", "TLC" 및 "HPLC")를 사용하여 대두 종자의 라피노스 사카라이드 함량을 결정하였다. 3 개 모두는 상기 분쇄 공정으로부터 유도된 종자 분말 상에서 수행하였다. 분석을 위한 제제로는 각 종자 시료를 분쇄한 후, 약 30 mg의 생성 분말을 칭량하여 13 x 100 mm 스크류 캡 튜브 중에 넣고, 1.6 mL의 클로로포름 및 1.4 mL의 메탄올:물 (4:3, v/v)을 가하였다. 각 시료의 정확한 분말 중량을 기록하고, 이는 시료 대 시료 중량 편차에 대한 하기 분석 결과를 조정하는데 사용하였다. 그 후, 튜브를 캡핑하여 랙에 놓고, 회전식 진탕기 상에서 실온, 1800 rpm에서 60 분 동안 흔들었다. 추출 후, 튜브의 내용물을 15 분 동안 안정시켰다. 안정시킨 후, 15 μL 분액의 메탄올:물의 상태를 96 웰 마이크로티터의 웰에 넣고, 45℃에서 20 분 동안 건조시켰다. 분석 조건을 변형시켜, 상기 기재한 α-갈락토시다제 및 갈락토시다제 탈수소효소를 사용하는 커플링된 "효소" 분석을 위한 반응 용기로서 건조 웰을 사용하였다(문헌[Schiweck and Busching, (1969) Zucker 22:377-384; Schiweck and Busching, (1975) Zucicer 28:242-243; Raffinose Detection-Kit, Boeinger Mannheim GMBH. Catalog Number 428 67]. 분석의 변형은 분석물에 소혈청 알부민(15 mg/mL) 및 α-갈락토시다제 완충액을 가하고, 온도를 증가시키고, 실온 내지 45 도씨에서 30 분 동안 α-갈락토시다제 인큐베이션시키며, 갈락토시다제 탈수소효소 인큐베이션 시간을 20 분 내지 60 분 증가시키면서, α-갈락토시드 표준물에 대하여 라피노스 대신에 스타키오스를 사용하였다. 인큐베이션 후, 340 nm에서 시료의 흡광도를 BIO-TEK(상표명) Model EL340 마이크로플레이트 리더상에서 측정하였다. 시료내 존재하는 갈락토시드의 양은 스타키오스 표준물의 공지된 비교하여 결정하였다. 수천 시료의 분석을 용이하게 하기 위해서, 효소 분석을 1 회 반복하였다. 1차 분석에서 라피노스 사카라이드 함량이 낮은 것으로 나타난 계통은 계속해서 재료를 충분히 이용할 수 있다면, 분쇄된 종자로부터 시작하여 삼중으로 재분석하였다. 2차 분석에서 확인된 조성의 계통을 필드(field) 조건하에 재배하여 필드 성장 식물로부터의 종자를 다시 분석하였다. 라피노스 사카라이드 및 갈락티놀 프로파일에 대한 보다 특별한 정보가 요구되는 경우, 효소 분석에 의해서 확인된 저함량 라피노스 사카라이드 계통을 HPLC 분석을 사용하여 재분석하였다(하기 기재).
저함량 라피노스 사카라이드 생식세포질의 신속한 선택을 용이하게 하기 위해서, 박막 크로마토그래피 "TLC" 분석을 전개하였다. 이 분석에 대하여, 약 60 mg의 분쇄된 종자 분말을 스크류 캡 튜브 중에 넣고, 1 mL의 메탄올:물(4:3, v/v) 및 1 mL의 클로로포름을 가하였다. 튜브를 캡핑하여 랙에 놓고, 회전식 진탕기 상에서 실온, 25 rpm에서 60 분 동안 흔들었다. 추출 후, 튜브를 2100 rpm에서 5 분 동안 원심분리시켰다. 메탄올:물층으로부터 4 μL 시료를 취하여 250 mm 분석 층을 갖는 20 x 20 cm 베이커('Baker') 실리카 겔 예비흡수/채널 TLC 플레이트 위에 놓았다. 시료를 실온에서 건조시키고, 플레이트를 3:4:4 (v/v/v) 에틸 아세테이트:이소프로판올:20%의 아세트산의 용액 (수중)을 갖는 TLC 탱크에 넣었다. 분석 채널 10 cm가 잠기도록 용액을 넣고, 이 때 플레이트를 제거하여 훈증 후드내에서 공기 건조시켰다. 그 후, 플레이트를 아닐린-디페닐아민 시약으로 분무시켜 시료내 탄수화물을 확인하였다. 이 시약은 1 ml의 아닐린을 100 ml의 아세톤, 1 g의 디페닐아민 및 10 ml의 인산과 혼합함으로써 제조되었다. 그 후, 플레이트를 100 ℃의 오븐에 15 분 동안 두어 건조시키고 분석 채널을 읽기 전에 냉각시켰다. 대두 시료내 스타키오스 및 라피노스 함량을 순수 표준물에서 보여주는 용출 패턴과 비교하여 평가하였다.
본 명세서에서 "HPLC" 분석이라고 부르는 고성능 음이온 교환 크로마토그래피/박동 암페어 측정 분석을 사용하여 개개의 라피노스 사카라이드 (예를 들어, 스타키오스 및 라피노스), 갈락티놀의 함량을 측정하고, 효소 또는 TLC 분석의 결과를 확인하였다. 종자의 분쇄 및 추출 조건은 상기 "효소" 분석에서 사용된 조건과 동일하였다. 수성상 750 μL 분액을 옮겨 80 ℃의 감압하에서 건조시켰다. 건조시킨 물질을 2 mL의 물 중에 용해시키고, 30 초 동안 격력하게 혼합하였다. 100 μL의 분액을 제거하고, 물 1 mL로 희석시켰다. 상기 시료를 다시 잘 혼합하고 10,000 x g에서 3 분 동안 원심분리시켰다. 원심 분리 후, 실온, 1.3 mL/분으로 150 mM의 NAO를 사용하는 디오넥스(Dionex)(상표명) PA1 칼럼상에서 20 μL의 시료를 분석하였다. E1 = 0.05v, E2 = 0.60v 및 E3 = -0.60v 및 3 mA의 출력 범위의 디오넥스(상표명) 검출기를 사용하였다. 갈락티놀, 글루코스, 프럭토즈, 슈크로스, 라피노스, 스타키오스 및 베르바스코스를 크로마토그래피 조건하에서 잘 분리하였다. 시료의 탄수화물 함량을 인증된 표준물과 비교하여 결정하였다.
탄수화물 분석으로부터 얻어진 결과를 소프트웨어 수퍼아노바(SuperANOVA)를 사용하는 변이 분석에 적용하였다(문헌[Abacus Concepts, Inc., 1984 Bonita Avenue, Berkeley, CA 94704]). 적합하다면, 피셔(Fisher)의 보호된 LSD를 평균 비교를 위하여 포스트-혹(post-hoc) 시험으로서 사용하였다. 다른 비교에서, 그들의 표준 에러(SEM)에 의해서 정의된 범위가 겹치지 않는다면, 평균은 전략적으로 매우 중요하였다. 라피노스 사카라이드의 평균을 대조 계통의 평균과 비교시, 상기 평균이 3개 이상이 대조 평균의 표준 편차 미만이라면, 평균은 대조 평균보다 덜 중요하게 생각하였다.
＜변이 생성 및 변이 선택＞
LR13 (윌리암(Williams) 82와 완전히 동일한 계통) 약 130,000 종자 (22.7 kg를 8 시간 동안 계속 통기시키면서 수돗물 150 L 중에 담갔다. 담금 용기의 바닥에 놓인 표준 수조 "에어스톤(airstones)"을 통하여 공기를 펌핑시켜 통기시켰다. 흡수된 종자을 유출시키고, 계속적으로 통기시키면서 pH 5.5, 0.1 M 인산염 완충액으로 완충된 98 L의 2.5 mM N-니트로소-N-메틸우레아 (NMU) 용액으로 이동시켰다. 종자를 3 시간 동안 NMU 용액 중에 넣어 둔 후, 남아 있는 NMU를 여과 제거하기 위해서 일련의 린스를 처리하였다. 제1 린스 동안, 처리된 종자를 1 분 동안 수돗물 45 L 중으로 이동시켰다. 제2 린스 동안, 종자를 계속적인 통기하에 1 시간 동안 신선한 수돗물 45 L 중으로 이동시켰다. 제3 린스 동안, 종자를 계속적인 통기하에 2 시간 동안 신선한 수돗물 45 L 중으로 이동시켰다. 제4 린스 동안, 종자를 계속적인 통기하에 신선한 수돗물 45 L 중으로 이동시켰다. 종자들 중 반이 2 시간 후에 제4 린스로부터 옮기고(소집락 1), 다른 반의 종자는 5 시간 후에 제4 린스로부터 옮겼다(소집락 2). 제4 린스로부터 옮긴 후, 종자의 외측 물을 없애고, 카드보드판 위에 펼쳐 놓고, 1 시간 동안 햇볕 아래서 건조시켰다. 그 후, 흡수된 M1 종자를 깊이 2.5 cm, 열 범위내 피트 당 약 14 개 종자의 밀도로, 46 cm의 줄간격으로 필드에 심었다(문헌[Isabela, Puerto Rico, USA]).
2 개 풀(소집락 1 및 2)의 M2 종자을 M1 식물로부터 대량 수확하였다. 소집락 1로부터 약 40,000 M2 종자 및 소집락 2로부터 52,000 M2 종자를 미국 포에르토리코 이사벨라에 심었다. 각 소집락내 각 3,000 M2 식물로부터 5 개 포드(pod)를 수확하고, 벌크 M3 종자 집락을 얻었다. 벌크 M3을 미국 포에르토리코 이사벨라에 심었다. 성숙기에 5000 M3 식물로부터의 종자를 각각 수확하여 각 소집락으로부터 5000 M 3:4 계통을 얻었다.
1991년 겨울 동안 총 8,000 이상의 M3:4 계통을 스크리닝하고, 상기 서술한 효소 방법을 사용하여 라피노스 사카라이드 함량을 측정하기 위하여 스크리닝하였다. 초기 스크리닝에서, 총 라피노스 사카라이드 함량이 감소된 2 개 계통은 제2의 자가수분 세대에서 유전성을 갖는 것으로 확인되었다. LR33로 명명된 이들 계통 중 하나는 동일한 환경에서 대조로서 재배한 우량 대두 교배종과 비교시에 스타키오스 및 라피노스 둘 모두의 함량이 감소되었다. 동일한 환경에서 재배한 3 종의 우량 교배종의 평균값을 비교할 때, LR33의 스타키오스 함량은 통계상 매우 낮았다. 3 세대 동안 LR33으로부터 유도된 자가수분 계통으로부터 수확된 벌크 종자의 가용성 탄수화물 함량을 표 1에 나타내었다.
＜LR33 계통을 자가수분하여 유도된 대두 계통의 성숙한 종자에 있어서 가용성 탄수화물＞
후속 계통 (1ST-83, 2ST-88 및 3ST- 101)은 LR33의 모두 자가 수분에 의해서 유도되었다. 이들 각 계통은 대조 계통 보다 더 낮은 스타키오스 함량을 가졌다.
＜실시예 2＞
＜저함량 라피노스 사카라이드 표현형을 나타내는 생리학적 결함의 확인＞
＜저함량 라피노스 사카라이드 양친으로서 LR33를 사용하는 유전적 교배＞
대두 종자의 총 라피노스 사카라이드 함량을 더 감소시키기 위한 연구로, LP33 및 LP28 간의 유전적 교배를 수행하였다. 계통 LR28은 국제 특허 공보 W093/07742에 기재되어 있다. 간단히, 이는 실시예 1에서 서술한 것과 유사한 스크리닝 과정에서 발견된 낮은 총함량의 라피노스 및 스타키오스 계통이었다. 저함량 라피노스 및 스타키오스 함량은 1 세대 내지 다음 세대까지 일정하였다. 또한, 계통 LR28 및 다른 양친에 교배하여 유도된 계통의 성숙 종자의 갈락티놀 함량은 야생형 대두 종자에 비하여 크게 증가하였다. LR33 및 LR28 교배로부터의 F1 식물을 재배하여 자가수분시켜 분리성(segregating) F2 자손을 생성하였다. LR28-유도 계통, 우량 교배종 및 LR28 및 LR33의 교배로부터 생성되는 분리성 집락의 종자를 동일한 환경에서 파종하였다. F2:3 종자를 각 F2 식물로부터 수확한 후, 상기 서술한 효소 분석을 사용하여 α-갈락토시드 함량에 대하여 스크리닝하였다. HPLC 분석에 앞서 예비 스크린으로부터 저함량 α-갈락토시드 선별을 수행하여 완전한 라피노스 사카라이드 프로파일을 얻었다. 저함량의 총 α-갈락토시드 함량에 대하여 선택된 전형적인 계통으로부터의 탄수화물 프로파일을 표 2에 나타내었다.
＜LR33 및 LR28 계통의 교배 및 우량 교배종후속 역교배로부터 유도된 대두 계통의 성숙한 종자에 있어서 가용성 탄수화물(LR33 및 5ST-1003(LR28 유도 계통)은 교배 양친의 예로서 포함됨; 우량 교배종 대조 2242)＞
5ST-1441, 5ST-1434 및 5ST-1309는 모두 LR33과 LR28 교배로부터 유도되었다. 계통 5ST-1441는 LR33 양친과 거의 유사한 반면, 놀랍게도 계통 5ST-1434 및 5ST-1309은 양친 계통 중 어느 하나보다 라피노스 및 스타키오스 모두에 있어서 매우 낮았고, 계통 LR28의 고함량의 갈락티놀 특성을 갖지 않았다.
＜라피노스 사카라이드 경로에 있어서 효소 활성의 시험관내 분석＞
LR33과 LR28 교배에 의해서 유도된 몇몇 계통에서 관찰된 예상외의 라피노스, 스타키오스 및 갈락티놀 표현형을 찾기 위한 연구에서, 빠른 라피노스 사카라이드 생합성의 기간 동안 효소 활성 및 대사물질 풀은 생리학적 성숙 단계 바로 전에 막 수확된 대두 종자에서 측정하였다. 이제 막 황색이 되기 시작한 포드로부터 종자를 옮겼다. 또한, 라피노스 사카라이드 생합성에서의 마지막 3 종 효소의 분석을 위하여, 녹색을 잃어가거나 이제 막 황색이 되어가고 있는 그러한 포드로부터 종자를 선택하였다(도 1 참조).
종자는 포드를 제거하고, 새로운 중량을 얻기 위해 칭량 후, 모르타르(mortar) 및 막자사발 내에서 분쇄하고, 2-메르캅토에탄올 중의 5 mM인 HEPES-NAOH 10 부피, pH 7 완충액 중에서 분쇄하였다. 분쇄된 시료를 10,000 x g에서 1O 분 동안 원심분리하고, 분쇄 완충액 중에서 평형화시킨 세파덱스(Sephadex) G-25을 통과시켜 상징액을 탈염시켰다.
갈락티놀 신타제의 분석을 위하여, 1O μL의 탈염 추출물을 20 mM 미오-이노시톨, 1O mM 디티오트레이톨, 1 mM MnCl2 및 1 mM UDP-[14C]갈락토시다제 (1.25 μCi μmol-1)인 pH 7 HEPES 완충액 90 μL에 가하였다. 분석 혼합물을 25 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션한 후, 400 μL의 에탄올을 가하여 중지시켰다. 중지된 반응에 도웩스(Dowex) AG-1x8 음이온 교환 수지(BioRAD) 200 μL를 가하고, 혼합물을 25 분 동안 흔들었다. 상기 수지는 원심분리에 의해서 제거하고, 상징액은 신틸레이션 계수 측정을 위하여 취하였다. 비-음이온성 방사활성은 갈락티놀 합성의 측정으로서 얻었다.
라피노스 신타제 및 스타키오스 신타제의 분석을 위하여, 50 μL의 탈염 추출물을 pH 7, 50 μL의 25 mM HEPES 완충액에 가하고, 라피노스 신타제 분석을 위하여 10 mM 디티오트레이톨, 1O mM 갈락티놀 및 40 mM 슈크로스에, 또는 타키오즈 신타제 분석을 위하여 40 mM 라피노스에 이를 가하였다. 25 ℃에서 1 시간 인큐베이션 후, 400 μL의 에탄올을 가하여 중지시키고, 단백질을 침전시키기 위해서 끓는 수욕 중에 1 분 동안 두었다. 반응 혼합물을 원심분리하여 맑게 만들고, 상징액은 0.22 미크론 필터를 통과시키고, 진공하에 건조시켰다. 잔사를 0.5 mL의 물에 용해시키고, 라피노스 및 스타키오스의 정량을 위하여 20 μL을 상기 언급한 도웩스(Dowex) HPLC 시스템상에서 분리하였다. 1994년 8월, 필드 재배 식물로부터 수확인 종자를 사용하여 수행한 실험 결과를 표 3에 나타내었다.
＜대두 계통의 황색화 종자에서 갈락티놀 신타제, 라피노스 신타제 및 스타키오스 신타제의 활성(야생형 대조는 계통1923임. 효소 활성은 분석 조건하에서 시간 당, 신선한 종자 그람 당 생성된 μmole의 생성물로서 나타냄; 값은 평균 ± 5 회 반복 실험에 대한 표준 편차임)＞
라피노스 및 스타키오스 합성에 기여된 3 종의 효소 중에서 야생형과 비교하여 단지 라피노스 신타제만이 저함량 라피노스 사카라이드 변이 계통에서 뚜렷한 활성 감소를 나타내었다. 라피노스 신타제 활성 감소를 유발하는 변이는 생합성 경로에서 효소 위치와 일치하였고, 갈락티놀 축적은 저함량 라피노스 사카라이드 표현형의 공급원으로서 단지 LR28를 갖는 계통에서만 관찰되었다. 갈락티놀 및 슈크로스는 라피노스 신타제를 위한 2 종의 기질이고, 이 두 대사 물질은 LR28 포함 계통에서 축적된다(도 1 및 표 2에 참조).
LR33 계통을 LR28 계통과 교배시, 저함량의 스타키오스, 라피노스 및 갈락티놀에도 불구하고, LR28 변이에 의해서 부여된 라피노스 신타제 활성 감소가 유일하게 변화된 활성이었다. LR28과 조합시 갈락티놀 함량의 적당한 감소를 부여하는 LR33 계통 손상에 대하여 갈락티놀 신타제 활성 감소가 주요한 후보 요소라고 생각되고, 측정된 이러한 효소의 시험관내 활성 감소는 없었다.
＜성숙기 대두 종자의 유리 미오-이노시톨 함량 분석＞
LR28 교배에 의한 LR-33에서 시험관내 갈락티놀 신타제의 감소가 없을 때, LR33 유도 계통의 성숙기 종자에 있어서 갈락티놀 신타제의 생체내 활성 가능성은 검사된 기질 중 하나의 이용성에 의해서 제한된다. 갈락티놀 신타제에 대한 UDP-갈락토시다제의 공급은 UDP-글루코스 4 에피머라제의 변이에 의해서 감소될 수 있고, 미오-이노시톨의 공급은 그의 신타제 또는 유리 이노시톨형을 생성하는 특이 포스파타제 중 하나에 작용하는 변이에 의해서 제한될 수 있다(도 1). 미오-이노시톨 풀은 야생형 및 LR33 유도 종자에서 총 유리 미오-이노시톨 함량에 대한 분석에 의해서 검사하였다. 이제 막 황색이 되기 시작하고, 밝은 녹색에서 황색으로 변하고 있는 포드로부터 취해진 종자로써 3 종의 대두 계통, 야생형 교배종 A2872 및 2 종의 LR33xLR28-유도 계통. 5ST-1434 및 5ST-1309를 30 ℃/22 ℃의 낮/밤 성장 온도 규정에서 16 일 동안 재배하였다. 각 계통으로부의 3 개 종자를 8 ml의 80% 메탄올 중에서 분쇄하였다. 혼합물을 12,000 x g에서 15 분 동안 원심분리하고, 상징액을 50 mL 플라스크에 기울여 따라내었다. 2 회 반복 추출하고, 상징액을 합하였다. 합한 상징액을 40 ℃의 진공하에서 건조 감소시키고, 잔사를 1 mL의 물에 재용해시켰다. 3 mL의 혼합 고정 이온 교환 수지(BloRad AG501x8)를 통과시킴으로써 재용해된 추출물을 탈이온화시키고, 4 mL의 물을 다시 건조시켰다. 잔사를 500 μL의 물 및 70 μL 분액에 재용해시키고, 70% 아세토니트릴로 1 mL/분 용출시키는 조르박스 아미노 칼럼(Zorbax Amino column) (DuPont)상의 HPLC에 의해서 분리하였다. 칼럼내 슈가는 시차 굴절 지수에 의해서 검출되었다. 슈크로스 및 미오-이노시톨의 표준 혼합물의 분리는, 후에 이노시톨이 나타나고, 단지 부분적으로 슈크로스로부터 분리되었음을 나타내었다. 종자 추출물 분석을 위하여 1 mL의 용출액 후, 실시에 1에 기재된 디오넥스 PAD 시스템에서 재주입 동안 슈크로스 피크를 잡았다. 디오넥스 시스템에서, 미오-이노시톨은 슈크로스 전에 잘 나타났고, 조르박스 아미노 칼럼 분획을 오염시키는 슈크로스로부터 깨끗하게 분리시킬 수 있었다. 미오-이노시톨의 외부 표준물과 비교하여, 야생형 2872 계통 5 μL 주입물은 3.2 mmole의 미오-이노시톨을 포함하였고, 5ST-1434 및 5ST-1309 5 μL 주입물은 각각 0.39 및 0.23 mmoles를 포함하였다.
야생형 및 LR33 유도 종자의 유리 미오-이노시톨 함량의 차이를 보다 특성화하기 위하여 제2 실험을 수행하였다. 제2 대조 계통(2242) 및 LR33 유도 계통 5ST-1434로부터 7 개 단일 종자를 상기 성숙 기준에 따라서 수확하였다. 종자를 각각 칭량하고 미세연결(microfuge) 튜브 1.5 mL 중에 넣고, 스파튤라로 분쇄하여 드라이아이스상에서 동결시키고, 동결 건조하였다. 건조 잔사를 칭량하고, 조르박스 아미노 칼럼상의 미오-이노시톨 보유 마커로서 작용시키기 위해서 1 μmole의 트레할로스가 함유된 1 mL of 80% 메탄올을 가하였다. 추출 매질을 60 ℃에서 1 시간 동안 가열시키고, 미세연결 튜브내에서 작은 막자사발로 다시 분쇄하고, 원심분리하여 불용성 물질을 펠렛화하였다. 상징액을 100 μL의 혼합 고정 수지를 함유하는 제2 미세연결 튜브로 옮기고, 상기 혼합물을 잠깐 흔들고 수지 위의 용액 20 μL를 제거하고, 진공하에 건조시켰다. 잔사를 11O μL의 총부피로 재용해시키고, 55 μL는 상기 기재한 바와 같은 조르박스 아미노 칼럼상에 주입시켰다. 트레할로스 피크를 잡고, 20 μL의 칼럼 분획을 디오넥스 시스템상에 재주입하였다. 트레할로스 내부 표준물과 비교하여 미오-이노시톨 피크를 정량하였다. 야생형 미오-이노시톨 함량에 대한 평균-표준 편차는 2.18 ± 0.98 μmole/건조중량 g인 반면, 5ST-1434 종자는 0.77 ± 0.32 μmole/건조중량 g이었다. 양 실험 결과, LR33 변이를 나타내는 종자는 신속한 라피노스 사카라이드 합성 기간 동안 미오-이노시톨을 덜 함유한다는 것을 나타내었다. 미오-이노시톨 풀이 전혀 부재한 실험은 없었다. 이러한 실험은 단지, 총 대사 물질 풀을 측정할 수 있지만, 미오-이노시톨은 갈락티놀 신타제에 의하여 그의 사용을 추가 제한할 수 있는 다른 인자를 갖는다(도 1).
＜라피노스 사카라이드의 생체내 라벨링에 있어서 미오-이노시톨 살포 효과＞
LR33 유도 종자의 유리 미오-이노시톨 함량의 감소가 관찰되는지 여부를 확실히 하는 것은 성숙기에 라피노스 사카라이드 함량 감소가 주요인이 될 것이고, 조직 슬라이스 공급 연구을 수행하였다. 야생형 계통 2242 및 LR33-유도 계통 5ST-1434의 각 4 개 종자는 상기 기술된 각 성숙 기준에 의해서 수확하였다. 종자 껍질을 제거하고, 떡잎을 pH 5.5의 5 mM 칼륨 인산염 완충액으로 린스하고, 약 1 mm 슬라이스로 얇게 썰어서 완충액으로 다시 린스하였다. 조직 슬라이스를 2 개의 군으로 나누었다. 하나의 군은 칼륨 인산염 완충액 중에 침지시키고, 제2군은 50 mM 미오-이노시톨 함유 칼륨 인산염 완충액 중에 침지시켰다. 조직 슬라이스를 진공 침윤시키고, 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.
예비 인큐베이션 시간 후, 5 μCi의 14C-글루코스를 각 군에 가하고, 상기 조직을 다시 진공 침윤시켰다. 라벨된 글루코스 첨가 후, 각 군으로부터 10 개의 조직 슬라이스를 2 시간 및 8 시간에 취하였다. 조직 슬라이스를 타르칠(tar)한 1.5 mL 미세연결 튜브에 넣고, 새롭게 칭량하고 300 μL의 80% 메탄올로 분쇄하였다. 튜브를 원심분리하고, 상징액을 제2 튜브로 옮기고, 2 회 반복 추출하고, 상징액을 합하였다. 합한 상징액을 건조 감소시키고, 50 % 아세토니트릴 중에 재용해시키고, 조르박스 아미노 칼럼 HPLC 시스템에 의해서 분리하였다. 글루코스, 슈크로스, 라피노스 및 갈락티놀을 포함하는 크로마토그램 부위를 통하여 15 초 간격으로, 또한 스타키오스 함유 부위를 통하여 1 분 간격으로 신틸레이션 계수용 분획들을 취하였다. 슈가 표준 피크에 상응하는 방사활성 분획을 분석용으로 그룹화하였다. 상기 결과를 표 4에, 4 개의 생성물 슈가 중의 식별용 방사성 동위원소 %로서 나타내었다.
＜미오-이노시톨과 함께 예비 인큐베이션 한 것과 하지 않은 대조 및 LR 33 유도 계통에 대하여 합한 슈가내 라벨 %로서 표현된 식별용 방사성 동위원소＞
야생형 및 5ST-1434 조직 슬라이스 모두를 공급된 14C-글루코스로부터의 라벨을 슈크로스로, 이 후 갈락티놀, 라피노스 및 스타키오스로 전환시켰다. 외생 미오-이노시톨의 부가없이, 야생형 계통(8 시간 후 58.9%)과 비교하여 LR33 변이 (5ST-1434) 함유 계통은 매우 적은 라벨을 라피노스 사카라이드 (8 시간 후 20.5%)로 전환시켰다. 모든 유전형은 공급 라벨을 보다 많이 라피노스 사카라이드 슈가로 전환시켜 외생 미오-이노시톨에 응답하였다. 미오-이노시톨의 부가와 함께 2 개의 유전형은 공급 라벨을 먼저는 갈락티놀, 및 그 후 라피노스 및 스타키오스로 전환시키는 능력이 거의 동일하였다. 전환율은 비융합 대조와 비교하여 야생형 계통에서조차 증가되었다.
갈락티놀 신타제에 대한 미오-이노시톨의 공급이 라피노스 및 스타키오스가 합성될 수 있는 속도를 늘 제한하는 것으로 보인다. LR33 변이의 존재는 이러한 제한을 보다 크게 하였다.
라피노스 신타제내 LR28 변이가 조합된 변이 계통내 이러한 단계를 통한 흐름을 늦추는데 여전히 효과적이라면, 예상되는 바와 같은 갈락티놀내 라벨의 축적은 없다는 점에서 라벨링의 패턴은 놀랍다. 갈락티놀 신타제를 통하여 갈락티놀에로의 흐름을 증가시키는 것으로 예측할 수 있고, 라벨은 라피노스 신타제의 감소된 활성으로 인하여 그곳에 축적되었다. 이러한 축적이 없다면 이러한 계통내 LR28 변이의 존재 또는 효력에 대한 의문을 불러일으킬 것이다.
＜종자 파이트산 및 무기 인산염 농도에 대한 LR33 변이의 영향＞
상기 결과는 LR33 변이가 도 1에서 나타낸 경로에서 유리 미오-이노시톨 전에 존재한다는 것을 나타낸다. 가능한 변이 위치를 보다 제한하기 위해서, 상기 경로의 해당 부분에서 다른 대사물질을 측정하였다.
대두 종자는 성숙기에 파이트산 20 내지 30 μmoles/g 농도를 포함하고, 파이트산내 50 내지 70%의 종자내 총 인산염이 함유되어 있기 때문에(문헌[Raboy et al. (1984) Crops Science 24:431-4341), 미오-이노시톨 합성에 영향을 주는 변이는 종자의 파이트산 및 무기 인산염 농도에도 영향을 주는 것같다. LR33 변이를 포함하는 3 종의 야생형 대두 계통 및 3 종의 계통에서 파이트산 및 무기 인산염의 농도는 상기 레보이의 문헌에 기재된 방법을 변형시켜 건조 종자에서 분석하였다. 각 계통으로부터 약 20 개의 종자를 소형 임팩트 밀에서 분쇄하고, 100 mg의 생성되는 분말을 칭량하여 15 mL 스크류 캡 튜브에 넣었다. 5 mL의 0.4 N HCl를 0.7M Na2SO4와 함께 분말에 가하고, 혼합물을 흔들대 위에서 밤새 흔들었다. 튜브를 3900 x g에서 15 분 동안 원심분리하고, 2 mL의 상징액을 제2의 유리 튜브로 옮겼다. 2 mL의 물 및 1 mL의 15 mM FeCl2를 가하고, 튜브를 수욕 중에서 20 분 동안 가열하였다. 튜브를 상기와 같이 원심분리하여 철:파이트산 착체를 침전시키고, 상징액을 기울여 따라냈다. 펠렛을 2 mL의 0.2 N HCl 중에 재현탁시키고, 끓는 수욕 중에서 10 분 동안 가열시켰다. 침전물을 원심분리에 의해서 다시 옮겨 2 mL의 5 mM EDTA 중에 재현탁시켰다. 파이트산 인산염을 얻기 위해서 15 μL의 EDTA 현탁액을 습윤 재화(ashing)하였다. 15 μL 분액을 포함하는 각 튜브에 가하여 1O μL의 1O% 질산 칼슘 용액을 가하였다. 물을 증발시키고, 재(ash)가 튜브 중에 남아 있을 때까지 잔사를 화염 가열하였다. 재를 0.3 mL의 0.5 N HCl 중에 용해시키고, 90 ℃에서 20 내지 30 분 동안 가열하였다. 산 몰리브데이트 시약(0.86 N 황산 중의 0.36% 암모늄 몰리브데이트 및 1.42% 아스코르브산 0.7 mL)을 가하고, 820 nm에서 읽기 전에 1 시간 동안 색이 나타나게 하였다.
0.3 mL의 0.5 N HCl 및 0.7 mL의 인산염 착색 시약을 초기 5 mL 추출물의 20 또는 40 μL 분액에 가함으로써 무기 인산염을 측정하였다. 칼륨 인산염 표준물을 동시에 전개시켰다. 실험을 3 회 반복하고, 결과를 하기 표에 나타내었다.
＜인산염/g으로서 발현된 무기 인산염 및 파이트산 내 종자 인산염(값은 평균임 ± 2 개 이상의 복제물을 얻었을 때의 표준 편차 또는 2 개 이상의 복제물을 얻었을 때의 평균값)＞
또한, LR33 변이는, 변이가 포함된 유전적 배경에 따라서 약 15 내지 25 배 종자 무기 인산염 함량의 동시 증가와 함께 약 2 배 종자내 파이트산 농도의 감소를 유발하였다(파이트산 분획내 인산염으로 표현됨). 도 1의 경로를 기초로 하여, 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 활성을 감소시키는 변이에 의해서 유리 미오-이노시톨 함량 감소와 함께 파이트산 함량 감소는 가장 잘 유발되었다. 무기 인산염 함량의 증가 요인은 알려져 있지 않지만, 오랫동안 인산염 저장소로서 파이트산의 기능이 종자 및 식물의 다른 부분에 형성되는 것으로 추측되어 왔다. 바람직한 저장대(미오-이노시톨)을 이용할 수 없을 때, 유입 무기 인산염은 다른 주요 경로를 갖지 않고, 단순하게 축적된다.
＜실시예 3＞
＜동형접합 LR33 계통의 종자 표현형의 확인＞
종자 무기 인산염에 대하여 몇몇 추가의 대두 계통을 분석하였다. 분쇄 종자 100 mg을 1 mL의 고온수로 추출하고, 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 상징액을 100 μL의 염화메틸렌으로 추출하여 액체 물질을 제거하고, 남은 수성 추출물을 트리클로로아세트산을 가하여 10%로 제조하였다. 용액을 원심분리하여 단백질을 제거하고, 5 μL의 상징액을 실시예 2에서 기재된 바와 같이 무기 인산염에 대하여 분석하였다. 표 6은 이러한 분석의 결과를 나타낸다.
＜야생형 LR28, LR33 및 LR28xLR33 대두 식물 종자의 무기 인산염 함량 (μmole/g)＞
LR28 변이만을 포함하는 모든 계통은 야생형 대조와 동일한 무기 인산염 농도를 가졌다. 계통 5ST- 1441은 LR33로부터 유도되었고(상기 실시예 2), 본래 변이와 관련된 스타키오스의 적당한 감소율을 나타내었다. 5ST-1441은 단지 약간 증가된 무기 인산염 함량을 가졌다. 양친 중 어느 쪽도 고함량의 무기 인산염을 갖지 않았지만, LR33과 LR28 교배로부터 유도된 모든 계통은 매우 높은 함량의 무기 인산염을 가졌다.
단지 LR33 변이만을 포함하는 계통 5ST-1441의 중간체 무기 인산염 표현형은 예측할 수 없었다. LR28 및 LR33 변이 모두 저함량 파이트산/고함량 무기 인산염 표현형을 생성해야 한다는 것을 지적할 수 있다. 그러나, 사실상 2 종의 변이가 감소될 것으로 보이는 두 활성을 코딩하는 구조적 유전자에 있다면, 이들은 파이트산 합성 변화에 부가적인 영향을 주는 방식으로 대사 경로와 관련되어 있지 않다. 그러나, LR33의 변이가 유리 또는 총 미오-이노시톨 생산에 영향을 준다면, 이는 단독으로 저함량 파이트산 및 생성되는 고함량 무기 인산염 표현형을 책임져야 한다.
또다른 설명은, 계통 5ST-1441가 LR33 변이에 대하여 동형접합체가 아니라는 것과 벌크 종자 분석은 야생형, 동형접합체 변이 및 이종접합 종자에 대한 단지 평균 표현형을 생성한다는 것일 수 있다. 이러한 가능성을 조사하기 위해서, 5ST-1441 종자의 벌크 시료로부터 13 개의 단일 종자를 칭량하여 분쇄하고 고온수로 추출하였다. 단백질은 침전되지 않았고, 무기 인산염은 상기와 같이 측정하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.
＜13 개의 개별적 종자 형태 계통 5ST-1441에 대한 추정 무기산 인산염 함량(μmole/g)＞
문자 d, j 및 l 종자는 분석된 남은 10 개 종자보다 약 3 배 이상의 무기 인산염을 가졌다. 또한, 단일 유전자의 작용으로 인하여 상기 비율은 고함량 무기 인산염의 변이 표현형이 열성인 종자의 분리성 집락으로부터 예상값을 추정하였다. 이러한 가정을 검정하기 위해서, 5ST-1441의 벌크 시료로부터 20 개 종자는 실온에서 6 시간 동안 물에서 흡수시켰다. 과량의 물을 제거하고, 배아 축의 말단을 떼어낸 떡잎 시료를 절단하였다. 조직 슬라이스를 칭량하고, 1.5 mL의 미세연결 튜브 중에 넣고, 충분한 70% 메탄올 중에서 분쇄하여 추출 용량 100 μL당 10 mg의 신선한 물질을 얻었다. 원심분리 후 존재하는 상징액 중의 인산염을 상기 기재된 바와 같이 측정하고, 그 결과를 표 8에 나타내었다.
＜계통 5ST-1441 종자의 분리성 집락으로부터 20 개의 일부 종자의 무기 인산염 함량(μmole/gfwt)＞
종자 4, 7, 11, 16 및 20을 성장 온도에서 화분에 심었다. 종자 7, 11, 16 및 20은 생존하여 실시예 2에서 기재된 조건하에 성장하였다. 성숙 식물로부터의 벌크 종자 및 2 종의 야생형 대조(A2872)를 건조 후 수확하여, 각 식물로부터 20 개의 종자를 실시예 1 및 2에 기재된 방법을 사용하여 가용성 탄수화물 및 파이트산의 분석을 위하여 대량으로 분쇄하였다. 종자내 총 파이트산 함량을 (파이트산 인산염 함량)/6로서 계산하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었다.
＜2 종의 대조 식물과 함께, LR33 변이를 갖고, 부분 종자 분석에서 고함량의 무기산 인산염에 대하여 선택된 분리성 종자 집락으로부터 4 종의 식물에 대한 가용성 탄수화물 함량 및 파이트산 함량 (μmole/g) (파이트산값은 2 개의 복제물의 평균임)＞
종자 번호 7로부터 재배한 식물의 가용성 탄수화물 표현형은 표 1에서 나타난 바와 같이 LR33 변이의 것과 유사하며, 나머지 식물은 보다 저함량의 라피노스 사카라이드를 가졌고, 보다 고함량의 슈크로스를 가졌다. 이들 가용성 탄수화물의 농도는 표 2의 변이 조합 LR28xLR33의 몇몇 식물에서 기인하는 표현형과 매우 유사하였다. 이러한 모순에 대한 가장 개연성있는 설명은 표 1의 데이타를 얻기 위해 분석된 벌크 종자가 변이에 동형접합인 식물보다 오히려 LR33 변이에 대하여 분리성 식물로부터 유도되었다는 것이다. 본 실시예의 식물 11, 16 및 20의 경우와 같이, 변이에 동형접합체인 식물을 선택할 경우, 진정한 동형접합체 종자 표현형이 관찰되었다. 저함량 라피노스, 스타키오스 및 갈락티놀의 조합을 생성하기 위해서 LR28 및 LR33 변이 모두 존재해야 할 필요가 있다는 가정은 옳지 않다. LR33 변이에 동형접합체인 계통은 처음부터 확인된 변이 계통을 자가수분시킴으로써 얻어지지 않았지만, 이 계통을 LR28와 교배함으로써 생성되는 분리체로부터 얻어졌다. 몇몇 교배종의 자손은 변이를 포함할 수도 있지만, LR33 변이로부터의 표현형은 LR28 변이로부터 생성되는 것보다 우세하였다. 이러한 우세종은 주로, LR28 변이로부터 탄소 흐름내 LR33 변이 업스트림의 위치에서 유도되었다(도 1 및 실시예 2참고).
동형접합체 LR33 표현형이 발현되지 않는 이유는 고유 변이 계통과 부딧치는 발아 문제 때문일 수도 있다. 벌크 필드의 분리 조건에서, LR33를 자가수분시킨 파종 종자의 25% 손실 (변이에 대하여 동형접합체일 수 있는 분획)을 놓칠 수도 있었다. 그 후, 벌크 집락으로부터 수확된 식물은 동형접합체에서 삭제되기도 하지만, 변이 유전자는 이형접합 상태로 집락내 유지되곤 하였다. 본 발명자들은 LR33 동형접합체로 하여금 필드 조건에서 발현되도록 하는데 더 기여하는 유전적 배경에 대하여 외교배(out cross)가 동형접합체를 얻게 할 것이라고 추측하였다. 이러한 초기 외교배는 라피노스 사카라이드 생합성 경로에서 또다른 변이를 수행하는 계통을 위한 것이라는 것은 교배 원래 의도에 부수적인 것이었고, 우세한 표현형 또는 개선된 필드 출현 어느 것도 중요하지 않다.
따라서, LR33 변이는 종자 그람 당 5 μmoles 미만의 스타키오스, 종자 그람 당 20 μmoles 미만의 라피노스, 종자 그람 당 200 μmoles 초과의 슈크로스 및 종자 그람 당 10 μmoles 미만의 파이트산 인산염을 갖는 종자를 생성하는 대두 식물을 생산할 수 있다.
＜실시예 4＞
＜LR33 변이 함유 대두 계통의 가용성 탄수화물 및 파이트산 함량＞
저함량 라피노스 사카라이드 계통 LR33 및 LR28를 교배하고, 실시예 1에 기재된 HPLC 분석에 의해서 F2 식물 종자내 저함량의 라피노스, 스타키오스 및 갈락티놀에 대한 분리성 F2 식물을 선별하였다. 이러한 교배종으로부터 유도된 선별 계통을 우량 교배종 양친과 교배하고, 이들 교배종의 자손을 동일한 방법에 의해서 F2 세대에서 선별하였다. 저함량의 라피노스 사카라이드를 함유하는 이러한 계통 중에서, 채소 식물의 농업적 특성을 근거하여 개발을 위한 몇몇을 선택하였다. 그러한 계통 중 4E76로 명명된 것은 후속해서 또다른 우량 대두 교배종과 시험 교배하고, 교배종으로부터 유도된 자가수분된 F1 식물의 단일 종자를 가용성 탄수화물 및 무기 인산염에 대하여 분석하였다. 종자를 매우 낮은 함량의 무기 인산염 및 야생형 라피노스 및 스타키오스 농도를 갖는 클래스 및 고함량의 무기 인산염 및 매우 저함량의 라피노스 및 스타키오스를 갖는 보다 작은 2 개 클래스로 나누었다. 이들 두 클래스의 비율은 열등 LR33 변이의 예측대로 거의 3:1이었다. 본 교배종에 존재하는 라피노스 사카라이드에 영향을 주는 다른 변이인 LR28의 분리에 대한 증거는 없다. 따라서, 계통 4E76는 선별된 우량 교배종 배경의 LR33 변이이다. 상기 계통은 탄수화물 분석에 대하여 선별된 우량 검사 계통과 함께 2 년에 걸쳐서 총 9 가지 환경에서 재배되었다. 3 가지 환경으로부터의 보다 제한된 시료 세트를 파이트산 함량에 대하여 분석하였다. 상기 탄수화물 데이타를 1O에 나타내었고, 파이트산 데이터는 표 11에 나타내었다.
＜LR33-함유 계통 4E76 및 13 종의 우수 재배종 검사물의 스타키오스, 라피노스 및 슈크로스 함량에 대한 평균, 표준 편차(SD) 및 2 개의 표준 편차(2SD)(모든 값은 μmole/g종자 중량으로서 나타냄)＞
＜LR33-함유 계통 4E76 및 우수 재배종 검사물 A2872의 스타키오스, 라피노스 및 슈크로스 함량에 대한 평균, 표준 편차(SD) 및 2 개의 표준 편차(2SD)(모든 값은 μmole/g종자 중량으로서 나타내고, 3 가지 환경으로부터 데이타를 나타냄)＞
시판용 대두의 전형인 우량 대두 교배종과 비교하여, LR33-유도 계통은 종자 중량 g 당 총 라피노스 사카라이드 질량에 있어서 8 내지 9 배 더 낮았다. 파이트산의 질량은 또한 약 40% 감소하였다. 우량 대두 교배종과 비교하여 LR-33-유도 계통은 라피노스 및 스타키오스 질량 모두에 있어서 더 낮았다. 라피노스 함량은 우량 계통에서 나타난 값보다 단지 약간 낮은 반면, 스타키오스 함량은 매우 크게 감소되었다. 대두 곡분을 한 개의 위를 갖는 동물에게 공급시 에너지 사용 효율에 대한 대두 라피노스 사카라이드 함량의 나쁜 효과는 α-갈락토시드 결합의 열등한 분해능으로 인한 것으로 알려져 있다. 따라서, 총 라피노스 및 스타키오스 함량의 감소는 증가된 소화력의 적당한 측정이 된다. 사실상, 이러한 측정은 스타키오스가 슈가 1 몰당 2 몰의 α-갈락토시드 결합을 함유하기 때문에 본 표현형의 효과를 과소 평가할 수 있다. 성숙 대두의 절대적 라피노스 사카라이드 함량은 환경 인자에 따라서 변화하는 것으로 알려져 있다. LR33-유도 계통에 존재하는 변이의 효과는 그러한 계통의 총 라피노스 및 스타키오스 함량이 14.5 μmol/g 중량 미만이 되도록 하기에 충분한 정도이고, 동일한 환경내 야생형 대두의 것보다 훨씬 적게 늘 남아있어야 한다. 또한, 토양내 유용한 인산염 농도의 편차로 인하여 성숙 대두 종자의 파이트산 함량도 환경 인자에 따라서 변화한다고 알려져 있다. 일단 다시, LR33-유도 계통내 존재하는 변이는 모든 성장 환경에 대하여 총 종자 파이트산 함량을 17 μmol/g 미만으로 유지하였다.
＜실시예 5＞
＜LR33 변이의 분자 확인＞
실시예 2에서 제시된 LR33로부터 유도된 계통에서 대사물질을 분석한 결과, LR33 변이가 미오-이노시톨을 생산하는 종자의 능력을 감소시킨다는 것을 강하게 입증하고 있다.
다른 유기체 뿐 아니라 식물에서 미오-이노시톨은 미오-이노시톨-1-인산염 신타제가 촉매하는 반응에서 글루코스-6-인산염이 미오-이노시톨-1-인산염으로 전환으로 시작해서 특이 미오-이노시톨-인산염 포스파타제에 의한 1-인산염의 가수분해로 마치는 경로를 통해서만 생성된다(도 1 참조, 문헌[Loews, F.A. In: Inositol Metabolism in Plants (1990) Wiley-Liss, New York, pp 13-19]). 파이트산은 가능한 전구체로서 미오-이노시톨-1-인산염을 가지며, 파이트산의 수준이 LR33 변이에 의해서 감소되기 때문에, 미오-이노시톨-인산염 신타제의 유전자 및 유전자 생성물은 야생형 및 LR33 변이 식물에서 특성이 관찰되었다.
＜야생형 대두 미오-이노시톨-1-인산염 신타제의 cDNA 클로닝＞
cDNA 라이브러리를 다음과 같이 제작하였다. 대두 배아(각각 약 50 mg 신선한 중량)를 포드(pod)로부터 제거하여 액체 질소로 동결시켰다. 액체 질소 존재하에서 동결된 배아를 미세한 곡분로 분쇄하여 폴리트론 균질화(Polytron homogenization)으로 추출하여 분획화하여 치르그윈(Chirgwin) 등의 방법[(1979) 생화학 18:5294-5299]으로 총 RNA를 부화시켰다.
굿만(Goodman) 등[(1979) Meth. Enzymol. 68:75-90]이 기술한 대로 총 RNA를 올리고-dT 셀룰로스 칼럼을 통과시키고 염으로 폴리A+ RNA를 배출시켜 핵산 분획을 폴리A+ RNA로 부화시켰다. cDNA 합성 시스템(Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD) 및 제조자 교시를 이용하여 정제된 폴리A+ RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 그 결과,합성된 이중-스트랜드 DNA를 EcoRI DNA 메틸라아제(Promega)로 메틸화시키고, T4 DNA 폴리머라제(Bethesda Research Laboratory)로 말단을 채우고 T4 DNA 리가제(Pharmacia)를 이용하여 인산화된 EcoRI 링커를 연결시켰다. 이중-스트랜드 DNA를 EcoRI 효소로 절단하여 겔 여과칼럼(세파로스 CL-4B)을 통과시켜 과잉의 링커를 분리하고, 제조 방법에 따라 ZAP 벡터(Stratagene)에 연결하였다. 제조자 교시에 따라 연결된 DNA를 기가팩(Gigapack)(상표명) 패키징 추출물 (Stratagene)을 이용하여 파아지로 패키징하였다. 그 결과 cDNA 라이브러리를 스트라트겐(Stratgene) 교시에 따라 증폭시켜 -80 ℃에 저장하였다.
람다 ZAP 클로닝 키트 매뉴얼(스트라타겐)의 교시에 따라 cDNA 파지 라이브러리로 E coli XLI 세포를 감염시켜 약 300,000 플라크 형성 단위로 6개의 150 mm 지름의 페트리 접시에 플레이팅하였다.
플레이트의 복제물 리프트(lift)를 니트로셀룰로스 필터(Schleicher ＆ Schuell, Keene, NH)로 옮겼다. 6X SSPE, 5X 덴하르트(Denhardt) 용액, 0.5% SDS, 5% 덱스트란 술페이트 및 0.1 mg/mL 변성 연어 정자 DNA (Sigma 화학적 Co.)로 구성된 예비 혼성화 완충액 25 mL로 60 ℃에서 2시간 동안 혼성화시켰다.
그리고 나서, 효모 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 (문헌[Johnson, M.A. (1994) Plant Physiol. 105:1023-1024])에 유사성을 이용하여 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 미오-이노시톨- 1-인산염 신타제로 확인된 cDNA로부터 합성된 방사선 표지화된 프로브로 블록된 필터를 혼성화시켰다. 아라비돕시스 클론은 미국 43210-1002 오하이오주 콜롬부스 캐리낙 1060 소재 아라비돕시스 바이올로지칼 리솔스 센타(Arabidopsis Biological Resource Center) DNA 스톡 센터로부터 클론 번호 18 1CI 8T7113E9T7을 얻었다. 1.2 kB 삽입 cDNA를 Sal I 및 Not I를 이용하여 벡터 DNA로부터 회수하여 아가로스 젤을 이용하여 DNA 단편을 정제하였다. 정제된 단편을 랜덤 프라이머 라벨링 키트(Bethesda Research Laboratory)를 이용하여 [32P]dCTP로 표지화하였다. 필터를 예비혼성화와 같은 방법에 기술된 것과 같은 조건에서 밤새 혼성화시켰다. 과잉 방사성라벨을 0.1% SDS를 포함하는 0.6x SSC로 필터를 세척하였다. 0.2xSSC, 0.1% SDS로 60 ℃에서 두 차례 세척하여 비특이적으로 결합된 라벨을 제거하도록 하였다. 필터를 밤새 필름에 노출시켰다. 약 200 포지티브 시그날이 관찰되었다. 여섯 개의 시그날 주위를 절단하여 정제하였다. 그리고, 파아지에 재 플레이팅하여 앞에서 같이 다시스크리닝을 하였다. 제조자(Strategene)이 기술한 방법을 이용하여 플라스미드 클론을 얻기위해 두 개의 클론을 파지미드로 절단하여 E. coli를 감염시켰다. 두 개의 클론 중, p5bmi- I-ps로 표시한 한 클론은 응용 생물 기구(Applied Biological Instruments)의 방법 및 장치를 이용하여 염기 서열을 분석하였다. p5bmi-I-ps의 삽입 cDNA의 염기 서열은 서열 번호 1에, 이 염기 서열에 의해 코딩되는 유도 아미노산 서열은 서열 번호 2에 제시하였다.
LR33 대두의 미성숙 종자에서 미오-이노시톨-1-인산염 신타제의 cDNA 클로닝 11,16 및 20으로 번호를 매겨 실시예 3에 기술되어 있는 종자(표 8)를 종자 충전 단계에서 50% 가량을 수확하여 포드로부터 회수하여 -80 ℃에서 냉동 보관하였다. mRNA를 분리하기 위해 벌크 종자 집락으로부터 냉동 종자 2g을 액체 질소 존재하에 모르타르 및 막자로 분쇄하였다.
냉동된 곡분을 다시 10 mM 트리스-HC 1, pH 9, 10 mM EDTA, 0.5% CTAB (세틸트리메틸 암모늄 브로마이드), 0.8 M NaCl, 1% 2-메르캅토에탄올 및 2% 폴리비닐프롤리돈으로 구성된 총 RNA 추출 완충액 10 mL로 분쇄하였다. 모든 시약에 사용되는 물은 0.05% 디에틸피로카르바메이트로 30 분간 처리하여 멸균하였다. 조직 슬러리를 a 15 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮겨 5,500 x g에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 미라클로쓰(Miracloth) (Calbiochem)를 통과시켜 제2 폴리프로필렌 튜브에 회수하여 0.3 부피의 클로로포름을 첨가하였다. 5,500 x g에서 10분가 원심분리하여 층을 분리하였다. 상층은 또다른 폴리프로필렌 튜브로 옮겨 1.5 부피의 10mM Tris-HCI pH 9, 10 mM EDTA, 0.5% CTAB 및 0. 1% 2-메르캅토에탄올을 첨가하였다. 상온에서 30분간 방치 5,500 x g에서 20분간 원심분리하여 핵산을 분리하였다.
핵산을 다시 0.1% 2-메르캅토에탄올을 포함하는 1 M NaCl 0.4mL에 재용해시켰다. 1:1 페놀:클로로포름의 1 부피로 추출하고 나서 핵산을 2 부피의 에탄올로 침전시켰다.
이 핵산분획으로부터 파마시아(Pharmacia)사의 mRNA 정제 키트를 이용하여 mRNA를 정제하였다. 약 12ug 가량의 mRNA가 회수되었다. 겜 앰프(Geme Amp) RNA-PCR 키트(Perkin Elmer Cetus, part no. N808-0017)를 이용하여 올리고-dT로부터 증폭하기 위한 주형으로 폴리아데닐화 mRNA 13ng을 사용하였다. 역전사효소반응을 42 ℃에서 30분간 수행하였다. PCR 증폭을 위한 DNA 중합 효소로 VentTm DNA 중합 효소(New England Biolabs)를 키트 제조업체로부터 공급받았다. 100mM 마그네슘 술페이트 2 μL을 각 100 μL 반응에 첨가하였다. 서열 번호 3의 5' 프라이머의 서열은 서열 번호 1의 57 내지 77 염기와 제한 효소의 활성을 증가시키기 위해 5'에 8개 추가된 염기를 갖는 프라이머내에 NdeI의 염기 서열을 갖도록 첨가된 염기 5'-GGGAATTCCATATG-3'로 구성되어있다.
서열 번호 4에 나타낸 3' 프라이머는 서열 번호1의 염기 1566 내지 1586에 역으로 상보적인 서열과 프라이머에 Not I 부위를 제공하기 위해 첨가된 염기 5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGC-3'와 제한효소 절단을 증가시키기위해 첨가된 10개의 염기로 구성되어 있다. PCR 반응은 어닐링 온도 52 ℃ 및 연장 시간 1.5분에서 35 사이클을 시행하였다. 약 1550 bp의 생성물이 얻어졌으며, 아미콘(Amicon) 50 미세연결 필터를 통과시켜 정제한 후 1:1 페놀:클로로포름 동일 부피로 추출하고 상층액을 페놀:클로로포름 분리 상층을 클로로포름 1 부피로 추출한 후 에탄올로 침전시켰다. 결과, 정제된 PCR 생성물 5 μg을 Nde I 및 Not 1으로 37 ℃에서 밤새 절단시킨 후 앞에서와 같이 페놀:클로로포름 추출법으로 단백질을 제거시키고, Nde I 및 Not I 처리 후 인산 말단을 가수분해시키기 위해 소창자 알칼리 포스파타제로 처리한 2ug pET24aT7 발현 벡터(Novogen)와 연결시켰다. 연결 혼합물로 전기경쟁적 DH 10B E coli세포를 형질전환시키고, 형질전환체를 30 mg/l 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 배지에 성장시켜 선별하였다. 형질변환 플레이트로부터 18개의 콜로니를 골라 100 μL의 멸균수에 넣었다. 세포 혼합물 40 μL를 삽입 cDNA를 분리하기 위해 초기에 사용했던 프라이머와 PCR 조건을 이용한 Taq(상표명) DNA 중합 효소(Perkin Elmer) PCR 반응에 DNA 주형으로 사용하였다. 6개의 콜로니가 정확한 크기의 산물을 증폭하는데 주형으로 역할을 하였다. 이들 콜로니의 남은 60 μL 세포 혼합물을 밤새 배양하여 각 콜로니의 플라스미드 DNA를 준비하였다. 각각의 6개의 클론으로부터 정제된 플라스미드는 전기경쟁적 DE 3 E.coli 세포를 형질전환시키는데 사용되었다.
＜E. coli에 있어 야생형 및 LR33 대두으로부터 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제의 기능 발현＞
야생형 대두 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제를 SEQ ID NO:3 및 서열 번호4에 있어 프라이머를 이용한 p5bmi-1-ps의 PCR 증폭, 및 역전사된 mRNA로부터 LR33 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제의 복제를 위해 상기 기술한 PCR 증폭 및 복제 프로토콜에 의해 pET24aT7 발현 벡터에 위치시켰다. 이 경우에는, cDNA 삽입물을 갖는 플라스미드를 함유하는 것으로 나타나는 9개의 DH 10B 복제로부터의 플라스미드 제제를 모아서 전기 경쟁적 DE 3 E. coli 세포로 전환시키는데 사용하였다.
카나마이신 내성 집락을 선택하고, 하룻밤 배양의 접종을 위해 6종을 선택했다. 30 mg/L의 카나마이신을 함유한 LB 매질에서 30℃로 성장시킨 하룻밤 배양을 2배의 새 매질로 희석하고, 1시간 동안 다시 성장시키며, 이소프로필-티오갈락토시드를 가하여 1mM의 최종 농도를 갖게 하였다.
세포를 3시간 동안 원심분리하여 취하고, 0.1 mM DTT 및 0.2 mM 페닐 메틸술포닐 플루오라이드를 함유하는 pH 8.0의 50 mM 트리스-염산 50 μL에 재현탁하였다. 1mm 유리 비드를 소량 가하고 혼합물을 미세프로브 초음파처리기에서 각 약 5초 동안 3회 초음파 분해시켰다. 혼합물을 원심분리하고, 상징액의 단백질 농도를 측정하였다. 각 복제 배양물의 가용 부분으로부터 1 μg의 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 분리하였다. 약 60 킬로달톤 중량의 부가 단백질 밴드를 나타낸 배양액을 활성 분석용으로 선택하였다.
분석을 위하여, [33P]글루코스-6-포스페이트를 포스페이트 제공자로서 [33P]-γ-ATP를 이용하여 글루코스이 포스포릴화를 촉매화하는 헥소키나제에 의해 제조하였다. 실온에서 30분 후, 반응 혼합물을 우선, 80% 메탄올, 이어서 물로 세척한 SEP-PAC C18 칼럼(MilliPore 사 제품, 메사추세츠주 밀포드 소재)에 통과시켰다. 추가의 5 mL와 함께 칼럼 통과물을 취하고, 1 mL의 80% 메탄올로 세척한 SEP-PAC SAX 칼럼을 통과시켰다. [33P]-글루코스-6-포스페이트를 80% 메탄올 중 0.02N 염산 2 mL로 용출하였다. 1 M 트리스 염기 40 μL를 가하고 진공하에 메탄올을 제거하였다. 잔류 용액의 글루코스-6-포스페이트 농도를 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소에 의해 6-포스포글루크론산으로의 전환에 의해 측정하였다. 반응 중 생성된 NADPH 를 340 nm에서의 흡광도로 정량화하였다.
세포 추출물의 10 μL를 37℃로 30분 동안 2mM 글루코스-6-포스페이트 (57,334 dpm 총 33P), 0.1 mM NAD, 및 15 mM 암모늄 아세테이트로 이루어진 반응물 100 μL에서 배양하였다. 반응물을 90℃로 가열하고, 단백질을 침전시키며, 원심분리하여 투명하게 하였다. 상징액 47 μL를 0.1 N NaOH 및 0.1 N 아세트산 나트륨을 이용하여 0.9 mL/분으로 작동하는 디오넥스(상표명)Pa-1 칼럼에 통과시켰다. 미오-이노시톨-1-포스페이트의 표준물은 주입 후 8 내지 10분에 용출되고 분리된 반응 혼합물의 1분 분량을 섬광 측정을 위한 시간 범위에서 취하였다. 피크 부분의 방사능을 총계하여 글루코스-6-포스페이트의 미오-이노시톨-1-포스페이트로의 전환을 얻고 빈 pET24aT7 벡터를 함유하는 1종의 표준 E. coli DE 3 배양물 및 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제 cDNA를 함유하는 2종의 복제에 대한 결과를 표 12에 나타냈다.
＜3 종의 E. coli 세포 배양 추출물에 대한 특이 활성(1 분당 단백질 1 mg이 생성하는 미오-이노시톨-1-포스페이트 μmole)(대조는 빈 플라스미드인 반면, 대두 클론 1 및 2는 대두 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제를 함유함)＞
수행 중 분석에서, cDNA 함유 복제 모두는 실질적으로 사용가능한 모든 기질을 사용하고, 따라서 표준보다 35배 이상 활성이 크다. 따라서, 대두 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제는 E. coli에 있어 기능 효소를 제조할 수 있다.
야생형 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제 복제 번호 1(대두 복제 1) 및 LR33 미오-이노시톨-1-포스페이트 복제 3종을 상기 기술한 바와 같이 단백질 발현을 위해 성장시켰다. 각 복제의 가용성 세포 추출물로부터 단백질 5 μg을 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. LR33 복제 번호 10(LR33-10)은 야생형 복제 번호 1에서 얻은 것과 실질적으로 동일한 다량으로 가용성 단백질 60 킬로달톤을 생성하였다. 2종의 추출물 각각의 단백질 4 μg을 NAD 3 μm 및 90 μm 글루코스-6-포스페이트로 이루어진 반응물 100 μL를 이용하는 상기 서술된 방법에 의해 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제의 활성을 분석하였다. 야생형 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제의 특정 활성은 이러한 조건하에 단백질 mg 당 1.5 nmol/분 인 반면에 LR33-유도된 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제의 특정 활성은 단백질 mg 당 0.16 nmol/분이었다.
＜LR33 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열＞
LR33-10(LR33 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제를 코딩하는 핵산 단편을 함유함) 복제 중 cDNA 삽입물의 뉴클레오티드 서열을 플라스미드 원천으로 DH 10 B E.coli 계통 및 야생형에 대하여 기술된 DNA 서열화를 이용하여 결정하였다. 뉴클레오티드의 서열은 서열 번호5에 나타나 있고, SEQ ID NO:6의 복제의 오픈 리딩 프레임으로부터 추론된 아미노산 서열을 얻었다. 서열 번호 5는 서열 번호 1로부터 염기 번호 1241에서 코딩 사슬 중 G에서 T로의 단일 염기쌍 변화에 의해 차별된다. 이러한 변화는 야생형 서열(서열 번호2)의 라이신에서 LR33 아미노산 서열(서열 번호 6)의 아스파라긴으로의 아미노산 번호 396의 변화를 가져온다.
미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제의 복제 중 발생하는 PCR에 의한 오류라기 보다는 LR33 게놈의 변화에 의해 야기되는 염기 변화를 확인하기 위해서, PCR 프라이머 2 세트를 제조하였다. 야생형 프라이머(서열 번호7) 및 LR33 프라이머(서열 번호8)을 사용하여 대두 재배품종 A2872의 건조 종자 및 대두 계통 LR33 복제 번호 16(표 8 참조)로부터 제조된 게놈 DNA를 증폭하였다. 서열 번호 4에 기술된 PCR 프라이머를 일반적인 안티센스(antisense) 사슬 프라이머로 사용하였다. 62℃ 또는 64℃의 가열 냉각 온도 및 35회의 가열 냉각 및 증폭에서 A2872 DNA가 주형으로 사용된 경우에는 단지 야생형 프라이머만 PCR 생성물을 생성하고, LR33 DNA가 주형으로 사용된 경우에는 단지 LR33 서열에 상응하는 프라이머만 생성물을 생성하였다.
변이 검사를 위해 프라이머의 특정성을 보다 자세하게 점검하기 위해서, DNA를 실시예 3(표 8 참조)에 기술한 LR33 복제 번호 7 계통을 분리하는 종자로부터 성장된 6종의 단일 식물로 제조하였다. 분리 개체군으로부터 시험된 6종의 플렌트 중에서, 2종이 프라이머 모두에 대한 주형으로 작동하는 DNA이고, 3종이 야생형 프라이머에만 작동하는 DNA이며, 하나의 종이 LR33 프라이머로만 생성물을 생성하는 DNA였다. 이는 1종의 야생형 및 1종의 유전자 변이 복사본을 함유하는 이형접합체를 함유하는 개체군으로부터 기대되는 결과였다.
대사물질 데이터 및 서열 데이터로부터, 매우 낮은 라피노스 사카라이드 슈크로스, 매우 높은 슈크로스 및 낮은 파이트산의 관찰된 종자 표현형은 모두 야생형과 서열 번호 1 및 서열 번호 5에 나타난 LR33 서열의 비교에 의해 기술된 단일 염기 변화 변이인 것으로 결론을 내릴 수 있다.
＜실시예 6＞
＜미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제 및 관련된 종자 표현형의 유전자 사일런싱을 얻기 위한 대두의 형질전환＞
＜대두 종자 발생에 있어 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제의 감소된 발현용 글리신 맥스의 형질전환을 위한 벡터의 구성＞
쿠니츠 트립신 억제제 3(KTi3) 프로모터[Jofuku and Goldberg, (1989) Plant Cell 1:1079-1093], 강낭대두 7S 종자 저장 단백질(파제올린) 프로모터[Sengupta Gopalan et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3320-3324; Hoffman et al., (1988) Planr Mil. Biol. 11:717-729] 및 대두 β-콘글리시닌 프로모터[Beachy et al., (1985) EMBO J 4:3047-3053]의 조절하에 대두 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제 cDNA 서열을 배향하는 플라스미드를 함유하는 안티센스 또는 센스를 구성하였다. 이러한 프로모터의 조절하에 대두 미오-이노시톨-1-포스페이트 신타제 cDNA를 발현하는 벡터의 구성은 하기 플라스미드를 이용함으로써 촉진된다: pML70, pCW108 및 pCW109A.
pML70 벡터는 KTi3 프로모터 및 KTi3 3' 미번역된 부위를 포함하고, pML51, pML55, pML64 및 pML65 중간체 플라스미드를 통해 시판중인 pTZ18R(Pharmacia) 벡터로부터 유도되었다. 문헌[Jofuku et al., (1989) Plant Cell 1:427-435]에 기재된 서열의 755에서 761 염기에 상응하는 Eco RI 위치에서 5' 미번역된 부위의 모든 2039 뉴클레오티드 및 KTi3 유전자 말단의 코딩 서열의 390 염기를 함유하는 완전한 대두 KTi3 유전자[상기 조후프 및 골드버그의 문허]의 Bst BI/Eco RI 단편 2.4 kb을 pTZ18R의 Acc I/Eco RI 위치로 연결하여 플라스미드 pML51을 생성하였다. 플라스미드 pML51을 Nco 1으로 절단하고, 클레나우(Klenow)를 이용하여 정리하고 재연결하여, KTi3 삽입물의 5' 미번역된 부위의 중간에 있어 Nco I 위치를 분해하여 플라스미드 pML55를 생성하였다. 플라스미드 pML55는 부분적으로 Xmn I/Eco RI로 침지시켜 상기 언급한 서열의 염기 732에서 755에 상응하는 폐기된 단편 0.42 kb를 방출하였다. Nco I 위치를 포함하는 합성 Xmn I/Eco RI 링커(linker)를 Xmn I 위치(5'-TCTTCC-3') 및 Eco RI 위치(5'-GAAGG-3')의 부분이 직접적으로 뒤따르는 Nco I 위치 (5'-CCATGGG-3')에 대한 코딩 서열로 이루어지는 상보적 합성 올리고뉴클레오티드의 이량체를 제조함으로써 구성하였다. Xmn I 와 Nco I/Eco RI는 짧은 개입 서열(5'-ATAGCCCCCCAA-3')에 의해 연결되었다. 이 합성 링커를 Xmn I/Eco RI 위치의 4.94 kb 단편으로 연결하여 플라스미드 pML64를 생성하였다. KTi3 유전자의 3' 미번역된 위치를 프라이머 ML51 및 ML52를 이용한 표준 PCR 프로토콜(Perkin Elmer Cetus사, GeneAmp PCR kit)에 의해 조후크(Jofuku) 등의 상기 문헌에 기재된 서열로부터 증폭하였다. 프라이머 ML51은 상기 언급한 서열의 염기 1072 내지 1091에 상응하는 20 개의 뉴클레오티드 및 프라이머의 5' 말단에서 Eco RV(5'-GATATC-3'), Nco I(5'-CCATGG-3'), Xba I(5'-TCTAGA-3'), Sma I(5'-CCCGGG-3') 및 Kpn I(5'-GGTACC-3') 위치에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하였다. 프라이머 ML52는 상기 언급한 서열 염기 1242에서 1259에 상응하는 뉴클레오티드의 완전한 보완물 및 프라이머의 5' 말단에서 Sma I(5'-CCCGGG-3'), Eco I(5'-GAATTC-3'), Bam HI(5'-GGATCC-3') 및 Sal I(5'-GTCGAC-3')위치에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하였다. KTi3 유전자의 PCR-증폭된 3' 말단을 pML64의 Nco I/Eco I 위치로 연결시켜 플라스미드 pML65를 생성하였다. 합성 다중 복제 위치 링커를 Pst I(5'-CTGCA-3'), Sal I(5'-GTCGAC-3'), Bam HI(5'-GGATCC-3') 및 Pst I(5'-CTGCA-3') 위치에 대한 코딩 서열로 이루어진 상보적 합성 올리고뉴클레오티드의 다이머를 제조함으로써 구성하였다. 링커를 pML65의 Pst I 위치(KTi3 프로모터 부위에 대한 5'에 직접적으로 연결함)에 연결하여 플라스미드 pMl70를 생성하였다.
pCW108 벡터는 대두 파제올린 프로모터 및 3' 미번역된 부위를 포함하고, 플라스미드 AS3 및 pCWIO4를 통해 시판용 pUC18 플라스미드(Gibco-BRL)로부터 유도되었다. 플라스미드 AS3는 5'-TGGTCTTTTGGT-3'로 출발하는 대두(강낭대두) 파제올린(7S 종자 저장 단백질) 프로모터의 495 염기쌍을 포함하고, 동일한 유전자의 3' 미번역된 부위의 전체 1175 염기쌍[도일 등의 (1986), J. Biol. Chem. 261:9228-9238 및 슬리톰 등의 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1897-1901 문헌의 서열에 관한 서술을 참조; 또한 WO911/3993에서도 서열에 관한 서술을 찾을 수 있음]이 pUC18의 Hind III 위치로 복제되었다. pUC18 다중 복제 부위(Eco RI, Sph I, Pst I 및 Sal I)의 추가 복제 위치는 Eco RI 및 Sal I로 침지하고, 키에나우로 정리하고, 재연결하여 플라스미드 pCW104를 얻음으로써 제거되었다. 신규 다중 복제 위치는 3종의 충전제 염기 (5'-TAG-3'), Sma I 위치(5'-TCTAGA-3')에 대한 코딩 서열, Kpn I 위치(5'-TAC-3')의 마지막 3종의 염기, 시토신 및 Xba 위치(5'-TCTAGA-3')에 대한 코딩 서열등이 뒤따르는 Nco I 위치 (5'-CCATGG-3')에 대한 코딩 서열로 이루어진 상보적 합성 올리고뉴클레오티드의 삽입 다이머에 의해 5'파제올린의 495 bp 및 3' 파제올린의 1175 bp 사이에서 생성되었다. 이 플라스미드는 파제올린 프로모터의 뒤에 직접적으로 고유한 Nco I, Sma I, Kpn I 및 Xba I 위치를 갖고있다.
벡터 pCW109A는 대두 β-콘글리시닌 프로모터 서열 및 파제올린 3' 미번역된 부위를 포함하고 있고 시판중인 플라스미드 pUC18(Gibco-BRL)로부터 유도되는 pCW109 벡터의 개질된 변형이다. 벡터 pCW109를 벡터 pUC18a의 Hind III 위치로 β-콘글리시닌 유전자의 555 bp 5'논-코딩 부위(프로모터 부위를 포함함), 이어서 상기 pCW1O8에 대하여 기술한 바와 같이 Nco 1, Sma 1, Kpn I 및 Xba 1에 대한 제한 엔도뉴클레아제를 포함하는 다중 복제 서열, 이어서 1174 bp의 일반 대두 파제올린 3' 미번역된 부위를 Hind III 위치(상기 기술된 바와 같음)로 삽입함으로써 제조하였다.
사용된 β-콘글리시닌 프로모터 부위은 27 뉴클레오티드 위치의 상이성으로 인해 공표된 β-콘글리시닌 유전자(도일 등의 문헌[1986) J. Biol. Chem. 261:9228-9238])의 대립 유전자이다. 또한 본 유전자의 서열에 관한 사항은 W091/13993에서 찾을 수 있다
이러한 3종의 핵산 구성은 파이트산으로의 후속 전환을 포함하는 미오-이노시톨 합성의 광범위한 발생 기간에 걸친 발현으로 종자 특이 발현 벡터를 구성한다. 서열 번호 1 및 서열 번호 5에 기재된 서열을 이러한 벡터로 삽입하는 것은 상기 실시예 5에 기재된 PCR 방법에 의해 촉진된다. 서열 번호 1 또는 서열 번호 5의 부위를 상보적으로 선택한 PCR 프라이머는 pML70, pCWIO8 및 pCWIO9의 프로모터 서열을 따라 다중 복제 서열에서 또한 절단되는 것들 중에서 선택되는 제한 엔도뉴클레아제의 인식 서열을 구성하는 추가의 염기와 합성될 수 있다.
제한 위치의 배치는 대두 미오-이노시톨-1-인산염 신타제로부터 과도 발현 또는 공-억제를 달성하기 위한 센스 배향으로의 뉴클레오티드의 배향 또는 발현하에 달성하기 위한 안티센스 배향으로의 뉴클레오티드의 배향을 조절하기 위해서 선택될 수 있다.
＜체세포 대두 배 배양의 형질변환 및 대두 식물의 재생＞
하기 스톡 용액 및 배지는 시험관내 대두 조직 성장을 지지하기 위해 사용된다.
＜스톡 용액＞
＜배지＞
대두 배아생성 현탁 배양액을 16:8 시간 낮/밤 스캐줄에서 형광 및 백열광을 혼합하여 150 rpm, 28 ℃에서 회전식 진탕기상의 35 ml 액체 배지(SB55 또는 SBP6) 내에 유지하였다. 배양액을 매 4 주 마다 약 35 mg의 조직을 35 mL의 액체 배지에 접종함으로써 계대배양하였다. 파티클 검 밤바드먼트(particle gun bombardment)의 방법에 의해서(문헌[Klines et al. (1987) Nature (London) 327:70]참고) 대두 배아생성 현탁 배양액을 센스 또는 안티센스 배향의 미오-이노시톨-1-인산염 신타제 함유 종자 특이 발현 벡터로 형질변환시킬 수 있다. 이러한 형질변환을 위하여 듀퐁 바이오리스틱(DuPont Biolistic)(상표명)PDS1OOO/HE 기구(헬륨 레트로피트)를 사용하였다.
50 mL의 60 mg/mL 1 μm 금입자 현탁액을 가하였다(순서대로): 5 μL DNA (1 μg/μL), 20 μL 스페르미딘 (0.1 M) 및 50 W CaCl2(2.5 M). 입자 제조는 4 분 동안 젓고, 10 초 동안 미세관 중에서 스피닝하고, 상징액을 제거하였다. 그 후, DNA-코팅된 입자를 400 μL의 70% 에탄올로 1 회 세척하고, 40 μL의 무수 에탄올 중에 재현탁시켰다. DNA/입자 현탁액을 각 1 초 동안 3 회 초음파 처리하였다. 그 후, 5 μL의 DNA-코딩 금입자를 각 미세담체 디스크 상에 놓았다. 약 300 내지 400 mg의 4 주 묵힌 현탁 배양액을 60 x 15 mm의 빈 페트리 디쉬에 넣고, 남은 액체를 피펫으로 조직으로부터 제거하였다. 각 형질변환 실험을 위하여, 조직의 약 5 내지 10 개 플레이트를 정상적으로 밤바드시켰다. 막 파열 압력은 1000 psi로 고정시키고, 상기 챔버는 수은 28 인치의 진공까지 배기시켰다. 상기 조직을 작업 스크린으로부터 약 3.5 인치 떨어진 곳에 두고, 3 회 밤바드시켰다. 밤바드 후, 상기 조직을 다시 액체 중에 넣고, 상기 서술한 바와 같이 배양하였다.
11 일 후 밤바드 후, 액체 배지를 50 mg/mL 히그로마이신(hygromycin) 함유 신선한 SB55로 교환하였다. 이후에 선택 배지를 주마다 신선하게 하였다. 7 주 후 밤바드, 녹색의 형질변환된 조직을 비형질변환된 회저성 배아생성 클러스터로부터 성장하고 있는 것을 관찰할 수 있다. 신규의 클론 증식된 형질변환 배아생성 현탁 배양액을 생성하기 위해서 단리된 녹색 조직을 옮겨 각 플라스크에 접종하였다. 따라서, 형질변환 사건과는 독립적으로 각 신규 계통을 처리하였다. 그 후, 이들 현탁액은 계대배양을 통하여 미성숙 발달 단계에서 밀집되거나, 각 세포 배아의 발아 및 성숙에 의해서 온전한 식물로 재생된 배아 현탁액으로서 유지될 수 있다.
형질변환된 배아생성 클러스터는 액체 배양액으로부터 제거하고, 호르몬 또는 항생제를 함유하지 않는 고체 아가 배지(SBI03)상에 두었다. 배아를 16:8 시간 낮/밤 스케줄에서 형광 및 백열광을 혼합하여 8 주 동안 26 ℃에서 배양하였다. 이러한 시간 동안, 개개의 배아는 클러스터로부터 분리되어 다양한 배아 발달 단계에서 분석하였다. 8 주 후에, 체세포 배아는 발아하기 적합하게 되었다. 발아 동안, 8 주된 배아를 성숙화 배지로부터 옮겨 빈 페트리 접시내에서 1 내지 5 일 동안 건조시켰다. 그 후, 건조시킨 배아를 SB71-1 배지에 심고, 이들이 동일한 빛과 상기 서술된 발아 조건 하에서 발아하게 하였다. 그 후, 발아된 배아를 살균 토양으로 옮겨 종자 수집을 위해서 성숙시켰다.
상기 서술한 액체 배양액내 구형의 배아 상태에서 체세포 대두 배아는 매우 소량의 트리아실글리세롤 또는 성숙한 접합성 대두 배아의 전형적인 저장 단백질을 포함한다. 이 발달 단계에서, 체세포 배아 배양이 개시되는 발달 단계에서 전형적인 접합성 대두 배아로서, 총 극성 지질(인지질 및 당지질)에 대한 총 트리아실글리세롤의 비율은 약 1:4이었다. 또한, 구형의 단계에서 우세한 종자 단백질(β-콘글리신의 α'-소단위, 쿤닛츠 트립신 억제제 3 및 대두 종자 렉틴)에 대한 mRNA는 거의 없다. 상기 기재된 바와 같이 성숙기 체세포 배아 단계로 분화시키는 호르몬이 없는 배지로 이동시, 트리아실글리세롤이 가장 풍부한 지질 종류이다. 이외에, β-콘글리신의 α'-소단위, 쿤닛츠 트립신 억제제 3 및 대두 종자 렉틴은 매우 풍푸함 메신저가 된다. 이에 관하여, 체세포 대두 배아계는 생체내 성숙기 접합성 대두 배아에 매우 유사하게 작용한다. 초기 성숙기 동안, 체세포 배아내 존재하는 주요 가용성 탄수화물은 슈크로스, 글루코스 및 말코즈 (성숙 단계 동안 공급된 슈가)이다. 체세포 배아가 성숙하고 황색이 되기 시작하면서, 라피노스 및 스타키오스 모두 생성된다. 이에 관하여, 체세포 배아의 표현형은 말기 종자 발달 단계를 거쳐감에 따라서 접합성 배아와 매우 유사하였다. 따라서, 뉴클레오티드 서열 발현을 지시하는 종자 특이 발현 벡터로 형질변환시킨 배아 선택물은 센스 또는 안티센스 배향의 서열 번호 1 또는 서열 번호 5 I에 기재되어 있고, 이는 라피노스 및 스타키오스 함량을 감소시키고, 동일한 표현형을 갖는 종자 함유의, 성숙한 번식성 대두 식물을 재생시켜야 한다.
미생물 기탁에 관한 표시
(PCT 규칙 13bis)
| A. 하기 표시는 명세서 6페이지 31-32행에서 언급된 미생물관한 것이다. | |
| B. 기탁의 확인 | |
| 기탁 기관의 명칭아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 | |
| 기탁 기관의 주소 (우편번호 및 국가 포함)미국 20852 매릴랜드주 록크빌 파크로운 드라이브 12301 | |
| 기탁일:1997년 4월 17일 | 수탁번호97988 |
| C. 추가 공시 사항유럽 특허를 청구한 상기 명명된 미생물에 대하여 기탁된 미생물의 시료는 유럽 특허 공고가 발행되거나 또는 출원이 거절되거나 포기되거나 포기 간주될 때까지 시료의 분양을 신청한 사람에 의해 지명된 숙련가에게 분양함으로써만 이용될 수 있다 (EPC 규칙 28(4)). | |
| D. 공시 사항이 적용되는 지정국 | |
| E. 공시 사항의 별도 공급 | |
| 권한있는 관리 | 권한있는 관리 |
PCT/RO/134(1992년 7월)
미생물 기탁에 관한 표시
(PCT 규칙 13bis)
| A. 하기 표시는 명세서 6페이지 31-32행에서 언급된 미생물관한 것이다. | |
| B. 기탁의 확인 | |
| 기탁 기관의 명칭아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 | |
| 기탁 기관의 주소 (우편번호 및 국가 포함)미국 20852 매릴랜드주 록크빌 파크로운 드라이브 12301 | |
| 기탁일:1997년 4월 4일 | 수탁번호97971 |
| C. 추가 공시 사항유럽 특허를 청구한 상기 명명된 미생물에 대하여 기탁된 미생물의 시료는 유럽 특허 공고가 발행되거나 또는 출원이 거절되거나 포기되거나 포기 간주될 때까지 시료의 분양을 신청한 사람에 의해 지명된 숙련가에게 분양함으로써만 이용될 수 있다 (EPC 규칙 28(4)). | |
| D. 공시 사항이 적용되는 지정국 | |
| E. 공시 사항의 별도 공급 | |
| 권한있는 관리 | 권한있는 관리 |
PCT/RO/134(1992년 7월)
미생물 기탁에 관한 표시
(PCT 규칙 13bis)
| A. 하기 표시는 명세서 6페이지 31-32행에서 언급된 미생물관한 것이다. | |
| B. 기탁의 확인 | |
| 기탁 기관의 명칭아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 | |
| 기탁 기관의 주소 (우편번호 및 국가 포함)미국 20852 매릴랜드주 록크빌 파크로운 드라이브 12301 | |
| 기탁일:1997년 4월 4일 | 수탁번호97970 |
| C. 추가 공시 사항유럽 특허를 청구한 상기 명명된 미생물에 대하여 기탁된 미생물의 시료는 유럽 특허 공고가 발행되거나 또는 출원이 거절되거나 포기되거나 포기 간주될 때까지 시료의 분양을 신청한 사람에 의해 지명된 숙련가에게 분양함으로써만 이용될 수 있다 (EPC 규칙 28(4)). | |
| D. 공시 사항이 적용되는 지정국 | |
| E. 공시 사항의 별도 공급 | |
| 권한있는 관리 | 권한있는 관리 |
PCT/RO/134(1992년 7월)
Claims (16)
- 대두 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 단리된 핵산 단편.
- 제1항에 있어서, 코딩된 대두 미오-이노시톨-1-인산염 신타제의 아미노산 서열이 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 핵산 단편.
- 적합한 조절 서열에 작동가능하게 결합된 제1항의 핵산 단편 또는 제1항의 핵산 단편의 상보물을 포함하고, 키메라 유전자의 발현이 대두 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 고유 유전자의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 키메라 유전자.
- 적합한 조절 서열에 작동가능하게 결합된 제1항의 핵산 단편의 소단편 또는 제1항의 핵산 단편의 소단편의 상보물을 포함하고, 키메라 유전자의 발현이 대두 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 고유 유전자의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 키메라 유전자.
- 미오-이노시톨-1-인산염의 합성능이 감소된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 단리된 핵산 단편.
- 제5항에 있어서, 코딩된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제의 아미노산 서열이 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 핵산 단편.
- (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 부여하는, 미오-이노시톨-1-인산염 합성능이 감소된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자에 대하여 동형접합체인 대두 식물(단, 상기 식물은 LR33이 아님).
- 제7항의 대두 식물의 종자.
- (i) 제3항의 키메라 유전자;(ii) 제4항의 키메라 유전자; 및(iii) 제5항의 핵산 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 요소를 포함하고, (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 대두 식물(단, 상기 식물은 LR33이 아님).
- 제9항의 임의의 대두 식물의 종자.
- (a) LR33 또는 제9항의 임의의 대두 식물과 우량 대두 식물을 교배시키는 단계; 및(b) (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 갖는 단계 (a)의 교배종의 자손 식물을 선별하는 단계로 이루어지는, (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 갖는 대두 식물의 생산 방법.
- (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 부여하고, 미오-이노시톨-1-인산염 합성능이 감소된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자에 대한 대두 식물 동형접합체의 종자로부터 유도된 대두 단백질 생성물.
- 제8항의 대두 종자의 가공 처리로부터 유도된 대두 단백질 생성물.
- 제10항의 대두 종자의 가공 처리로부터 유도된 대두 단백질 생성물.
- (a) 농업적 우량 대두 식물을 LR33 또는 제9항의 대두 식물과 교배시키는 단계;(b) (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형에 대하여 단계 (a)의 교배종의 자손 식물을 선별하는 단계; 및(c) 단계 (b)에서 선별된 종자를 가공 처리하여 목적하는 대두 단백질 생성물을 얻는 단계로 이루어지는, 미오-이노시톨-1-인산염 합성능이 감소된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자(상기 유전자는 (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 부여함)에 대하여 동형접합체인 대두 식물의 종자로부터 유도된 대두 단백질 생성물의 제조 방법.
- (a) 미오-이노시톨-1-인산염 합성능이 감소된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 포함하는 대두 식물과, 변이를 포함하지 않는 임의의 대두 양친을 교배시켜 F1 잡종을 생산하는 단계;(b) F1 잡종을 1 세대 이상 동안 자가수분시키는 단계; 및(c) 미오-이노시톨-1-인산염 합성능이 감소된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자(상기 유전자는 (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 부여함)에 대하여 동형접합체인 단계 (b)의 자손을 찾아내는 단계로 이루어지는, 미오-이노시톨-1-인산염 합성능이 감소된 변이 미오-이노시톨-1-인산염 신타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자(상기 유전자는 (i) 종자의 파이트산 함량이 17 μmol/g 미만, (ii) 종자의 라피노스 및 스타키오스 총 함량이 14.5 μmol/g 미만, 및 (iii) 종자의 슈크로스 함량이 200 μmol/g을 초과하는 유전성 표현형을 부여함)에 대하여 동형접합체인 대두 식물을 사용하는 방법.
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