BR112018012887B1 - Cassete de expressão, vetor, métodos de obtenção de célula vegetal e planta transgênica, métodos para expressar um polinucleotídeo - Google Patents

Cassete de expressão, vetor, métodos de obtenção de célula vegetal e planta transgênica, métodos para expressar um polinucleotídeo Download PDF

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Abstract

molécula de ácido nucleico, cassete de expressão, vetor, célula vegetal, planta, método para expressar um polinucleotídeo. trata-se de composições e métodos para regular expressão de sequências de nucleotídeos heterólogos em uma planta. composições incluem sequências de nucleotídeos para regiões reguladoras. promotores de proteína de transferência de fosfolipídeo (pltp) são fornecidos. também é fornecido um método para expressar uma sequência de nucleotídeos heterólogos em uma planta com o uso de uma sequência de promotores, tal como um promotor de pltp, revelada no presente documento. construtos de dna que compreendem um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse também são fornecidos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório no U.S. 62/271230, depositado em terça-feira, 22 de dezembro de 2015, que está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS APRESENTADA ELETRONICAMENTE
[0002] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida eletronicamente através de EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo nomeado "20160826_6870WOPCT_SeqList.txt", criado em 23 de agosto de 2016, e que tem um tamanho de 162 quilobites e é depositado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida nesse documento em formato ASCII é parte do relatório descritivo e está incorporada ao presente documento em sua totalidade a título de referência.
CAMPO DA REVELAÇÃO
[0003] A presente revelação refere-se ao campo de biologia molecular de planta, mais particularmente à regulação de expressão de gene em plantas.
ANTECEDENTES DA REVELAÇÃO
[0004] Expressão de sequências de DNA heterólogas em um hospedeiro vegetal é dependente da presença de elementos reguladores operacionalmente ligados que são funcionais dentro do hospedeiro vegetal. A escolha da sequência de promotores determinará quando e onde dentro do organismo a sequência de DNA heteróloga é expressa. Quando a expressão em tecidos ou órgãos específicos é desejada, promotores preferenciais de tecido podem ser usados. Quando a expressão genética em resposta a um estímulo é desejada, promotores induzíveis são o elemento regulador de escolha. Em contraste, quando a expressão contínua é desejada ao longo das células de uma planta, os promotores constitutivos são utilizados. Sequências reguladoras adicionais a montante e/ou a jusante da sequência de promotores nuclear podem ser incluídas nos construtos de expressão de vetores de transformação para promover níveis variantes de expressão de sequências de nucleotídeos heterólogos em uma planta, tal como uma planta transgênica.
[0005] Frequentemente é desejável expressar uma sequência de DNA, em particular tecidos ou órgãos de uma planta. Por exemplo, uso de promotores preferenciais de tecido operacionalmente ligados aos genes morfogênicos que promovem proliferação celular é útil para recuperação eficiente de eventos transgênicos durante o processo de transformação. Tais promotores preferenciais de tecido também têm utilidade na expressão de genes característicos e/ou proteínas de resistência a patógenos no tecido vegetal desejado de modo a intensificar rendimento vegetal e resistência aos patógenos. Alternativamente, pode ser desejável inibir a expressão de uma sequência de DNA nativo dentro de tecidos de uma planta para alcançar um fenótipo desejado. Nesse caso, tal inibição pode ser alcançada com a transformação da planta para compreender um promotor preferencial de tecido operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos antissenso, de modo que a expressão da sequência antissenso produza uma transcrição de RNA que interfere na tradução do mRNA da sequência de DNA nativa.
[0006] Adicionalmente, pode ser desejável expressar uma sequência de DNA em tecidos vegetais que estão em uma fase de desenvolvimento ou crescimento particular, tal como, por exemplo, divisão ou alongamento celular. Tal sequência de DNA pode ser usada para promover ou inibir processos de crescimento vegetal, desse modo, se afeta a taxa de crescimento ou arquitetura da planta.
[0007] Isolamento e caracterização de promotores preferenciais de tecido, particularmente promotores que podem servir como elementos reguladores para expressão controlada de genes estimuladores de crescimento são necessários.
BREVE SUMÁRIO DA REVELAÇÃO
[0008] Composições e métodos para regular expressão genética em uma planta são fornecidos. Composições compreendem sequências de nucleotídeos inovadoras para um promotor ativo em tecidos antes, durante e após polinização. Mais particularmente, os promotores conferem expressão preferencial de tecido. Mais particularmente, promotores de PLTP são fornecidos no presente documento. Determinados aspectos da revelação compreendem a sequência de nucleotídeos apresentada em pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27 e fragmentos da sequência de nucleotídeos apresentada em pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27. Também estão incluídos fragmentos funcionais da sequência apresentada em pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27, que conduzem expressão preferencial de tecido de uma sequência de nucleotídeos operacionalmente ligada. Aspectos da revelação também incluem construtos de DNA que compreendem um promotor, tal como um promotor de PLTP, operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse, sendo que o promotor tem capacidade para conduzir expressão da sequência de nucleotídeos em uma célula vegetal e o promotor compreende uma das sequências de nucleotídeos reveladas no presente documento. Aspectos da revelação fornecem adicionalmente vetores de expressão, e plantas ou células vegetais que têm incorporado estavelmente em seus genomas um construto de DNA conforme descrito acima. Adicionalmente, composições incluem semente de tais plantas.
[0009] Aspectos adicionais compreendem um meio para expressar seletivamente uma sequência de nucleotídeos em uma planta, que compreendem transformar uma célula vegetal com um construto de DNA e regenerar uma planta transformada a partir da dita célula vegetal, sendo que o dito construto de DNA compreende um promotor da revelação, tal como um promotor de PLTP e uma sequência de nucleotídeos heterólogos operacionalmente ligada ao promotor, sendo que o promotor inicia a transcrição da sequência de nucleotídeos em tipos de tecidos ou célula específicos, tais como o embrião e células de folha, enquanto se impede a expressão em tais órgãos como raízes, borla, e na espiga verde. Dessa maneira, as sequências de promotor são úteis para controlar a expressão de sequências codificadoras operacionalmente ligadas de uma maneira preferencial de tecido.
[0010] A jusante da região de iniciação transcricional do promotor está a sequência de interesse, que está posicionada de modo que produza um fenótipo modificado na planta. Tal modificação inclui modular a produção de um produto endógeno como para a quantidade, distribuição relativa, ou semelhantes, ou produção de um produto de expressão exógeno, para fornecer uma função ou um produto inovador ou modulado na planta. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos heterólogos que codifica um produto genético que confere resistência ou tolerância a herbicidas, sal, frio, à seca, a patógenos, nematódeos ou insetos é englobada.
[0011] Em um aspecto adicional, um método para modular expressão de um gene em uma planta estavelmente transformada é fornecido, em que o mesmo compreende as etapas de (a) transformar uma célula vegetal com um construto de DNA que compreende o promotor da revelação operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência de nucleotídeos; (b) cultivar a célula vegetal sob condições de cultivo de planta e (c) regenerar uma planta estavelmente transformada a partir da célula vegetal, sendo que a expressão da sequência de nucleotídeos ligada altera o fenótipo da planta.
[0012] Em um aspecto, a presente revelação fornece uma molécula de ácido nucleico que compreende um elemento regulador preferencial de tecido que tem uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em (a) uma sequência com pelo menos 70% de identidade com pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27; (b) um fragmento ou uma variante da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27, sendo que a sequência inicia a transcrição em uma célula vegetal; (c) um polinucleotídeo que é complementar ao polinucleotídeo de (a) ou (b); e (d) um polinucleotídeo que compreende pelo menos 100 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27; e sendo que o elemento regulador é operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo de interesse. Em um aspecto, um cassete de expressão que compreende o elemento regulador da molécula de ácido nucleico revelada que compreende um elemento regulador preferencial de tecido é fornecido. Em um aspecto, um vetor que compreende o cassete de expressão é fornecido. Em um aspecto, uma célula vegetal que compreende o cassete de expressão é fornecida. Em um aspecto, o cassete de expressão é estavelmente integrado ao genoma da célula vegetal. Em um aspecto, o cassete de expressão é transitoriamente expresso na célula vegetal. Em um aspecto, a célula vegetal é de uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea ou a dicotiledônea é selecionada dentre o grupo que consiste em: maís, sorgo, arroz, soja, trigo, algodão e Brassica. Em um aspecto, uma planta que compreende o cassete de expressão é fornecida. Em um aspecto, a planta é uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea ou a dicotiledônea é selecionada dentre o grupo que consiste em: maís, sorgo, arroz, soja, trigo, algodão e Brassica. Em um aspecto, o cassete de expressão é estavelmente incorporado ao genoma da planta. Em um aspecto, o cassete de expressão é transitoriamente expresso na célula vegetal. Em um aspecto, uma semente da planta é fornecida, sendo que a semente compreende o cassete de expressão. Em um aspecto, o polinucleotídeo heterólogo de interesse codifica um fator de transcrição. Em um aspecto, o polinucleotídeo heterólogo codifica um produto genético que confere tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a patógenos ou resistência a insetos. Em um aspecto, o polinucleotídeo heterólogo de interesse codifica um produto genético que confere tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a patógenos ou resistência a insetos. Em um aspecto, o polinucleotídeo heterólogo codifica um produto genético que está envolvido em metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula tronco, estímulo de crescimento celular, organogênese, iniciação de embriogênese somática e desenvolvimento do meristema apical. Em um aspecto, o polinucleotídeo heterólogo codifica um produto genético que está envolvido em metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula tronco, estímulo de crescimento celular, organogênese, iniciação de embriogênese somática e desenvolvimento do meristema apical. Em um aspecto, o polinucleotídeo heterólogo é WUS ou ODP2 (BBM). Em um aspecto, expressão do polinucleotídeo altera o fenótipo da dita planta. Em um aspecto, um cassete de expressão é fornecido, em que o mesmo compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende um fragmento funcional que tem atividade promotora, sendo que o fragmento é derivado de uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27. Em um aspecto, o elemento regulador é expresso em um embrião. Em um aspecto, uma célula vegetal é fornecida, sendo que o elemento regulador é expresso em uma folha. Em um aspecto, uma célula vegetal é fornecida, sendo que o elemento regulador é expresso em um embrião e uma folha.
[0013] Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece um método para expressar um polinucleotídeo em uma planta ou uma célula vegetal, sendo que o método compreende introduzir na planta ou na célula vegetal um cassete de expressão que compreende um elemento regulador, sendo que o elemento regulador compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27 ou uma sequência que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27; (b) uma sequência de nucleotídeos que compreende um fragmento ou uma variante da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27, sendo que a sequência inicia a transcrição em uma célula vegetal; e (c) uma sequência de nucleotídeos que é complementar a (a) ou (b). Em um aspecto, o elemento regulador é operacionalmente associado a um polinucleotídeo heterólogo. Em um aspecto, o polinucleotídeo heterólogo de interesse codifica um produto genético que está envolvido em tolerância à seca, metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula tronco, estímulo de crescimento celular, organogênese, iniciação de embriogênese somática e desenvolvimento do meristema apical. Em um aspecto, o produto genético está envolvido em tolerância ao estresse abiótico. Em um aspecto, o polinucleotídeo heterólogo de interesse codifica um produto genético que confere tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a patógenos ou resistência a insetos. Em um aspecto, a planta é uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea ou a dicotiledônea é selecionada dentre o grupo que consiste em: maís, sorgo, arroz, soja, trigo, algodão e Brassica.
[0014] Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece um método para expressar um polinucleotídeo de interesse em uma planta, sendo que o método compreende introduzir em uma célula vegetal um elemento regulador heterólogo que tem capacidade para aumentar a expressão do polinucleotídeo de interesse, sendo que o elemento regulador heterólogo compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27 ou uma sequência que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27; (b) uma sequência de nucleotídeos que compreende pelo menos um fragmento de 100 bp da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27, sendo que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal; e (c) uma sequência de nucleotídeos que é complementar a (a) ou (b). Em um aspecto, o polinucleotídeo de interesse codifica um polipeptídeo que está envolvido em desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula tronco, estímulo de crescimento celular, organogênese, iniciação de embriogênese somática, desenvolvimento do meristema apical e uma combinação dos mesmos. Em um aspecto, o polinucleotídeo de interesse é um gene endógeno da planta. Em um aspecto, o polinucleotídeo de interesse codifica um polipeptídeo que confere tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a patógenos ou resistência a insetos. Em um aspecto, a planta é uma dicotiledônea ou uma monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea ou a dicotiledônea é selecionada dentre o grupo que consiste em: maís, sorgo, arroz, soja, trigo, algodão e Brassica.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS
[0015] A Figura 1 ilustra um corte transversal longitudinal de um embrião imaturo de maís sob um estereomicroscópio de epifluorescência, com o eixo geométrico de embrião no fundo e o escutelo acima. Em embriões que expressam PLTP PRO::Zs- GREEN1::pinII, fluorescência verde forte foi observada em células na superfície escutelar.
[0016] A Figura 2A e a Figura 2B ilustram epiderme de folha de maís em uma planta que contém um cassete transgênico com o promotor de PLTP de maís que conduz expressão de proteína fluorescente ZS-GREEN1. Fluorescência foi observada em apenas dois tipos celulares; as células acessórias que flanqueiam as células de proteção dos estomas (indicadas por setas na Figura 2A) e em células curtas (também denominadas células de cortiça, indicadas pelas setas na Figura 2B). A imagem foi obtida com o uso de um microscópio de epifluorescência composto.
[0017] A Figura 3 ilustra que a fluorescência verde foi observada em pelos de seda em plantas de maís que expressam PLTP PRO::ZS-GREEN1::pinII. A imagem foi obtida com o uso de um estereomicroscópio de epifluorescência.
[0018] A Figura 4 ilustra que fluorescência verde foi observada em diversos embriões somáticos em desenvolvimento individuais na superfície de um embrião imaturo zigótico transformado com um T-DNA que contém NOS PRO::ZM-WUS2::ZM-IN2-1 TERM + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM + ZM-PLTP PRO::ZS- GREEN1::PINII TERM. A imagem foi obtida com o uso de um estereomicroscópio de epifluorescência.
[0019] A Figura 5 ilustra a expressão do gene de Proteína de Transferência de Fosfolipídeo de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-PLTP) (SEQ ID NO: 1). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0020] A Figura 6 ilustra a expressão do gene homólogo 1 de Proteína de Transferência de Fosfolipídeo de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-PLTP1) (SEQ ID NO:3). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0021] A Figura 7 ilustra a expressão do gene homólogo 2 de Proteína de Transferência de Fosfolipídeo de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-PLTP2) (SEQ ID NO: 4). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0022] A Figura 8 ilustra a expressão do gene Frutose-1,6- bisfosfatase de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-FBP) (SEQ ID NO: 10). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0023] A Figura 9 ilustra a expressão do gene de proteína que contém domínio de ligação NAD(P) de dobra Rossmann de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-RFP) (SEQ ID NO: 11). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0024] A Figura 10 ilustra a expressão do gene de proteína de tipo proteína associada à membrana plasmática de Adipócito de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-APMP) (SEQ ID NO: 12). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0025] A Figura 11 ilustra a expressão do gene de proteína de domínio de ferro e enxofre Rieske (2Fe-2S) de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-RfeSP) (SEQ ID NO: 13). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0026] A Figura 12 ilustra a expressão do gene 6 de redução de Clororrespiração de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-CRR6) (SEQ ID NO: 14). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0027] A Figura 13 ilustra a expressão do gene D-glicerato 3- quinase de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-G3K) (SEQ ID NO: 15). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0028] A Figura 14 ilustra a expressão do gene 7 de proteína de ligação a-b de Clorofila de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-CAB7) (SEQ ID NO: 16). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0029] A Figura 15 ilustra a expressão do gene de proteína Ultravioleta-B-repressível de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-UBR) (SEQ ID NO: 17). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0030] A Figura 16 ilustra a expressão do gene de proteína de família de ligação ao hemo e Soul de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-HBP) (SEQ ID NO: 18). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0031] A Figura 17 ilustra a expressão do gene psi-N de subunidade de centro de reação de Fotossistema I de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-PS1-N) (SEQ ID NO: 19). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0032] A Figura 18 ilustra a expressão do gene desidrogenase/redutase de cadeia curta de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-SDR) (SEQ ID NO: 20). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0033] A Figura 19 ilustra a expressão do gene de ubiquitina de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-UBI) (SEQ ID NO: 31). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0034] A Figura 20 ilustra a expressão do gene lactoilglutationa liase de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-LGL PRO) (SEQ ID NO: 25). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0035] A Figura 21 ilustra a expressão do gene Lea-14-A de proteína abundante embriogênica late de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-LEA14-A PRO) (SEQ ID NO: 26). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0036] A Figura 22 ilustra a expressão do gene Lea34-D de proteína abundante embriogênica late de maís endógeno através de seu promotor nativo (ZM-LEA34-D PRO) (SEQ ID NO: 27). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0037] A Figura 23 ilustra a expressão do gene fator 1A de alongamento de soja endógeno através de seu promotor nativo (GM- EF1A) (SEQ ID NO: 32). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0038] A Figura 24 ilustra a expressão do gene Protein3 de Transferência de Lipídio de soja endógeno através de seu promotor nativo (GM-LTP3) (SEQ ID NO: 21). Níveis de transcrição com base em Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados em Partes Por Dez Milhões (PPTM).
[0039] A Figura 25 mostra resposta de transformação conforme medida pela frequência de cotiledôneas imaturas tratadas que produziram embriões somáticos após transformação mediada por Agrobacterium para introduzir um T-DNA que contém um cassete de expressão com o gene Arabidopsis WUS atrás de um dos cinco promotores; promotor Gm-Phytochrome P450 (P450 PRO); promotor Gm-Glycosyl Hydrolase (GH PRO); promotor de proteína de domínio Gm-Homeodomain/Start (HSD PRO); promotor Gm-LTP3 (LTP3 PRO); promotor Gm-Strictosidine Synthase-Like1 (SSL1 PRO); o controle negativo sem expressão de WUS (NEG CON). Para cada promotor, as extremidades superior e inferior da caixa indicam o quartil superior e inferior para a distribuição dos dados, enquanto a linha dentro da caixa representa a mediana. Para o P450 PRO apenas duas réplicas foram incluídas nessa análise e, então, nenhuma mediana foi calculada.
[0040] A Figura 26A mostra uma micrografia de luz e a Figura 26B mostra a imagem epifluorescente correspondente de embriões somáticos que foram movidos para o meio de maturação para concluir o desenvolvimento do embrião (mostrado no meio de maturação 35 dias após a cotiledônea imatura subjacente ser transformada com um T-DNA contendo Gm-LTP3 PRO::At-WUS). A seta aponta para uma das cotiledôneas somáticas fluorescentes vermelhas; as barras de escala representam 2 mm de comprimento.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0041] A revelação se refere a composições e métodos direcionados a promotores de planta e métodos de seu uso. As composições da revelação compreendem sequências de nucleotídeos para promotores preferenciais de tecido conhecidos como ZM-PLTP (SEQ ID NO: 1), ZM-PLTP1 (SEQ ID NO: 3), ZM-PLTP2 (SEQ ID NO: 4), SB-PLTP1 (SEQ ID NO: 2), SBPLTP2 (SEQ ID NO: 5), SB-PLTP3 (SEQ ID NO: 6), OS-PLTP1 (SEQ ID NO: 8) , OS-PLTP2 (SEQ ID NO: 9), SI-PLTP1 (SEQ ID NO: 7), ZM-FBP1 (SEQ ID NO: 10), ZM-RFP (SEQ ID NO: 11), ZM-APMP (SEQ ID NO: 12), ZM-RfeSP (SEQ ID NO: 13), ZM-CRR6 (SEQ ID NO: 14), ZM-G3K (SEQ ID NO: 15), ZM-CAB7 (SEQ ID NO: 16), ZM-UBR (SEQ ID NO: 17), ZM-HBP (SEQ ID NO: 18), ZM-PS1-N (SEQ ID NO: 19), ZM-SDR (SEQ ID NO: 20), OS-SDR (SEQ ID NO: 23), SB-SDR (SEQ ID NO: 24), ZM-SDR(longo) (SEQ ID NO: 22), ZM-LGL (SEQ ID NO: 25), ZM-LEA14-A (SEQ ID NO: 26), ZM-LEA34-D (SEQ ID NO: 27) e GM-LTP3 (SEQ ID NO: 21). As composições compreendem adicionalmente construtos de DNA que compreendem uma sequência de nucleotídeos para os promotores acima operacionalmente ligados a uma sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse. Em particular, a presente revelação fornece moléculas de ácido nucleico que compreendem pelo menos uma das sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 a 27, e fragmentos, variantes e complementos das mesmas. Um resumo das SEQ ID NOS: 1 a 32 é apresentado na Tabela 1. Tabela 1. Resumo das SEQ ID NOS: 1 a 32.
[0042] As sequências reguladoras da presente revelação incluem construtos de nucleotídeo que permitem iniciação de transcrição em uma planta. Em aspectos específicos, os promotores de PLTP e outros promotores permitem iniciação de transcrição de uma maneira preferencial de tecido. Tais construtos da revelação compreendem regiões de iniciação de transcrição regulada associadas à regulação de desenvolvimento de planta. Assim, as composições da presente revelação incluem construtos de DNA que compreendem uma sequência de nucleotídeos de interesse operacionalmente ligada a um promotor vegetal, mais particularmente um promotor de PLTP e/ou outros promotores descritos no presente documento, e uma sequência de 5'UTR. Sequências que compreendem promotores de PLTP a partir de maís, sorgo, arroz e Setaria são apresentadas no presente documento como SEQ ID NOS: 1 a 9.
[0043] Os promotores da revelação são úteis para expressar sequências. Em aspectos específicos, as sequências de promotor da revelação são úteis para expressar sequências de interesse, particularmente de uma maneira preferencial de tecido. As sequências de nucleotídeos da revelação também encontram uso na construção de vetores de expressão para expressão subsequente de uma sequência de nucleotídeos heterólogos em uma planta de interesse ou como sondas para o isolamento de outros promotores. Em particular, a presente revelação fornece construtos de DNA isolados que compreendem as sequências de promotor de nucleotídeos apresentadas em pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27 operacionalmente ligadas a uma sequência de nucleotídeos de interesse.
[0044] Aspectos da revelação incluem uma molécula de ácido nucleico que compreende um elemento regulador que tem uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em: uma sequência com pelo menos 70% de identidade com pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27; um fragmento ou uma variante da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27, sendo que a sequência inicia a transcrição em uma célula vegetal; um polinucleotídeo que é complementar ao polinucleotídeo de (a) ou (b); e um polinucleotídeo que compreende pelo menos 100 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27; e sendo que o elemento regulador é operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo de interesse. Também é incorporado um cassete de expressão que compreende o elemento regulador que contém o ácido nucleico, um vetor que compreende o cassete de expressão e uma célula vegetal que compreende o cassete de expressão. Aspectos adicionais incluem a célula vegetal, sendo que o dito cassete de expressão é estavelmente integrado ao genoma da célula vegetal, de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas, e em que a planta compreende o cassete de expressão descrito, se a planta monocotiledônea ou dicotiledônea, inclui maís, sorgo, arroz, soja, trigo, algodão ou Brassica. Também é incorporado um elemento regulador preferencial de tecido.
[0045] Também é incorporada uma planta com o cassete de expressão descrito estavelmente incorporado ao genoma da planta, uma semente da planta, sendo que a semente compreende o cassete de expressão e uma planta, em que o polinucleotídeo heterólogo de interesse codifica um fator de transcrição. É adicionalmente incorporada uma planta em que o dito gene ou produto genético confere tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a patógenos ou resistência a insetos. Uma planta em que a expressão do dito polinucleotídeo altera o fenótipo da dita planta também é incorporada. Também é incorporado um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende um fragmento funcional que tem atividade promotora, sendo que o fragmento é derivado de uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1 a 27. Também é incorporada uma planta, sendo que o dito cassete de expressão é transitoriamente expresso na célula vegetal. É adicionalmente incorporada uma planta, em que o polinucleotídeo heterólogo é WUS ou ODP2 (BBM). É adicionalmente incorporada uma célula vegetal, em que o elemento regulador é expresso em um embrião, uma folha ou um embrião e uma folha.
[0046] Um aspecto adicional inclui um método para expressar um polinucleotídeo em uma planta ou uma célula vegetal, sendo que o dito método compreende introduzi na planta ou na célula vegetal um cassete de expressão que compreende um elemento regulador, sendo que o dito elemento regulador compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em: uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27 ou uma sequência que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27; uma sequência de nucleotídeos que compreende um fragmento ou uma variante da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27, sendo que a sequência inicia a transcrição em uma célula vegetal; e uma sequência de nucleotídeos que é complementar a (a) ou (b).
[0047] Aspectos também incluem: o método em que o elemento regulador é operacionalmente associado a um polinucleotídeo heterólogo, o método em que o polinucleotídeo heterólogo de interesse codifica um produto genético que está envolvido em tolerância à seca, metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula tronco, estímulo de crescimento celular, organogênese, embriogênese somática, iniciação e desenvolvimento do meristema apical, o método em que o dito produto genético está envolvido em tolerância ao estresse abiótico, o método em que o polinucleotídeo heterólogo de interesse codifica um produto genético que confere tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a patógenos ou resistência a insetos, e o método em que a dita planta é uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea.
[0048] Aspectos adicionais incluem um método para expressar um polinucleotídeo de interesse em uma planta, sendo que o dito método compreende introduzir em uma célula vegetal um elemento regulador que tem capacidade para aumentar a expressão de um polinucleotídeo de interesse, sendo que o elemento regulador heterólogo compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em: uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27 ou uma sequência que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27; uma sequência de nucleotídeos que compreende pelo menos um fragmento de 100 bp da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27 e uma sequência de nucleotídeos que é complementar a (a) ou (b), sendo que a sequência inicia a transcrição em uma célula vegetal.
[0049] Também são incorporados: um método em que o polinucleotídeo de interesse codifica um polipeptídeo que está envolvido em desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula tronco, estímulo de crescimento celular, organogênese, iniciação de embriogênese somática, desenvolvimento do meristema apical e uma combinação dos mesmos, o método em que o polinucleotídeo de interesse é um gene endógeno da planta, o método em que o polinucleotídeo de interesse codifica um polipeptídeo que confere tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a patógenos ou resistência a insetos, o método em que a dita planta é uma dicotiledônea ou uma monocotiledônea, e o método em que a monocotiledônea ou dicotiledônea é selecionada dentre o grupo que consiste em: maís, sorgo, arroz, soja, trigo, algodão e Brassica.
[0050] A revelação engloba composições de ácido nucleico substancialmente purificadas ou isoladas. Uma molécula de ácido nucleico "isolada" ou "purificada" ou porção biologicamente ativa da mesma é substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida através de técnicas recombinantes ou substancialmente livre de precursores químicos ou outras substâncias químicas quando quimicamente sintetizada. Um ácido nucleico "isolado” é substancialmente livre de sequências (que incluem sequências codificadoras de proteína) que naturalmente flanqueiam o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Por exemplo, em vários aspectos, a molécula de ácido nucleico isolada pode conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de nucleotídeos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico em DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado. As sequências da revelação podem ser isoladas da região não traduzida 5’ que flanqueia seus respectivos locais de iniciação de transcrição.
[0051] Fragmentos e variantes das sequências de nucleotídeo de promotor reveladas também são abrangidos pela presente revelação. Em particular, fragmentos e variantes das sequências de promotor de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27 podem ser usados nos construtos de DNA da revelação. Conforme usado no presente documento, o termo "fragmento" se refere a uma porção da sequência de ácidos nucleicos. Fragmentos de sequências reguladoras retêm a atividade biológica de iniciar transcrição, tal como conduzir transcrição de uma maneira constitutiva. Alternativamente, fragmentos de uma sequência de nucleotídeos que são úteis como sondas de hibridização podem não necessariamente reter atividade biológica. Fragmentos de uma sequência de nucleotídeos para as regiões reguladoras reveladas no presente documento podem estar na faixa de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, e até o comprimento completo de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27.
[0052] Uma porção biologicamente ativa de um promotor pode ser preparada isolando-se uma porção das sequências de promotor da revelação, e avaliando-se a atividade promotora da porção. Moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência de promotores de nucleotídeos compreendem pelo menos cerca de 16, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 ou 800 nucleotídeos ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência reguladora de comprimento completo revelada no presente documento.
[0053] Conforme usado no presente documento, o termo "variantes" destina-se a significar sequências que têm similaridade substancial com uma sequência de promotores revelada no presente documento. Uma variante compreende uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais internos dentro do polinucleotídeo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais no polinucleotídeo nativo. Conforme usado no presente documento, uma sequência de nucleotídeos "nativa" compreende uma sequência de nucleotídeos de ocorrência natural. Para sequências de nucleotídeos, variantes de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bastante conhecidas, tais como, por exemplo, com técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR) e de hibridização conforme delineado no presente documento.
[0054] As sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas, como aquelas geradas, por exemplo, usando-se mutagênese de local direcionado. De modo geral, variantes de uma sequência de nucleotídeos particular dos aspectos terá pelo menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, a 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com aquela sequência de nucleotídeos particular conforme determinado pelos programas de alinhamento de sequência descritos em outro lugar no presente documento com o uso de parâmetros padrão. Variantes biologicamente ativas também são englobadas pelos aspectos. Variantes biologicamente ativas incluem, por exemplo, as sequências de promotor nativas dos aspectos que têm uma ou mais substituições, deleções ou inserções de nucleotídeo. Atividade promotora pode ser medida com o uso de técnicas, tais como análise Northern blot, medições de atividade de repórter obtidas a partir de fusões transcricionais, e semelhantes. Consultar, por exemplo, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), doravante "Sambrook," incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. Alternativamente, níveis de um gene repórter, tal como proteína verde fluorescente (GFP) ou proteína amarelo fluorescente (YFP) ou semelhantes produzidos sob o controle de um fragmento ou uma variante de promotor podem ser medidos. Consultar, por exemplo, Matz et al. (1999) Nature Biotechnology 17:969 a 973; documento de Patente no U.S. 6.072.050, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência; Nagai, et al., (2002) Nature Biotechnology 20(1):87 a 90. As sequências de nucleotídeos variantes também abrangem as sequências derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico, como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais sequências de nucleotídeos diferentes para o promotor podem ser manipuladas para criar um novo promotor. Dessa maneira, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequência relacionada que compreendem regiões de sequência que têm identidade de sequência substancial e podem ser recombinadas de modo homólogo in vitro ou in vivo. As estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91:10.747 a 10.751; Stemmer, (1994) Nature 370:389 a 391; Crameri, et al., (1997) Nature Biotech. 15:436 a 438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336 a 347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 94:4.504 a 4.509; Crameri, et al. , (1998) Nature 391:288 a 291 e documentos de Patente no U.S. 5.605.793 e 5.837.458, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0055] Métodos para mutagênese e alterações de sequência de nucleotídeos são bastante conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Kunkel, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82:488 a 492; Kunkel, et al., (1987) Methods in Enzymol. 154:367 a 382; documento de Patente no U.S. 4.873.192; Walker e Gaastra, edições (1983) Techniques in Molecular Biology (Companhia de Publicação MacMillan, Nova Iorque) e as referências citadas nas mesmas, incorporadas no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0056] As sequências de nucleotídeos da revelação podem ser usadas para isolar sequências correspondentes de outros organismos, particularmente outras plantas, mais particularmente outras monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Dessa maneira, métodos, tais como PCR, hibridização e semelhantes podem ser usados para identificar tais sequências com base em sua homologia de sequência com as sequências apresentadas no presente documento. Sequências isoladas com base em sua identidade de sequência com as sequências inteiras apresentadas no presente documento ou com fragmentos das mesmas estão englobadas pela presente revelação.
[0057] Em uma abordagem de PCR, iniciadores de oligonucleotídeo podem ser projetados para uso em reações de PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse. Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook, supra. Consultar também, Innis, et al., edições (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, edições (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis e Gelfand, edições (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Métodos conhecidos de PCR incluem, porém não se limitam aos métodos que usam iniciadores pareados, iniciadores aninhados, iniciadores únicos específicos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos de gene, iniciadores específicos de vetor, iniciadores parcialmente não correspondidos e semelhantes.
[0058] Em técnicas de hibridização, toda ou parte de uma sequência de nucleotídeos conhecida é usada como uma sonda que se hibridiza seletivamente com outras sequências de nucleotídeos correspondentes presente em uma população de fragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de cDNA (isto é, bibliotecas de genômicas ou de cDNA) a partir de um organismo escolhido. As sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos, e podem ser marcadas com um grupo detectável, tal como 32P, ou qualquer outro marcador detectável. Assim, por exemplo, sondas para hibridização podem ser produzidas marcando- se oligonucleotídeos sintéticos com base nas sequências reguladoras da revelação. Métodos para preparação de sondas para hibridização e para construção de bibliotecas genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook, supra.
[0059] Por exemplo, a sequência reguladora inteira revelada no presente documento, ou uma ou mais porções da mesma, pode ser usada como uma sonda que tem capacidade para hibridizar especificamente com sequências reguladoras de dicotiledônea correspondentes e RNAs mensageiros. Para obter hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas dentre sequências reguladoras e são, de modo geral, de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos em comprimento ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos em comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar sequências reguladoras correspondentes a partir de uma planta escolhida através de PCR. Essa técnica pode ser usada para isolar sequências de codificação adicionais a partir de um organismo desejado ou como um ensaio diagnóstico para determinar a presença de sequências de codificação em um organismo. Técnicas de hibridização incluem exame de hibridização de bibliotecas de DNA em placa (sejam placas ou colônias, consultar, por exemplo, Sambrook, supra).
[0060] A hibridização de tais sequências pode ser executada sob condições estringentes. Os termos "condições severas" ou “condições de hibridização severas" são destinados a significar condições sob as quais uma sonda hibridizará para sua sequência- alvo até um grau maior de modo detectável do que outras sequências (por exemplo, pelo menos fundo de 2 vezes). As condições estringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Controlando-se a estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, as sequências direcionadas que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma não correspondência entre as sequências de modo que graus menores de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda é menor que cerca de 1.000 nucleotídeos em comprimento, menor de modo ideal que 500 nucleotídeos em comprimento.
[0061] Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor que cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é de pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (por exemplo, maiores que 50 nucleotídeos). As condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, como formamida. Condições de baixa estringência exemplificativas incluem hibridização com uma solução de tampão de formamida a 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS a 1% (sulfato de dodecila de sódio) a 37 °C e uma lavagem em SSC de 1 vez a 2 vezes (SSC de 20 vezes = NaCl 3,0 M/citrato trissódico 0,3 M) em 50 a 55 °C. Condições de estringência moderada exemplificativas incluem hibridização em formamida a 40 a 45%, NaCl 1,0 M, SDS a 1% a 37 °C e uma lavagem em SSC de 0,5 vez a 1 vez de em 55 a 60 °C. Condições de estringência alta exemplificativa incluem hibridização em formamida a 50%, NaCl 1 M, SDS a 1% a 37 °C e um lavagem final em SSC de 0,1 vez em 60 a 65 °C por uma duração de pelo menos 30 minutos. A duração de hibridização é geralmente menor que cerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem será pelo menos um comprimento de tempo suficiente para alcançar o equilíbrio.
[0062] A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hibridização, em que os fatores críticos são a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos de DNA e DNA, o ponto de fusão térmica (Tm) pode ser aproximado da equação de Meinkoth e Wahl, (1984) Anal. Biochem 138:267 a 284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (% de GC) - 0,61 (% de form) - 500/l; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, % de GC é a porcentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, % de form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e l é o comprimento dos pares de base em híbrido. A Tf é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% de uma sequência-alvo complementar hibrida com uma sonda perfeitamente correspondente. Tmé reduzida em cerca de 1 °C para cada 1% de incompatibilidade, assim, Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com sequências da identidade desejada. Por exemplo, se as sequências com 90% de identidade são observadas, a Tm pode ser diminuída 10 °C. De modo geral, condições estringentes são selecionadas de modo a serem cerca de 5 °C menores que a Tm para a sequência específica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos. No entanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4 °C menor que a Tm; condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10 °C menor que a Tm; condições de estringência baixa podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20 °C menor que a Tm. Usando a equação, composições de hibridação e lavagem, e Tf desejada, os com perícia habitual entenderão que são inerentemente descritas variações na estringência das soluções de hibridação e/ou lavagem. Se o grau desejado de emparelhamentos defeituosos originar uma Tf menor do que 45 °C (solução aquosa) ou 32 °C (solução de formamida), é preferencial aumentar a concentração de SSC de modo a poder ser usada uma temperatura mais elevada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos encontra-se em Tijssen, (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte 1, Capítulo 2 (Elsevier, Nova Iorque); e Ausubel, et al., edições (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova Iorque), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Também consultar, Sambrook.
[0063] Assim, sequências isoladas que têm atividade promotora constitutiva e que hibridizam sob condições estringentes com as sequências reguladoras reveladas no presente documento ou com fragmentos das mesmas, são englobadas pela presente revelação.
[0064] Em geral, as sequências que têm atividade promotora e hibridizam com as sequências de promotor reveladas no presente documento serão pelo menos 40% a 50% homólogas, cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% a 98% homólogas ou mais com as sequências reveladas. Isto é, a similaridade de sequência de sequências pode estar na faixa de, compartilhando pelo menos cerca de 40% a 50%, cerca de 60% a 70% e cerca de 80%, 85%, 90%, 95% a 98% de similaridade de sequência.
[0065] Os termos a seguir são usados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais ácido nucleicos ou polinucleotídeos: (a) "sequência de referência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade de sequência", (d) "porcentagem de identidade de sequência" e (e) "identidade substancial".
[0066] Conforme usado no presente documento, "sequência de referência" é uma sequência definida usada como base para comparação de sequências. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma sequência especificada; por exemplo, como um segmento de um cDNA ou sequência genética de comprimento completo ou o cDNA ou sequência genética completa.
[0067] Conforme usado no presente documento, "janela de comparação" faz referência a um segmento contíguo e especificado de uma sequência de polinucleotídeos, sendo que a sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. De modo geral, a janela de comparação é de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos em comprimento e, opcionalmente, pode ser de 30, 40, 50, 100 ou mais longa. Aqueles de habilidade na técnica entendem que para evitar uma alta similaridade com uma sequência de referência devido a inclusão de lacunas na sequência de polinucleotídeos, uma penalidade de lacuna é tipicamente introduzida e é subtraída do número de correspondências.
[0068] Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Desse modo, a determinação de porcentagem de identidade de sequência entre quaisquer duas sequências pode ser alcançada com o uso de um algoritmo matemático. Exemplos sem limitação de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller, (1988) CABIOS 4:11 a 17; o algoritmo de Smith, et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de Needleman e Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443 a 453; o algoritmo de Pearson e Lipman, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2.444 a 2.448; o algoritmo de Karlin e Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 872:264, modificado como em Karlin e Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:5.873 a 5.877, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0069] As implantações de computador desses algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de sequências para determinar a identidade de sequência. Tais implantações incluem, mas sem limitação: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível a partir de Intelligenetics, Mountain View, Calif.); o programa ALIGN (Versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA em GCG Wisconsin Genetics Software Package®, Versão 10 (disponível a partir de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Calif., U.S.). Os alinhamentos com o uso desses programas podem ser realizados com o uso de parâmetros padrão. O programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins, et al., (1988) Gene 73:237 a 244 (1988); Higgins, et al., (1989) CABIOS 5:151 a 153; Corpet, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:10.881 a 10.890; Huang, et al., (1992) CABIOS 8:155 a 165; e Pearson, et al., (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 a 331, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. O programa ALIGN é com base no algoritmo de Myers e Miller, (1988) supra. Uma tabela de peso de resíduo PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12, e uma penalidade de lacuna de 4 pode ser usada com o programa ALIGN durante a comparação de sequências de aminoácidos. Os programas BLAST de Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência, são com base no algoritmo de Karlin e Altschul, (1990) supra. Buscas por nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeos homólogas a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína da revelação. Buscas por proteína BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma proteína ou polipeptídeo da revelação. Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado conforme descrito em Altschul, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3.389, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser usado para realizar uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas. Consultar Altschul, et al., (1997) supra. Durante a utilização de BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTN para sequências de nucleotídeos, BLASTX para proteínas) podem ser usados. Consultar, o site na internet para o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia na internet em ncbi.nlm.nih.gov. O alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.
[0070] A não ser que determinado de outro modo, os valores de identidade/similaridade de sequência fornecidos no presente documento se referem ao valor obtido com o uso de GAP Versão 10 com o uso dos seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos com o uso de Peso de GAP de 50 e Peso do Comprimento de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade e % de similaridade para uma sequência de aminoácidos usando Peso de GAP de 8 e Peso do Comprimento de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62; ou qualquer programa equivalente a estes. Conforme usado no presente documento, "programa equivalente” é qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem correspondências de resíduo de nucleotídeo ou aminoácido idênticas e uma porcentagem de identidade de sequência idêntica quando em comparação com o alinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10.
[0071] O programa GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch, supra, para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de lacunas. GAP considera todos os alinhamentos e posições de lacuna possíveis e cria o alinhamento com o maior número de bases correspondidas e o menor número de lacunas. O mesmo permite a provisão de uma penalidade de criação de lacuna e uma penalidade de extensão de lacuna em unidades de bases correspondidas. GAP deve se beneficiar do número de penalidade de criação de lacuna penalidade de correspondências para cada lacuna que insere. Se uma penalidade de extensão de lacuna maior que zero for escolhida, GAP deve, além disso, se beneficiar de cada lacuna inserida do comprimento da lacuna vezes a penalidade de extensão de lacuna. Valores de penalidade de criação de lacuna padrão e valores de penalidade de extensão de lacuna na Versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package® para sequências de proteína são 8 e 2, respectivamente. Para as sequências de nucleotídeos, a penalidade de criação de lacuna padrão é 50 enquanto a penalidade de extensão de lacuna padrão é 3. As penalidades de criação de lacuna e extensão de lacuna podem ser expressas como um número inteiro selecionado dentre o grupo de números inteiros que consiste em 0 a 200. Desse modo, por exemplo, as penalidades de criação de lacuna e extensão de lacuna podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou maiores.
[0072] GAP apresenta um membro da família de melhores alinhamentos. Pode haver muitos membros dessa família, mas nenhum outro membro tem uma qualidade melhor. GAP exibe quatro figuras de mérito para alinhamentos: Qualidade, Razão, Identidade e Similaridade. A Qualidade é a medida maximizada a fim de alinhar as sequências. A razão é a qualidade dividida pelo número de bases no segmento mais curto. A Porcentagem de Identidade é o por cento dos símbolos que se correspondem realmente. A Porcentagem de Similaridade é o por cento dos símbolos que são similares. Os símbolos que estão através das lacunas são ignorados. A similaridade tem escore quando o valor de matriz de escore para um par de símbolos é maior ou igual a 0,50, o limiar de similaridade. A matriz de pontuação usada na Versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package® é BLOSUM62 (consultar, Henikoff e Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10.915, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência).
[0073] Conforme usado no presente documento, "identidade de sequência" ou "identidade" no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo faz referência aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada. Quando a porcentagem de identidade de sequência é usada em referência às proteínas se reconhece que as posições de resíduo que não são idênticas se diferem frequentemente por substituições de aminoácido conservadoras, em que resíduos de aminoácido são substituídos por outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Quando as sequências diferem em substituições conservativas, a percentagem de identidade de sequência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. É dito que sequências que diferem por tais substituições conservativas têm "similaridade de sequência" ou "similaridade". Os meios para fazer esse ajuste são bem conhecidos pelos versados na técnica. Tipicamente, isso envolve a pontuação de uma substituição conservativa como um emparelhamento defeituoso parcial em vez de completo, aumentando assim a porcentagem de identidade de sequência. Assim, por exemplo, quando um aminoácido idêntico recebe uma pontuação de um e uma substituição não conservadora recebe uma pontuação de zero, uma substituição conservadora recebe uma pontuação entre zero e um. A pontuação de substituições conservadoras é calculada, por exemplo, conforme implantado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif.).
[0074] Conforme usado no presente documento, "porcentagem de identidade de sequência" significa o valor determinado comparando-se duas sequências alinhadas de maneira ideal sobre uma janela de comparação, sendo que a porção da sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições em que a mesma base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para gerar o número de posições correspondentes, dividindo-se o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resultado por 100 para gerar a percentagem de identidade de sequência.
[0075] O termo "identidade substancial" de sequências de polinucleotídeos significa que um polinucleotídeo compreende uma sequência que tem pelo menos 70% de identidade de sequência, de maneira ideal pelo menos 80%, de maneira mais ideal pelo menos 90% e de maneira ainda mais ideal pelo menos 95%, em comparação com uma sequência de referência que usa um programa de alinhamento que usa parâmetros padrão. Uma pessoa de habilidade na técnica reconhecerá que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar identidade correspondente de proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeos levando-se em conta degeneração de códon, similaridade de aminoácido, posicionamento de quadro de leitura e semelhantes. Identidade substancial de sequências de aminoácidos para esses fins significa normalmente identidade de sequência de pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% e pelo menos 95%.
[0076] Outra indicação que as sequências de nucleotídeos são substancialmente idênticas é se duas moléculas hibridizam uma a outra sob condições severas. Geralmente, as condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5 °C inferiores à Tm para a sequência específica a uma força iônica e pH definidos. Contudo, as condições estringentes abrangem temperaturas na gama de cerca de 1 °C a cerca de 20 °C inferiores à Tm, dependendo do grau de estringência desejado, como de outro modo aqui qualificado. Os ácidos nucleicos que não hibridam entre si sob condições estringentes são ainda substancialmente idênticos se os polipeptídeos que codificam forem substancialmente idênticos. Tal pode ocorrer, por exemplo, quando é criada uma cópia de um ácido nucleico usando a degenerescência máxima de códons permitida pelo código genético. Uma indicação de que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é quando o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico tem imunologicamente reatividade cruzada com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico.
[0077] As sequências reguladoras reveladas no presente documento, assim como variantes e fragmentos das mesmas, são úteis para engenharia genética de plantas, por exemplo, para a produção de uma planta transformada ou transgênica, para expressar um fenótipo de interesse. Tal como aqui utilizado, os termos "planta transformada" e "planta transgênica" se referem a uma planta que compreende dentro do seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo está integrado de forma estável no genoma de uma planta transgênica ou transformada de tal modo que o polinucleotídeo é passado para sucessivas gerações. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de uma construção de DNA recombinante. Deve ser entendido que, conforme usado no presente documento, o termo "transgênico" inclui qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte de planta ou planta em que o genótipo do mesmo foi alterado pela presença de ácido nucleico heterólogo que inclui aqueles transgênicos inicialmente alterados, assim como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexual a partir do transgênico inicial.
[0078] Um "evento" transgênico é produzido através de transformação de células vegetais com um construto de DNA heterólogo, que inclui um cassete de expressão de ácido nucleico que compreende um gene de interesse, a regeneração de uma população de plantas que resulta da inserção do gene transferido para o genoma da planta e seleção de uma planta particular caracterizada pela inserção em uma localização de genoma particular. Um evento é caracterizado fenotipicamente pela expressão do gene inserido. No nível genético, um evento é parte da composição genética de uma planta. O termo "evento" também se refere à progênie produzida através de um cruzamento sexual entre o transformante e outra planta em que a progênie inclui o DNA heterólogo.
[0079] Conforme usado no presente documento, o termo planta inclui plantas inteiras, órgãos de planta (por exemplo, folhas, talos, raízes, etc.), células vegetais, protoplastos vegetais, culturas de tecido de célula vegetal a partir das quais plantas podem ser regeneradas, calos de planta, tufos de planta e células vegetais que estão intactas em plantas ou partes de plantas, tais como embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramos, fruta, caroços, espigas, sabugos, cascas, caules, raízes, pontas de raiz, anteras e semelhantes. Grão destina-se a significar a semente madura produzida por produtores comerciais para propósitos diferentes de cultivo ou reprodução da espécie. Progênie, variantes e mutantes das plantas regeneradas também estão incluídas no escopo da revelação, visto que essas partes compreendem os polinucleotídeos introduzidos.
[0080] A presente revelação pode ser usada para transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas sem limitação, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de espécies de planta incluem milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milheto (por exemplo, mexoeira (Pennisetum glaucum), sementes de paniço (Panicum miliaceum), paniço (Setaria italica), milho moído (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterrabas (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), Setaria italica, aveia, cevada, vegetais, pomadas e coníferas.
[0081] Vegetais incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), feijões verdes (Phaseolus vulgaris), feijões-lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.) e membros do gênero Cucumis, tais como pepino (C. sativus), meloa (C. cantalupensis) e melão de casca (C. melo). Pomadas incluem azaleia (Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo.
[0082] Coníferas que podem ser empregadas na prática da presente revelação incluem, por exemplo, pinheiros, tais como pinus (Pinus taeda), pinheiro-americano (Pinus elliotii), ponderosa pinho (Pinusponderosa), pinheiro-da-praia (Pinus contorta) e pinheiro-de-Monterey (Pinus radiata); pinheiro-do- oregón (Pseudotsuga menziesii); tsuga-do-Canadá (Tsuga canadensis); espruce-branco (Picea glauca); sequóia (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros, tais como abeto-branco-do- pacífico (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea) e cedros, tais como tuia (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis). Em aspectos específicos, plantas da presente revelação são plantas cultivadas (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milheto, tabaco, etc.). Em outros aspectos, plantas de milho e soja são ideais, e em ainda outros aspectos plantas de milho são ideais.
[0083] Outras plantas de interesse incluem plantas de grão que fornecem sementes de interesse, plantas de semente oleaginosas e leguminosas. Sementes de interesse incluem sementes de grão, tais como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, etc. Plantas oleaginosas incluem algodão, soja, cártamo, girassol, Brassica, maís, alfafa, palmeira, coco, etc. Plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem goma guar, alfarrobeira, feno-grego, soja, feijão comum, feijão caupi, feijão mungo, feijão-de-lima, feijão-fava, lentilha, grão de bico, etc.
[0084] Conforme usado no presente documento, PLTP se refere ao gene de "Proteína de Transferência de Fosfolipídeo", que corresponde ao gene GRZM2G101958_T01 no conjunto de unigene público 5b.60 e está localizado no cromossomo de maís 10 em uma posição genética de 28,95 cM e uma posição física de 3.833.396 a 3.834.547 bases. Esse gene é expresso no embrião, em calo, nas células acessórias que flanqueiam as células de proteção dos estômatos, em pelos de seda e sob estresse hídrico, sob refrigeração e após uma geada. No presente documento, a expressão não ocorre em raízes, na borla (incluindo as anteras e pólen), na espiga verde, ou em grãos. No presente documento, sequências de PLTP, conforme reveladas aqui são ZM-PLTP (SEQ ID NO: 1), ZM- PLTP1 (SEQ ID NO: 3), ZM-PLTP2 (SEQ ID NO: 4), SB-PLTP1 (SEQ ID NO: 2), SB-PLTP2 (SEQ ID NO: 5), SB-PLTP3 (SEQ ID NO: 6), OS- PLTP1 (SEQ ID NO: 8), OS-PLTP2 (SEQ ID NO: 9) e SI-PLTP1 (SEQ ID NO: 7) e variantes e fragmentos das mesmas.
[0085] Conforme usado no presente documento, LTP3 se refere ao gene de Protein3 de Transferência de Lipídio que corresponde ao número de acesso Genbank XM-0066066884.2 localizado na posição física 47.778.536 a 4.776.537 no cromossomo de soja 20. Esse gene é expresso no embrião, na semente de desenvolvimento e em células cultivadas. No presente documento, a expressão não ocorre em raízes, talos, meristemas ou estruturas reprodutivas (flor ou vagem). No presente documento, sequência de LTP3 é GM- LTP3 (SEQ ID NO: 21) e variantes e fragmentos das mesmas.
[0086] A revelação se refere às composições e métodos elaborados para promotores de planta, tais como promotores de PLTP, e métodos de uso dos mesmos. Composições compreendem sequências de nucleotídeos para promotores preferenciais de tecido conhecidos como ZM-PLTP, ZM-PLTP1, ZM-PLTP2, SB-PLTP, SBPLTP2, SB-PLTP3, OS-PLTP, OS-PLTP2, SI-PLTP, ZM-FBP1, ZM-RFP, ZM-APMP, ZM-RfeSP, ZM-CRR6, ZM-G3K, ZM-CAB7, ZM-UBR, ZM-HBP, ZM- PS1-N, ZM-SDR, GM-LTP3, OS-SDR, SB-SDR, ZM-SDR(longo), ZM-LGL, ZM-LEA-14-A e LEA-34-D. (consultar a Tabela 1 no presente documento). Determinados aspectos da revelação compreendem a sequência de nucleotídeos apresentada em pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27 e fragmentos da sequência de nucleotídeos apresentada em pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27. Também estão incluídos fragmentos funcionais da sequência apresentada em pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1 a 27, que conduzem expressão preferencial de tecido de uma sequência de nucleotídeos operacionalmente ligada. A Tabela 1 fornece um resumo das SEQ ID NOS: 1 a 27. Determinados aspectos da revelação compreendem o uso de mais de uma das sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 a 27 no mesmo cassete de expressão e nos métodos descritos no presente documento para expressar um polinucleotídeo de interesse em uma planta ou uma célula vegetal.
[0087] Sequências codificadoras heterólogas expressas por uma sequência reguladora da revelação podem ser usadas para variar o fenótipo de uma planta. Várias alterações em fenótipo são de interesse em incluir expressão de modificação de um gene em uma planta, alterar um patógeno da planta ou mecanismo de defesa de inseto, aumentar uma tolerância da planta aos herbicidas, alterar desenvolvimento de planta para responder ao estresse ambiental, modular a resposta da planta ao sal, temperatura (quente e fria), seca e semelhantes. Esses resultados podem ser alcançados através da expressão de uma sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse que compreende um produto genético apropriado. Em aspectos específicos, a sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse é uma sequência vegetal endógena cujo nível de expressão é aumentado na planta ou parte de planta. Resultados podem ser obtidos fornecendo-se expressão alterada de um ou mais produtos de gene endógeno, particularmente hormônios, receptores, moléculas sinalizadoras, enzimas, transportadores ou cofatores ou afetando-se admissão de nutriente na planta. Expressão preferencial de tecido, conforme fornecida pelos promotores revelados no presente documento pode alterar expressão. Essas alterações resultam em uma alteração em fenótipo da planta transformada. Em determinados aspectos, visto que o modelo de expressão é preferencial de tecido, os modelos de expressão são úteis para diversos tipos de exame.
[0088] Categorias gerais de sequências de nucleotídeos de interesse para a presente revelação incluem, por exemplo, aqueles genes envolvidos em informações, tais como dedos de zinco, aqueles envolvidos em comunicação, tais como quinases e aqueles envolvido em gestão interna, tal como proteínas de choque de calor. Categorias mais específicas de transgenes incluem, por exemplo, genes codificantes de traços importantes para agronomia, resistência a insetos, resistência a doenças, resistência a herbicidas, resistência ao estresse ambiental (tolerância alterada ao frio, sal, à seca, etc.) e características de grão. Ainda outras categorias de transgenes incluem genes para induzir expressão de produtos exógenos, tais como enzimas, cofatores e hormônios de plantas e outros eucarioatas, assim como organismos procariotas. É reconhecido que qualquer gene de interesse pode ser operacionalmente ligado ao promotor da revelação e expresso na planta.
[0089] Traços agronomicamente importantes que afetam a qualidade de grão, tal como níveis e tipos de óleos, saturado e insaturado, qualidade e quantidade de aminoácidos essenciais, níveis de celulose, teor de amido e proteína podem ser geneticamente alterados com o uso dos métodos dos aspectos. Modificações para traços de grão incluem, porém sem limitação, aumentar o teor de ácido oleico, óleos saturados e insaturados, aumentar os níveis de lisina e enxofre, fornecer aminoácidos essenciais e modificar amido. Modificações de proteína de hordotionina em milho são descritas nos documentos de Patente no U.S. 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802 e 5.703.049; incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Outro exemplo é proteína de semente rica em lisina e/ou enxofre codificada pela albumina de soja 2S descrita no documento de Patente no U.S. 5.850.016, depositado em 20 de março de 1996 e o inibidor de quimotripsina da cevada, Williamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem 165:99 a 106, em que as revelações dos mesmos estão incorporadas no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0090] Genes de resistência a insetos podem codificar resistência às pestes que tem grande perda de rendimento, tal como crisomelídeo, lagarta rosca, broca europeia do milho e semelhantes. Tais genes incluem, por exemplo, genes de proteína tóxicos de Bacillus thuringiensis, documentos de Patente no U.S. 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881 e Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, em que as revelações dos mesmos estão incorporadas no presente documento em sua totalidade a título de referência. Genes codificantes de traços de resistência à doença incluem, por exemplo, genes de desintoxicação, tais como aqueles que desintoxicam fumonisina (documento de Patente no U.S. 5.792.931); avirulência (avr) e genes de resistência à doença (R) (Jones, et al., (1994) Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science 262:1.432; e Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1.089), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0091] Traços de resistência a herbicidas podem incluem genes que codificam resistência aos herbicidas que atuam para inibir a ação de acetolactato sintase (ALS), em particular os herbicidas de tipo sulfonilureia (por exemplo, o gene de acetolactato sintase (ALS) que contém mutações que levam a tal resistência, em particular as mutações de S4 e/ou Hra), genes que codificam resistência aos herbicidas que atuam para inibir a ação de glutamina sintase, tal como fosfinotricina ou basta (por exemplo, o gene bar), genes que codificam resistência ao glifosato (por exemplo, o gene EPSPS e o gene GAT; consultar, por exemplo, o documento de Patente no de Publicação U.S. 2004/0082770 e WO 03/092360, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência) ou outros tais genes conhecidos na técnica. O gene bar codifica resistência ao herbicida basta, o gene nptII codifica resistência aos antibióticos canamicina e geneticina e os mutantes de gene ALS codificam resistência ao herbicida clorsulfurão.
[0092] A resistência a glifosato é conferida por 5- enolpiruvil-3-fosfiquimato sintase mutante (EPSP) e genes aroA. Consultar, por exemplo, a Patente n° U.S. 4.940.835 para Shah, et al., a qual revela a sequência de nucleotídeo de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência a glifosato. A Patente n° U.S. 5.627.061 de Barry, et al., também descreve os genes codificantes de enzimas EPSPS. Também consultar, os documentos de Patente no U.S. 6.248.876 B1; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE 37.287 E e 5.491.288 e as publicações internacionais no WO 97/04103; WO 97/04114; WO 00/66746; WO 01/66704; WO 00/66747 e WO 00/66748, que estão incorporadas no presente documento em sua totalidade a título referência. Resistência ao glifosfato também é transmitida às plantas que expressam um gene que codifica uma enzima de oxido-redutase de glifosato, conforme descrito mais completamente nos documentos de Patente no U.S. 5.776.760 e 5.463.175, que estão incorporados no presente documento em sua totalidade a título referência. Além disso, a resistência a glifosato pode ser conferida a plantas pela superexpressão de genes codificadores de glifosato N-acetiltransferase. Consultar, por exemplo, os Pedidos de Patente no de série U.S. 11/405.845 e 10/427.692, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0093] Genes de esterilidade também podem ser codificados em um construto de DNA e fornecer uma alternativa para despendoamento físico. Exemplos de genes usados de tais maneiras incluem genes preferenciais de tecido masculino e genes com fenótipos de esterilidade masculina, tal como QM, descrito no documento de Patente no U.S. 5.583.210, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. Outros genes incluem quinases e aqueles que codificam compostos tóxicos para desenvolvimento gamenotrófico masculino e feminino.
[0094] Os traços comerciais também podem ser codificados em um gene ou genes que podem aumentar, por exemplo, o amido para a produção de etanol ou fornecer a expressão de proteínas. Outro importante uso comercial de plantas transformadas é a produção de polímeros e bioplásticos, tais como os descritos no documento de Patente no U.S. 5.602.321, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. Genes, tais como β- Cetotiolase, PHBase (sintase de poliidroxibutirato), e acetoacetil-CoA redutase (consultar, Schubert, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:5.837 a 5.847, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência) facilitam a expressão de poli-hidroxialcanoatos (PHAs).
[0095] Produtos exógenos incluem enzimas e produtos de planta, assim como aqueles de outras fontes que incluem procariotas e outros eucarioatas. Tais produtos incluem enzimas, cofatores, hormônios e semelhantes.
[0096] Exemplos de outros genes aplicáveis e seu fenótipo associado incluem o gene que codifica proteína de revestimento viral e/ou RNA, ou outros genes virais ou vegetais que conferem resistência viral; genes que conferem resistência fúngica; genes que promovem melhoramento de rendimento; e genes que fornecem resistência ao estresse, tal como ao frio, desidratação que resulta da seca, aquecimento e salinidade, metal tóxico ou elementos vestigiais ou semelhantes.
[0097] Em um aspecto, o promotor é usado para expressar transgenes envolvidos em desenvolvimento de órgão, células tronco, iniciação e desenvolvimento do meristema apical, tal como o gene Wuschel (WUS); consultar os documentos de Patente no U.S. 7.348.468 e 7.256.322 e o Pedido de Publicação de Patente no U.S. 20070271628 publicado em 22 de novembro de 2007, pela Pioneer Hi-Bred International; Laux et al. (1996) Development 122:87 a 96; e Mayer et al. (1998) Cell 95:805 a 815. Espera-se que a modulação de WUS module fenótipo de planta e/ou tecido vegetal que inclui estímulo de crescimento celular, organogênese e embriogênese somática. WUS também pode ser usado para melhorar a transformação por meio de embriogênese somática. Expressão de WUS de Arabidopse pode induzir células tronco em tecidos vegetativos, que podem se diferenciar em embriões somáticos (Zuo, et al. (2002) Plant J 30:349 a 359). Também de interesse a este respeito seria um gene MYB118 (consultar o documento de Patente no U.S. 7.148.402), gene MYB115 (consultar, Wang et al. (2008) Cell Research 224 a 235), gene BABYBOOM (BBM; consultar, Boutilier et al. (2002) Plant Cell 14:1.737 a 1.749), gene CLAVATA (consultar, por exemplo, o documento de Patente no U.S. 7.179.963) ou genes WOX (van der Graaff et al., 2009, Genome Biology 10:248; Dolzblasz et al., 2016, Mol. Plant 19:1.028 a 1039).
[0098] A título de ilustração, sem a intenção de ser limitante, a seguir há uma lista de outros exemplos dos tipos de genes que podem ser usados em combinação com as sequências reguladoras da revelação. 1. Transgenes Que Conferem Resistência Aos Insetos Ou Doença e Que Codificam: (A) Genes de resistência à doença de planta. Defesas de planta são frequentemente ativadas por interação específica entre o produto de um gene de resistência a doenças (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para modificar geneticamente plantas que são resistentes a cepas de patógenos específicos. Consultar, por exemplo, Jones, et al., (1994) Science 266:789 (clonagem do gene de Cf-9 de tomate para resistência ao Cladosporium fulvum); Martin, et al., (1993) Science 262:1.432 (gene Pto de tomate para resistência ao tomate Pseudomonas syringae pv. codifica uma proteína quinase); Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1.089 (gene Arabidopsis RSP2 para resistência ao Pseudomonas syringae); McDowell e Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4):178 a 183 e Toyoda, et al., (2002) Transgenic Res. 11(6):567 a 582, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. Uma planta resistente a uma doença é uma mais resistente a um patógeno em comparação à planta do tipo selvagem. (B) Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado na mesma. Consultar, por exemplo, Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, que revelou a clonagem e sequência de nucleotídeos de um fene de Bt delta- endotoxina. Além disso, moléculas de DNA que codificam genes delta-endotoxina podem ser adquiridos a partir da Coleção de Cultura de Tipo Americana (Rockville, MD), por exemplo, sob os números de acesso da ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998. Outros exemplos de transgenes de Bacillus thuringiensis que são geneticamente projetados são dados nos seguintes documentos de patente e pedidos de patente, e que são incorporados aqui a título de referência para esse fim: Os documentos de Patente no U.S. 5.188.960; 5.689.052; 5.880.275; WO 91/14778; WO 99/31248; WO 01/12731; WO 99/24581; WO 97/40162 e documentos de Patente no de série U.S. 10/032.717; 10/414.637 e 10/606.320, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. (C) Um hormônio específico de inseto ou ferormônio, tal como um hormônio ecdisteroide e juvenil, uma variante do mesmo, um mimético baseado no mesmo, ou um antagonista ou agonista do mesmo. Consultar, por exemplo, a revelação por Hammock, et al., (1990) Nature 344:458, de expressão baculovírus de hormônio esterase juvenil clonado, um inativador de hormônio juvenil, incorporada no presente documento em sua totalidade a título de referência. (D) Um peptídeo específico de inseto que, sob expressão, rompe a fisiologia da peste afetada. Por exemplo, consultar as revelações de Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (clonagem de expressão rende DNA codificante para receptor de hormônio diurético de inseto); Pratt, et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163:1.243 (uma alostatina é identificada em Diploptera puntata); Chattopadhyay, et al., (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1):33 a 54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2):300 a 310; Carlini e Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11):1.515 a 1.539; Ussuf, et al., (2001) Curr Sci. 80(7):847 a 853 e Vasconcelos e Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385 a 403, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Também consultar, o documento de Patente no U.S. 5.266.317 por Tomalski, et al., que revela genes codificantes de toxinas específicas de inseto, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. (E) Uma enzima responsável por uma hiperacumulação de um monterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoide ou outra diferente de proteína com atividade inseticida. (F) Uma enzima envolvida na modificação, que inclui a modificação pós-traducional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, seja natural ou sintética. Consultar, o Pedido PCT no WO 93/02197 no nome de Scott, et al., que revela a sequência de nucleotídeos de um gene calase, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. As moléculas de DNA que contêm sequências de codificação de quitinase podem ser obtidas, por exemplo, a partir da ATCC sob os números de acesso 39637 e 67152. Também consultar, Kramer, et al., (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691, que ensina a sequência de nucleotídeos de um cDNA codificante de ancilóstomo quitinase de tabaco, e Kawalleck, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673, que fornece a sequência de nucleotídeos do gene poliubiquitina ubi4-2 parsley, documentos de Pedido de Patente no de série U.S. 10/389.432, 10/692.367 e o documento de Patente no U.S. 6.563.020, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. (G) Uma molécula que estimula transdução de sinal. Por exemplo, consultar a revelação por Botella, et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757, de sequências de nucleotídeos para clones de cDNA de calmodulina de feijão-mungo, e Griess, et al., (1994) Plant Physiol.104:1.467, que fornecem a sequência de nucleotídeos de um clone de cDNA de calmodulina de maís, incorporada no presente documento em sua totalidade a título de referência. (H) Um peptídeo de momento hidrofóbico. Consultar, o Pedido PCT no WO 95/16776 e o documento de Patente no U.S. 5.580.852 (revelação de derivados de peptídeo de Taquiplesina que inibe patógenos de planta fúngicos) e o Pedido PCT no WO 95/18855 e o documento de Patente no U.S. 5.607.914) (ensina peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência à doença), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. (I) Uma membrana permease, um formador de canal ou um bloqueador de canal. Por exemplo, consultar a revelação por Jaynes, et al., (1993) Plant Sci. 89:43, de expressão heteróloga de um análogo de peptídeo lítico de cecropina-beta para renderizar plantas de tabaco transgênicas resistentes para Pseudomonas solanacearum, incorporada no presente documento em sua totalidade a título de referência. (J) Uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento viral em células de plantas transformadas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento de doença efetuado pelo vírus a partir do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, assim como por vírus relacionados. Consultar, Beachy, et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. A resistência mediada por proteína de revestimento tem sido conferida em plantas transformadas contra vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do pepino, vírus da risca do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus do entalhe do tabaco, vírus “rattle” do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Id. (K) Um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo direcionado a uma função metabólica essencial nos intestinos do inseto poderia inativar uma enzima afetada, exterminando o inseto. Cf. Taylor, et al., Resumo no 497, SEVENTH INT'L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edinburgh, Escócia, 1994) (inativação enzimática em tabaco transgênica por meio de produção de fragmentos de anticorpo de cadeia única), incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. (L) Um anticorpo específico de vírus. Consultar, por exemplo, Tavladoraki, et al., (1993) Nature 366:469, que mostra que plantas transgênicas que expressam genes de anticorpo recombinantes são protegidas do ataque de vírus, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. (M) Uma proteína de prisão de desenvolvimento produzida em natura por um patógeno ou um parasita. Desse modo, endo alfa- 1,4-D-poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e a liberação de nutriente de planta solubilizando-se a homo-alfa-1,4-D-galacturonase de parede de célula vegetal. Consultar, Lamb, et al., (1992) Bio/Technology 10:1.436, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. A clonagem e caracterização de um gene que codifica uma proteína de inibição de endopoligalacturonase de feijão é descrita por Toubart, et al., (1992) Plant J. 2:367, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. (N) Uma proteína de prisão de desenvolvimento produzida em natura por uma planta. Por exemplo, Logemann, et al., (1992) Bio/Technology 10:305, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência, mostrou que plantas transgênicas que expressam o gene de inativação ribossômica de cevada tem uma resistência à doença fúngica aumentada. (O) Genes envolvidos na Resposta de Resistência Adquirida Sistêmica (SAR) e/ou os genes relacionados à patogênese. Briggs, (1995) Current Biology 5(2):128 a 131, Pieterse e Van Loon, (2004) Curr. Opin. Plant Bio. 7(4):456 a 464 e Somssich, (2003) Cell 113(7):815 a 816, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. (P) Genes antifúngicos (Cornelissen e Melchers, (1993) Pl. Physiol. 101:709 a 712 e Parijs, et al., (1991) Planta 183:258 a 264 e Bushnell, et al., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2):137 a 149. Consultar também, o documento de Patente no U.S. 09/950.933, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. (Q) Genes de desintoxicação, tais como para fumonisina, beauvericina, moniliformina e zearalenona e seus derivados estruturalmente relacionados. Por exemplo, consultar, o documento de Patente no U.S. 5.792.931, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. (R) Inibidores de cistatina e cisteína proteinase. Consultar o Pedido de Patente no de série U.S. 10/947.979, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. (S) Genes de defensina. Consultar o documento no WO03/000863 e o Pedido de Patente no de série U.S. 10/178.213, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. (T) Genes que conferem resistência aos nematódeos. Consultar o documento no WO 03/033651 e Urwin, et. al. , (1998) Planta 204:472 a 479, Williamson (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4):327 a 331, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. (U) Genes, tais como rcg1 que conferem resistência ao apodrecimento de caule de Antracnose, que é causado pelo fungo Colletotrichum graminiola. Consultar, Jung, et al., Generation-means analysis and quantitative trait locus mapping of Anthracnose Stalk Rot genes in Maize, Theor. Appl. Genet. (1994) 89:413 a 418, assim como o Pedido de Patente Provisório no U.S. 60/675.664, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. 2. Transgenes Que Conferem Resistência a um Herbicida, Por Exemplo: (A) Um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como uma imidazolinona ou uma sulfonilureia. Genes exemplificativos nesse código de categoria para enzima ALS e AHAS mutante, conforme descritos, por exemplo, por Lee, et al., (1988) EMBO J. 7:1.241 e Miki, et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449, respectivamente. Também consultar, documentos de Patente no U.S. 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937 e 5.378.824 e a Publicação Internacional no WO 96/33270, que estão incorporados no presente documento em sua totalidade a título referência. (B) Glifosato (resistência transmitida por sintase de 5- enolpiruvl-3-fosfiquimato (EPSP) mutante e genes aroA, respectivamente) e outros compostos de fosfono, tal como glufosinato (genes de fosfinotricina acetil transferase (PAT) e fosfinotricina acetil transferase de Streptomyces hygroscopicus (bar)) e ácidos propriônicos de piridinoxi ou fenoxi e cicloexonas (genes codificantes de inibidor ACCase). Consultar, por exemplo, a Patente n° U.S. 4.940.835 para Shah, et al. , a qual revela a sequência de nucleotídeo de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência a glifosato. A Patente n° U.S. 5.627.061 de Barry, et al., também descreve os genes codificantes de enzimas EPSPS. Também consultar, os documentos de Patente no U.S. 6.566.587; 6.338.961; 6.248.876 B1; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE 37.287 E e 5.491,288 e Publicações Internacionais no EP1173580; WO 01/66704; EP1173581 e EP1173582, que estão incorporadas no presente documento em sua totalidade a título referência. Resistência ao glifosfato também é transmitida às plantas que expressam um gene que codifica uma enzima de oxido-redutase de glifosato, conforme descrito mais completamente nos documentos de Patente no U.S. 5.776.760 e 5.463.175, que estão incorporados no presente documento em sua totalidade a título referência. Além disso, a resistência a glifosato pode ser conferida a plantas pela superexpressão de genes codificadores de glifosato N-acetiltransferase. Consultar, por exemplo, os Pedidos de Patente no de série U.S. 11/405.845 e 10/427.692 e o Pedido PCT no US01/46227, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida sob o no de Acesso da ATCC 39256 e a sequência de nucleotídeos do gene mutante é revelado documento de Patente no U.S. 4.769.061 para Comai, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. O Pedido de Patente no EP 0 333 033 de Kumada, et al., e o documento de Patente no U.S. 4.975.374 de Goodman, et al., revelam sequências de nucleotídeos de genes de glutamina sintetase que conferem resistência aos herbicidas, tais como L- fosfinotricina, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. A sequência de nucleotídeos de um gene fosfinotricina-acetil-transferase é fornecida nos documentos de Patente no EP 0 242 246 e 0 242 236 de Leemans, et al., De Greef, et al., (1989) Bio/Technology 7:61 que descrevem a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos codificantes para atividade de fosfinotricina acetil transferase, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Também consultar, os documentos de Patente no U.S. 5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675; 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616 B1 e 5.879.903, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Genes exemplificativos que conferem resistência aos ácidos propiônicos de fenoxi e cicloexonas, tais como setoxidim e haloxifope, são os genes Acc1- S1, Acc1-S2 e Acc1-S3 descritos por Marshall, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. (C) Um herbicida que inibe fotossíntese, tal como uma triazina (genes psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene nitrilase). Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3:169, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência, descreve a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos codificantes de genes psbA mutantes. Sequências de nucleotídeos para genes nitrilase são reveladas no documento de Patente no U.S. 4.810.648 de Stalker, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência, e moléculas de DNA que contêm esses genes estão disponíveis sob os números de Acesso da ATCC 53435, 67441 e 67442. Clonagem e expressão de DNA codificante para uma glutationa S-transferase é descrita por Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285:173, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. (D) Sintase de ácido acetoidróxico, em que se constatou por tornar plantas que expressam essa enzima resistentes aos múltiplos tipos de herbicidas, foi introduzida em uma variedade de plantas (consultar, por exemplo, Hattori, et al., (1995) Mol Gen Genet 246:419, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência). Outros genes que conferem resistência aos herbicidas incluem: um gene que codifica uma proteína quimérica de oxidorredutase de citocromo de rato P4507A1 e citocromo NADPH P450 de levedura (Shiota, et al., (1994) Plant Physiol. 106(1):17 a 23), genes para glutationa redutase e dismutase de superóxido (Aono, et al., (1995) Plant Cell Physiol 36:1.687, e genes para várias fosfotransferases (Datta, et al., (1992) Plant Mol Biol 20:619), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. (E) Oxidase de protoporfirinogênio (protox) é necessária para a produção de clorofila, que é necessária para sobrevivência de toda planta. A enzima protox serve como o direcionamento para uma variedade de compostos herbicidas. Esses herbicidas também inibem o crescimento de todas as espécies diferentes de plantas presentes, causando sua destruição total. O desenvolvimento de plantas que contêm atividade de protox alterada que são resistentes àqueles herbicidas é descrito nos documentos de Patentes no U.S. 6.288.306 B1; 6.282.837 B1 e 5.767.373; e na Publicação Internacional no WO 01/12825, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. 3. Transgenes Que Conferem Ou Contribuem Para uma Característica de Grão Alterada, Tais Como: (A) Ácidos graxos alterados, por exemplo, por (1) Regulação decrescente de estearoil-ACP dessaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta. Consultar, Knultzon, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:2.624 e WO99/64579 (Genes for Desaturases to Alter Lipid Profiles in Corn), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência, (2) Elevar ácido oleico por meio de modificação de gene FAD-2 e/ou diminuir ácido linoleico por meio de modificação de gene FAD-3 (consultar os documentos de Patente no U.S. 6.063.947; 6.323.392; 6.372.965 e WO 93/11245, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência), (3) Alterar teor de ácido linolênico ou linoleico conjugado, tal como no documento no WO 01/12800, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência, (4) Alterar genes LEC1, AGP, Dek1, Superal1, mi1ps, de vários lpa, tal como lpa1, lpa3, hpt ou hggt. Por exemplo, consultar, os documentos no WO 02/42424, WO 98/22604, WO 03/011015, o documento de Patente no U.S. 6.423.886, o documento de Patente no U.S. 6.197.561, o documento de Patente no U.S. 6.825.397, as Publicações de Pedido de Patente no U.S. 2003/0079247, 2003/0204870, WO02/057439, WO03/011015 e Rivera- Madrid, et. al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:5.620 a 5.624, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. (B) Teor de fósforo alterado, por exemplo, pela (1) Introdução de um gene codificante de fitase intensificaria a quebra de fitato, que adiciona mais fosfato livre à planta transformada. Por exemplo, consultar, Van Hartingsveldt, et al., (1993) Gene 127:87, para uma revelação da sequência de nucleotídeos de um gene de Aspergillus niger fitase, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. (2) Regulação ascendente de um gene que reduz teor de fitato. Em maís, isso, por exemplo, poderia ser alcançado, clonando-se e, então, reintroduzindo-se DNA associado a um ou mais dentre os alelos, tais como os alelos de LPA, identificados em mutantes de maís caracterizados por baixos níveis de ácido fítico, tal como em Raboy, et al., (1990) Maydica 35:383 e/ou alterando-se atividade de inositol quinase como no documento no WO 02/059324, na Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2003/0009011, WO 03/027243, na Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2003/0079247, WO 99/05298, no documento de Patente no U.S. 6.197.561, documento de Patente no U.S. 6.291.224, documento de Patente no U.S. 6.391.348, WO2002/059324, Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2003/0079247, WO98/45448, WO99/55882, WO01/04147, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. (C) Carboidratos alterados efetuados, por exemplo, alterando-se um gene para uma enzima que afeta o modelo de ramificação de amido ou um gene que altera tiorredoxina, tal como NTR e/ou TRX (consultar o documento de Patente no U.S. 6.531.648, que é incorporado a título de referência em sua totalidade) e/ou um knockout ou mutante de gama-zein, tal como cs27 ou TUSC27 ou en27 (consultar o documento de Patente no U.S. 6.858.778 e as Publicações de Pedido de Patente no U.S. 2005/0160488 e 2005/0204418; que estão incorporadas a título de referência em sua totalidade). Consultar, Shiroza, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810 (sequência de nucleotídeos de gene frutosiltransferase de mutantes de Streptococcus), Steinmetz, et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (sequência de nucleotídeos de gene levansucrase de Bacillus subtilis), Pen, et al., (1992) Bio/Technology 10:292 (produção de plantas transgênicas que expressam alfa-amilase de Bacillus licheniformis), Elliot, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (sequências de nucleotídeos de genes invertase de tomate), S0gaard, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22.480 (mutagênese de local direcionado de gene alfa-amilase de cevada) e Fisher, et al., (1993) Plant Physiol. 102:1.045 (enzima II de ramificação de amido de endosperma de maís), documento no WO 99/10498 (digestibilidade e/ou extração de amido melhorada através de modificação de 4-epimerase de UDP-D-xilose, Fragile 1 e 2, Ref1, HCHL, C4H), documento de Patente no U.S. 6.232.529 (método para produzir semente rica em óleo através de modificação de níveis de amido (AGP)), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Os genes de modificação de ácido graxo mencionados acima também podem ser usados para afetar o teor e/ou composição de amido através da correlação das vias de amido e óleo. (D) Teor ou composição de antioxidante alterada, tal como alteração de tocoferol ou tocotrienóis. Por exemplo, consultar o documento de Patente no U.S. 6.787.683, a Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0034886 e o documento no WO 00/68393 que envolvem a manipulação de níveis de antioxidante através de alteração de uma fitl-prenil-transferase (ppt), o documento no WO 03/082899, através de alteração de uma homogentisate geranil-geranil-transferase (hggt), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. (E) Aminoácidos de semente essenciais alterados. Por exemplo, consultar o documento de Patente no U.S. 6.127.600 (método para aumentar o acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), documento de Patente no U.S. 6.080.913 (métodos binários para aumentar acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), documento de Patente no U.S. 5.990.389 (alta lisina), documento no WO99/40209 (alteração de composições de aminoácido em sementes), WO99/29882 (métodos para alterar teor de aminoácido de proteínas), documento de Patente no U.S. 5.850.016 (alteração de composições de aminoácido em sementes), documento no WO98/20133 (proteínas com níveis de aminoácidos essenciais intensificados), documento de Patente no U.S. 5.885.802 (alta metionina), documento de Patente no U.S. 5.885.801 (alta treonina), documento de Patente no U.S. 6.664.445 (enzimas biossintéticas de aminoácido vegetal), documento de Patente no U.S. 6.459.019 (lisina e treonina aumentadas), documento de Patente no U.S. 6.441.274 (subunidade beta de sintase de triptofano vegetal), documento de Patente no U.S. 6.346.403 (enzimas metabólicas de metionina), documento de Patente no U.S. 5.939.599 (alto enxofre), documento de Patente no U.S. 5.912.414 (metionina aumentada), documento no WO98/56935 (enzimas biossintéticas de aminoácido vegetal), documento no WO98/45458 (proteína de semente projetada que tem porcentagem mais elevada de aminoácidos essenciais), documento no WO98/42831 (lisina aumentada), documento de Patente no U.S. 5.633.436 (teor de aminoácido de enxofre crescente), documento de Patente no U.S. 5.559.223 (proteínas de armazenamento sintéticas com estrutura definida que contém níveis de aminoácidos essenciais programáveis para melhoramento do valor nutricional de plantas), documento no WO96/01905 (treonina aumentada), documento no WO95/15392 (lisina aumentada), Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2003/0163838, Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2003/0150014, Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0068767, documento de Patente no U.S. 6.803.498, documentos no WO01/79516 e WO00/09706 (Ces A: sintase de celulose), documento de Patente no U.S. 6.194.638 (hemicelulose), documento de Patente no U.S. 6.399.859 e Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0025203 (UDPGdH), documento de Patente no U.S. 6.194.638 (RGP), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. 4. Genes que criam um local para integração de DNA de local específico Isso inclui a introdução de locais de FRT que podem ser usados no sistema FLP/FRT e/ou locais Lox que podem ser usados no sistema Cre/Loxp. Por exemplo, consultar Lyznik, et al., (2003) Plant Cell Rep 21:925 a 932 e WO 99/25821, que estão incorporados aqui a título de referência em sua totalidade. Outros sistemas que podem ser usados incluem a recombinase Gin de fago Mu (Maeser, et al., 1991; Vicki Chandler, The Maize Handbook ch. 118 (Springer-Verlag 1994), a recombinase Pin de E. coli (Enomoto, et al., 1983), e o sistema R/RS do plasmídeo pSR1 (Araki, et al., 1992), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. 5. Genes que afetam resistência ao estresse abiótico (que incluem, porém sem limitação, o desenvolvimento de flores, espiga e semente, intensificação de eficiência de utilização de nitrogênio, capacidade de resposta de nitrogênio alterada, resistência ou tolerância à seca, resistência ou tolerância ao frio e resistência ou tolerância ao sal) e rendimento aumentado sob estresse. Por exemplo, consultar o documento no WO 00/73475 em que a eficiência de uso de água é alterada através da alteração de malato; documento de Patente no U.S. 5.892.009, documento de Patente no U.S. 5.965.705, documento de Patente no U.S. 5.929.305, documento de Patente no U.S. 5.891.859, documento de Patente no U.S. 6.417.428, documento de Patente no U.S. 6.664.446, documento de Patente no U.S. 6.706.866, documento de Patente no U.S. 6.717.034, WO2000060089, documentos no WO2001026459, WO2001035725, WO2001034726, WO2001035727, WO2001036444, WO2001036597, WO2001036598, WO2002015675, WO2002017430, WO2002077185, WO2002079403, WO2003013227, WO2003013228, WO2003014327, WO2004031349, WO2004076638, WO9809521 e WO9938977 que descrevem genes, incluindo genes CBF e fatores de transcrição eficazes em mitigar os efeitos negativos de congelamento, alta salinidade e seca em plantas, assim como conferir outros efeitos positivos em fenótipo de planta; a Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0148654 e documento no WO01/36596 em que ácido abscísico é alterado em plantas que resultam em fenótipo de planta melhorado, tal como rendimento aumentado e/ou tolerância ao estresse abiótico aumentada; documentos no WO2000/006341, WO04/090143, Pedido de Patente no de série U.S. 10/817483 e documento de Patente no U.S. 6.992.237, em que a expressão de citocinina é modificada, o que resulta em plantas com tolerância ao estresse aumentada, tal como tolerância à seca, e/ou rendimento aumentado, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Consultar também os documentos no WO0202776, WO2003052063, JP2002281975, o documento de Patente no U.S. 6.084.153, WO0164898, documento de Patente no U.S. 6.177.275 e o documento de Patente no U.S. 6.107.547 (intensificação de utilização de nitrogênio e capacidade de resposta de nitrogênio alterada), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Para alteração de etileno, consultar a Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0128719, Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2003/0166197 e o documento no WO200032761, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Para fatores de transcrição vegetal ou reguladores transcricionais de estresse abiótico, consultar, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0098764 ou Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0078852, incorporadas no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0099] Outros genes e fatores de transcrição que afetam crescimento vegetal e traços agronômicos, tais como rendimento, floração, crescimento vegetal e/ou estrutura vegetal, podem ser introduzidos ou introgredidos em plantas, consultar, por exemplo, os documentos no WO97/49811 (LHY), WO98/56918 (ESD4), WO97/10339 e o documento de Patente no U.S. 6.573.430 (TFL), documento de Patente no U.S. 6.713.663 (FT), WO96/14414 (CON), WO96/38560, WO01/21822 (VRN1), WO00/44918 (VRN2), WO99/49064 (GI), WO00/46358 (FRI), WO97/29123, documento de Patente no U.S. 6.794.560, o documento de Patente no U.S. 6.307.126 (GAI), WO99/09174 (D8 e Rht) e WO2004076638 e WO2004031349 (fatores de transcrição), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0100] A sequência de nucleotídeos heterólogos operacionalmente ligada às sequências reguladoras e seus fragmentos ou variantes biologicamente ativos relacionados revelados no presente documento podem ser uma sequência antissenso para um gene direcionado. A terminologia "sequência de nucleotídeos de DNA antissenso” é destinada a significar uma sequência que está na orientação inversa à orientação normal de 5’ a 3' daquela sequência de nucleotídeos. Quando entregue em uma célula vegetal, a expressão da sequência de DNA antissenso evita expressão normal da sequência de nucleotídeos de DNA para o gene direcionado. A sequência de nucleotídeos antissenso codifica uma transcrição de RNA que é complementar e tem capacidade para hibridizar com o RNA mensageiro endógeno (mRNA) produzido através de transcrição da sequência de nucleotídeos de DNA para o gene direcionado. Nesse caso, a produção da proteína nativa codificada pelo gene direcionado é inibida de modo a obter uma resposta fenotípica desejada. As modificações das sequências antissenso podem ser feitas desde que as sequências se hibridizem e interfiram com a expressão do RNAm correspondente. Dessa maneira, construções antissenso que têm 70%, 80%, 85% de identidade de sequência com as sequências antissenso correspondentes podem ser usadas. Além disso, porções dos nucleotídeos antissenso podem ser usadas para perturbar a expressão do gene direcionado. De modo geral, as sequências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou mais podem ser usadas. Assim, as sequências de promotor reveladas no presente documento podem ser operacionalmente ligadas às sequências de DNA antissenso para reduzir ou inibir expressão de uma proteína nativa na planta.
[0101] "RNAi" se refere a uma série de técnicas relatadas para reduzir a expressão de genes (consultar, por exemplo, o documento de Patente no U.S. 6.506.559, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência). As técnicas mais velhas denominadas por outros nomes são ensinadas agora para depender do mesmo mecanismo, mas são dados nomes diferentes na literatura. Essas incluem "inibição antissenso", a produção de transcrições de RNA antissenso que têm capacidade para suprimir a expressão da proteína-alvo e "cossupressão" ou "supressão de sentido", que se referem à produção de transcrições de RNA antissenso que têm capacidade para suprimir a expressão de genes endógenos ou estranhos idênticos ou substancialmente similares (documento de Patente no U.S. 5.231.020, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Tais técnicas dependem do uso de construtos que resulta no acúmulo de RNA de fita dupla com uma fita complementar ao gene- alvo a ser silenciado. As sequências reguladoras dos aspectos podem ser usadas para conduzir expressão de construtos que resultarão em interferência de RNA, incluindo microRNAs e siRNAs.
[0102] Conforme usados no presente documento, os termos "promotor" ou "região de iniciação transcricional" significam uma região reguladora de DNA que compreende normalmente uma caixa TATA que tem capacidade para direcionar RNA polimerase II para iniciar síntese de RNA no local de iniciação de transcrição apropriado para uma sequência codificante particular. Um promotor pode compreender adicionalmente outras sequências de reconhecimento posicionadas, de modo geral, a montante ou 5' da caixa TATA, denominados elementos promotores a montante, que influenciam a taxa de iniciação de transcrição. É reconhecido que ter identificado as sequências de nucleotídeos para as regiões promotoras reveladas no presente documento, está dentro do estado da técnica para isolar e identificar elementos reguladores adicionais na região 5' não traduzida a montante das regiões promotoras particulares identificadas no presente documento. Adicionalmente, promotores quiméricos podem ser fornecidos. Tais quimeras incluem porções da sequência de promotores fundidas aos fragmentos e/ou variantes de regiões reguladoras transcricionais heterólogas. Assim, as regiões promotoras reveladas no presente documento podem compreender elementos reguladores a montante, tais como, aqueles responsáveis por expressão de tecido e temporal da sequência codificante, intensificadores e semelhantes. Da mesma maneira, os elementos promotores, que permitem expressão no tecido desejado, tal como tecido reprodutivo, podem ser identificados, isolados e usados com outros promotores nucleares para conferir expressão preferencial de endosperma precoce. Nesse aspecto da revelação, "promotor nuclear” é destinado a significar um promotor sem elementos promotores.
[0103] Conforme usado no presente documento, o termo "elemento regulador" também se refere a uma sequência de DNA, normalmente, porém nem sempre, a montante (5') da sequência codificante de um gene estrutural, que inclui sequências que controlam a expressão da região codificante fornecendo-se o reconhecimento para RNA polimerase e/ou outros fatores necessários para que a transcrição se inicie em um local particular. Um exemplo de um elemento regulador que fornece o reconhecimento para RNA polimerase ou outros fatores transcricionais para assegurar a iniciação em um local particular é um elemento promotor. Um elemento promotor compreende um elemento promotor nuclear, responsável pela iniciação de transcrição, assim como outros elementos reguladores que modificam a expressão genética. Deve ser entendido que as sequências de nucleotídeos, localizadas dentro de íntrons ou 3’ da sequência de região codificante também podem contribuir com a regulação de expressão de uma região codificante de interesse. Os exemplos de íntrons adequados incluem, mas sem limitação, o íntron IVS6 de maís, ou o íntron de actina de maís. Um elemento regulador também pode incluir aqueles elementos localizados a jusante (3') do local de iniciação de transcrição, ou dentro de regiões transcritas, ou ambos. No contexto da presente revelação um elemento regulador pós-transcricional pode incluir elementos que são ativos depois da iniciação de transcrição, por exemplo, intensificadores traducionais e transcricionais, repressores traducionais e transcricionais e determinantes de estabilidade de mRNA.
[0104] Os elementos reguladores ou variantes ou fragmentos dos mesmos, da presente revelação podem ser operativamente associados aos elementos reguladores heterólogos ou promotores de modo a modular a atividade do elemento regulador heterólogo. Tal modulação inclui intensificar ou reprimir a atividade de transcrição do elemento regulador heterólogo, modular os eventos pós-transcrição, ou intensificar ou reprimir a atividade de transcrição do elemento regulador heterólogo e modular os eventos pós-transcrição. Por exemplo, um ou mais elementos reguladores ou fragmentos dos mesmos da presente revelação podem ser operativamente associados aos promotores constitutivos, induzíveis ou específicos de tecido ou fragmentos dos mesmos, para modular a atividade de tais promotores dentro de tecidos desejados em células vegetais.
[0105] As sequências reguladoras da presente revelação ou variantes ou fragmentos das mesmas, quando operacionalmente ligadas a uma sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse podem conduzir expressão constitutiva ou transiente da sequência de nucleotídeos heterólogos no tecido da planta que expressa esse construto. O termo "expressão constitutiva" significa que a expressão da sequência de nucleotídeos heterólogos é encontrada ao longo da planta.
[0106] Uma "sequência de nucleotídeos heterólogos", conforme usado ao longo da revelação, é uma sequência que não é de ocorrência natural com a ou operacionalmente ligada à sequência de promotores da revelação. Embora essa sequência de nucleotídeos seja heteróloga à sequência de promotores, a mesma pode ser homóloga ou nativa ou heteróloga ou estranha ao hospedeiro vegetal. Da mesma forma, a sequência de promotores pode ser homóloga ou nativa ou heteróloga ou estranha ao hospedeiro vegetal e/ou ao polinucleotídeo de interesse.
[0107] As sequências de promotor isoladas da presente revelação podem ser modificadas para fornecer uma faixa de níveis de expressão da sequência de nucleotídeos heterólogos. Assim, menos que a região de promotor inteira pode ser utilizada e a capacidade para conduzir a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse é retida. É reconhecido que níveis de expressão do mRNA podem ser alterados de diferentes maneiras com deleções de porções das sequências de promotor. Os níveis de expressão de mRNA podem ser diminuídos, ou alternativamente, a expressão pode ser aumentada como um resultado de deleções de promotor caso, por exemplo, haja um elemento regulador negativo (para um repressor) que é removido durante o processo de truncação. De modo geral, pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de uma sequência de promotores isolada serão usados para conduzir a expressão de uma sequência de nucleotídeos.
[0108] Sequências de nucleotídeos heterólogas podem incluir fatores de transcrição vegetal, sequências cujas proteínas codificadas podem se ligar ao promotor, intensificador ou outras sequências reguladoras, e no processo estimulam ou reprimem transcrição do gene endógeno relacionado. Exemplos de fatores de transcrição incluem membros da família AP2/EREBP (incluindo as subfamílias BBM (ODP2), pletora e aintegumenta, proteínas de ligação de caixa CAAT, tais como LEC1 e HAP3, e proteínas que contêm homeobox, tais como WUS1, WUS2, WUS3, WOX2, WOX2a, WOX4, WOX5) assim como membros das famílias MYB, bHLH, NAC, MADS, bZIP e WRKY. Do total de aproximadamente 26.000 genes em Arabidopse, mais de 1.500 desses são reguladores transcricionais, dos quais cerca de 45% são únicos para plantas (Reichmann et al., 2000. Science 290:2.105 a 2.110).
[0109] É reconhecido que para aumentar níveis de transcrição, intensificadores podem ser utilizados em combinação com as regiões promotoras da revelação. Intensificadores são sequências de nucleotídeos que atuam para aumentar a expressão de uma região promotora. Intensificadores são conhecidos na técnica e incluem a região intensificadora SV40, o elemento intensificador 35S e semelhantes. Alguns intensificadores também são conhecidos por alterar modelos de expressão de promotor normais, por exemplo, fazendo-se com que um promotor seja expresso constitutivamente quando não se tem o intensificador, o mesmo promotor é expresso apenas em um tecido específico ou em poucos tecidos específicos.
[0110] Modificações das sequências de promotor isoladas da presente revelação podem fornecer uma faixa de expressão da sequência de nucleotídeos heterólogos. Desse modo, as mesmas podem ser modificadas para serem promotores fracos ou promotores fortes. Geralmente, um "promotor fraco" significa um promotor que aciona a expressão de uma sequência de codificação em um nível baixo. Um "nível baixo" de expressão é destinado a significar expressão em níveis de cerca de 1/10.000 transcrições a cerca de 1/100.000 transcrições a cerca de 1/500.000 transcrições. Ao contrário, um promotor forte aciona a expressão de uma sequência de codificação em um nível alto, ou em cerca de 1/10 transcrições a cerca de 1/100 transcrições a cerca de 1/1.000 transcrições.
[0111] É reconhecido que os promotores da revelação, tal como os promotores de PLTP, podem ser usados com suas sequências codificadoras nativas para aumentar ou diminuir expressão, desse modo se resulta em uma alteração em fenótipo da planta transformada. As sequências de nucleotídeos reveladas na presente revelação, tais como os promotores de PLTP e o promotor de LTP3 (consultar a Tabela 1 no presente documento), assim como variantes e fragmentos das mesmas, são úteis na manipulação genética de qualquer planta. As sequências reguladoras são úteis nesse aspecto quando operacionalmente ligadas a uma sequência de nucleotídeos heterólogos cuja expressão deve ser controlada para obter uma resposta fenotípica desejada. O termo "operacionalmente ligado" significa que a transcrição ou tradução da sequência de nucleotídeos heterólogos está sob a influência da sequência de promotores. Dessa maneira, as sequências de nucleotídeos para os promotores da revelação podem ser fornecidas em cassetes de expressão juntamente com sequências de nucleotídeos heterólogos de interesse para expressão na planta de interesse, mais particularmente para expressão no tecido reprodutivo da planta.
[0112] Em um aspecto da revelação, cassetes de expressão compreendem uma região de iniciação transcricional que compreende uma das sequências de promotor de nucleotídeos da presente revelação, tais como os promotores de PLTP e LTP3, ou variantes ou fragmentos das mesmas, operacionalmente ligadas à sequência de nucleotídeos heterólogos. Tal cassete de expressão pode ser fornecido com uma pluralidade de locais de restrição para inserção da sequência de nucleotídeos que deve estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode conter genes marcadores adicionalmente selecionáveis assim como regiões de terminação 3’.
[0113] O cassete de expressão pode incluir, na direção de transcrição 5’ a 3', uma região de iniciação transcricional (isto é, um promotor, ou variante ou fragmento do mesmo, da revelação), uma região de iniciação translacional, uma sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse, uma região de terminação translacional e, opcionalmente, uma região de terminação transcricional funcional no organismo hospedeiro. As regiões reguladoras (isto é, promotores, regiões reguladoras transcricionais, e regiões de terminação translacionais) e/ou o polinucleotídeo dos aspectos podem ser nativos/análogos à célula hospedeira ou entre si. Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou o polinucleotídeo dos aspectos podem ser heterólogos à célula hospedeira ou entre si. Conforme usado no presente documento, "heterólogo" em referência a uma sequência é uma sequência que se origina de uma espécie estranha ou, caso seja da mesma espécie, é substancialmente modificada de sua forma nativa em composição e/ou locus genômico através de intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente da espécie da qual o polinucleotídeo foi derivado ou, se for de espécie igual/análogo, uma ou ambas são substancialmente modificadas de sua forma e/ou locus genômico original ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo operacionalmente ligado.
[0114] Embora o mesmo possa ser preferencial para expressar uma sequência de nucleotídeos heterólogos que usa os promotores da revelação, tais como os promotores de PLTP e LTP3, as sequências nativas podem ser expressas. Tais construtos alterariam os níveis de expressão da proteína na planta ou célula vegetal. Assim, o fenótipo da planta ou célula vegetal é alterado.
[0115] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ligada de modo operacional, pode ser nativa com o hospedeiro de planta, ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, em que a sequência de DNA é expressa, o hospedeiro de planta, ou qualquer combinação dos mesmos). As regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Também consultar, Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141 a 144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671 a 674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141 a 149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1.261 a 1.272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151 a 158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7.891 a 7.903; e Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9.627 a 9.639, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0116] O cassete de expressão que compreende as sequências da presente revelação também pode conter pelo menos uma sequência de nucleotídeos adicional para um gene a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, a sequência (ou sequências) adicional pode ser fornecida em outro cassete de expressão.
[0117] Quando apropriado, as sequências de nucleotídeos cuja expressão deve estar sob o controle da sequência de promotores preferencial de tecido de endoesperma precoce da presente revelação e qualquer sequência de nucleotídeos (ou sequências de nucleotídeos) adicional podem ser otimizadas para expressão aumentada na planta transformada. Isto é, essas sequências de nucleotídeos podem ser sintetizadas com o uso de códons preferidos de planta para expressão melhorada. Consultar, por exemplo, Campbell e Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1 a 11, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência, para uma discussão sobre uso de códon preferencial de hospedeiro. Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferenciais para plantas. Consultar, por exemplo, documentos de Patente no U.S. 5.380.831, 5.436.391 e Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477 a 498, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0118] As modificações de sequência adicionais são conhecidas por intensificar a expressão de gene em um hospedeiro celular. Essas incluem eliminação de sequências codificantes de sinais de poliadenilação artificiais, sinais de local de divisão de éxon e íntron, repetições tipo transposão e outras tais sequências bastante caracterizadas que podem ser prejudiciais à expressão genética. O teor de G-C da sequência de nucleotídeos heteróloga pode ser ajustado para níveis médios para um dado hospedeiro celular, como calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar as estruturas de mRNA secundárias em grampo previstas.
[0119] Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente sequências-líder 5'. Tais sequências-líder podem atuar para intensificar a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação: picornoavírus líderes, por exemplo, EMCV líder (região não codificante 5’ de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein, et al., (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 86:6.126 a 6.130); potivírus líderes, por exemplo, TEV líder (Vírus Tobacco Etch) (Allison, et al., (1986) Virology 154:9 a 20); MDMV líder (Vírus Maize Dwarf Mosaic); proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak, et al., (1991) Nature 353:90 a 94); líder não traduzido do mRNA de proteína de revestimento de vírus de mosaico de alfafa (AMV RNA 4) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622 a 625); vírus de mosaico de tabaco líder (TMV) (Gallie, et al., (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237 a 256) e vírus mosqueado clorótico de maís líder (MCMV) (Lommel, et al., (1991) Virology 81:382 a 385), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Consultar, também, Della- Cioppa, et al., (1987) Plant Physiology 84:965 a 968, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. Métodos conhecidos para intensificar estabilidade de mRNA também podem ser utilizados, por exemplo, íntrons, tais como o íntron de Ubiquitina de maís (Christensen e Quail, (1996) Transgenic Res. 5:213 a 218; Christensen, et al., (1992) Plant Molecular Biology 18:675 a 689) ou o íntron de AdhI de maís (Kyozuka, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 228:40 a 48; Kyozuka, et al., (1990) Maydica 35:353 a 357) e semelhantes, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0120] Os construtos de DNA dos aspectos também podem incluir intensificadores adicionais, intensificadores de tradução ou transcrição, conforme podem ser necessários. Essas regiões intensificadoras são bastante conhecidas pelas pessoas versadas na técnica, e podem incluir o códon de iniciação ATG e sequências adjacentes. O códon de iniciação precisa estar sintonizado com o quadro de leitura da sequência codificante para assegurar tradução da sequência inteira. Os sinais de controle de tradução e códons de iniciação podem ter uma variedade de origens, tanto naturais quanto sintéticas. Regiões de iniciação translacionais podem ser fornecidas a partir da fonte da região de iniciação transcricional, ou a partir do gene estrutural. A sequência também pode ser derivada do elemento regulador selecionado para expressar o gene, e pode ser especificamente modificada de modo a aumentar a tradução do mRNA. É reconhecido que para aumentar níveis de transcrição, intensificadores podem ser utilizados em combinação com as regiões promotoras dos aspectos. Os intensificadores são conhecidos na técnica e incluem a região intensificadora SV40, o elemento intensificador 35S e semelhantes.
[0121] Na preparação do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no quadro de leitura adequado. Para esse fim, os adaptadores ou ligantes pode ser empregada para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem ser envolvidas para fornecer locais de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de locais de restrição ou semelhantes. Com esse propósito, a mutagênese in vitro, o reparo de iniciador, a restrição, o anelamento, as ressubstituições, por exemplo, transições e transversões podem ser envolvidos.
[0122] Genes repórteres ou genes marcadores selecionáveis também podem ser incluídos nos cassetes de expressão da presente revelação. Exemplos de genes repórteres adequados conhecidos na técnica podem ser encontrados em, por exemplo, Jefferson, et al., (1991) em Plant Molecular Biology Manual, edição, Gelvin, et al., (Kluwer Academic Publishers), páginas 1 a 33; DeWet, et al., (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725 a 737; Goff, et al., (1990) EMBO J. 9:2.517 a 2.522; Kain, et al., (1995) Bio Techniques 19:650 a 655 e Chiu, et al., (1996) Current Biology 6:325 a 330, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0123] Genes marcadores selecionáveis para seleção de células ou tecidos transformados podem incluir genes que conferem resistência antibiótica ou resistência aos herbicidas. Exemplos de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, porém sem limitação, genes codificantes de resistência ao cloranfenicol (Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J. 2:987 a 992); metotrexato (Herrera Estrella, et al., (1983) Nature 303:209 a 213; Meijer, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16:807 a 820); higromicina (Waldron, et al., (1985) Plant Mol. Biol. 5:103 a 108 e Zhijian, et al., (1995) Plant Science 108:219 a 227); estreptomicina (Jones, et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86 a 91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard, et al., (1996) Transgenic Res. 5:131 a 137); bleomicina (Hille, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 7:171 a 176); sulfonamida (Guerineau, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:127 a 136); bromoxinila (Stalker, et al., (1988) Science 242:419 a 423); glifosato (Shaw, et al., (1986) Science 233:478 a 481 e Pedidos de Patente no de série U.S. 10/004.357 e 10/427.692); fosfinotricina (DeBlock, et al., (1987) EMBO J. 6:2.513 a 2.518), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0124] Outros genes que teriam utilidade na recuperação de eventos transgênicos incluiriam, porém sem limitação, os exemplos, tais como GUS (beta-glucuronidase; Jefferson, (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (proteína de fluorescência verde; Chalfie, et al., (1994) Science 263:802), luciferase (Riggs, et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15(19):8.115 e Luehrsen, et al., (1992) Methods Enzymol. 216:397 a 414) e os genes de maís codificantes para produção de antocianina (Ludwig, et al., (1990) Science 247:449), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0125] O cassete de expressão que compreende as sequências reguladoras da presente revelação operacionalmente ligadas a uma sequência de nucleotídeos de interesse pode ser usado para transformar qualquer planta. Dessa maneira, plantas, células vegetais, tecido vegetal, semente, raiz geneticamente modificados e semelhantes podem ser obtidos.
[0126] Conforme usado no presente documento, "vetor" se refere a uma molécula de DNA, tal como um plasmídeo, cosmídeo ou fago bacteriano para introduzir um construto de nucleotídeo, por exemplo, um cassete de expressão, em uma célula hospedeira. Vetores de clonagem contêm tipicamente um, ou um pequeno número de locais de reconhecimento de endonuclease de restrição nos quais sequências de DNA estranhas podem ser inseridas de uma maneira determinável sem a perda de função biológica essencial do vetor, assim como um gene marcador que é adequado para uso na identificação e seleção de células transformadas com o vetor de clonagem. Genes marcadores incluem tipicamente genes que fornecem resistência à tetraciclina, resistência à higromicina ou resistência à ampicilina.
[0127] Os métodos da revelação envolvem introduzir um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. Conforme usado no presente documento, o termo "introduzir" é destinado a significar apresentar à planta o polinucleotídeo ou polipeptídeo de uma tal maneira que a sequência ganha acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da revelação não dependem de um método particular para introduzir uma sequência em uma planta, apenas que o polinucleotídeo ou polipeptídeos ganham acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introduzir polinucleotídeo ou polipeptídeos em plantas são conhecidos na técnica, que incluem, porém sem limitação, os métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente e métodos mediados por vírus.
[0128] Uma "transformação estável” é uma transformação na qual o construto de nucleotídeo introduzido em uma planta se integra no genoma da planta e tem capacidade para ser herdado pela progênie da mesma. "Transformação transiente" significa que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra no genoma da planta ou um polipeptídeo é introduzido em uma planta.
[0129] Os protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeos em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionada para transformação. Métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células vegetais e inserção subsequente no genoma vegetal incluem microinjeção (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320 a 334), eletroporação (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83:5.602 a 5.606), transformação mediada por Agrobacterium (Townsend, et al., documento de Patente no U.S. 5.563.055 e Zhao, et al. , documento de Patente no U.S. 5.981.840), transferência de gene direta (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2.717 a 2.722) e aceleração de partícula balística (consultar, por exemplo, documentos de Patente no U.S. 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes, et al., (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, edição, Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlim); McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923 a 926) e transformação de Lec1 (WO 00/28058). Consultar também, Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 a 477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27 a 37 (cebola); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671 a 674 (soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923 a 926 (soja); Finer e McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175 a 182 (soja); Singh, et al., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319 a 324 (soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736 a 740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:4.305 a 4.309 (maís); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559 a 563 (maís); documentos de Patente no U.S. 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440 a 444 (maís); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833 a 839 (maís); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature (Londres) 311:763 a 764; documento de Patente no U.S. 5.736.369 (cereais); Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 84:5.345 a 5.349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, edição, Chapman, et al., (Longman, Nova Iorque), páginas 197 a 209 (pólen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415 a 418 e Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560 a 566 (transformação mediada por fibra); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1.495 a 1.505 (eletroporação); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250 a 255 e Christou e Ford, (1995) Annals of Botany 75:407 a 413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750 (maís por meio de Agrobacterium tumefaciens), em que todos esses estão incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Métodos e composições para rápida transformação vegetal também se encontram no Pedido Provisório no U.S. 62/248578, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0130] Em aspectos específicos, os construtos de DNA que compreendem as sequências de promotor da revelação, tais como os promotores de PLTP, podem ser fornecido a uma planta com o uso de uma variedade de métodos de transformação transiente. Tais métodos de transformação transiente incluem, mas sem limitação, sistemas de vetor viral e a precipitação do polinucleotídeo de uma maneira que impeça a liberação subsequente do DNA. Portanto, a transcrição a partir do DNA ligado à partícula pode ocorrer, mas a frequência com que a mesma é liberada para se integrar ao genoma é muito reduzida. Tais métodos incluem a utilização de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma no P3143).
[0131] Em outros aspectos, o polinucleotídeo da revelação pode ser introduzido em plantas colocando-se plantas em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem incorporar um construto de nucleotídeo da revelação dentro de um DNA viral ou molécula de RNA. Os métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada nos mesmos, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, documentos de Patente no U.S. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 e Porta, et al., (1996) Molecular Biotechnology 5:209 a 221, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0132] São conhecidos na técnica métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em uma localização específica no genoma da planta. Em um aspecto, a inserção do polinucleotídeo em uma localização genômica desejada é obtida com o uso de um sistema de recombinação de local específico. Consultar, por exemplo, os documentos no WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, em que todos esses estão incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Brevemente, o polinucleotídeo da revelação pode estar contido em cassete de transferência flanqueado por dois locais de recombinação não idênticos. O cassete de transferência é introduzido em uma planta que tem um local-alvo estavelmente incorporado em seu genoma, o qual é flanqueado por dois locais de recombinação não idênticos que correspondem aos locais do cassete de transferência. Uma recombinase apropriada é fornecida e o cassete de transferência é integrado ao local-alvo. O polinucleotídeo de interesse é, assim, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma de planta.
[0133] As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas, de acordo com maneiras convencionais. Consultar, por exemplo, McCormick, et al., (1986) Plant Cell Reports 5:81a 84, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. Essas plantas podem, então, ser cultivadas, e polinizadas com a mesma cepa transformada ou diferentes cepas, e a progênie resultante que tem expressão da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e, então, as sementes colhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido atingida. Dessa maneira, a presente revelação fornece a semente transformada (também denominada "semente transgênica") que tem um construto de nucleotídeo da revelação, por exemplo, um cassete de expressão da revelação, incorporado de modo estável em seu genoma.
[0134] Há uma variedade de métodos para a regeneração de plantas a partir de tecido vegetal. O método particular de regeneração dependerá do tecido vegetal de partida e da espécie de planta particular a ser regenerada. A regeneração, desenvolvimento e cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplasto vegetal únicos ou a partir de vários explantes transformados é bastante conhecida na técnica (Weissbach e Weissbach, (1988), em: Methods for Plant Molecular Biology, (Edições), Academic Press, Inc., San Diego, Calif., incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência). Esse processo de regeneração e crescimento inclui, tipicamente, as etapas de seleção de células transformadas, cultivar aquelas células individualizadas através dos estágios normais de desenvolvimento embriônicos através do estágio de plântula enraizada. Embriões transgênicos e sementes são regenerados de maneira similar. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são plantados após isso em um meio de crescimento vegetal apropriado, tal como solo. Preferencialmente, as plantas regeneradas são autopolinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigóticas. De outra forma, pólen obtido a partir das plantas regeneradas é cruzado com plantas cultivadas de semente de linhagens agronomicamente importantes. Por outro lado, pólen a partir de plantas dessas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica dos aspectos que contém um polinucleotídeo desejado é cultivada com o uso de métodos bastante conhecidos por uma pessoa versada na técnica.
[0135] Os aspectos fornecem composições para examinar compostos que modulam a expressão dentro das plantas. Os vetores, células e plantas podem ser usados para examinar moléculas candidatas a agonistas e antagonistas das sequências reguladoras reveladas no presente documento. Por exemplo, um gene repórter pode ser operacionalmente ligado a uma sequência reguladora e expresso como um transgene em uma planta. Compostos a serem testados são adicionados e expressão genética de repórter é medida para determinar o efeito sobre a atividade promotora.
Métodos para Introduzir Tecnologias de Edição de Genoma em Plantas
[0136] Em um aspecto, os métodos e composições revelados podem ser usados para introduzir em embriões somáticos com eficiência e velocidade aumentadas polinucleotídeos úteis para direcionar um local específico para modificação no genoma de uma planta derivada do embrião somático. As modificações específicas para local que podem ser introduzidas com os métodos e composições revelados incluem aquelas produzidas com o uso de qualquer método para introduzir modificações específica para local, incluindo, porém sem limitação, através do uso de oligonucleotídeos de reparo de gene (por exemplo, Publicação no U.S. 2013/0019349) ou através do uso de tecnologias de quebra de fita dupla, tais como TALENs, meganucleases, nucleases de dedo de zinco, CRISPR-Cas e similares. Por exemplo, os métodos e composições revelados podem ser usados para introduzir um sistema de CRISPR-Cas em embriões somáticos, com o propósito de modificação de genoma de uma sequência-alvo no genoma de uma planta ou célula vegetal derivada do embrião somático, para selecionar plantas, para deletar uma base ou uma sequência, para edição de gene e para inserir um polinucleotídeo de interesse no genoma de uma planta derivada de um embrião somático. Assim, os métodos e composições revelados podem ser usados juntamente com um sistema de CRISPR-Cas para fornecer um sistema eficaz para modificar ou alterar locais-alvo e nucleotídeos de interesse dentro do genoma de uma planta, célula vegetal ou semente.
[0137] Em um aspecto, a presente revelação compreende métodos e composições para produzir um embrião somático, sendo que o método compreende introduzir um polinucleotídeo de interesse em um local-alvo no genoma de uma célula vegetal, sendo que o método compreende (a) transformar uma ou mais células de um explante com um construto de expressão que compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 e DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) que permite expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar um ou mais embriões somáticos, sendo que nenhum calo é formado; e em que nenhuma proliferação de meristema ocorre; e em que a transformação compreende adicionalmente um primeiro construto de expressão que tem capacidade para expressar um nucleotídeo-guia e um segundo construto de DNA recombinante que tem capacidade para expressar uma endonuclease Cas, sendo que o nucleotídeo- guia e a endonuclease Cas têm capacidade para formar um complexo que permite que a endonuclease Cas introduza uma quebra de fita dupla no local-alvo. Alternativamente, o construto de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 e DNA também pode compreender uma sequência de nucleotídeos que tem capacidade para expressar o nucleotídeo- guia e uma sequência de nucleotídeos que tem capacidade para expressar a endonuclease Cas.
[0138] Em um aspecto, o gene de endonuclease Cas é uma endonuclease Cas9 otimizada vegetal, sendo que a endonuclease Cas9 otimizada vegetal tem capacidade para se ligar a e criar uma quebra de fita dupla em uma sequência-alvo genômica do genoma vegetal.
[0139] A endonuclease Cas é guiada pelo nucleotídeo-guia para reconhecer e, opcionalmente, introduzir uma quebra de fita dupla em um local-alvo específico no genoma de uma célula. O sistema de CRISPR-Cas fornece um sistema eficaz para modificar locais- alvo dentro do genoma de uma planta, célula vegetal ou semente. São adicionalmente fornecidos métodos e composições que empregam um sistema de polinucleotídeo-guia/endonuclease Cas para fornecer um sistema eficaz para modificar locais-alvo dentro do genoma de uma célula e para editar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula. Uma vez que um local-alvo genômico é identificado, uma variedade de métodos podem ser empregados para modificar adicionalmente os locais-alvo de modo que os mesmos contenham uma variedade de polinucleotídeos de interesse. As composições e os métodos revelados podem ser usados para introduzir um sistema de CRISPR-Cas para editar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula. A sequência de nucleotídeos a ser editada (a sequência de nucleotídeos de interesse) pode estar localizada dentro ou fora de um local-alvo que é reconhecido por uma endonuclease Cas.
[0140] Os loci CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas) (também conhecidos como Repetições Diretas Interespaçadas SPIDRs--SPacer) constituem uma família de loci de DNA recentemente descrita. Os loci de CRISPR consistem em repetições de DNA curtas e altamente conservadas (tipicamente 24 a 40 bp, repetidas de 1 a 140 vezes - também denominadas repetições CRISPR) que são parcialmente palindrômicas. As sequências repetidas (normalmente específicas para uma espécie) são interespaçadas por sequências variáveis de comprimento constante (tipicamente de 20 a 58 dependendo do locus CRISPR (WO2007/025097 publicado em 1 de março de 2007).
[0141] Loci CRISPR foram reconhecidos primeiro em E. coli (Ishino et al. (1987) J. Bacterial. 169:5.429 a 5.433; Nakata et al. (1989) J. Bacterial. 171 :3.553 a 3.556). As repetições de sequência curtas interespaçadas similares foram identificadas em Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena e Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al. (1993) Mol. Microbiol. 10:1.057 a 1.065; Hoe et al. (1999) Emerg. Infect. Dis. 5:254 a 263; Masepohl et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:26 a 30; Mojica et al. (1995) Mol. Microbiol. 17:85 a 93). Os loci de CRISPR diferem de outros SSRs pela estrutura das repetições, as quais foram denominadas repetições espaçadas regularmente curtas (SRSRs) (Janssen et al. (2002) OMICS J. Integ. Biol. 6:23 a 33; Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244 a 246). As repetições são elementos curtos que ocorrem em agrupamentos que são sempre regularmente espaçados por sequências variáveis de comprimento constante (Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244 a 246).
[0142] O gene Cas inclui um gene que é geralmente acoplado, associado ou que está próximo ou na vizinhança de loci de CRISPR flanqueadores. Os termos "gene Cas" e "gene associado a CRISPR (Cas)" são usados de forma intercambiável no presente documento. Uma revisão compreensiva da família de proteínas Cas é apresentada em Haft et al. (2005) Computational Biology, PLoS Comput Biol 1(6): e60. doi:10,1371/journal.pcbi.0010060.
[0143] Adicionalmente às quatro famílias de genes inicialmente descritas, uma família de 41 genes associados a CRISPR (Cas) adicional foi descrita no documento WO/2015/026883, que está incorporado ao presente documento a título de referência. Essa referência mostra que os sistemas de CRISPR pertencem às classes diferentes, com diferentes padrões de repetição, conjuntos de genes e gamas de espécies. O número de genes Cas em um dado locus de CRISPR pode variar entre espécies. A endonuclease Cas refere-se a uma proteína Cas codificada por um gene Cas, em que a proteína Cas tem capacidade de introduzir uma quebra de fita dupla em uma sequência-alvo de DNA. A endonuclease Cas é guiada pelo polinucleotídeo-guia para reconhecer e, opcionalmente, introduzir uma quebra de fita dupla em um local-alvo específico no genoma de uma célula. Conforme usado no presente documento, o termo "sistema de polinucleotídeo-guia/endonuclease Cas" inclui um complexo de uma endonuclease Cas e um polinucleotídeo-guia que tem capacidade para introduzir uma quebra de fita dupla em uma sequência-alvo de DNA. A endonuclease Cas desenrola o duplex de DNA em grande proximidade do local-alvo gemômico e cliva ambas as fitas de DNA sob reconhecimento de uma sequência-alvo através de um nucleotídeo-guia, porém apenas se o motivo adjacente de protoespaçador correto (PAM) estiver orientado aproximadamente na extremidade 3' da sequência-alvo (consultar a Figura 2A e a Figura 2B do documento no WO/2015/026883, publicado em 26 de fevereiro de 2015).
[0144] Em um aspecto, o gene de endonuclease Cas é uma endonuclease Cas9, tal como, porém sem limitação, os genes Cas9 listados nas SEQ ID NOs: 462, 474, 489, 494, 499, 505 e 518 do documento no WO2007/025097, publicado em 1 de março de 2007, e incorporado no presente documento a título de referência. Em outro aspecto, o gene de endonuclease Cas é endonuclease Cas9 otimizada de planta, maís ou soja, tal como, porém sem limitação, aquelas mostradas na Figura 1A do documento no WO/2015/026883. Em outro aspecto, o gene de endonuclease Cas é ligado de modo operacional a um sinal de direcionamento nuclear de SV40 a montante da região de códon de Cas e um sinal de localização nuclear de VirD2 bipartido (Tinland et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:7.442 a 7.446) a jusante da região de códon de Cas.
[0145] Em um aspecto, o gene de endonuclease Cas é um gene de endonuclease Cas9 da SEQ ID NO:1, 124, 212, 213, 214, 215, 216, 193 ou nucleotídeos 2.037 a 6.329 da SEQ ID NO:5, ou qualquer fragmento funcional ou variante do mesmo, do documento no WO/2015/026883.
[0146] Conforme relacionado à endonuclease Cas, os termos "fragmento funcional", "fragmento que é funcionalmente equivalente" e “fragmento funcionalmente equivalente" são usados de modo intercambiável no presente documento. Esses termos se referem a uma porção ou subsequência da sequência de endonuclease Cas da presente revelação em que a capacidade para criar uma quebra de fita dupla é mantida.
[0147] Conforme relacionado à endonuclease Cas, os termos "variante funcional", "variante que é funcionalmente equivalente" e “variante funcionalmente equivalente" são usados de modo intercambiável no presente documento. Esses termos se referem a uma variante da endonuclease Cas da presente revelação em que a capacidade para criar uma quebra de fita dupla é mantida. Os fragmentos e as variantes podem ser obtidos por meio de métodos, tais como mutagênese local-dirigida e construção sintética.
[0148] Em um aspecto, o gene de endonuclease Cas é um gene Cas9 de Streptococcus pyogenes otimizado por códon vegetal que pode reconhecer qualquer sequência genômica da forma N(12-30)NGG que pode, a princípio, ser direcionado.
[0149] Endonucleases são enzimas que clivam a ligação de fosfodiéster dentro de uma cadeia de polinucleotídeo, e incluem endonucleases de restrição que clivam DNA em locais especiais sem danificar as bases. As endonucleases de restrição incluem endonucleases do Tipo I, Tipo II, Tipo III e Tipo IV, que incluem, ainda, subtipos. Nos sistemas do Tipo I e Tipo III, as atividades tanto de metilase quanto de restrição estão contidas em um complexo único. Endonucleases também incluem meganucleases, também conhecidas como endonucleases de alojamento (HEases), que assim como endonucleases de restrição, se ligam e cortam em um local de reconhecimento específico, no entanto, os locais de reconhecimento para meganucleases são tipicamente mais longos, cerca de 18 bp ou mais (Pedido de Patente PCT/U.S. 12/30061 depositado em 22 de março de 2012). As meganucleases foram classificadas em quatro famílias com base em motivos de sequência conservados, as famílias são as famílias de LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H e His-Cys box. Esses motivos participam da coordenação de íons metálicos e hidrólise de ligações fosfodiéster. As meganucleases são notáveis por seus longos locais de reconhecimento e por tolerar alguns polimorfismos de sequência nos seus substratos de DNA. A convenção de nomenclatura para meganuclease é similar à convenção para outra endonuclease de restrição. As meganucleases também são caracterizadas por prefixo F-, I- ou PI- para enzimas codificadas por ORFs, íntrons e inteínas independentes, respectivamente. Uma etapa no processo de recombinação envolve clivagem polinucleotídica no ou próximo ao local de reconhecimento. Essa atividade de clivagem pode ser usada para produzir uma quebra de fita dupla. Para análises de recombinases local-específicas e seus locais de reconhecimento, consultar Sauer (1994) Curr Op Biotechnol 5:521 a 527; e Sadowski (1993) FASEB 7:760 a 767. Em alguns exemplos, a recombinase é das famílias Integrase ou Resolvase. As nucleases de efetor TAL são uma nova classe de nucleases sequência-específicas que pode ser usada para realizar quebras de fita dupla em sequências alvo específicas no genoma de uma planta ou outro organismo. (Miller, et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143 a 148). As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) são agentes de indução de quebra de fita dupla modificados compreendidos por um domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco e um domínio de agente de indução de quebra de fita dupla. A especificidade de local de reconhecimento é conferida pelo domínio de dedo de zinco, que compreende, tipicamente, dois, três ou quatro dedos de zinco, por exemplo, que tem uma estrutura C2H2, no entanto, outras estruturas de dedo de zinco são conhecidas e foram modificadas. Os domínios de dedo de zinco são propícios para projetar polipeptídeos que se ligam especificamente a uma sequência de reconhecimento de polinucleotídeo selecionada. As ZFNs incluem um domínio de dedo de zinco de ligação ao DNA modificado ligado a um domínio de endonuclease não específico, por exemplo, domínio de nuclease de uma endonuclease do Tipo Ms, tal como Fokl. Funcionalidades adicionais podem ser fundidas com o domínio de ligação de dedo de zinco, incluindo domínios de ativador transcricional, domínios de repressor transcricional e metilases. Em alguns exemplos, a dimerização de domínio de nuclease é exigida para a atividade de clivagem. Cada dedo de zinco reconhece três pares de base consecutivos no DNA alvo. Por exemplo, um domínio de 3 dedos reconheceu uma sequência de 9 nucleotídeos contíguos, com uma exigência de dimerização da nuclease, dois conjuntos de tripletos de dedo de zinco são usados para ligar uma sequência de reconhecimento de 18 nucleotídeos.
[0150] Bactérias e archaea têm defesas imunológicas adaptativas evoluídas denominadas sistemas associados às repetições palindrômicas curtas regularmente espaçadas e agrupadas (CRISPR)/CRISPR (Cas) que usam RNA curto para direcionar a degradação de ácidos nucleicos estranhos ((WO2007/025097 publicado em 1 de março de 2007). O sistema CRISPR tipo II/Cas de bactérias emprega um crRNA e tracrRNA para orientar a endonuclease Cas para o seu alvo de DNA. O crRNA (CRISPR RNA) contém a região complementar a uma fita do DNA-alvo de fita dupla e pares de base com o tracrRNA (CRISPR RNA de transativação) que formam um duplex de RNA que orienta a endonuclease Cas a clivar o DNA-alvo.
[0151] Conforme usado no presente documento, o termo “nucleotídeo-guia" refere-se a uma fusão sintética de duas moléculas de RNA, um crRNA (RNA de CRISPR) que compreende um domínio de direcionamento variável e um tracrRNA. Em um aspecto, o nucleotídeo-guia compreende um domínio de direcionamento variável de 12 a 30 sequências de nucleotídeos e um fragmento de RNA que pode interagir com uma endonuclease Cas.
[0152] Conforme usado no presente documento, o termo "polinucleotídeo-guia" se refere a uma sequência de polinucleotídeos que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas e permite que a endonuclease Cas reconheça e, opcionalmente, clive um local-alvo de DNA. O polinucleotídeo guia pode ser uma molécula única ou uma molécula dupla. A sequência de polinucleotídeos-guia pode ser uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma combinação das mesmas (uma sequência de combinação de RNA-DNA). Opcionalmente, o polinucleotídeo-guia pode compreender pelo menos um nucleotídeo, ligação fosfodiéster ou modificação de ligação como, mas sem limitação, Ácido Nucleico Bloqueado (LNA), 5-metil dC, 2.6- diaminopurina, 2'-Fluoro A, 2'-Fluoro U, 2'-O-Metil RNA, ligação de fosforotioato, ligação a uma molécula de colesterol, ligação a uma molécula de polietilenoglicol, ligação a uma molécula de espaçador 18 (cadeia de hexaetilenoglicol), ou ligação covalente 5' a 3’ que resulta em circularização. Um polinucleotídeo-guia que compreende somente ácidos ribonucleicos também é denominado “nucleotídeo-guia".
[0153] O polinucleotídeo-guia pode ser uma molécula dupla (também denominada duplex de polinucleotídeo-guia) que compreende um primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (denominado domínio de Direcionamento Variável ou domínio de VT) que é complementar a uma sequência de nucleotídeos em um DNA- alvo e um segundo domínio de sequência de nucleotídeos (denominado domínio de reconhecimento de endonuclease Cas ou domínio de CER) que interage com um polipeptídeo de endonuclease Cas. O domínio de CER do polinucleotídeo guia de molécula dupla compreende duas moléculas separadas que são hibridizadas ao longo de uma região de complementariedade. As duas moléculas separadas podem ser RNA, DNA e/ou sequências de combinação de RNA-DNA. Em um aspecto, a primeira molécula do polinucleotídeo- guia duplex que compreende um domínio de VT ligado a um domínio de CER é denominada "crDNA" (quando composta de um trecho contíguo de nucleotídeos de DNA) ou "crRNA" (quando composta de um trecho contíguo de nucleotídeos de RNA) ou "crDNA-RNA" (quando composta de uma combinação de DNA e nucleotídeos de RNA). O crNucleotídeo pode compreender um fragmento do cRNA de ocorrência natural em Bactéria e Archaea. Em um aspecto, o tamanho do fragmento do cRNA de ocorrência natural em Bactérias e Archaea que está presente em um crNucleotídeo revelado no presente documento pode estar na faixa de, porém sem limitação, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos.
[0154] Em um aspecto, a segunda molécula do polinucleotídeo- guia duplex que compreende um domínio de CER é denominada "tracrRNA" (quando composta de um trecho contíguo de nucleotídeos de RNA) ou "tracrDNA" (quando composta de um trecho contíguo de nucleotídeos de DNA) ou "tracrDNA-RNA" (quando composta de uma combinação de nucleotídeos de RNA e DNA. Em um aspecto, o RNA que guia o complexo de endonuclease Cas9 de RNA é um RNA duplo que compreende um duplex de crRNA e tracrRNA.
[0155] O polinucleotídeo-guia também pode ser uma molécula única que compreende um primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (denominado domínio de Direcionamento Variável ou domínio de VT) que é complementar a uma sequência de nucleotídeos em um DNA-alvo e um segundo domínio de nucleotídeo (denominado domínio de reconhecimento de endonuclease Cas ou domínio de CER) que interage com um polipeptídeo de endonuclease Cas. Por “domínio” entende-se uma extensão contígua de nucleotídeos que pode ser uma sequência de RNA, DNA e/ou combinação de RNA-DNA. O domínio VT e/ou o domínio de CER de um polinucleotídeo-guia único pode compreender uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma sequência de combinação de RNA-DNA. Em um aspecto, o polinucleotídeo-guia único compreende um crNucleotídeo (que compreende um domínio VT ligado a um domínio de CER) ligado a um tracrNucleotídeo (que compreende um domínio de CER), em que a ligação é uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência de RNA, uma sequência de DNA, ou uma sequência de combinação de RNA-DNA. O polinucleotídeo-guia único que é compreendido por sequências do crNucleotídeo e tracrNucleotídeo pode ser denominado "nucleotídeo-guia único" (quando composto de um trecho contíguo de nucleotídeos de RNA) ou "DNA-guia único" (quando composto de um trecho contíguo de nucleotídeos de DNA) ou “DNA-nucleotídeo-guia único" (quando composto de uma combinação de RNA e nucleotídeos de DNA). Em um aspecto da revelação, o nucleotídeo-guia único compreende um cRNA ou fragmento de cRNA e um tracrRNA ou fragmento de tracrRNA do sistema CRISPR/Cas do tipo II que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas tipo II, em que o complexo de nucleotídeo- guia e endonuclease Cas pode direcionar a endonuclease Casa um local-alvo genômico de planta, que possibilita que a endonuclease Cas introduza uma quebra de fita dupla no local- alvo genômico. Um aspecto de uso de um polinucleotídeo-guia único versus um polinucleotídeo-guia duplex é que apenas um cassete de expressão precisa ser feito para expressar o polinucleotídeo- guia único.
[0156] O termo “domínio de direcionamento variável" ou "domínio de VT" é usado de modo intercambiável no presente documento e inclui uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma fita (sequência de nucleotídeos) de um local- alvo de DNA de fita dupla. A % de complementação entre o primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (domínio de VT) e a sequência-alvo pode ser de pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. O domínio- alvo variável pode ser de pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos em comprimento. Em um aspecto, o Domínio de Direcionamento Variável compreende uma extensão contígua de 12 a 30 nucleotídeos. O domínio de direcionamento variável pode ser composto de uma sequência de DNA, uma sequência de RNA, uma sequência de DNA modificada, uma sequência de RNA modificada ou qualquer combinação das mesmas.
[0157] O termo "domínio de reconhecimento de endonuclease Cas" ou "domínio de CER" de um polinucleotídeo guia é usado de modo intercambiável no presente documento e inclui uma sequência de nucleotídeos (como um segundo domínio de sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo guia), que interage com um polipeptídeo de endonuclease Cas. O domínio de CER pode ser composto de uma sequência de DNA, uma sequência de RNA, uma sequência de DNA modificada, uma sequência de RNA modificada (consultar, por exemplo, as modificações descritas no presente documento) ou qualquer combinação dos mesmos.
[0158] A sequência de nucleotídeos que liga o crNucleotídeo e o tracrNucleotídeo de um polinucleotídeo-guia único pode compreender uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma sequência de combinação de RNA-DNA. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que liga o crNucleotídeo e o tracrNucleotídeo de um polinucleotídeo-guia único pode ser de pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 nucleotídeos em comprimento. Em outro aspecto, a sequência nucleotídica que liga o crNucleotídeo e o tracrNucleotídeo de um polinucleotídeo-guia único pode compreender uma sequência de tetralaço, tal como, porém sem limitação, uma sequência de tetralaço GAAA.
[0159] A modificação de sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo-guia, do domínio de VT e/ou do domínio de CER pode ser selecionada, mas sem limitação, dentre o grupo que consiste em um cap 5’, uma cauda poliadenilada de 3’, uma sequência de riboswitch, uma sequência de controle de estabilidade, uma sequência que forma um duplex de dsRNA, uma modificação ou sequência que direciona o polinucleotídeo-guia para uma localização subcelular, uma modificação ou sequência que fornece rastreamento, uma modificação ou sequência que fornece um local de ligação para proteínas, um Ácido Nucleico Bloqueado (LNA), um nucleotídeo 5-metil dC, um nucleotídeo 2.6- Diaminopurina, um nucleotídeo 2’-Flúor A, um nucleotídeo 2’- Flúor U; um nucleotídeo de RNA 2’-O-Metil, uma ligação fosforotioato, uma ligação a uma molécula de colesterol, uma ligação a uma molécula de polietilenoglicol, uma ligação a uma molécula de espaçador 18, uma ligação covalente 5’ a 3’ ou qualquer combinação das mesmas. Essas modificações podem resultar em pelo menos um recurso benéfico adicional, em que o recurso benéfico adicional é selecionado dentre o grupo de uma estabilidade modificada ou regulada, um direcionamento subcelular, rastreamento, uma identificação fluorescente, um local de ligação para uma proteína ou complexo de proteína, afinidade de ligação modificada a uma sequência-alvo complementar, resistência modificada à degradação celular e permeabilidade celular aumentada.
[0160] Em um aspecto, o nucleotídeo-guia e a endonuclease Cas têm capacidade para formar um complexo que permite que a endonuclease Cas introduza uma quebra de fita dupla em um local- alvo de DNA.
[0161] Em um aspecto da revelação o domínio-alvo variável tem 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos em comprimento.
[0162] Em um aspecto da revelação, o nucleotídeo-guia compreende um cRNA (ou fragmento de cRNA) e um tracrRNA (ou fragmento de tracrRNA) do sistema CRISPR/Cas do tipo II que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas tipo II, em que o complexo de nucleotídeo-guia e endonuclease Cas pode direcionar a endonuclease Casa um local-alvo genômico de planta, que possibilita que a endonuclease Cas introduza uma quebra de fita dupla no local-alvo genômico. Em um aspecto, o nucleotídeo-guia pode ser introduzido em uma planta ou célula vegetal diretamente com o uso de qualquer método conhecido na técnica, tal como, porém sem limitação, bombardeio de partículas ou aplicações tópicas.
[0163] Em um aspecto, o nucleotídeo-guia pode ser introduzido indiretamente introduzindo-se uma molécula de DNA recombinante que compreende a sequência de DNA-guia correspondente operacionalmente ligada a um promotor específico de planta que tem capacidade para transcrever o nucleotídeo-guia na célula vegetal. O termo “DNA-guia correspondente” inclui uma molécula de DNA que é idêntica à molécula de RNA, mas tem um “T” substituído para cada “U” da molécula de RNA.
[0164] Em um aspecto, o nucleotídeo-guia é introduzido por meio de bombardeamento de partícula ou com o uso dos métodos e composições revelados para transformação de Agrobacterium de um construto de DNA recombinante que compreende o DNA-guia correspondente operacionalmente ligado a um promotor de polimerase III U6 vegetal.
[0165] Em um aspecto, o RNA que guia o complexo de endonuclease Cas9 de RNA, [e um RNA duplex que compreende um duplex de crRNA e tracrRNA. Uma vantagem do uso de um nucleotídeo-guia versus um crRNA-tracrRNA duplexado é que somente um cassete de expressão precisa ser produzido para expressar o nucleotídeo-guia fundido.
[0166] Os termos “local-alvo”, “sequência-alvo”, “DNA-alvo”, “locus-alvo”, “local-alvo genômico”, “sequência-alvo genômica” e “locus-alvo genômico” são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência de polinucleotídeos no genoma (incluindo DNA cloroplástico e mitocondrial) de uma célula vegetal na qual uma ruptura de fita dupla é induzida no genoma de célula vegetal por uma endonuclease Cas. O local-alvo pode ser um local endógeno no genoma de planta ou, alternativamente, o local-alvo pode ser heterólogo à planta e, assim, não ser de ocorrência natural no genoma, ou o local- alvo pode ser encontrado em uma localização genômica heteróloga em comparação ao local que a mesma ocorre na natureza.
[0167] Conforme usado no presente documento, os termos “sequência-alvo endógena” e “sequência-alvo nativa” são usados de modo intercambiável no presente documento e referem-se a uma sequência-alvo que é endógena ou nativa do genoma de uma planta e está na posição endógena ou nativa dessa sequência-alvo no genoma da planta. Em um aspecto, o local-alvo pode ser similar a um local de reconhecimento de DNA ou local-alvo que é especificamente reconhecido e/ou ligado por um agente de indução de quebra de fita dupla, tal como uma endonuclease LIG3-4 (Publicação de Patente no U.S. 2009-0133152 A1 (publicada em 21 de maio de 2009) ou uma meganuclease MS26++ (Pedido de Patente no U.S. 13/526912 depositado em 19 de junho de 2012).
[0168] Um “local-alvo artificial” ou uma “sequência-alvo artificial” são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência-alvo que foi introduzida no genoma de uma planta. Tal sequência-alvo artificial pode ter sequência idêntica a uma sequência-alvo endógena ou nativa no genoma de uma planta, mas estar localizadas em uma posição diferente (isto é, uma posição não endógena ou não nativa) no genoma de uma planta.
[0169] Um "local-alvo alterado", “sequência-alvo alterada", "local-alvo modificado" e "sequência-alvo modificada" são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência-alvo conforme revelada no presente documento que compreende pelo menos uma alteração em comparação com sequência- alvo não alterada. Tais “alterações” incluem, por exemplo: (i) substituição de pelo menos um nucleotídeo, (ii) uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, (iii) uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii).
[0170] Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração e não como limitação.
EXEMPLOS
[0171] Os aspectos são adicionalmente definidos nos seguintes Exemplos, nos quais partes e porcentagens estão em peso e graus estão em Celsius, a menos que afirmado de outra forma. Deve ser entendido que esses Exemplos, embora indiquem aspectos da revelação, são concedidos apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e desses Exemplos, uma pessoa versada na técnica pode determinar as características essenciais dos aspectos, e sem se afastar do espírito e escopo dos mesmos, pode realizar várias alterações e modificações nos mesmos para se adaptarem às várias utilizações e condições. Assim, várias modificações dos aspectos adicionalmente àquelas mostradas e descritas no presente documento serão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição acima. Tais modificações também se destinam a ser abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas.
EXEMPLO 1. IDENTIFICAÇÃO DO PROMOTOR DE PLTP.
[0172] Promotores foram identificados para melhorar métodos de transformação que usam os genes WUS2 e ODP2 de maís. Altos níveis de expressão de ODP2 (por exemplo, com o uso do PRO de UBI de maís; SEQ ID NO: 31) e níveis inferiores de expressão de WUS2 (por exemplo, com uso de PRO de NOS de Agrobacterium) foram relatados e ambos expressos imediatamente após transformação mediada por Agrobacterium e ao logo do crescimento de calo para fornecer crescimento ideal e taxas de recuperação de evento (consultar a Publicação no U.S. US20140157453, incorporada no presente documento em sua totalidade a título de referência. No entanto, continuar a expressar esses fatores de transcrição nesse nível resultou em graves anormalidades pleiotrópicas, que incluem inchaço, raízes atrofiadas, grave torção e deformidade da porção vegetativa da planta, e também resultou em esterilidade. Uma solução anterior foi extirpar esses genes antes da regeneração de plântulas, com o uso de uma recombinase de CRE conduzida por RAB17 PRO. No entanto, o processo de dessecação necessário para estimular expressão de CRE foi prejudicial para a saúde subsequente de diversas inatos, e uma solução alternativa foi necessária.
[0173] A partir de estudos anteriores sabe-se que plantas de milho foram particularmente sensíveis à expressão ectópica de ODP2 e WUS2 nas raízes, borla e espiga. Com base nessas informações, observou-se novos promotores que se expressaram no embrião (e, assim, calo), sem expressão nas raízes (em todos os estágios de desenvolvimento), borla ou espiga - o que também antecipa que a expressão precoce na folha seria aceitável.
[0174] Uma vez que os critérios de expressão acima foram estabelecidos, 73.268 candidatos a gene do banco de dados da DuPont Pioneer foram analisados (com o uso de dados da Illumina RNA-Seq) para determinar quais genes de maís correspondem a esse perfil de expressão. Com base nessa análise, onze promotores candidatos foram identificados, os quais correspondem a esses critérios. Um promotor identificado, ZM-PLTP (SEQ ID NO: 1), a partir de um gene de maís gene de fosfolipídeo transferase de maís anteriormente não identificado foi mais altamente expresso no embrião. Conforme mostrado na Figura 5, em comparação com a expressão constitutiva do PRO de UBI (Figura 19), a expressão de PLTP (Figura 5) foi i) muito forte em sedas, pericarpo e endosperma, ii) forte no embrião, iii) moderada na folha e talo e iv) ausente na raiz, meristema, espiga verde, borla, anteras e pólen, embora o nome implique, a expressão de UBI foi observada em todos os tecidos, sendo particularmente forte em pólen. Expressão tanto de PLTP quanto de UBI foi em uma faixa similar, em aproximadamente 13.000 e 17.000 PPM, respectivamente.
EXEMPLO 2. ALINHAMENTO DOS PROMOTORES DE PLTP DE MAÍS E SORGO.
[0175] As sequências de promotor para os promotores de maís e sorgo (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, respectivamente) foram alinhadas para distinguir elementos compartilhados (7 bases ou mais longas) dentro dos promotores, e para determinar quais desses elementos compartilharam a estrutura dos elementos de promotor vegetal conhecidos na literatura. Com base nessa análise, as sequências de promotor SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 compartilharam um número grande de elementos, incluindo diversos elementos que correspondem aos elementos de promotor vegetal conhecidos. Tabela 2. Elementos compartilhados entre a sequência de promotores de PLTP de maís (SEQ ID NO: 1) e a sequência de promotores de PLTP de sorgo (SEQ ID NO: 2). A Tabela 2 inclui as sequências consensuais para elementos de promotor vegetal conhecidos que correspondem à SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. SE na Tabela 2 representa elementos compartilhados. Y representa uma pirimidina e W representa uma preferência fraca por A ou T.
EXEMPLO 3. MODELOS DE EXPRESSÃO TRANSGENE CONDUZIDOS PELO PROMOTOR DE PLTP DE MAÍS.
[0176] Para avaliar modelos espaciais e temporais de expressão conduzidos pelo promotor de PLTP, o seguinte cassete de expressão foi construído: PLTP PRO::DS-GREEN::pinII TERM. Eventos de maís transgênicos que contêm esse cassete de expressão foram produzidos. Tecidos de embriões zigóticos em desenvolvimento, de raízes e folhas de plantas em germinação (e durante estágios subsequentes de crescimento vegetativo), a partir de borla e espiga foram observados sob iluminação de epifluorescência com o uso de um estereomicroscópio e com o uso de um microscópio de epifluorescência composto. Expressão no embrião zigótico foi forte, porém foi confinada ao epitélio secretor do escutelo (a superfície que entra em contato com o endosperma, consultar a Figura 1). Em folhas, o modelo de expressão não foi uniforme, porém foi restrito muito especificamente às células acessórias que flanqueiam as células de proteção e às células curtas na epiderme (consultar a Figura 2). Embora a expressão nas sedas também tenha sido muito forte, não foi uniforme, em que fluorescência verde-clara foi observada nos pelos de seda e na ponta da seda (consultar a Figura 3).
[0177] Após transformação mediada por Agrobacterium de embriões imaturos de tipo selvagem com o uso de uma linhagem inatas da Pioneer, a fluorescência verde foi observada embriões somáticos transgênicos em desenvolvimento precoce (consultar a Figura 4) e continuaram a ser expressos em regeneração (nas folhas, porém não nas raízes).
EXEMPLO 4: PLASMÍDEOS.
[0178] Plasmídeos que compreendem T-DNA descritos na Tabela 1 foram usados em experimentos descritos no presente documento. Tabela 3. Plasmídeos que compreendem T-DNA descritos na Tabela 1 foram usados em experimentos descritos abaixo no presente documento. Os plasmídeos listados na Tabela 1 abrigam um T-DNA que contém os componentes indicados.
Exemplo 5: MEIOS DE CULTURA
[0179] Vários meios são referidos nos Exemplos para uso em transformação e cultura celular. As descrições desses meios são descritas abaixo na Tabelas 4 a 11. Tabela 4. Composições de meios para transformação de sorgo. aMeios PHI-I, PHI-T, PHI-U, PHI-V, PHI-X e PHI-Z de Zhao et al. 2000 breserva de vitaminas MS: 0,1 g/l de ácido nicotínico, 0,1 g/l de HCl de piridoxina, 0,02 g/l HCl de tiamina, 0,4 g/l de glicina. Tabela 5. Composição de meio de infecção de líquido de trigo WI 4. Tabela 6. Composição de meio de cocultivo de trigo WC no 10. Tabela 7. Composição de meio de cultura de Tecido Verde de trigo DBC4. Tabela 8. Composição de meio de indução de Tecido Verde de trigo DBC6. Tabela 9. Composição de meio de regeneração de trigo MSA. Tabela 10. Composição de meio de regeneração de trigo MSB. Tabela 11. Formações de meios para transformação, seleção e regeneração de maís. Tabela 11, continuação.
EXEMPLO 6. TRANSFORMAÇÃO COM O USO DO PROMOTOR DE PLTP.
[0180] Uso do promotor de PLTP para conduzir a expressão do gene de ODP2 de maís melhorou a transformação e permitiu a regeneração de plantas férteis fenotipicamente normais. Uma linhagem imatura da Pioneer usada para teste foi muito sensível à expressão de ODP2 ectópica. Quando um construto foi usado em cepa de Agrobacterium LBA4404 THY-, que conteve NOS PRO::WUS2::PINII TERM + UBI PRO::ODP2::PINII TERM dentro do T- DNA, frequências de transformação no nível de calo frequentemente alcançaram 70% (calos transgênicos relativos ao número de embriões de partida), no entanto, caso o crescimento continuasse em regeneração de planta, a expressão contínua de ODP2 resultaria em raízes atrofiadas, anormalidades em desenvolvimento de folha e 100% de esterilidade. Em contraste, quando a mesma linhagem imatura foi transformada com uma Agrobacterium que carrega os cassetes de expressão NOS PRO::WUS2::PINII TERM + PLTP PRO::ODP2::PINII TERM no T-DNA, as frequências de transformação de calo também foram muito altas (>100%). Adicionalmente, todas as plantas regeneradas exibiram morfologia de tipo selvagem normal e todas foram férteis.
[0181] Em outro conjunto de experimentos, o promotor de PLTP que conduz ODP2 e o promotor de NOS que conduz expressão de WUS2 resultaram em formação de embrião somático rápida e direta.
[0182] Embriões imaturos (de 2 a 2,5 mm em comprimento) foram colhidos a partir de PH184C imatura de maís da Pioneer aproximadamente 11 dias após polinização, e foram infectados com cepa de Agrobacterium AGL1 que contém um T-DNA com a seguinte composição; RB + NOS PRO:Top2:ZM-WUS2::IN2-1 TERM + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM + GZ-W64A TERM + UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ESR::SB-SAG12 TERM + SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM + LTP2 PRO::ZS-YELLOW::PINII TERM-LB (para o PRO de PLTP, consultar a SEQ ID NO: 1, e para PHP77833, consultar a SEQ ID NO:28). Agrobacterium foi cultivada em meio líquido a uma densidade óptica de 0,5 (em 520 nm) e os embriões imaturos (53, 52 e 56 embriões de três espigas separadas) foram incubados na suspensão de Agrobacterium por 5 minutos antes da remoção do líquido para serem colocados em meio 710I sólido.
[0183] Após 24 horas, os embriões foram movidos para o meio fresco para começar a seleção contra a Agrobacterium. Após 6 dias, diversos pequenos embriões somáticos foram observados na superfície de cada um dos 124 embriões imaturos tratados. Cada embrião imaturo conteve embriões somáticos diversos, distintos e individuais, sendo que vários são sustentados em suspensores claramente definidos. Após transformação de Agrobacterium com um T-DNA que contém cassetes de expressão AXIG1::WUS2:: IN2 e PLTP::ODP2::OS-T28, juntamente com um cassete de expressão UBI PRO::ZS-GREEN::PINII (PHP79024, consultar a SEQ ID NO:29), se observou que diversos embriões somáticos verde fluorescente individuais cresceram a partir do escutelo do embrião zigótico originalmente infectado (Figura 4). Essa imagem foi capturada 4 dias após o início de infecção por Agrobacterium, com o uso de um estereomicroscópio com anexos de epifluorescência e um conjunto de filtro de Leica GFP padrão. Como referência, o comprimento total do embrião zigótico foi de aproximadamente 1,5 mm.
[0184] Sete dias após Agroinfecção, os embriões foram transferidos para o meio de maturação (meio 289Q + 0,1 mg/l de imazapir), com o uso do herbicida imidazolinona para selecionar embriões transgênicos. Após 14 dias no meio de maturação, os embriões maduros foram movidos em meio de enraizamento (meio 13158H; meio 13158 mais 25 mg/l de cefotaxima) e pedaços de folha foram amostrados para análise por PCR. Dos 53 embriões derivados da primeira espiga, 12 plantas resistentes ao herbicida foram analisadas por PCR e enviadas para a estufa entre 32 a 34 dias após o início do experimento, que foi iniciado quando a transformação de Agrobacterium foi iniciada. Plantas foram amostradas por PCR colhendo-se duas amostras de cada planta, uma de cada uma dentre duas espigas opostas (de lados opostos da planta) para verificar a possibilidade de qualquer uma das plantas estar apenas parcialmente transformada (quimérica). Resultados de PCR para cada par de amostras de todas as plantas foram consistentes com as outras, o que indica que nenhuma planta quimérica foi produzida, e que as plantas T0 foram homogeneamente transgênicas.
EXEMPLO 7. MODELOS DE EXPRESSÃO PARA PROMOTORES.
[0185] Dados foram analisados para avaliar modelos de expressão normais em vários tecidos de maís durante desenvolvimento vegetal. Sequenciação de assinatura massivamente paralela (Reinartz J et al. 2002. Brief Funct Genomic Proteomic. 1(1):95 a 104; Brenner S et al. 2000. Nat Biotechnol. 18(6):630 a 634; Torres et al., 2008. Gene expression profiling by massively parallel sequencing. Genome Res. 18(1):172 a 177) foi usada para avaliação. Vários tecidos vegetais em diferentes estágios de desenvolvimento foram amostrados para análise, e incluíram raiz, caule, folha/broto, espiga verde, embrião, pedicelo, endosperma, pericarpo, seda, borla, espigueta, antera, pólen e meristema. Dados de expressão para Sequenciação de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) são mostrados para ZM- PLTP (SEQ ID NO. 1) na Figura 5, para ZM-PLTP1 (SEQ ID NO. 3) na Figura 6, para ZM-PLTP2 (SEQ ID NO. 4) na Figura 7, para ZM-FBP1 (SEQ ID NO. 10) na Figura 8, para ZM-RFP (SEQ ID NO. 11) na Figura 9, para ZM-APMP (SEQ ID NO. 12) na Figura 10, para ZM- RfeSP (SEQ ID NO. 13) na Figura 11, para ZM-CRR6 (SEQ ID NO. 14) na Figura 12, para ZM-G3K (SEQ ID NO. 15) na Figura 13, para ZM- CAB7 (SEQ ID NO. 16) na Figura 14, para ZM-UBR (SEQ ID NO. 17) na Figura 15, para ZM-HBP (SEQ ID NO. 18) na Figura 16, para ZM- PS1-N (SEQ ID NO. 19) na Figura 17 e psi-N de subunidade de centro de reação de Fotossistema I de ZM-SDR (SEQ ID NO. 20) na Figura 18. Para todos esses promotores, uma expressão distintiva característica foi que nenhuma expressão foi observada nas raízes, e a expressão nas estruturas reprodutivas (exceto para sedas em alguns promotores) foi inexistente ou baixa. Expressão de folha foi de moderada para alta para diversos desses genes, exceto para ZM-SDR (SEQ ID NO:20) na Figura 18, ZM-LGL (SEQ ID NO:25) na Figura 20, ZM-LEA14-A (SEQ ID NO:26) na Figura 21 e ZM-LEA34-D (SEQ ID NO: 27) na Figura 22, que mostrou expressão apenas (ou predominantemente) nos embriões.
EXEMPLO 8: USO DO PROMOTOR DE LTP3 DE SOJA (GM-LTP3) PARA CONTROLAR EXPRESSÃO DE WUS PARA MELHORAR TRANSFORMAÇÃO DE SOJA.
[0186] Promotores foram identificados para melhorar os métodos de transformação com o uso do gene WUS de Arabidopsis. Altos níveis de expressão para WUS de Arabidopsis (por exemplo, com o uso do PRO de EF1A de soja; SEQ ID NO: 32), expressos imediatamente após transformação mediada por Agrobacterium e ao longo do crescimento de calo aumentou as taxas de formação de evento. No entanto, continuar a expressar esse fator de transcrição nesse nível prejudicou regeneração de evento. Possíveis soluções seriam extirpar esse gene antes da regeneração de plântulas e restringir a expressão ectópica de WUS de Arabidopsis em embriões somáticos de diferenciação e maturação. Com base nisso, observou-se que novos promotores se expressam em células cultivadas, embriões e sementes imaturas em desenvolvimento, sem ou com muita pouca expressão em outros tecidos vegetais. O promotor de LTP3 de soja (GM-LTP3; SEQ ID NO: 21) correspondeu a esses critérios. GM-LTP3 (SEQ ID NO: 21) é de um gene de fosfolipídeo transferase de soja anteriormente não identificado. Em comparação com a expressão constitutiva do PRO de EF1A (Figura 23), a expressão de LTP3 (Figura 24) foi i) forte no desenvolvimento de sementes imaturas e ii) fraca ou ausente em outras amostras e partes de uma planta, enquanto a expressão de EF1A foi observada em todos os tecidos.
[0187] A cepa de Agrobacterium AGL1, que contém um T-DNA com os cassetes de expressão GM-LTP3 PRO::AT-WUS::UBI14 TERM + GM- UBQ PRO::TAGRFP::UBQ3 TERM, foi usada para transformar a variedade de soja da Pioneer 93Y21. Quatro dias após a infecção por Agrobacterium iniciar, o tecido foi lavado com meio de cultura estéril para remover bactérias em excesso. Nove dias depois o tecido foi movido para meio de maturação de embrião somático e 22 dias depois os embriões transgênicos somáticos estavam prontos para secar. Nesse ponto, embriões somáticos maduros bem formados estavam vermelhos fluorescentes sob um estereomicroscópio de epifluorescência com um conjunto de filtro de RFP. Os embriões somáticos que se desenvolveram foram funcionais e germinaram para produzir plantas saudáveis na estufa. Esse rápido método de produção de embriões somáticos e germinação para formar plantas reduziu o cronograma típico da infecção por Agrobacterium para mover plantas T0 transgênicas para a estufa de 4 meses (para transformação de soja convencional) para dois meses.
[0188] Conforme mostrado no diagrama de plotagem em caixa na Figura 25 que exibe a distribuição de respostas de embriogênese somática de explantes de cotilédone imaturos 2 semanas após infecção por Agrobacterium, o uso do promotor de LTP3 de GM para conduzir a expressão de At-WUS (PRO de LTP3) resultou em um melhoramento substancial em embriogênese somática (em comparação com outros promotores testados, tal como os promotores de P450, GH, HSD e SSL1, ou com o controle negativo (CON NEG) sem cassete de expressão de WUS).
[0189] O aumento na resposta de embrião somático sobre a população de cotiledôneas imaturas infectadas também foi acompanhado por rápido desenvolvimento de embrião somático, que foi observado tanto sob microscopia ótica para avaliar morfologia (Figura 26A) quanto epifluorescência para observar fluorescência vermelha (Figura 26B). A mesma mostra embriões somáticos de soja transgênicos maduros que estavam prontos para dessecação e após isso germinação apenas 5 semanas após infecção por Agrobacterium. Quando cotiledôneas imaturas foram transformadas sem LTP3::At-WUS (tratamento de controle) embriões somáticos maduros não foram somente produzidos em uma frequência altamente reduzida (consultar Figura 25) mas a duração de infecção por Agrobacterium para um estágio comparável de maturação de embrião somático precisou de nove semanas de cultivo.
EXEMPLO 9: RESULTADOS SOBRE O USO DE VÁRIOS PROMOTERS DE PLTP DE FONTES GENÉTICAS HOMÓLOGAS PARA PRODUZIR EMBRIÕES SOMÁTICOS EM MILHO.
[0190] Para os estudos descritos abaixo, uma única configuração de T-DNA foi utilizada, começando com a seguinte configuração usada como o controle positivo: RB + ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM + GZ-W64A TERM + UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ESR::SB-SAG12 TERM + SB- ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM + UBI PRO::ZS-GREEN1::PINII TERM:SB-ACTIN TERM-LB. Dentro do contexto desse T-DNA, todos os componentes permaneceram os mesmos exceto pelo fato de que PRO de ZM-PLTP (SEQ ID NO:1 do tratamento de controle) foi substituído por promotores de dois parálogos de maís (ZM-PLTP1 e ZM-PLTP2, SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, respectivamente) ou de três otrólogos de Poaceae (SB-PLTP1 de Sorghum bicolor (SEQ ID NO:2), SI-PLTP1 de Setaria italica (SEQ ID NO:7) ou OS-PLTP1 de Oryza sativa (SEQ ID NO:8)). Usar PH1V5T, PH1V69 e PHH5G inatos da Pioneer como a fonte de embriões imaturos, quando o T-DNA de controle (todos os componentes de maís conforme mostrado acima) foi introduzido no escutelo, para a maior parte de embriões imaturos infectados aproximadamente metade da área de superfície escutelar seria coberta por embriões somáticos recém desenvolvidos após 7 dias e essa resposta seria pontuada como um "2". Na extremidade superior do espectro de resposta, quando o escutelo foi coberto por um "gramado" de embriões somáticos individuais em desenvolvimento que eram prontamente discerníveis sob o microscópio de dessecação 7 dias após infecção, essa resposta recebeu uma pontuação relativa de "4" e todos os outros tratamentos foram classificados em incrementos de número inteiro de "0" (sem resposta) a "4" (a produção mais prolífica de embriões somáticos). Em termos da resposta padrão para esses três inatos (isto é, sem cassetes de expressão de WUS2 ou ODP2 no T-DNA), PH1V5T produziu um baixo nível de embriões somáticos (pontuação de 1), enquanto tanto PH1V69 quanto PHH5G não produziram resposta (pontuação de 0).
[0191] Usar vários promotores "homólogos" produziu uma gama de embriogênese somática rápida em três diferentes inatos da Pioneer (Tabela 12) relativos ao tratamento de controle (PRO de ZM-PLTP) que produziu pontuações entre 1 e 2. Tabela 12. Resposta de transformação de inato aos diferentes homólogos de promotor de PLTP
[0192] Nesse experimento, o promotor de ZM-PLTP1 produziu as pontuações de embriogênese somática mais elevadas em sete dias após infecção, que estiveram na faixa de 3 (aproximadamente 75% coberto com embriões somáticos em PH1V5T) a 4 (totalmente coberto como em PH1V69 e PHH5G). ZM-PLTP2 também produziu resultados melhores que o controle, com uma pontuação uniforme de 3 por todos os três inatos. Para promotores de PLTP1 de outros membros da Poaceae, os promotores de sorgo e arroz produziram uma resposta de nível intermediário (2) em dois inatos e uma resposta baixa (1) em um inato, enquanto o promotor de Setaria resultou em uma resposta de nível baixo em dois e uma resposta de nível intermediário em um inato. Entretanto, todos os promotores de PLTP testados resultou em estímulo positivo de embriogênese somática após sete dias.
[0193] Conforme usado no presente documento, as formas singulares "um", "uma", "o” e "a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Desse modo, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de tais células e referência "à proteína" inclui referência a uma ou mais proteínas e equivalentes dos mesmos conhecidos por aqueles versados na técnica, e assim por diante. Todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta revelação pertence, a menos que indicado de outro modo.
[0194] Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório descritivo são indicativas do nível daqueles versados na técnica à qual essa revelação pertence. Todas as patentes e publicações estão incorporadas ao presente documento a título de referência na totalidade tal como se cada patente, publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como estando incorporado a título de referência em sua totalidade.
[0195] Embora a revelação supracitada tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo com propósitos de clareza de entendimento, certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (25)

1. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um elemento regulador que tem uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre o grupo que consiste em: (a) uma sequência compreendendo SEQ ID NO: 1 ou 3; (b) uma sequência conforme estabelecida pela SEQ ID NO: 1, sendo que a sequência inicia a transcrição em sedas, pericarpo, endosperma, embrião, talo e folha, mas não em raiz, meristema, espiga verde, borla, anteras e pólen; e (c) uma sequência conforme estabelecida pela SEQ ID NO: 3, sendo que a sequência inicia a transcrição em sedas, pericarpo, endosperma, embrião, espiga verde, talo e folha, mas não em raiz, meristema, borla, anteras e pólen, em que o elemento regulador é operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo de interesse.
2. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 1.
3. Método de obtenção de uma célula vegetal transgênica, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende: a) transformar uma célula vegetal com o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 1; e b) cultivar a referida célula vegetal transformada sob condições de crescimento de célula vegetal.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal é de uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea ou a dicotiledônea é selecionada dentre o grupo que consiste em: milho; sorgo; arroz e soja.
6. Método de obtenção de uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende: a) transformar uma célula vegetal com o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 1; b) cultivar a referida célula vegetal transformada sob condições de crescimento de célula vegetal; e c) regenerar a planta transgênica a partir da referida célula vegetal transformada.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a planta é uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea ou a dicotiledônea é selecionada dentre o grupo que consiste em: milho; sorgo; arroz e soja.
9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo de interesse codifica um fator de transcrição.
10. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 9, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo codifica um produto genético que confere tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a patógenos ou resistência a insetos.
11. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 9, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo codifica um produto genético que está envolvido em metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula tronco, estímulo de crescimento celular, organogênese, iniciação de embriogênese somática e desenvolvimento do meristema apical.
12. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo é WUS ou ODP2 (BBM).
13. Método de obtenção de uma célula vegetal transgênica, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende: a) transformar a célula vegetal com elemento regulador, conforme definido na reivindicação 1; e b) cultivar a referida célula vegetal transformada sob condições de crescimento de célula vegetal; em que o elemento regulador é expresso em (i) um embrião ou (ii) em uma folha; ou (iii) em um embrião e em uma folha.
14. Método para expressar um polinucleotídeo em uma planta ou uma célula vegetal, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende introduzir na planta ou na célula vegetal um cassete de expressão que compreende um elemento regulador como definido na reivindicação 1.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o elemento regulador é operacionalmente associado a um polinucleotídeo heterólogo.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo de interesse codifica um produto genético que está envolvido em tolerância à seca, metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula tronco, estímulo de crescimento celular, organogênese, iniciação de embriogênese somática e desenvolvimento do meristema apical.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o produto genético está envolvido em tolerância ao estresse abiótico.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo de interesse codifica um produto genético que confere tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a patógenos ou resistência a insetos.
19. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a planta é uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea.
20. Método para expressar um polinucleotídeo de interesse em uma planta, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende introduzir em uma célula vegetal um elemento regulador heterólogo que tem capacidade para aumentar a expressão do polinucleotídeo de interesse, sendo que o elemento regulador heterólogo compreende uma sequência de polinucleotídeos conforme definida pela reivindicação 1.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de interesse codifica um polipeptídeo que está envolvido em desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula tronco, estímulo de crescimento celular, organogênese, iniciação de embriogênese somática, desenvolvimento do meristema apical e uma combinação dos mesmos.
22. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de interesse é um gene endógeno da planta.
23. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de interesse codifica um polipeptídeo que confere tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicidas, resistência a patógenos ou resistência a insetos.
24. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a planta é uma dicotiledônea ou uma monocotiledônea.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea ou a dicotiledônea é selecionada dentre o grupo que consiste em: milho; sorgo; arroz e soja.
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