BR112020018646A2 - Métodos para transformação de planta - Google Patents

Abstract

os métodos revelados no presente documento usam um gene morfogênico ou um gene repressor para fornecer uma planta transgênica contendo uma cópia única de um evento transgênico em que o gene morfogênico ou o gene repressor não se integra ao genoma da planta e a planta não contém estrutura de vetor (plasmídeo).

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para "MÉTODOS PARA TRANSFORMAÇÃO DE PLANTA"

CAMPO DA REVELAÇÃO

[0001] A presente revelação refere-se, em geral, ao campo de biologia molecular vegetal, incluindo manipulação genética de plantas. Mais especificamente, a presente divulgação se refere a métodos rápidos de alta eficiência para a produção de uma planta transformada.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0002] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos no de série 62/641.725, depositado em 12 de março de 2018 e do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos no de série 62/641.733 depositado em 12 de março de 2018, cada um dos quais é incorporado em sua totalidade ao presente documento a título de referência.

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDO COMO UM ARQUIVO DE TEXTO POR MEIO DE EFS-WEB

[0003] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida eletronicamente através de EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo nomeado “20190309_7486WOPCT_SeqList.TXT”, criado em 9 de março de 2019, e que tem um tamanho de 803.180 bytes e é depositado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida neste documento formatado em ASCII faz parte do relatório descritivo e é incorporada na sua totalidade neste documento a título de referência.

ANTECEDENTES

[0004] O uso de protocolos padrão de transformação e regeneração é demorado e ineficaz, e impacta negativamente nas linhas de tempo de desenvolvimento de produto transgênico, dado que há normalmente uma “janela de desenvolvimento de prioridade” limitada por estação para tomar decisões relacionadas a quais construtos genéticos priorizar para uso em trabalho de campo de grande escala com base nos resultados obtidos durante a pesquisa inicial. Os métodos de transformação e regeneração padrão disponíveis têm múltiplas desvantagens que limitam a velocidade e a eficácia com a qual as plantas transgênicas podem ser produzidas e triadas. Por exemplo, muitos métodos de transformação e regeneração padrão exigem o uso de altos níveis de auxina ou citoquinina e exigem etapas que envolvem formação de calo embriogênica ou organogênese, levando a procedimentos que podem levar semanas antes de produzir plantas para crescimento em uma definição de estufa seguindo a transformação. Ainda há a necessidade de métodos de transformação que produzam frequências de transformação significativamente mais altas e eventos com significativamente mais qualidade (eventos contendo uma cópia de um cassete de expressão gênica de traço sem estrutura de vetor (plasmídeo)) em múltiplas linhas de cruzamento consanguíneo com o uso de uma variedade de tipos de tecido de partida, incluindo cruzamentos consanguíneos transformados que representam uma gama de diversidades genéticas e têm utilidade comercial significativa.

SUMÁRIO

[0005] A presente revelação compreende métodos e composições para a produção de eventos transgênicos que contêm uma cópia de um gene de traço. Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece uma semente da planta produzida pelos métodos revelados no presente documento.

[0006] Em um aspecto, a revelação fornece um método de produção de uma planta transgênica que tem uma cópia de um cassete de expressão gênica de traço que compreende: o contato de uma célula de planta com um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica de traço e um T-DNA contendo uma cassete de expressão gênica morfogênica; seleção de uma célula vegetal contendo o cassete de expressão gênica de traço e nenhum cassete de expressão gênica morfogênica; e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal.

Em um aspecto adicional, o contato compreende o contato simultâneo de uma célula vegetal com um T- DNA contendo um cassete de expressão gênica de traço em uma primeira cepa bacteriana e um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica morfogênica em uma segunda cepa bacteriana.

Em um aspecto ainda adicional, o contato compreende o contato de uma célula vegetal com uma cepa bacteriana contendo um plasmídeo que compreende um cassete de expressão gênica de traço dentro do T-DNA e um cassete de expressão gênica morfogênica fora do T-DNA.

Em ainda outro aspecto, o contato compreende o contato de uma célula vegetal com o T-DNA contendo um cassete de expressão gênica de traço e o T-DNA contendo um cassete de expressão gênica morfogênica em uma cepa bacteriana.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo Babyboom (BBM) ou um polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) ou (iii) uma combinação de (i) e (ii). Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX.

Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9. Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2). Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionada de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2. Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2). Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9 e o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionado de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica de traço compreende: um gene de traço selecionado do grupo de um gene que confere resistência a pragas, um gene que confere resistência a herbicidas, um gene que confere tolerância ao estresse, um gene que confere resistência à seca, um gene que confere eficiência no uso de nitrogênio (NUE), um gene que confere resistência a doenças e um gene que confere uma capacidade de alterar uma via metabólica; Em um aspecto adicional, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são a mesma cepa bacteriana.

Em um aspecto adicional, a mesma cepa bacteriana é uma Rhizobiales selecionada do grupo de uma Agrobacteria desarmada, uma bactéria Ochrobactrum e uma bactéria Rhizobiaceae.

Em um aspecto adicional, a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-. Em um aspecto adicional, a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2. Em um aspecto adicional, a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3. Em um aspecto ainda adicional, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são cepas bacterianas diferentes.

Em um aspecto adicional, as cepas bacterianas diferentes são selecionadas de: (i) uma Agrobacteria desarmada e uma bactéria Ochrobactrum; (ii) uma Agrobacteria desarmada e bactéria Rhizobiaceae e (iii) uma bactéria Rhizobiaceae e uma bactéria Ochrobactrum.

Em um aspecto adicional, a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-. Em um aspecto adicional, a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2. Em um aspecto adicional, a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3. Em um aspecto adicional, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 50:50. Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 75:25. Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 90:10. Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 95:5. Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 99:1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente um promotor selecionado da Tabela 4 ou Tabela 5. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor HBSTART3 ligado operacionalmente a um gene WUS.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor Ubiquitina ligado operacionalmente a um gene LEC1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene LEC1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral

T2A e gene LEC1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente uma sequência viral ou intensificadora vegetal. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene BBM. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene RepA. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a uma fusão PKLamiRNA. Em um aspecto adicional, é fornecida uma semente de planta contendo o cassete de expressão gênica de traço.

[0007] Em um aspecto, a revelação fornece um método de produção de uma planta transgênica que tem uma cópia de um cassete de expressão gênica de traço e uma cópia de um cassete de expressão de marcador selecionável que compreende: o contato de uma célula vegetal com uma cepa bacteriana contendo um plasmídeo que compreende um T- DNA que tem uma borda direita e uma borda esquerda flanqueando um cassete de expressão gênica de traço e um cassete de expressão de marcador selecionável, e fora do T-DNA um cassete de expressão gênica repressora, em que o cassete de expressão de marcador selecionável compreende um promotor que é reprimido por um polipeptídeo repressor expresso por um gene repressor; seleção de uma célula vegetal contendo o cassete de expressão gênica de traço e o cassete de expressão de marcador selecionável e nenhum cassete de expressão gênica repressora; e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica repressora compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o repressor de tetraciclina (TETR), um repressor de etametsulfuron (ESR), um repressor de clorsulfuron (CSR) e uma fusão de repressor-dCAS9 que tem um RNA guia direcionado ao promotor no T-DNA.

Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o repressor de tetraciclina (TETR) que reprime o promotor ligado operacionalmente ao marcador selecionável no T-DNA.

Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o repressor de etametsulfuron (ESR) que reprime o promotor ligado operacionalmente ao marcador selecionável no T-DNA.

Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o repressor de clorsulfuron (CSR) que reprime o promotor ligado operacionalmente ao marcador selecionável no T-DNA.

Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica a fusão de repressor-dCAS9 que tem um RNA guia que reprime o promotor ligado operacionalmente ao marcador selecionável no T-DNA.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica de traço compreende: um gene de traço selecionado do grupo de um gene que confere resistência a pragas, um gene que confere resistência a herbicidas, um gene que confere tolerância ao estresse, um gene que confere resistência à seca, um gene que confere eficiência no uso de nitrogênio (NUE), um gene que confere resistência a doenças e um gene que confere uma capacidade de alterar uma via metabólica; Em um aspecto adicional, a cepa bacteriana é uma Rhizobiales selecionada do grupo de uma Agrobacteria desarmada, uma bactéria Ochrobactrum e uma bactéria Rhizobiaceae.

Em um aspecto adicional, a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-. Em um aspecto adicional, a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2. Em um aspecto adicional, a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3. Em um aspecto adicional, é fornecida uma semente de planta contendo o cassete de expressão gênica de traço.

[0008] Em um aspecto, a revelação fornece um método de produção de uma planta transgênica que tem uma cópia de um cassete de expressão gênica de traço que compreende: o contato simultâneo de uma célula de planta com um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica de traço em uma primeira cepa bacteriana e um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica morfogênica em uma segunda cepa bacteriana; em que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo Babyboom (BBM) ou um polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); em que o cassete de expressão gênica de traço compreende: um gene de traço selecionado do grupo de um gene que confere resistência a pragas, um gene que confere resistência a herbicida, um gene que confere tolerância ao estresse, um gene que confere resistência à seca, um gene que confere eficiência de uso de nitrogênio (NUE), um gene que confere resistência a doenças e um gene que confere a capacidade de alterar uma via metabólica; seleção de uma célula vegetal contendo o cassete de expressão gênica de traço e nenhum cassete de expressão gênica morfogênica; e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal. Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9. Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2). Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionada de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2. Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2). Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9 e o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionado de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2. Em um aspecto adicional, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são a mesma cepa bacteriana.

Em um aspecto adicional, a mesma cepa bacteriana é uma Rhizobiales selecionada do grupo de uma Agrobacteria desarmada, uma bactéria Ochrobactrum e uma bactéria Rhizobiaceae.

Em um aspecto adicional, a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-. Em um aspecto adicional, a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2. Em um aspecto adicional, a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3. Em um aspecto adicional, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são cepas bacterianas diferentes.

Em um aspecto adicional, as cepas bacterianas diferentes são selecionadas de: (i) uma Agrobacteria desarmada e uma bactéria Ochrobactrum; (ii) uma Agrobacteria desarmada e bactéria Rhizobiaceae e (iii) uma bactéria Rhizobiaceae e uma bactéria Ochrobactrum.

Em um aspecto adicional, a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-. Em um aspecto adicional, a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2. Em um aspecto adicional, a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3. Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 50:50. Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 75:25. Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 90:10. Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 95:5. Em um aspecto, a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 99:1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente um promotor selecionado da Tabela 4 ou Tabela 5. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor HBSTART3 ligado operacionalmente a um gene WUS.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor Ubiquitina ligado operacionalmente a um gene LEC1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene LEC1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene LEC1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente uma sequência viral ou intensificadora vegetal.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene BBM.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene RepA.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a uma fusão PKLamiRNA. Em um aspecto adicional, é fornecida uma semente de planta contendo o cassete de expressão gênica de traço.

[0009] Em um aspecto, a revelação fornece um método de produção de uma planta transgênica que tem uma cópia de um cassete de expressão gênica de traço que compreende: o contato de uma célula vegetal com uma cepa bacteriana contendo um plasmídeo que compreende um cassete de expressão gênica de traço dentro do T-DNA e um cassete de expressão gênica morfogênica fora do T-DNA; em que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo Babyboom (BBM) ou um polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); em que o cassete de expressão gênica de traço compreende: um gene de traço selecionado do grupo de um gene que confere resistência a pragas, um gene que confere resistência a herbicida, um gene que confere tolerância ao estresse, um gene que confere resistência à seca, um gene que confere eficiência de uso de nitrogênio (NUE), um gene que confere resistência a doenças e um gene que confere a capacidade de alterar uma via metabólica; seleção de uma célula vegetal contendo o cassete de expressão gênica de traço e nenhum cassete de expressão gênica morfogênica; e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal. Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9. Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2). Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionada de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2. Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2). Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9 e o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionado de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2. Em um aspecto adicional, a cepa bacteriana é uma Rhizobiales selecionada do grupo de uma Agrobacteria desarmada, uma bactéria Ochrobactrum e uma bactéria Rhizobiaceae.

Em um aspecto adicional, a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-. Em um aspecto adicional, a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2. Em um aspecto adicional, a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente um promotor selecionado da Tabela 4 ou Tabela 5. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor HBSTART3 ligado operacionalmente a um gene WUS.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor Ubiquitina ligado operacionalmente a um gene LEC1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene LEC1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene LEC1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente uma sequência viral ou intensificadora vegetal. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene BBM. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene RepA. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a uma fusão PKLamiRNA. Em um aspecto adicional, é fornecida uma semente de planta contendo o cassete de expressão gênica de traço.

[0010] Em um aspecto, a revelação fornece um método de produção de uma planta transgênica que tem uma cópia de um cassete de expressão gênica de traço que compreende: o contato de uma célula vegetal com uma cepa bacteriana que compreende um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica de traço e um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica morfogênica; em que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo Babyboom (BBM) ou um polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); em que o cassete de expressão gênica de traço compreende: um gene de traço selecionado do grupo de um gene que confere resistência a pragas, um gene que confere resistência a herbicida, um gene que confere tolerância ao estresse, um gene que confere resistência à seca, um gene que confere eficiência de uso de nitrogênio (NUE), um gene que confere resistência a doenças e um gene que confere a capacidade de alterar uma via metabólica; seleção de uma célula vegetal contendo o cassete de expressão gênica de traço e nenhum cassete de expressão gênica morfogênica; e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal.

Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX.

Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9. Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2). Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionada de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2. Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2). Em um aspecto adicional, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9 e o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionado de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2. Em um aspecto adicional, a dita cepa bacteriana é uma Rhizobiales selecionada do grupo de uma Agrobacteria desarmada, uma bactéria Ochrobactrum e uma bactéria Rhizobiaceae.

Em um aspecto adicional, a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-. Em um aspecto adicional, a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2. Em um aspecto adicional, a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente um promotor selecionado da Tabela 4 ou Tabela 5. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor HBSTART3 ligado operacionalmente a um gene WUS.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor Ubiquitina ligado operacionalmente a um gene LEC1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene LEC1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene LEC1. Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente uma sequência viral ou intensificadora vegetal.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene BBM.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene RepA.

Em um aspecto adicional, o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a uma fusão PKLamiRNA. Em um aspecto adicional, é fornecida uma semente de planta contendo o cassete de expressão gênica de traço.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0011] A Figura 1 mostra a eficiência da formação de embriões somáticos de plasmídeos PHP81718 (Tratamento WUS) e PHP80728 (Tratamento TAG-RFP) conforme descrito no Exemplo 11.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0012] As revelações no presente documento serão descritas mais completamente doravante com referência às figuras adjuntas, nas quais alguns, porém não todos, dos aspectos possíveis são mostrados. De fato, as revelações podem ser incorporadas em muitas formas diferentes e não devem ser interpretadas como limitadas aos aspectos apresentados no presente documento; em vez disso, esses aspectos são fornecidos de modo que esta revelação satisfaça os requisitos legais aplicáveis.

[0013] Muitas modificações e outros aspectos revelados no presente documento serão percebidos por um versado na técnica à qual pertencem os métodos revelados, que têm o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições a seguir e nas figuras associadas. Portanto, deve-se entender que as revelações não devem ser limitadas aos aspectos específicos revelados e que modificações e outros aspectos são concebidos como estando incluídos dentro do escopo das reivindicações anexas. Embora termos específicos sejam empregues no presente documento, os mesmos são usados apenas em um sentido genérico e descritivo e não com propósitos de limitação.

[0014] A terminologia usada no presente documento tem a finalidade de descrever aspectos particulares apenas e não se destina a ser limitante. Como usado no relatório descritivo e nas reivindicações, o termo "compreendendo" pode incluir o aspecto de "consistindo em". A menos que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual pertencem os métodos revelados. Neste relatório descritivo e nas reivindicações a seguir, será feita referência a diversos termos que serão definidos no presente documento.

[0015] A presente revelação compreende métodos para produzir uma planta transgênica com o uso de um gene morfogênico. Como usado no presente documento, o termo “gene morfogênico” significa um gene que, quando expresso ectopicamente, estimula a formação de uma estrutura derivada somaticamente que pode produzir uma planta. Mais precisamente, a expressão ectópica do gene morfogênico estimula a formação de novo de um embrião somático ou uma estrutura organogênica, como um meristema de broto, que pode produzir uma planta. Essa formação de novo estimulada ocorre na célula em que o gene morfogênico é expresso, ou em uma célula vizinha. Um gene morfogênico pode ser um fator de transcrição que regula a expressão de outros genes, ou um gene que influencia níveis de hormônio em um tecido vegetal, ambos os quais podem estimular alterações morfogênicas. Como usado no presente documento, o termo "fator morfogênico" significa um gene morfogênico e/ou a proteína expressa por um gene morfogênico.

[0016] Um gene morfogênico está envolvido no metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgãos, desenvolvimento de células-tronco, estímulo de crescimento celular, organogênese, iniciação da embriogênese somática, maturação embrionária somática acelerada, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto ou uma combinação dos mesmos, tais como genes WUS/WOX (WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9) consultar, Patentes nos U.S. 7.348.468 e 7.256.322 e Publicação de Pedidos de Patente nos U.S. 2017/0121722 e 2007/0271628, incorporadas em sua totalidade ao presente documento a título de referência; Laux et al. (1996) Development 122: 87 a 96; e Mayer et al. (1998) Cell 95: 805 a 815; van der Graaff et al., 2009, Genome Biology 10: 248; Dolzblasz et al., 2016, Mol. Plant 19: 1028 a 39. A modulação de WUS/WOX deve modular o fenótipo de planta e/ou de tecido vegetal, incluindo metabolismo vegetal, desenvolvimento de órgãos, desenvolvimento de células-tronco, estimulação de crescimento celular, organogênese, iniciação de embriogênese somática, maturação embrionária somática acelerada, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema apical, iniciação e/ou desenvolvimento do meristema de broto ou uma combinação dos mesmos. Expressão de WUS de Arabidopsis pode induzir células tronco em tecidos vegetativos, que podem se diferenciar em embriões somáticos (Zuo et al. (2002) Plant J 30:349 a 359). Também seria de interesse nesse sentido um gene MYB118 (consultar a Patente no U.S.

7.148.402), gene MYB115 (consultar Wang et al. (2008) Cell Research 224 a 235), um gene BABYBOOM (BBM; consultar Boutilier et al. (2002) Plant Cell 14:1737 a 1749), ou um gene CLAVATA (consultar, por exemplo, a Patente no U.S. 7.179.963).

[0017] Sequências de polinucleotídeos morfogênicas e sequências de aminoácidos de polipeptídeos homeobox WUS/WOX são úteis nos métodos revelados. A proteína Wuschel, projetada doravante como WUS, desempenha um papel importante na iniciação e na manutenção do maristema apical, que contém um agrupamento de células-tronco pluripotentes (Endrizzi, et al., (1996) Plant Journal 10:967 a 979; Laux, et al.,

(1996) Development 122:87 a 96; e Mayer, et al., (1998) Cell 95:805 a 815). O mutante de plantas Arabidopsis para o gene WUS contém células-tronco que são especificadas erradas e que parecem sofrer diferenciação. WUS codifica uma proteína de homeodomínio nova que funciona, presumidamente, como um regulador de transcrição (Mayer, et al., (1998) Cell 95:805 a 815). Acredita-se que a população de célula-tronco de maristemas de broto de Arabidopsis seja mantida por um ciclo regulatório entre os genes CLAVATA (CLV) que promovem a iniciação de órgãos e o gene WUS que é necessário para a identidade de célula-tronco, com os genes CLV que reprimem WUS no nível de transcrição, e sendo que a expressão de WUS é suficiente para induzir a identidade celular de maristema e a expressão do marcador de célula-tronco CLV3 (Brand, et al., (2000) Science 289:617 a 619; Schoof, et al., (2000) Cell 100:635 a 644). Foi mostrado que a expressão constitutiva de WUS em Arabidopsis leva à proliferação de broto adventícia de folhas (em planta) (Laux, T., Talk Presented at the XVI International Botanical Congress Meeting, 1 a 7 de agosto de 1999, St. Louis, Mo.).

[0018] Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX útil nos métodos da revelação é um polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5, WOX5A ou WOX9 (consultar, Patentes nos U.S. 7.348.468 e

7.256.322 e Publicações de Pedido de Patente nos U.S. 2017/0121722 e 2007/0271628, incorporadas em sua totalidade ao presente documento a título de referência e van der Graaff et al., 2009, Genome Biology 10: 248). O polipeptídeo homeobox WUS/WOX útil nos métodos da revelação pode ser obtido ou derivado de qualquer uma das plantas descritas no presente documento. Genes WUS/WOX adicionais úteis nos métodos da revelação são listados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1.

SEQ Polinucleotídeo Nome Descrição ID (DNA) ou NO: Polipeptídeo (PRT) 1 DNA A-WUS Sequência de codificação de WUS de Arabidopsis thaliana 2 PRT A-WUS Sequência de proteína de WUS de Arabidopsis thaliana 3 DNA LJ-WUS Sequência de codificação de WUS de Lotus japonicus 4 PRT LJ-WUS Sequência de proteína de WUS de Lotus japonicus 5 DNA GM-WUS Sequência de codificação de WUS de Glycine max 6 PRT GM-WUS Sequência de proteína de WUS de Glycine max 7 DNA CS-WUS Sequência de codificação de WUS de Camelina sativa 8 PRT CS-WUS Sequência de proteína de WUS de Camelina sativa 9 DNA CR-WUS Sequência de codificação de WUS de Capsella rubella 10 PRT CR-WUS Sequência de proteína de WUS de Capsella rubella 11 DNA AA-WUS Sequência de codificação de WUS de Arabis alpina 12 PRT AA-WUS Sequência de proteína de WUS de

Arabis alpina 13 DNA RS-WUS Sequência de codificação de WUS de Raphanus sativus 14 PRT RS-WUS Sequência de proteína de WUS de Raphanus sativus 15 DNA BN-WUS Sequência de codificação de WUS de Brassica napus 16 PRT BN-WUS Sequência de proteína de WUS de Brassica napus 17 DNA BO-WUS Sequência de codificação de WUS de Brassica oleracea var. oleracea 18 PRT BO-WUS Sequência de proteína de WUS de Brassica oleracea var. oleracea 19 DNA HA-WUS Sequência de codificação de WUS de Helianthus annuus 20 PRT HA-WUS Sequência de proteína de WUS de Helianthus annuus 21 DNA PT-WUS Sequência de codificação de WUS de Populus trichocarpa 22 PRT PT-WUS Sequência de proteína de WUS de Populus trichocarpa 23 DNA VV-WUS Sequência de codificação de WUS de Vitus vinifera 24 PRT VV-WUS Sequência de proteína de WUS de Vitus vinifera 25 DNA A-WUS Sequência de codificação de WUS de Arabidopsis thaliana (otimizada com soja) 26 PRT A-WUS Sequência de proteína de WUS de Arabidopsis thaliana 27 DNA LJ-WUS Sequência de codificação de WUS de Lotus japonicus (otimizada com soja) 28 PRT LJ-WUS Sequência de proteína de WUS de Lotus japonicus 29 DNA MT-WUS Sequência de codificação de WUS de Medicago trunculata (otimizada com soja) 30 PRT MT-WUS Sequência de proteína de WUS de Medicago trunculata 31 DNA PY-WUS Sequência de codificação de WUS de Petunia hybrida (otimizada com soja) 32 PRT PY-WUS Sequência de proteína de WUS de Petunia hybrida 33 DNA PV-WUS Sequência de codificação de WUS de Phaseolus vulgaris (otimizada com soja) 34 PRT PV-WUS Sequência de proteína de WUS de Phaseolus vulgaris

[0019] Outros genes morfogênicos úteis na presente revelação incluem, porém, sem limitação, LEC1 (Patente no U.S. 6.825.397 incorporada em sua totalidade ao presente documento a título de referência , Lotan et al., 1998, Cell 93: 1195 a 1205), LEC2 (Stone et al., 2008, PNAS 105: 3151 a 3156; Belide et al., 2013, Plant Cell Tiss. Organ Cult 113:543 a

553), KN1/STM (Sinha et al., 1993. Genes Dev 7:787 a 795), o gene IPT de Agrobacterium (Ebinuma e Komamine, 2001, In vitro Cell. Dev Biol – Plant 37:103 a 113), MONOPTEROS-DELTA (Ckurshumova et al., 2014, New Phytol. 204:556 a 566), the Agrobacterium AV-6b gene (Wabiko and Minemura 1996, Plant Physiol. 112:939 a 951), the combination of the Agrobacterium IAA-h and IAA-m genes (Endo et al., 2002, Plant Cell Rep., 20:923 a 928), the Arabidopsis SERK gene (Hecht et al., 2001, Plant Physiol. 127:803 a 816), the Arabiopsis AGL15 gene (Harding et al., 2003, Plant Physiol. 133:653 a 663), the FUSCA gene (Castle and Meinke, Plant Cell 6:25 a 41), and the PICKLE gene (Ogas et al., 1999, PNAS 96:13839 a 13844).

[0020] Como usado no presente documento, o termo "cassete de expressão" significa um componente distinto do DNA do vetor que consiste em sequências codificantes e não codificantes, incluindo sequências reguladoras 5 'e 3' que controlam a expressão em uma célula transformada/transfectada.

[0021] Como usado no presente documento, o termo "sequência codificante" significa a porção da sequência de DNA ligada por um códon de início e de parada que codifica os aminoácidos de uma proteína.

[0022] Como usado no presente documento, o termo "sequência não codificante" significa as porções de uma sequência de DNA que são transcritas para produzir um RNA mensageiro, mas que não codificam os aminoácidos de uma proteína, tais como as regiões 5 'não traduzidas, íntrons e regiões não traduzidas 3’. Sequência não codificante também pode se referir a moléculas de RNA, tais como micro-RNAs, RNA de interferência ou RNA em forma de grampo, que quando expressos podem regular negativamente a expressão de um gene endógeno ou outro transgene.

[0023] Como usado no presente documento, o termo "sequência reguladora" significa um segmento de uma molécula de ácido nucleico que é capaz de aumentar ou diminuir a expressão de um gene. As sequências reguladoras incluem promotores, terminadores, elementos intensificadores, elementos silenciadores, UTR 5' e UTR 3' (região não traduzida).

[0024] Como usado no presente documento, o termo "Agro1" significa uma Agrobacterium que abriga um plasmídeo com um T-DNA contendo um cassete de expressão de "gene de traço".

[0025] Como usado no presente documento, o termo "Agro2" significa um Agrobacterium que abriga um plasmídeo com um T-DNA contendo um cassete de expressão de "gene morfogênico", que expressa genes tais como, porém, sem limitação, BBM e/ou WUS2.

[0026] Como usado no presente documento, o termo "cassete de transferência" significa um T-DNA que compreende um cassete de expressão ou cassetes de expressão flanqueadas pela borda direita e pela borda esquerda.

[0027] Como usado no presente documento, T-DNA significa uma porção de um plasmídeo Ti que é inserido no genoma de uma célula vegetal hospedeira.

[0028] Como usado no presente documento, o termo "marcador selecionável" significa um transgene que, quando expresso em uma célula transformada/transfectada, confere resistência a agentes seletivos, tais como antibióticos, herbicidas e outros compostos tóxicos para uma célula não transformada/não transfectada.

[0029] Como usado no presente documento, o termo "EAR" significa um Motivo de Repressão Anfifílica associado por fator de ligação a elemento responsivo ao etileno com uma sequência de consenso geral de LLxLxL, DNLxxP, LxLxPP, R/KLFGV ou TLLLFR que atuam como sinais de repressão transcricional dentro de fatores de transcrição. A adição de um elemento repressor do tipo EAR a uma proteína de ligação ao DNA, tal como um fator de transcrição, dCAS9 ou LEXA (como exemplos), confere função de repressão transcricional para a proteína de fusão (Kagale, S., and Rozwadowski, K. 2010. Plant Signaling and Behavior 5:691 a 694).

[0030] Como usado no presente documento, o termo “fator de transcrição” significa uma proteína que controla a taxa de transcrição de genes específicos por ligação à sequência de DNA do promotor e sobrerregula ou sub-regula a expressão. Os exemplos de fatores de transcrição, que também são genes morfogênicos, incluem membros da família AP2/EREBP (incluindo as subfamílias BBM (ODP2), pletora e aintegumenta, proteínas de ligação de caixa de CAAT como LEC1 e HAP3 e membros das famílias MYB, bHLH, NAC, MADS, bZIP e WRKY.

[0031] As sequências de plinucleotídeos morfogênicas e as sequências de aminoácidos de polipeptídeos de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) e polipeptídeos relacionados, por exemplo, proteínas da família de proteínas Babyboom (BBM) são úteis nos métodos da revelação. Em um aspecto, um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3, consultar Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2017/0121722, incorporada em sua totalidade ao presente documento a título de referência. Os polipeptídeos ODP2 úteis nos métodos da revelação contêm dois domínios APETALA2 (AP2) previstos e são membros da família de proteínas AP2 (Acesso PFAM PF00847). A família AP2 de fatores de transcrição putativa foi mostrada para regular uma ampla gama de processos de desenvolvimento e os membros da família são caracterizados pela presença de um domínio de ligação de AP2-DNA. Esse núcleo conservado é predito para formar uma hélice alfa anfipática que se liga ao DNA. O domínio AP2 foi identificado, primeiro, em APETALA2, uma proteína de Arabidopsis que regula a identidade de meristema, especificação de órgão floral,

desenvolvimento de revestimento de semente e expressão de gene homeótico floral. O domínio AP2 foi encontrado, agora, em uma variedade de proteínas.

[0032] Os polipeptídeos ODP2 úteis nos métodos da revelação compartilham homologia com diversos polipeptídeos dentro da família AP2, por exemplo, consultar a Figura 1 do documento US8420893, que é incorporado em sua totalidade ao presente documento a título de referência, fornece um alinhamento dos polipeptídeos ODP2 de milho e arroz com oito outras proteínas que tem dois domínios AP2. Uma sequência de consenso de todas as proteínas que aparecem no alinhamento do documento US8420893 também é fornecida na Figura 1 no mesmo. O polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação AP2-DNA úteis nos métodos da revelação pode ser obtido ou derivado de qualquer uma das plantas descritas no presente documento. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação AP2-DNA úteis nos métodos da revelação é um polipeptídeo ODP2. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação AP2-DNA úteis nos métodos da revelação é um polipeptídeo BBM2. O polipeptídeo ODP2 e o polipeptídeo BBM2 úteis nos métodos da revelação podem ser obtidos ou derivados de qualquer uma das plantas descritas no presente documento.

[0033] Um gene morfogênico pode ser incorporado de modo estável no genoma de uma planta ou pode ser expresso de modo transiente. Em um aspecto, a expressão do gene morfogênico é controlada. A expressão controlada pode ser uma expressão pulsada do gene morfogênico por um determinado período de tempo. Alternativamente, o gene morfogênico pode ser expresso em apenas algumas células transformadas e não expresso em outras. O controle da expressão do gene morfogênico pode ser alcançado por uma variedade de métodos, conforme revelado no presente documento abaixo. Os genes morfogênicos úteis nos métodos da revelação podem ser obtidos ou derivados de qualquer espécie de planta descrita no presente documento.

[0034] O termo "planta" se refere a plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), tecidos de plantas, células de plantas, partes de plantas, sementes, propágulos, embriões e progênie das mesmas. As células vegetais podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, calo não diferenciado, embriões imaturos e maduros, embrião zigótico imaturo, cotilédone imaturo, eixo geométrico embrionário, células de cultura em suspensão, protoplastos, folha, células de folha, células de raiz, células de floema e pólen). As células vegetais incluem, sem limitação, células de sementes, culturas de suspensão, explantes, embriões imaturos, embriões, embriões zigóticos, embriões somáticos, calo embrionário, meristema, meristemas somáticos, calo organogênico, protoplastos, embriões derivados de semente derivada de espiga madura, bases de folha, folhas de plantas maduras, pontas de folha, influorescências imaturas, borla, espiga imatura, sedas, cotiledôneas, cotiledôneas imaturas, eixos geométricos embrionários, regiões meristemáticas, tecido de calo, células de folhas, células de caules, células de raízes, células de brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. As partes de planta incluem tecidos diferenciados e não diferenciados que incluem, mas não são limitados a, raízes, caules, brotos, folhas, pólen, sementes, tecido de tumor e diversas formas de células em cultura (por exemplo, células individuais, protoplastos, embriões e tecido de calo). O tecido vegetal pode estar em uma planta ou em uma cultura de órgãos, tecidos ou células de planta. Grão destina-se a significar a semente madura produzida por produtores comerciais para propósitos diferentes de cultivo ou reprodução da espécie. A progênie, as variantes e mutantes das plantas regeneradas também são incluídas no escopo da revelação, desde que essa progênie, variantes e mutantes compreendam os polinucleotídeos introduzidos.

[0035] A presente revelação pode ser usada para transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, porém, sem limitação, monocotiledôneas e dicotiledôneas. As monocotiledôneas incluem, porém, sem limitações, cevada, maís (milho), milheto (por exemplo, milheto pérola (Pennisetum glaucum), milheto proso (Panicum miliaceum), milheto tipo rabo de raposa (Setaria italica), milheto tipo dedo (Eleusine coracana), teff (Eragrostis tef), aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, triticale ou trigo ou culturas de folha e caule, incluindo, porém, sem limitações, bambu, grama marram, poa dos prados, juncos, azevém, cana de açúcar; gramados, gramíneas ornamentais e outras gramíneas como painço amarelo e relva. Alternativamente, as plantas dicotiledôneas usadas na presente revelação incluem, porém, sem limitações, couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-Índia, alfafa, feijão-fava, tomate, amendoim, mandioca, soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão.

[0036] Os exemplos de espécies de planta de interesse incluem, porém, sem limitação, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), painço (por exemplo, mexoeira (Pennisetum glaucum), painço-branco (Panicum miliaceum), milho-painço (Setaria italica), capim-pé-de-galinha- gigante (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), mamão (Carica papaya), castanha de caju (Anacardium occidentale), noz de macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveias, cevada, vegetais, plantas ornamentais e coníferas.

[0037] As plantas superiores, por exemplo, classes de Angiospermae e Gymnospermae podem ser usadas na presente revelação. As plantas de espécies adequadas úteis na presente revelação podem ser provenientes da família Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae e Vitaceae. As plantas de membros do gênero Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus,

Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis e Zea podem ser usadas nos métodos da revelação.

[0038] As plantas importantes ou interessantes para a agricultura, horticultura, produção de biomassa (para produção de moléculas de combustível líquido e outros agentes químicos) e/ou florestamento podem ser usadas nos métodos da revelação. Os exemplos não limitantes incluem, por exemplo, Panicum virgatum (painço), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum spp. (cana de açúcar, cana energética), Populus balsamifera (choupo), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba sacarina), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Erianthus spp., Andropogon gerardii (bluestem alto), Pennisetum purpureum (capim- elefante), Phalaris arundinacea (capim-amarelo), Cynodon dactylon (grama bermudas), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (cabo de grama de pradaria), Arundo donax (cana gigante), Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto, incluindo E. grandis (e seus híbridos, conhecidos como “urograndis”), E. globulus, E. camaldulensis, E. tereticornis, E.viminalis, E. nitens, E. saligna e E. urophylla), Triticosecale spp. (triticum - trigo X centeio), teff (Eragrostis tef), bambu, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatrofa), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linho), Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (alface),

Phaseolus vulgaris (feijão-verde), Phaseolus limensis (feijões-lima), Lathyrus spp. (ervilhas), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica spp. (B. napus (canola), B. rapa, B. juncea), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve-de-bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimento e pimentão), Arachis hypogaea (amendoins), Ipomoea batatus (batata doce), Cocos nucifera (coco), Citrus spp. (árvores cítricas), Persea americana (abacate), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), Carica papaya (mamão), Anacardium occidentale (cajú), Macadamia integrifolia (árvore de macadâmia), Prunus amygdalus (amêndoa), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão almiscarado), Cucumis sativus (pepino), Cucumis cantalupensis (cantalupo), Cucurbita maxima (abobrinha), Cucurbita moschata (abobrinha), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (beringela), Cyamopsis tetragonoloba (grãos de guar), Ceratonia siliqua (alfarroba), Trigonella foenum-graecum (feno- grego), Vigna radiata (feijão-mungo), Vigna unguiculata (feijão-frade), Vicia faba (feijão-fava), Cicer arietinum (grão de bico), Lens culinaris (lentilha), Papaver somniferum (papoila de ópio), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis,

Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guaiúle), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (menta), Bixa orellana (urucum), Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Rhododendron spp. (azaleia), Macrophylla hydrangea (hortênsia), Hibiscus rosasanensis (hibisco), Tulipa spp. (tulipas), Narcissus spp. (narcisos), Petunia hybrida (petúnias), Dianthus caryophyllus (cravo), Euphorbia pulcherrima (poinsétia), Chrysanthemum, Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveias), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (faia), Pinus spp. (pinheiro), Abies spp. (abeto), Acer spp. (bordo), Hordeum vulgare (cevada), Poa pratensis (cabelo- de-cão), Lolium spp. (azevém), Phleum pratense (erva-dos-prados) e coníferas.

[0039] A coníferas podem ser usadas na presente revelação e incluem, por exemplo, pinheiros, como pinheiro (Pinus taeda), pinheiro- americano (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro de lodgepole (Pinus contorta) e pinheiro-de-Monterey (Pinus radiata); pinheiro- do-oregon (Pseudotsuga menziesii); cicuta oriental ou do Canadá (Tsuga canadensis); cicuta ocidental (Tsuga heterophylla); cicuta de montanha (Tsuga mertensiana); lariço americano ou lariço (Larix occidentalis); abeto Sitka (Picea glauca); sequóia (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros, como abeto de prata (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros, como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis).

[0040] As gramíneas podem ser usadas na presente revelação e incluem, porém, sem limitações: poa-anual (Poa annua); azevém anual (Lolium multiflorum); poa canadiana (Poa compressa); Agrostide-ténue (Agrostis tenuis); erva-fina (Agrostis palustris); grama de trigo do deserto ("crested wheatgrass") (Agropyron desertorum); capim-mombaça (Agropyron cristatum); festuca rígida (Festuca longifolia); erva-de-febra (Poa pratensis); panasco (Dactylis glomerata); azevém perene (Lolium perenne); festuca- encarnada (Festuca rubra); germínia rubra (Agrostis alba); poa-comum (Poa trivialis); festuca ovina (Festuca ovina); bromo (Bromus inermis); rabo-de- gato (Phleum pratense); Agrostis-de-cão ("velvet bentgrass") (Agrostis canina); Grama-salgada ("weeping alkaligrass") (Puccinellia distans); erva- trigo ocidental (Agropyron smithii); grama Santo Agostinho (Stenotaphrum secundatum); Grama Zoysia (Zoysia spp.); grama-Bahia (Paspalum notatum); grama tapete (Axonopus affinis); grama centípede (Eremochloa ophiuroides); grama Kikuio (Pennisetum clandesinum); capim-arame-da- praia (Paspalum vaginatum); grama azul (Bouteloua gracilis); grama americana (Buchloe dactyloids); "sideoats gramma" (Bouteloua curtipendula).

[0041] Em aspectos específicos, as plantas transformadas pelos métodos da presente revelação são plantas de cultivo (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, arroz, sorgo, trigo, milheto, tabaco, etc.). As plantas de interesse específico incluem plantas de grãos que fornecem sementes de interesse, plantas de semente oleaginosa e plantas leguminosas. As sementes de interesse incluem sementes de grãos, como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, etc. As plantas de semente oleaginosa incluem algodão, feijão-soja, cártamo, girassol, Brassica, maís, alfafa, palma, coco, etc. As plantas leguminosas incluem, mas sem limitação, feijões e ervilhas. Feijões incluem, mas sem limitação, guar, alfarrobeira, feno-grego, feijão-soja, feijões-de-jardim, caupi, feijão mungo, feijão-de-lima, feijão-fava, lentilhas e grão-de-bico.

[0042] A presente revelação também inclui plantas obtidas por meio de qualquer um dos métodos revelados no presente documento. A presente revelação também inclui sementes de uma planta obtidas por qualquer um dos métodos revelados no presente documento. Uma planta transgênica é definida como uma planta madura, fértil que contém um transgene.

[0043] Nos métodos revelados, vários explantes derivados de plantas podem ser usados, incluindo embriões imaturos, embriões zigóticos de 1 a 5 mm, embriões de 3 a 5 mm, e embriões derivados de semente derivada de espiga madura, bases de folha, folhas de plantas maduras, pontas de folha, influorescências imaturas, panícula, espiga imatura e sedas. Em um aspecto, os explantes usados nos métodos revelados podem ser derivados de semente derivada de espiga madura, bases de folha, folhas de plantas maduras, pontas de folha, influorescências imaturas, panícula, espiga imatura e sedas. O explante usado nos métodos revelados pode ser derivado de qualquer uma das plantas descritas no presente documento.

[0044] A revelação engloba composições de ácido nucleico substancialmente purificadas ou isoladas. Uma molécula ou proteína de ácido nucleico "isolada" ou "purificada" ou uma porção biologicamente ativa da mesma é substancialmente livre de outro material celular ou componentes que normalmente acompanham ou interagem com a molécula de ácido nucleico ou proteína como encontrada em seu ambiente de ocorrência natural ou é substancialmente livre de meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizado quimicamente. Um ácido nucleico "isolado” é substancialmente livre de sequências (que incluem sequências codificadoras de proteína) que naturalmente flanqueiam o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Por exemplo, em vários aspectos, uma molécula de ácido nucleico isolada pode conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de nucleotídeos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico em DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado. A proteína que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína que têm menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de proteína contaminante. Quando uma proteína útil nos métodos da revelação ou uma porção biologicamente ativa da mesma for produzida de forma recombinante, de modo ideal, o meio de cultura representa menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de precursores químicos ou produtos químicos não proteicos de interesse. As sequências úteis nos métodos da revelação podem ser isoladas da região não traduzida 5’ que flanqueia seus respectivos locais de iniciação de transcrição. A presente revelação abrange composições de ácidos nucleicos ou proteínas isoladas ou substancialmente purificadas úteis nos métodos da revelação.

[0045] Como usado no presente documento, o termo "fragmento" se refere a uma porção da sequência de ácido nucleico. Fragmentos de sequências úteis nos métodos da revelação retêm a atividade biológica da sequência de ácido nucleico. Alternativamente, fragmentos de uma sequência de nucleotídeos que são úteis como sondas de hibridização podem não necessariamente reter atividade biológica. Fragmentos de uma sequência de nucleotídeos revelada no presente documento podem variar de pelo menos cerca de 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1425, 1450, 1475, 1500, 1525, 1550, 1575, 1600, 1625, 1650, 1675, 1700, 1725, 1750, 1775, 1800, 1825, 1850, 1875, 1900, 1925, 1950, 1975, 2000, 2025, 2050, 2075, 2100, 2125, 2150, 2175, 2200,

2225, 2250, 2275, 2300, 2325, 2350, 2375, 2400, 2425, 2450, 2475, 2500, 2525, 2550, 2575, 2600, 2625, 2650, 2675, 2700, 2725, 2750, 2775, 2800, 2825, 2850, 2875, 2900, 2925, 2950, 2975, 3000, 3025, 3050, 3075, 3100, 3125, 3150, 3175, 3200, 3225, 3250, 3275, 3300, 3325, 3350, 3375, 3400, 3425, 3450, 3475, 3500, 3525, 3550, 3575, 3600, 3625, 3650, 3675, 3700, 3725, 3750, 3775, 3800, 3825, 3850, 3875, 3900, 3925, 3950, 3975, 4000, 4025, 4050, 4075, 4100, 4125, 4150, 4175, 4200, 4225, 4250, 4275, 4300, 4325, 4350, 4375, 4400, 4425, 4450, 4475, 4500, 4525, 4550, 4575, 4600, 4625, 4650, 4675, 4700, 4725, 4750, 4775, 4800, 4825, 4850, 4875, 4900, 4925, 4950, 4975, 5000, 5025, 5050, 5075, 5100, 5125, 5150, 5175, 5200, 5225, 5250, 5275, 5300, 5325, 5350, 5375, 5400, 5425, 5450, 5475, 5500, 5525, 5550, 5575, 5600, 5625, 5650, 5675, 5700, 5725, 5750, 5775, 5800, 5825, 5850, 5875, 5900, 5925, 5950, 5975, 6000, 6025, 6050, 6075, 6100, 6125, 6150, 6175, 6200, ou 6225 nucleotídeos, e até o comprimento total da sequência em questão. Uma parte biologicamente ativa de uma sequência de nucleotídeos pode ser preparada isolando-se uma parte da sequência e avaliando-se a atividade da parte.

[0046] Fragmentos e variantes de sequências de nucleotídeos e as proteínas codificadas desse modo úteis nos métodos da presente revelação também são abrangidos. Como usado no presente documento, o termo "fragmento" se refere a uma porção de uma sequência de nucleotídeos e, portanto, a proteína codificada pela mesma ou uma porção de uma sequência de aminoácidos. Fragmentos de uma sequência de nucleotídeos podem codificar fragmentos de proteínas que retêm a atividade biológica da proteína nativa. Alternativamente, os fragmentos de uma sequência de nucleotídeos úteis como sondas de hibridização, em geral, não codificam as proteínas em fragmento que retêm atividade biológica. Assim, os fragmentos de uma sequência de nucleotídeos podem variar de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos e até a sequência de nucleotídeos de comprimento total que codifica as proteínas úteis nos métodos da revelação.

[0047] Conforme usado no presente documento, o termo "variantes" significa sequências que têm similaridade substancial com uma sequência revelada no presente documento. Uma variante compreende uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos ou peptídeos em um ou mais locais internos dentro do polinucleotídeo ou polipeptídeo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos ou peptídeos em um ou mais locais no polinucleotídeo ou polipeptídeo nativo. Como usado no presente documento, uma sequência de nucleotídeos ou peptídeos "nativos" compreende uma sequência de nucleotídeos ou peptídeos de ocorrência natural, respectivamente. Para sequências de nucleotídeos, variantes de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bastante conhecidas, tais como, por exemplo, técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR) e de hibridização conforme delineado no presente documento. Uma variante biologicamente ativa de uma proteína útil nos métodos da revelação pode diferir daquela proteína nativa por tão poucos quanto 1 a 15 resíduos de aminoácidos, tão poucos quanto 1 a 10, tal como 6 a 10, tão poucos quanto 5, tão poucos quanto 4, 3, 2 ou mesmo 1 resíduo de aminoácido.

[0048] Sequências nucleotídicas variantes também incluem sequências nucleotídicas derivadas sinteticamente, tais como aquelas geradas, por exemplo, com o uso de mutagênese dirigida ao local. De modo geral, as variantes de uma sequência de nucleotídeos revelada no presente documento terão pelo menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, a 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com aquela sequência de nucleotídeos conforme determinado por programas de alinhamento de sequência descritos em outro local no presente documento usando parâmetros padrão. As variantes ativas biologicamente de uma sequência de nucleotídeos revelada no presente documento também são englobadas. Atividade biológica pode ser medida com o uso de técnicas, tais como análise Northern blot, medições de atividade de repórter obtidas a partir de fusões transcricionais e semelhantes. Consultar, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), doravante "Sambrook," incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. Alternativamente, os níveis de um gene repórter, tal como proteína verde fluorescente (GFP) ou proteína amarela fluorescente (YFP) ou semelhantes produzidos sob o controle de um promotor ligado operacionalmente a um fragmento de nucleotídeo ou variante podem ser medidos. Consultar, por exemplo, Matz et al. (1999) Nature Biotechnology 17:969 a 973; documento de Patente no U.S.

6.072.050, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência; Nagai et al., (2002) Nature Biotechnology 20(1):87 a 90. As sequências de nucleotídeos variantes também abrangem as sequências derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico, como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais sequências de nucleotídeos diferentes podem ser manipuladas para criar uma sequência de nucleotídeos nova. Deste modo, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequência relacionados que compreendem regiões de sequência que têm identidade de sequência substancial e podem ser recombinadas homologamente in vitro ou in vivo. As estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91:10.747 a 10.751; Stemmer, (1994)

Nature 370:389 a 391; Crameri, et al., (1997) Nature Biotech. 15:436 a 438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336 a 347; Zhang, et al., (1997) Proc Natl. Acad. Sci. EUA 94:4.504 a 4.509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288 a 291 e documentos de Patente no U.S. 5.605.793 e 5.837.458, incorporados em sua totalidade ao presente documento a título de referência.

[0049] Métodos de mutagênese e alterações de sequências de nucleotídeos são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Kunkel, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82:488 a 492; Kunkel, et al., (1987) Methods in Enzymol. 154:367 a 382; documento de Patente no U.S.

4.873.192; Walker e Gaastra, edições (1983) Techniques in Molecular Biology (Companhia de Publicação MacMillan, Nova Iorque) e as referências citadas nas mesmas, incorporadas no presente documento em sua totalidade a título de referência. Diretrizes a respeito de substituições de aminoácidos apropriadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporado aqui a título de referência. Substituições conservativas, tal como a troca de um aminoácido por outro que tem propriedades similares, podem ser ideais.

[0050] As sequências de nucleotídeos da revelação podem ser usadas para isolar sequências correspondentes de outros organismos, particularmente outras plantas, mais particularmente outras monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Dessa maneira, métodos, tais como PCR, hibridização e semelhantes podem ser usados para identificar tais sequências com base em sua homologia de sequência com as sequências apresentadas no presente documento. Sequências isoladas com base em sua identidade de sequência com as sequências inteiras apresentadas no presente documento ou com fragmentos das mesmas estão englobadas pela presente revelação.

[0051] Em uma abordagem de PCR, iniciadores de oligonucleotídeo podem ser projetados para uso em reações de PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse. Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook, supra. Consultar também, Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, edições (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis e Gelfand, edições (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Métodos conhecidos de PCR incluem, porém não se limitam, aos métodos que usam iniciadores pareados, iniciadores aninhados, iniciadores únicos específicos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos de gene, iniciadores específicos de vetor, iniciadores parcialmente não correspondidos e semelhantes.

[0052] Em técnicas de hibridização, toda ou parte de uma sequência de nucleotídeos conhecida é usada como uma sonda que se hibridiza seletivamente com outras sequências de nucleotídeos correspondentes presente em uma população de fragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de cDNA (isto é, bibliotecas de genômicas ou de cDNA) a partir de um organismo escolhido. As sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos, e podem ser marcadas com um grupo detectável, tal como 32P, ou qualquer outro marcador detectável. Assim, por exemplo, sondas para hibridização podem ser produzidas marcando-se oligonucleotídeos sintéticos com base nas sequências da revelação. Métodos para preparação de sondas para hibridização e para construção de bibliotecas genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook, supra.

[0053] Por exemplo, uma sequência completa aqui revelada, ou uma ou mais porções da mesma, pode ser utilizada como uma sonda capaz de hibridar especificamente com sequências correspondentes e RNAs mensageiros. Para obter hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas dentre sequências e são, de modo geral, de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos em comprimento ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos em comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar sequências correspondentes a partir de uma planta escolhida através de PCR. Essa técnica pode ser usada para isolar sequências de codificação adicionais de um organismo desejado ou como um ensaio de diagnóstico para determinar a presença de sequências de codificação em um organismo. Técnicas de hibridização incluem exame de hibridização de bibliotecas de DNA em placa (sejam placas ou colônias, consultar, por exemplo, Sambrook, supra).

[0054] A hibridização de tais sequências pode ser executada sob condições estringentes. Os termos "condições estringentes" ou “condições de hibridização estringentes" são destinados a significar condições sob as quais uma sonda hibridizará a sua sequência-alvo até um grau maior de modo detectável do que outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre fundo). As condições estringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Controlando a estringência das condições de hibridação e/ou de lavagem, as sequências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algum emparelhamento errado nas sequências de modo que sejam detectados graus mais baixos de similaridade (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda é menor que cerca de 1.000 nucleotídeos em comprimento, menor de modo ideal que 500 nucleotídeos em comprimento.

[0055] Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor que cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é de pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (por exemplo, maiores que 50 nucleotídeos). As condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, como formamida. Condições de baixa estringência exemplificativas incluem hibridização com uma solução de tampão de formamida a 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS a 1% (sulfato de dodecila de sódio) a 37 °C e uma lavagem em SSC de 1 vez a 2 vezes (SSC de 20 vezes = NaCl 3,0 M/citrato trissódico 0,3 M) em 50 a 55 °C. Condições de estringência moderada exemplificativas incluem hibridização em formamida a 40 a 45%, NaCl 1,0 M, SDS a 1% a 37 °C e uma lavagem em SSC de 0,5 vez a 1 vez em 55 a 60 °C. Condições de estringência alta exemplificativa incluem hibridização em formamida a 50%, NaCl 1 M, SDS a 1% a 37 °C e um lavagem final em SSC de 0,1 vez em 60 a 65 °C por uma duração de pelo menos 30 minutos. A duração de hibridização é geralmente menor que cerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem será pelo menos um comprimento de tempo suficiente para alcançar o equilíbrio.

[0056] A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós- hibridização, em que os fatores críticos são a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos de DNA e DNA, o ponto de fusão térmica (Tm) pode ser aproximado da equação de Meinkoth e Wahl, (1984)

Anal.

Biochem 138:267 a 284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (%form) - 500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de base.

A Tm é a temperatura (sob força iônica definida e pH) na qual 50% de uma sequência-alvo complementar hibridiza para uma sonda perfeitamente correspondida.

Tm é reduzida em cerca de 1 °C para cada 1% de incompatibilidade, desse modo, Tm, hibridização, e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar sequências da identidade desejada.

Por exemplo, se as sequências com 90% identidade forem buscadas, a Tm pode ser diminuída em 10 °C.

Geralmente, as condições severas são selecionadas para serem cerca de 5 °C mais baixas do que a Tm para a sequência específica e seu complemento em uma força iônica definida e pH.

Entretanto, as condições extremamente severas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4 °C mais baixos do que a Tm; as condições moderadamente severas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10 °C mais baixos do que a Tm; as condições de severidade baixa podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20 °C mais baixos do que a Tm.

Com o uso das equação, hibridização e composições de lavagem, e Tm desejada, aqueles de habilidade comum na técnica entenderão que as variações na severidade de hibridização e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas.

Se o grau desejado de emparelhamento errôneo resultar em uma Tm de menos de 45 °C (solução aquosa) ou 32 °C (solução de formamida), é preferido aumentar a concentração de SSC para que uma temperatura mais alta possa ser usada.

Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos encontra-se em Tijssen, (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes,

Parte 1, Capítulo 2 (Elsevier, Nova Iorque); e Ausubel, et al., edições (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova Iorque), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Também consultar Sambrook supra. Assim, sequências isoladas que têm atividade e que hibridizam sob condições estringentes com as sequências reveladas no presente documento ou com fragmentos das mesmas, são englobadas pela presente revelação.

[0057] Em geral, as sequências que têm atividade e hibridizam com as sequências reveladas no presente documento serão pelo menos 40% a 50% homólogas, cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% a 98% homólogas ou mais com as sequências reveladas. Isto é, a similaridade de sequência de sequências pode estar na faixa de, compartilhando pelo menos cerca de 40% a 50%, cerca de 60% a 70% e cerca de 80%, 85%, 90%, 95% a 98% de similaridade de sequência.

[0058] Os termos a seguir são usados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais ácido nucleicos ou polinucleotídeos: (a) "sequência de referência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade de sequência", (d) "percentagem de identidade de sequência" e (e) "identidade substancial".

[0059] Conforme usado no presente documento, "sequência de referência" é uma sequência definida usada como base para comparação de sequências. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma sequência especificada; por exemplo, como um segmento de um cDNA ou sequência genética de comprimento completo ou o cDNA ou sequência genética completa.

[0060] Conforme usado no presente documento, "janela de comparação" se refere a um segmento contíguo e especificado de uma sequência de polinucleotídeos, sendo que a sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. Geralmente, a janela de comparação tem comprimento de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos e, opcionalmente, pode ser de 30, 40, 50, 100 ou mais. Aqueles de habilidade na técnica entendem que para evitar uma alta similaridade com uma sequência de referência devido a inclusão de lacunas na sequência de polinucleotídeos, uma penalidade de lacuna é tipicamente introduzida e é subtraída do número de correspondências.

[0061] Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Assim, a determinação da percentagem de identidade de sequência entre quaisquer duas sequências pode ser realizada utilizando um algoritmo matemático. Exemplos sem limitação de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller, (1988) CABIOS 4:11 a 17; o algoritmo de Smith, et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de Needleman e Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443 a 453; o algoritmo de Pearson e Lipman, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2.444 a 2.448; o algoritmo de Karlin e Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 872:264, modificado como em Karlin e Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:5.873 a 5.877, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0062] As implantações de computador desses algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de sequências para determinar a identidade de sequência. Tais implantações incluem, porém, sem limitação: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível junto à Intelligenetics, Mountain View, Califórnia); o programa ALIGN (Versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no GCG Wisconsin Genetics

Software Package®, Versão 10 (disponível junto à Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Califórnia, EUA). Os alinhamentos com o uso desses programas podem ser realizados com o uso de parâmetros padrão.

O programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins, et al., (1988) Gene 73:237 a 244 (1988); Higgins, et al., (1989) CABIOS 5:151 a 153; Corpet, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:10.881 a 10.890; Huang, et al., (1992) CABIOS 8:155 a 165; e Pearson, et al., (1994) Meth.

Mol.

Biol. 24:307 a 331, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

O programa ALIGN é com base no algoritmo de Myers e Miller, (1988) supra.

Uma tabela de peso de resíduo PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12, e uma penalidade de lacuna de 4 podem ser usadas com o programa ALIGN durante a comparação de sequências de aminoácidos.

Os programas BLAST de Altschul, et al., (1990) J.

Mol.

Biol. 215:403, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência, são com base no algoritmo de Karlin e Altschul, (1990) supra.

Buscas por nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeos homólogas a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína da revelação.

Buscas por proteína BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma proteína ou polipeptídeo da revelação.

Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado conforme descrito em Altschul, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3.389, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser usado para realizar uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas.

Consultar Altschul, et al., (1997) supra.

Durante a utilização de BLAST, Gapped BLAST,

PSI-BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTN para sequências de nucleotídeos, BLASTX para proteínas) podem ser usados. Consultar o site na internet para o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia na internet em ncbi.nlm.nih.gov. O alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.

[0063] A não ser que determinado de outro modo, os valores de identidade/similaridade de sequência fornecidos aqui se referem ao valor obtido com o uso de GAP Versão 10 com o uso dos seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos com o uso de Peso de GAP de 50 e Peso do Comprimento de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade e % de similaridade para uma sequência de aminoácidos usando Peso de GAP de 8 e Peso do Comprimento de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62; ou qualquer programa equivalente a esses. Conforme usado no presente documento, "programa equivalente” é qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem correspondências de resíduo de nucleotídeo ou aminoácido idênticas e uma porcentagem de identidade de sequência idêntica quando em comparação com o alinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10.

[0064] O programa GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch, supra, para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de lacunas. GAP considera todos os alinhamentos e posições de lacuna possíveis e cria o alinhamento com o maior número de bases correspondidas e o menor número de lacunas. O mesmo permite a provisão de uma penalidade de criação de lacuna e uma penalidade de extensão de lacuna em unidades de bases correspondidas. GAP deve se beneficiar do número de penalidade de criação de lacuna de correspondências para cada lacuna que insere. Se uma penalidade de extensão de lacuna maior que zero for escolhida, GAP deve, além disso, se beneficiar de cada lacuna inserida do comprimento da lacuna vezes a penalidade de extensão de lacuna. Valores de penalidade de criação de lacuna padrão e valores de penalidade de extensão de lacuna na Versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package® para sequências de proteína são 8 e 2, respectivamente. Para as sequências de nucleotídeos, a penalidade de criação de lacuna padrão é 50 enquanto a penalidade de extensão de lacuna padrão é 3. As penalidades de criação de lacuna e extensão de lacuna podem ser expressas como um número inteiro selecionado dentre o grupo de números inteiros que consiste em 0 a 200. Assim, por exemplo, as penalidades por criação de lacuna e extensão de lacuna podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou maiores.

[0065] GAP apresenta um membro da família de melhores alinhamentos. Pode haver muitos membros dessa família, mas nenhum outro membro tem uma qualidade melhor. GAP exibe quatro parâmetros de mérito para alinhamentos: Qualidade, Razão, Identidade e Similaridade. A Qualidade é a métrica maximizada para alinhar as sequências. A Razão é a Qualidade dividida pelo número de bases no segmento mais curto. A Percentagem de Identidade é a percentagem dos símbolos que se correspondem realmente. A Percentagem de Similaridade é a percentagem dos símbolos que são similares. Os símbolos que se encontram através de intervalos são ignorados. Uma similaridade é pontuada quando o valor da matriz de pontuação para um par de símbolos é maior ou igual a 0,50, o limiar de similaridade. A matriz de pontuação usada na Versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package® é BLOSUM62 (consultar Henikoff e Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10.915, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência).

[0066] Conforme usado no presente documento, "identidade de sequência" ou "identidade" no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo se refere aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada. Quando a porcentagem de identidade de sequência é usada em referência às proteínas, se reconhece que as posições de resíduo que não são idênticas se diferem frequentemente por substituições de aminoácido conservadoras, em que resíduos de aminoácido são substituídos por outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Quando as sequências diferem em substituições conservativas, a percentagem de identidade de sequência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. As sequências que diferem por tais substituições conservativas são ditas ter "semelhança de sequência" ou "semelhança". Meios para fazer este ajustamento são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Tipicamente isto envolve a classificação de uma substituição conservativa como um emparelhamento errado parcial em vez de um completo, aumentando assim a percentagem de identidade de sequência. Assim, por exemplo, quando um aminoácido idêntico recebe uma pontuação de um e uma substituição não conservadora recebe uma pontuação de zero, uma substituição conservadora recebe uma pontuação entre zero e um. A pontuação de substituições conservadoras é calculada, por exemplo, conforme implantado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif.).

[0067] Conforme usado no presente documento, "porcentagem de identidade de sequência" significa o valor determinado comparando-se duas sequências alinhadas de maneira ideal sobre uma janela de comparação, sendo que a porção da sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições em que a mesma base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para gerar o número de posições correspondentes, dividindo-se o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resultado por 100 para gerar a percentagem de identidade de sequência.

[0068] O termo "identidade substancial" de sequências de polinucleotídeos significa que um polinucleotídeo compreende uma sequência que tem pelo menos 70% de identidade de sequência, de maneira ideal pelo menos 80%, de maneira mais ideal pelo menos 90% e de maneira ainda mais ideal pelo menos 95%, em comparação com uma sequência de referência que usa um programa de alinhamento que usa parâmetros padrão. Um versado na técnica reconhecerá que estes valores podem ser ajustados apropriadamente para determinar a identidade correspondente de proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeos, considerando a degenerescência de códons, semelhança de aminoácidos, posicionamento do quadro de leitura e semelhantes. Identidade substancial de sequências de aminoácidos para esses fins significa normalmente identidade de sequência de pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% e pelo menos 95%.

[0069] Outra indicação que as sequências de nucleotídeos são substancialmente idênticas é se duas moléculas hibridizam uma a outra sob condições severas. Geralmente, as condições severas são selecionadas para serem 5 °C mais baixas do que a Tm para a sequência específica a uma força iônica e pH definidos. Entretanto, as condições severas abrangem temperaturas na faixa de cerca de 1 °C a cerca de 20 °C mais baixos do que a Tm, dependendo do grau desejado de severidade, conforme qualificado de outro modo no presente documento. Os ácidos nucleicos que não hibridam entre si sob condições estringentes são ainda substancialmente idênticos se os polipeptídeos que codificarem forem substancialmente idênticos. Tal pode ocorrer, por exemplo, quando é criada uma cópia de um ácido nucleico usando a degenerescência máxima de códons permitida pelo código genético. Uma indicação de que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é quando o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico tem imunologicamente reatividade cruzada com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico.

[0070] "Variantes" destina-se a significar sequências substancialmente similares. Para polinucleotídeos, variantes conservativas incluem aquelas sequências que, devido à degenerescência do código genético, codificam a sequência de aminoácidos de um dos genes morfogênicos e/ou genes/polinucleotídeos de interesse revelados no presente documento. Os polinucleotídeos variantes também incluem polinucleotídeos derivados sinteticamente, tais como aqueles gerados, por exemplo, com o uso de mutagênese dirigida ao local, mas que ainda codificam uma proteína de um gene morfogênico e/ou gene/polinucleotídeo de interesse revelado no presente documento. Geralmente, as variantes de um determinado gene morfogênico e/ou gene/polinucleotídeo de interesse revelado no presente documento terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com esse gene morfogênico específico e/ou gene/polinucleotídeo de interesse, como determinado por programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos em outro lugar no presente documento.

[0071] Proteína "variante" se destina a significar uma proteína derivada da proteína nativa por deleção ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios internos na proteína nativa e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativa. Proteínas variantes abrangidas pela presente revelação são biologicamente ativas, isto é, as mesmas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, isto é, o polipeptídeo possui gene morfogênico e/ou gene/polinucleotídeo de atividade de interesse. Tais variantes podem resultar, por exemplo, de polimorfismo genético ou de manipulação humana. Variantes biologicamente ativas de um gene morfogênico nativo e/ou gene/polinucleotídeo de proteína de interesse revelados no presente documento terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos para a proteína nativa como determinado por programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos em outro lugar no presente documento. Uma variante biologicamente ativa de uma proteína da revelação pode diferir daquela proteína por tão pouco quanto 1 a 15 resíduos de aminoácido, tão pouco quanto 1 a 10, como 6 a 10, tão pouco quanto 5, tão pouco quanto 4, 3, 2 ou até mesmo 1 resíduo de aminoácido.

[0072] As sequências e genes revelados no presente documento, bem como variantes e fragmentos dos mesmos, são úteis para a engenharia genética de plantas, por exemplo, para produzir uma planta transformada ou transgênica, para expressar um fenótipo de interesse. Como usados aqui, os termos "planta transformada" e "planta transgênica" se relacionam com uma planta que compreende dentro do seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo está integrado de forma estável no genoma de uma planta transgênica ou transformada de tal modo que o polinucleotídeo é passado para sucessivas gerações. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de um construto de DNA recombinante. Deve ser entendido que, conforme usado no presente documento, o termo "transgênico" inclui qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte de planta ou planta em que o genótipo foi alterado pela presença de um ácido nucleico heterólogo que inclui aqueles transgênicos inicialmente alterados, assim como aqueles criados por cruzamentos sexuados ou propagação assexuada a partir do transgênico inicial.

[0073] Um "evento" transgênico é produzido através de transformação de células vegetais com um construto de DNA heterólogo, que inclui um cassete de expressão de ácido nucleico que compreende um gene de interesse, a regeneração de uma população de plantas que resulta da inserção do gene transferido para o genoma da planta e seleção de uma planta caracterizada pela inserção em uma localização de genoma particular. Um evento é caracterizado fenotipicamente pela expressão do gene inserido. A nível genético, um evento é parte da composição genética de uma planta. O termo "evento" também se refere à progênie produzida através de um cruzamento sexuado entre o transformante e outra planta em que a progênie inclui o DNA heterólogo.

[0074] Os protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeos em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, visada para transformação. Métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células vegetais e subsequente inserção no genoma vegetal incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320 a 334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl.

Acad. Sei USA 83: 5602 a 5606, transformação mediada por Agrobacterium (Townsend et al., Patente no U.S. 5.563.055; Zhao et al., Patente no U.S.

5.981.840), transferência direta de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717 a 2722), e aceleração de partículas balísticas (consultar, por exemplo, Sanford et al., Patente no U.S. 4.945.050; Tomes et al., Patente no U.S. 5.879.918; Tomes et al., Patente no U.S. 5.886.244; Bidney et al., Patente no U.S. 5.932.782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer- Verlag, Berlim) (maize); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923 a -926); e Lec1 transformation (documento nº WO 00/28058). Também consultar Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 a -477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27 a -37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671 a -674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923 a -926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175 a 182 (soybean); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319 a 324 (soybean); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736 a 740 (rice); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305 a 4309 (maize); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559 a 563 (maize); Tomes, U.S. Pat. no U.S. 5.240.855; Buising et al., Patentes nos 5.322.783 e 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311: 763-764; Bowen et al., Patente no U.S. 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345 a 49 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197 a 209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415 a 418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560 a 566 (whisker-mediated transformation); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495 a

1505 (electroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250 a 255; Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407 a 413 (rice); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750 (maize via Agrobacterium tumefaciens); e Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2017/0121722 (rapid plant transformation), todos incorporadas em sua totalidade ao presente documento a título de referência.

[0075] Os métodos fornecidos no presente documento dependem do uso de transferência de gene mediada por bactérias e/ou mediada por biolística para produzir células vegetais regeneráveis que têm uma sequência de nucleotídeos de interesse incorporada. As cepas bacterianas úteis nos métodos da revelação incluem, porém, sem limitações, uma Agrobacteria desarmada, bactérias Ochrobactrum ou bactérias Rhizobiaceae.

[0076] A Agrobacteria desarmada útil nos presentes métodos inclui, porém, sem limitações, AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-.

[0077] As cepas bacterianas Ochrobactrum úteis nos presentes métodos incluem, porém, sem limitação, aquelas listadas na Tabela 2. Tabela 2. Ochrobactrum haywardense H1 NRRL Depósito B-67078 Ochrobactrum cytisi Ochrobactrum daejeonense Ochrobactrum oryzae Ochrobactrum tritici LBNL124-A-10 HTG3-C-07 Ochrobactrum pecoris

Ochrobactrum ciceri Ochrobactrum gallinifaecis Ochrobactrum grignonense Ochrobactrum guangzhouense Ochrobactrum haematophilum Ochrobactrum intermedium Ochrobactrum lupini Ochrobactrum pituitosum Ochrobactrum pseudintermedium Ochrobactrum pseudogrignonense Ochrobactrum rhizosphaerae Ochrobactrum thiophenivorans Ochrobactrum tritici

[0078] As cepas bacterianas de Rhizobiaceae úteis nos presentes métodos incluem, porém, sem limitação, aquelas listadas na Tabela 3 (consultar também documento US 9.365.859 incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Tabela 3. Rhizobium lusitanum Rhizobium rhizogenes Agrobacterium rubi Rhizobium multihospitium Rhizobium tropici Rhizobium miluonense Rhizobium leguminosarum Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli

Rhizobium leguminosarum. bv. viciae Rhizobium leguminosarum Madison Rhizobium leguminosarum USDA2370 Rhizobium leguminosarum USDA2408 Rhizobium leguminosarum USDA2668 Rhizobium leguminosarum 2370G Rhizobium leguminosarum 2370LBA Rhizobium leguminosarum 2048G Rhizobium leguminosarum 2048LBA Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 2668G Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 2668LBA Rhizobium leguminosarum RL542C Rhizobium etli USDA 9032 Rhizobium etli bv. phaseoli Rhizobium endophyticum Rhizobium tibeticum Rhizobium etli Rhizobium pisi Rhizobium phaseoli Rhizobium fabae Rhizobium hainanense Arthrobacter viscosus Rhizobium alamii Rhizobium mesosinicum Rhizobium sullae Rhizobium indigoferae Rhizobium gallicum

Rhizobium yanglingense Rhizobium mongolense Rhizobium oryzae Rhizobium loessense Rhizobium tubonense Rhizobium cellulosilyticum Rhizobium soli Neorhizobium galegae Neorhizobium vignae Neorhizobium huautlense Neorhizobium alkalisoli Aureimonas altamirensis Aureimonas frigidaquae Aureimonas ureilytica.

Aurantimonas coralicida Fulvimarina pelagi Martelella mediterranea Allorhizobium undicola Allorhizobium vitis Allorhizobium borbor Beijerinckia fluminensis Agrobacterium larrymoorei Agrobacterium radiobacter Rhizobium selenitireducens corrig.

Rhizobium rosettiformans Rhizobium daejeonense Rhizobium aggregatum Pararhizobium capsulatum

Pararhizobium giardinii Ensifer mexicanus Ensifer terangae Ensifer saheli Ensifer kostiensis Ensifer kummerowiae Ensifer fredii Sinorhizobium americanum Ensifer arboris Ensifer garamanticus Ensifer meliloti Ensifer numidicus Ensifer adhaerens Sinorhizobium sp. Sinorhizobium meliloti SD630 Sinorhizobium meliloti USDA1002 Sinorhizobium fredii USDA205 Sinorhizobium fredii SF542G Sinorhizobium fredii SF4404 Sinorhizobium fredii SM542C.

[0079] O polinucleotídeo da revelação pode ser introduzido em plantas colocando-se plantas em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem incorporar um construto de nucleotídeo da revelação dentro de um DNA viral ou molécula de RNA. Os métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada nos mesmos, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, documentos de

Patente no U.S. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 e Porta, et al., (1996) Molecular Biotechnology 5:209 a 221, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[0080] Os métodos da revelação envolvem introduzir um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. Conforme usado no presente documento, o termo "introduzir" significa apresentar à planta o polinucleotídeo ou polipeptídeo de uma tal maneira que a sequência ganha acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da revelação não dependem de um método particular para introduzir uma sequência em uma planta, apenas que o polinucleotídeo ou polipeptídeos ganham acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introduzir polinucleotídeo ou polipeptídeos em plantas são conhecidos na técnica, que incluem, porém, sem limitação, os métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente e métodos mediados por vírus.

[0081] Uma "transformação estável" é uma transformação na qual um construto de nucleotídeo ou um cassete de expressão introduzido em uma planta se integra no genoma da planta e é capaz de ser herdado pela progênie da mesma. “Transformação transiente" significa que um polinucleotídeo ou um cassete de expressão é introduzido na planta e não é integrado no genoma da planta ou que um polipeptídeo é introduzido em uma planta.

[0082] Genes repórteres ou genes marcadores selecionáveis também podem ser incluídos nos cassetes de expressão revelados no presente documento e usados nos métodos da revelação. Exemplos de genes repórteres adequados conhecidos na técnica podem ser encontrados em, por exemplo, Jefferson, et al., (1991) em "Plant Molecular Biology Manual", edição, Gelvin, et al., (Kluwer Academic Publishers), páginas 1 a 33; DeWet, et al., (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725 a 737; Goff, et al., (1990)

EMBO J. 9:2.517 a 2.522; Kain, et al., (1995) Bio Techniques 19:650 a 655 e Chiu, et al., (1996) Current Biology 6:325 a 330, incorporados no presente documento na sua totalidade a título de referência.

[0083] Um marcador selecionável compreende um segmento de DNA que permite que um indivíduo identifique ou selecione em favor ou contra uma molécula ou uma célula que contém o mesmo, frequentemente sob condições específicas. Esses marcadores podem codificar uma atividade, tal como, mas sem limitação, a produção de RNA, peptídeo ou proteína, ou podem fornecer um sítio de ligação a RNA, peptídeos, proteínas, composições ou compostos inorgânicos e orgânicos e semelhantes. Os exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas sem limitação, segmentos de DNA que compreendem sítios de enzimas de restrição; segmentos de DNA que codificam produtos que fornecem resistência contra compostos tóxicos de outra forma (por exemplo, antibióticos como espectinomicina, ampicilina, canamicina, tetraciclina, Basta, neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT); segmentos de DNA que codificam produtos que carecem, de outra forma, na célula recipiente (por exemplo, genes de tRNA, marcadores auxotróficos); segmentos de DNA que codificam produtos que podem ser prontamente identificados (por exemplo, marcadores fenotípicos, como β-galactosidase, GUS; proteínas fluorescentes, como proteína fluorescente verde (GFP), ciano (CFP), amarela (YFP), vermelha (RFP), e proteínas de superfície de célula); a geração de novos sítios de iniciador para PCR (por exemplo, a justaposição de duas sequências de DNA não previamente justapostas), a inclusão de sequências de DNA não atuadas ou atuadas por uma endonuclease de restrição ou outra enzima de modificação de DNA, produto químico, etc.; e, a inclusão de sequências de DNA exigidas para uma modificação específica (por exemplo, metilação) que permite a sua identificação.

[0084] Genes marcadores selecionáveis para seleção de células ou tecidos transformados podem incluir genes que conferem resistência a antibióticos ou resistência a herbicidas. Exemplos de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, porém, sem limitação, genes codificadores de resistência ao cloranfenicol (Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J. 2:987 a 992); metotrexato (Herrera Estrella, et al., (1983) Nature 303:209 a 213; Meijer, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16:807 a 820); higromicina (Waldron, et al., (1985) Plant Mol. Biol. 5:103 a 108 e Zhijian, et al., (1995) Plant Science 108:219 a 227); estreptomicina (Jones, et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86 a 91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard, et al., (1996) Transgênicos Res. 5:131 a 137); bleomicina (Hille, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 7:171 a 176); sulfonamida (Guerineau, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:127 a 136); bromoxinil (Stalker, et al., (1988) Science 242:419 a 423); glifosato (Shaw, et al., (1986) Science 233:478 a 481 e Pedidos de Patente dos EUA com os nos de série 10/004,357 e 10/427,692); fosfinotricina (DeBlock, et al., (1987) EMBO J. 6:2.513 a 2.518), incorporados no presente documento na sua totalidade a título de referência.

[0085] Os marcadores selecionáveis que conferem resistência a compostos herbicidas incluem genes que codificam resistência e/ou tolerância a compostos herbicidas, tais como glifosato, sulfonilureias, glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Consultar, em geral, Yarranton, (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506 a 511; Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:6.314 a

6.318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63 a 72; Reznikoff, (1992) Mol. Microbiol. 6:2.419 a 2.422; Barkley et al. (1980) em The Operon, páginas 177 a 220; Hu et al. (1987) Cell 48:555 a 566; Brown et al. (1987) Cell 49:603 a 612; Figge et al. (1988) Cell 52:713 a 722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 86:5.400 a 5.404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2.549 a 2.553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480 a 483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1.917 a 1.921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3.343 a 3.356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3.952 a 3.956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5.072 a 5.076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4.647 a 4.653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143 a 162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1.591 a 1.595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1.094 a 1.104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:5.547 a 5.551; Oliva et al., (1992) Antimicrob Agents Chemother 36:913 a 919; Hlavka et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Volume 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al., (1988) Nature 334:721 a 724. Tais revelações são incorporadas no presente documento a título de referência.

[0086] Determinados marcadores selecionáveis úteis nos presentes métodos incluem, mas sem limitação, o gene HRA de maís (Lee et al., 1988, EMBO J 7:1.241 a 1.248) que confere resistência às sulfonilureias e imidazolinonas, o gene GAT que confere resistência ao glifosato (Castle et al., 2004, Science 304:1.151 a 1.154), genes que conferem resistência à espectinomicina como o gene aadA (Svab et al., 1990, Plant Mol Biol. 14:197 a 205) e o gene bar que confere resistência ao amônio glufosinato (White et al., 1990, Nucl. Acids Res. 25:1.062), e PAT (ou moPAT para milho, consulte Rasco-Gaunt et al., 2003, Plant Cell Rep.21:569 a 576) e o gene PMI que permite o crescimento em meio que contém manose (Negrotto et al., 2000, Plant Cell Rep. 22:684 a 690) são muito úteis para a rápida seleção durante o breve tempo transcorrido abrangido pela embriogênese somática e maturação embrionária do método. No entanto,

dependendo do marcador selecionável usado e da cultura, da consanguinidade ou variedade que é transformada, a porcentagem de fugas do tipo selvagem pode variar. Em maís e sorgo, o gene HRA é eficaz na redução da frequência de fugas do tipo selvagem.

[0087] Outros genes que poderiam ter utilidade na recuperação de eventos transgênicos incluem, porém, sem limitação, exemplos como GUS (beta-glucuronidase; Jefferson, (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (verde proteína de fluorescência; Chalfie, et al., (1994) Science 263:802), luciferase (Riggs, et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15 (19):8115 e Luehrsen, et al., (1992) Methods Enzymol. 216:397 a -414), várias proteínas fluorescentes com um espectro de emissões alternativas ótimas abrangendo Far-Red, Red, Orange, Yellow, Green Cyan e Blue (Shaner et al., 2005, Nature Methods 2:905 a 909) e os genes de maís que codificam para a produção de antocianina (Ludwig, et al., (1990) Science 247:449), incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0088] A lista acima de marcadores selecionáveis não é destinada a ser limitante. Qualquer marcador selecionável pode ser usado nos métodos da revelação.

[0089] Em um aspecto, os métodos da revelação fornecem métodos de transformação que permitem a seleção de crescimento positivo. Um versado na técnica pode observar que os métodos de transformação de planta convencionais contaram predominantemente com os esquemas de seleção negativa como descritos acima, em que um antibiótico ou herbicida (um agente seletivo negativo) é usado para inibir ou exterminar célula ou tecidos não transformados, e as células ou tecidos transgênicos continuam a crescer devido à expressão de um gene resistente. Em contrapartida, os métodos da presente revelação podem ser usados sem aplicação de um agente seletivo negativo. Assim, embora as células do tipo selvagem possam crescer sem obstáculos, por comparação, as células impactadas pela expressão controlada de um gene morfogênico podem ser prontamente identificadas devido à sua taxa de crescimento acelerada em relação ao tecido circundante do tipo selvagem. Além de simplesmente observar o crescimento mais rápido, os métodos da revelação fornecem células transgênicas que exibem morfogênese mais rápida em relação às células não transformadas. Consequentemente, tal crescimento diferencial e desenvolvimento morfogênico podem ser usados para distinguir facilmente as estruturas de planta transgênica do tecido não transformado circundante, cujo processo é denominado no presente documento como "seleção de crescimento positivo".

[0090] A presente revelação fornece métodos para a produção de plantas transgênicas com eficiência e velocidade aumentadas e proporciona frequências de transformação significativamente mais altas e eventos significativamente de mais qualidade (eventos contendo uma cópia de um cassete de expressão gênica de traço sem estrutura de vetor (plasmídeo)) em múltiplas linhas de cruzamento consanguíneo com o uso de uma variedade de tipos de tecido de partida, incluindo cruzamentos consanguíneos transformados que representam uma gama de diversidades genéticas e que têm utilidade comercial significativa. Os métodos revelados podem compreender adicionalmente polinucleotídeos que proporcionam traços e características melhoradas.

[0091] Conforme usado no presente documento, "traço" se refere a uma característica fisiológica, morfológica, bioquímica ou física de uma planta ou material de planta específico ou célula. Em alguns casos, essa característica é visível ao olho humano, como a semente ou o tamanho da planta, ou pode ser medida por meio de técnicas bioquímicas, como detecção da proteína, amido ou teor de óleo de semente ou folhas, ou por meio da observação de um processo metabólico ou fisiológico, por exemplo, medindo-se a admissão de dióxido de carbono, ou por meio da observação do nível de expressão de um gene ou genes, por exemplo, empregando-se a análise Northern, RT-PCR, ensaios de expressão de gene em microarranjo ou sistemas de expressão de gene repórter, ou por meio de observações agrícolas como tolerância à tensão, rendimento ou tolerância ao patógeno.

[0092] Traços importantes no campo de agronomia, tais como teor de óleo, amido e proteína podem ser geneticamente alterados além do uso de métodos tradicionais de melhoramento. As modificações incluem aumentar o teor de ácido oleico, óleos saturados e insaturados, aumentar níveis de lisina e enxofre, fornecer aminoácidos essenciais e também a modificação e amido. As modificações de proteína hordotionina são descritas nas Patentes nos U.S. 5.703.049, 5.885.801, 5.885.802 e 5.990.389, incorporadas ao presente documento a título de referência. Outro exemplo é proteína de semente rica em lisina e/ou enxofre codificada pela albumina 2S de feijão-soja descrita na Patente no U.S. 5.850.016 e o inibidor de quimotripsina de cevada, descrito em Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99 a 106, cuja revelação está incorporada ao presente documento a título de referência.

[0093] Derivados das sequências de codificação podem ser produzidos por meio de mutagênese direcionada a sítio para aumentar o nível de aminoácidos pré-selecionados no polipeptídeo codificado. Por exemplo, as proteínas de planta rica em metionina como da semente de girassol (Lilley et al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, editor Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Ill.), páginas 497 a 502; incorporado ao presente documento a título de referência); milho (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6.279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359;

ambos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência); e arroz (Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123, incorporado ao presente documento a título de referência) poderiam ser usadas. Outros genes agronoquimicamente importantes codificam látex, Floury 2, fatores crescimento, fatores de armazenamento de semente e fatores de transcrição.

[0094] Muitos traços agronômicos podem afetar o "rendimento", incluindo, mas sem limitação, altura da planta, quantidade de vagens, posição da vagem na planta, quantidade de internódios, incidência de pedaços da vagem, tamanho de grão, eficiência da nodulação e fixação de nitrogênio, eficiência de assimilação de nutriente, resistência à tensão biótica e abiótica, assimilação de carbono, arquitetura da planta, resistência ao acamamento, germinação de semente em percentual, vigor da semente e traços juvenis. Outros traços que podem afetar o rendimento incluem, eficiência da germinação (incluindo germinação em condições de tensão), taxa de crescimento (incluindo taxa de crescimento em condições de tensão), quantidade de espigas, quantidade de semente por espiga, tamanho da semente, composição da semente (amido, óleo, proteína) e características do enchimento da semente. Também é de interesse a geração de plantas transgênicas que demonstram propriedades fenotípicas desejáveis que podem ou não conferir um aumento no rendimento da planta geral. Tais propriedades incluem morfologia de planta aumenta, fisiologia de planta ou componentes aprimorados da semente madura colhida da planta transgênica.

[0095] “Rendimento aumentado" de uma planta transgênica da presente revelação pode ser evidenciado e medido de vários modos, incluindo peso em teste, quantidade de semente por planta, peso da semente, quantidade de semente por unidade de área (isto é, sementes ou peso das sementes por acre), alqueires por acre, toneladas por acre, quilo por hectare. Por exemplo, o rendimento do maís pode ser medido como a produção de núcleos de milho envolvidos por unidade de área de produção, por exemplo, em alqueires por acre ou toneladas métricas por hectare, frequentemente relatados com base em umidade ajustada, por exemplo, em 15,5% de umidade. O rendimento aumentado pode resultar da utilização aprimorada de compostos bioquímicos chave, como nitrogênio, fósforo e carboidrato, ou de tolerância aprimorada às tensões ambientais, como frio, calor, seca, sal e ataque de pragas ou patógenos. O DNA recombinante de intensificação de traço também pode ser usado para fornecer plantas transgênicas que têm crescimento e desenvolvimento aprimorado e, por fim, rendimento aumentado, como resultado da expressão modificada de reguladores de crescimento da planta ou modificação de ciclo da célula ou trajetórias de fotossíntese.

[0096] Um "traço intensificado" conforme usado na descrição dos aspectos da presente revelação inclui eficiência de uso da água ou tolerância à seca aprimorada ou intensificada, tolerância à tensão osmótica, tolerância à tensão em alta salinidade, tolerância à tensão em calor, tolerância ao frio intensificada, incluindo tolerância à germinação em frio, rendimento aumentado, qualidade de semente aprimorada, eficiência de uso de nitrogênio intensificado, crescimento e desenvolvimento da planta precoce, crescimento e desenvolvimento da planta tardio, proteína da semente intensificada e produção de óleo de semente intensificada.

[0097] Qualquer polinucleotídeo de interesse ou gene de traço pode ser usado nos métodos da revelação. Várias mudanças no fenótipo, transmitidas por um gene de interesse ou gene de traço, incluem aquelas para modificar a composição de ácido graxo em uma planta, alterar o teor de aminoácido, teor de amido ou teor de carboidrato de uma planta, alterar um mecanismo de defesa de patógeno da planta, alterar o tamanho de núcleo, alterar o carregamento de sacarose, e semelhantes. O gene de interesse ou gene de traço também pode estar envolvido na regulação do influxo de nutrientes, e na regulação de expressão de gene fitato particularmente aos níveis de fitato inferiores na semente. Esses resultados podem ser obtidos fornecendo-se a expressão de produtos heterólogos ou expressão aumentada de produtos endógenos em plantas. Alternativamente, os resultados podem ser obtidos fornecendo-se uma redução de expressão de um ou mais produtos endógenos, particularmente, enzimas ou cofatores na planta. Essas mudanças resultam em uma mudança do fenótipo da planta transformada.

[0098] Como usado no presente documento, "gene de traço" significa um gene de interesse a ser integrado no genoma da planta para produzir uma planta T0 transgênica fértil. Marcadores selecionáveis, tais como a Acetolactato Sintase Altamente Resistente (HRA) e marcadores visuais, tais como genes de proteínas fluorescentes, são usados no presente documento a título de exemplo. Um gene de traço pode ser qualquer gene (ou combinação de genes) que confere um fenótipo agronômico, fisiológico, bioquímico ou físico com valor agregado.

[0099] Genes de interesse/genes de traço refletem os mercados comerciais e os interesses daqueles envolvidos no desenvolvimento da cultura. As culturas e mercados de interesse mudam, e à medida que nações em desenvolvimento abrem os mercados mundiais, novas culturas e tecnologias surgirão também. Além disso, à medida que aumenta a compreensão dos traços e características agronômicas, tais como rendimento e aumento de heterose, a escolha dos genes e dos traços para transformação mudará de acordo. Categorias gerais de sequências de nucleotídeos ou genes de interesse ou genes de traço usados nos métodos da revelação incluem, por exemplo, os genes envolvidos na informação, tais como dedos de zinco, aqueles envolvidos na comunicação, tais como quinases, e aqueles envolvidos na manutenção, tais como proteínas de choque térmico. Categorias mais específicas de transgenes incluem, por exemplo, genes codificadores de traços importantes para agronomia, resistência a insetos, resistência a doenças, resistência a herbicidas, esterilidade, resistência ao estresse ambiental (tolerância alterada ao frio, sal, à seca, etc.), características de grão e produtos comerciais.

[00100] Sequências de codificação heterólogas, polinucleotídeos heterólogos e polinucleotídeos de interesse expressos por uma sequência de promotor transformada pelos métodos revelados no presente documento podem ser usados para variar o fenótipo de uma planta. Várias alterações em fenótipo são de interesse incluindo modificar a expressão de um gene em uma planta, alterar um patógeno de planta ou mecanismo de defesa de inseto, aumentar uma tolerância da planta aos herbicidas, alterar desenvolvimento de planta para responder ao estresse ambiental, modular a resposta de planta ao sal, temperatura (quente e fria), seca e semelhantes. Esses resultados podem ser alcançados através da expressão de uma sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse que compreende um produto genético apropriado. Em aspectos específicos, a sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse é uma sequência vegetal endógena cujo nível de expressão é aumentado na planta ou parte de planta. Resultados podem ser obtidos fornecendo-se expressão alterada de um ou mais produtos de gene endógeno, particularmente hormônios, receptores, moléculas sinalizadoras, enzimas, transportadores ou cofatores ou afetando-se admissão de nutriente na planta. Essas mudanças resultam em uma mudança do fenótipo da planta transformada. Ainda outras categorias de transgenes incluem genes para induzir expressão de produtos exógenos, tais como enzimas, cofatores e hormônios de plantas e outros eucariotas, assim como organismos procariotas.

[00101] É reconhecido que qualquer gene de interesse, polinucleotídeo de interesse, gene de traço ou múltiplos genes/polinucleotídeos/traços de interesse podem ser ligados operacionalmente a um promotor ou promotores e expressos em uma planta transformada pelos métodos revelados no presente documento, por exemplo, genes de traço de resistência a insetos que podem ser empilhados com um ou mais genes de traços de entrada adicionais (por exemplo, resistência a herbicidas, resistência a fungos, resistência a vírus, tolerância ao estresse, resistência a doenças, esterilidade masculina, força do caule e similares) ou genes de traços de saída (por exemplo, rendimento aumentado, amidos modificados, perfil de óleo melhorado, aminoácidos equilibrados, alta lisina ou metionina, digestibilidade aumentada, qualidade de fibra melhorada, resistência à seca e similares).

[00102] Um promotor pode ser ligado operacionalmente a genes de traços agronomicamente importantes para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento que afetam a qualidade do grão, tais como níveis (aumento do teor de ácido oleico) e tipos de óleos, saturados e insaturados, qualidade e quantidade de aminoácidos essenciais, níveis crescentes de lisina e enxofre, níveis de celulose e teor de amido e proteínas. Um promotor pode ser ligado operacionalmente a genes de traço que fornecem modificações da proteína hordotionina para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento que são descritos nas Patentes nos U.S.

5.990.389; 5.885.801; 5.885.802 e 5.703.049; incorporadas em sua totalidade ao presente documento a título de referência. Outro exemplo de um gene de traço ao qual um promotor pode ser ligado operacionalmente para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento é uma proteína de semente rica em lisina e/ou enxofre codificada pela albumina 2S de soja descrita na Patente no U.S. 5.850.016, e o inibidor de quimotripsina de cevada, Williamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem 165:99 a 106, cujas revelações são incorporadas no presente documento a título de referência na sua totalidade.

[00103] Um promotor pode ser ligado operacionalmente a genes de traço de resistência a insetos que codificam resistência a pragas que produzem arrasto, tais como crisomelídeo, roscas, broca do milho europeia e similares para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento. Tais genes incluem, por exemplo, genes de proteína tóxica de Bacillus thuringiensis, documentos de Patente no U.S. 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881 e Geiser et al. (1986) Gene 48:109, em que as revelações dos mesmos estão incorporadas no presente documento em sua totalidade a título de referência. Genes de traço que codificam traços de resistência a doenças que podem ser operacionalmente ligados a um promotor para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento incluem, por exemplo, genes de desintoxicação, tais como aqueles que desintoxicam fumonisina (Patente no U.S. 5.792.931); genes de avirulência (avr) e resistência a doenças (R) (Jones, et al., (1994) Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science 262:1432; e Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089), incorporados em sua totalidade ao presente documento a título de referência.

[00104] Genes de traço de resistência a herbicidas que podem ser ligados operacionalmente a um promotor para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento incluem genes que codificam resistência aos herbicidas que atuam para inibir a ação de acetolactato sintase (ALS), em particular os herbicidas de tipo sulfonilureia (por exemplo, o gene de acetolactato sintase (ALS) que contém mutações que levam a tal resistência, em particular as mutações de S4 e/ou Hra), genes que codificam resistência aos herbicidas que atuam para inibir a ação de glutamina sintase, tal como fosfinotricina ou basta (por exemplo, o gene bar), genes que codificam resistência ao glifosato (por exemplo, o gene EPSPS e o gene GAT; consultar, por exemplo, o documento de Patente no de Publicação U.S. 2004/0082770, WO 03/092360 e WO 05/012515, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência) ou outros tais genes conhecidos na técnica. O gene bar codifica resistência ao herbicida basta, o gene nptII codifica resistência aos antibióticos canamicina e geneticina e os mutantes do gene ALS codificam resistência ao herbicida clorsulfuron, qualquer um dos quais pode ser ligado operacionalmente a um promotor para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento.

[00105] A resistência ao glifosato é conferida pela 5- enolpiruvil-3-fosfiquimato sintase (EPSPS) mutante e genes aroA que podem ser ligados operacionalmente a um promotor para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento. Consultar, por exemplo, a Patente nº U.S. 4,940,835 atribuída a Shah, et al., a qual revela a sequência de nucleotídeos de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência ao glifosato. A Patente no U.S. 5.627.061 de Barry, et al., também descreve genes que codificam enzimas EPSPS que podem ser operacionalmente ligados a um promotor para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento. Também consultar os documentos de Patente no U.S. 6.248.876 B1; 6.040.497;

5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642;

4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060;

4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE 37.287 E e 5.491.288 e as publicações internacionais no WO 97/04103; WO 97/04114; WO 00/66746; WO 01/66704; WO 00/66747 e WO 00/66748, que estão incorporadas no presente documento em sua totalidade a título referência. A resistência ao glifosato também é transmitida a plantas que expressam um gene que pode ser ligado operacionalmente a um promotor para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento que codificam uma enzima glifosato óxido-redutase, como descrito mais detalhadamente nas Patentes nos U.S. 5,776,760 e 5,463,175, que são incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade. A resistência ao glifosato também pode ser transmitida a plantas pela superexpressão de genes que podem ser operacionalmente ligados a um promotor para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento que codificam glifosato N- acetiltransferase. Consultar, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0082770, WO 03/092360 e WO 05/012515, incorporada no presente documento a título de referência na sua totalidade.

[00106] Genes de esterilidade ligados operacionalmente a um promotor para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento também podem ser codificados em um construto de DNA e fornecer uma alternativa ao despendoamento físico. Exemplos de genes usados de tais maneiras incluem genes preferenciais de tecido masculino e genes com fenótipos de esterilidade masculina, tal como QM, descrito no documento de Patente no U.S. 5.583.210, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. Outros genes que podem ser operacionalmente ligados a um promotor para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento incluem quinases e aqueles que codificam compostos tóxicos para o desenvolvimento gametofítico masculino ou feminino.

[00107] As características comerciais também podem ser codificadas por um gene ou genes ligados operacionalmente a um promotor para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento que podem aumentar, por exemplo, amido para produção de etanol ou fornecer expressão de proteínas. Outro importante uso comercial de plantas transformadas é a produção de polímeros e bioplásticos, tais como os descritos no documento de Patente n o U.S.

5.602.321, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. Genes tais como β-Cetotiolase, PHBase (poli-hidroxibutirato sintase) e acetoacetil-CoA redutase, que facilitam a expressão de poli- hidroxialcanoatos (PHAs) podem ser operacionalmente ligados a um promotor para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento (consultar Schubert, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:5837 a 5847, incorporado no presente documento a título de referência na sua totalidade).

[00108] Exemplos de outros genes de traço aplicáveis e seu fenótipo associado que podem ser operacionalmente ligados a um promotor para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento incluem genes que codificam proteínas de revestimento viral e/ou RNAs, ou outros genes virais ou vegetais que conferem resistência viral; genes que conferem resistência a fungos; genes que promovem a melhoria do rendimento e genes que fornecem resistência ao estresse, tal como frio, desidratação resultante da seca, calor e salinidade, metal tóxico ou oligoelementos ou similares.

[00109] A título de ilustração, sem a intenção de ser limitante, a seguir está uma lista de outros exemplos dos tipos de genes de traço que podem ser ligados operacionalmente a um promotor para expressão em plantas transformadas pelos métodos revelados no presente documento.

[00110] Genes de Traço que Conferem Resistência aos Insetos ou Doença e que Codificam:

[00111] Genes de resistência à doença de planta. As defesas de plantas são frequentemente ativadas por interação específica entre o produto de um gene de resistência a doenças (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para manipular plantas que são resistentes a cepas de patógenos específicos. Consultar, por exemplo, Jones et al. (1994) Science 266:789 (clonagem do gene Cf-9 do tomate para resistência a Cladosporium fulvum); Martin et al. (1993) Science 262:1432 (gene de Pto do tomate para resistência a Pseudomonas syringae pv. tomate codifica uma proteína quinase); Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089 (gene RSP2 de Arabidopsis para resistência a Pseudomonas syringae), McDowell e Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4):178 a 183 e Toyoda et al. (2002) Transgenic Res. 11(6):567 a 582, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Uma planta resistente a uma doença é uma mais resistente a um patógeno em comparação à planta do tipo selvagem.

[00112] Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado na mesma. Consultar, por exemplo, Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, que revela a clonagem e sequência de nucleotídeos de um gene de delta-endotoxina Bt. Além disso, moléculas de DNA que codificam genes delta-endotoxina podem ser compradas junto a American Type Culture Collection (Rockville, MD), por exemplo, com número de acesso ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998. Outros exemplos de transgenes de Bacillus thuringiensis que são modificados geneticamente são dados nas seguintes patentes e pedidos de patente e, assim, estão incorporados a título de referência para esse propósito: As Patentes números US 5.188.960; 5.689.052; 5.880.275; WO 91/14778; WO 99/31248; WO 01/12731; WO 99/24581; WO 97/40162 e Pedidos de Patente de números de série US 10/032.717; 10/414.637 e 10/606.320, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00113] Um hormônio ou feromônio específico para inseto, tal como um ecdisteroide e hormônio juvenil, uma variante do mesmo, um mimético à base do mesmo ou um antagonista ou agonista do mesmo. Consultar, por exemplo, a revelação por Hammock et al. (1990) Nature 344:458, de expressão de baculovírus de esterase de hormônio juvenil clonado, um desativador de hormônio juvenil, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00114] Um peptídeo específico para inseto que, mediante expressão, perturba a fisiologia da praga afetada. Por exemplo, consultar as revelações de Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (clonagem de expressão produz DNA que codifica receptor de hormônio diurético de insetos); Pratt et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1.243 (uma alostatina é identificada em Diploptera puntata); Chattopadhyay et al. (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1):33 a 54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2):300 a 310; Carlini e Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11):1.515 a 1.539; Ussuf et al. (2001) Curr Sci. 80(7):847 a 853 e Vasconcelos e Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385 a 403, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Também consultar a Patente número US 5.266.317 por Tomalski et al., a qual revela genes que codificam toxinas específicas de inseto, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00115] Uma enzima responsável por um hiperacúmulo de um monterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoide ou outra molécula de não proteína com atividade inseticida.

[00116] Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-traducional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, um polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, seja natural ou sintética. Consultar o Pedido PCT número WO 93/02197 no nome de Scott et al., o qual revela a sequência de nucleotídeos de um gene de calase, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade. As moléculas de DNA que contêm sequências de codificação de quitinase podem ser obtidas, por exemplo, junto à ATCC sob os números de acesso 39637 e 67152. Consultar também Kramer et al. (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691, que ensinam a sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica uma quitinase de ancilóstomo de tabaco, e Kawalleck et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:673, que fornecem a sequência de nucleotídeos do gene de poliubiquitina ubi4-2 de salsa, Pedidos de Patente de números de série US 10/389.432, 10/692.367 e Patente número US 6.563.020, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00117] Uma molécula que estimula transdução de sinal. Por exemplo, consultar a revelação por Botella et al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:757 de sequências de nucleotídeo para clones de cDNA de calmodulina de feijão-mungo, e Griess et al. (1994) Plant Physiol. 104:1.467, que fornece a sequência de nucleotídeo de um clone de cDNA de calmodulina de maís, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00118] Um peptídeo de momento hidrofóbico. Consultar, o

Pedido PCT no WO 95/16776 e o documento de Patente no U.S. 5.580.852 (revelação de derivados de peptídeo de Taquiplesina que inibe patógenos de planta fúngicos) e o Pedido PCT no WO 95/18855 e o documento de Patente no U.S. 5.607.914) (ensina peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência à doença), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00119] Uma membrana permease, um formador de canal ou um bloqueador de canal. Por exemplo, consultar a revelação por Jaynes et al. (1993) Plant Sci. 89:43, de expressão heteróloga de um análogo de peptídeo lítico de cecropina-beta para tornar plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00120] Uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento viral em células de plantas transformadas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento de doença efetuado pelo vírus a partir do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, assim como por vírus relacionados. Consultar Beachy, et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. A resistência mediada por proteína de revestimento tem sido conferida em plantas transformadas contra vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do pepino, vírus da risca do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus do entalhe do tabaco, vírus “rattle” do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Id.

[00121] Um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo direcionado a uma função metabólica essencial nos intestinos do inseto poderia inativar uma enzima afetada, exterminando o inseto. Cf. Taylor et al., Resumo no 497, SEVENTH INT'L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE

INTERACTIONS (Edinburgh, Escócia, 1994) (inativação enzimática em tabaco transgênica por meio de produção de fragmentos de anticorpo de cadeia única), incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00122] Um anticorpo específico de vírus. Consultar, por exemplo, Tavladoraki et al. (1993) Nature 366:469, que mostra que plantas transgênicas que expressam genes de anticorpo recombinantes são protegidas do ataque de vírus, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00123] Uma proteína de prisão de desenvolvimento produzida in natura por um patógeno ou um parasita. Desse modo, endo alfa- 1,4-D-poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e a liberação de nutriente de planta solubilizando-se a homo-alfa-1,4-D- galacturonase de parede de célula vegetal. Consultar, Lamb et al. (1992) Bio/Technology 10:1.436, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. A clonagem e a caracterização de um gene que codifica uma proteína de inibição de endopoligalacturonase de feijão é descrita por Toubart et al. (1992) Plant J. 2:367, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00124] Uma proteína de prisão de desenvolvimento produzida in natura por uma planta. Por exemplo, Logemann et al. (1992) Bio/Technology 10:305, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência, mostrou que plantas transgênicas que expressam o gene de inativação ribossômica de cevada tem uma resistência à doença fúngica aumentada.

[00125] Genes envolvidos na Resposta de Resistência Adquirida Sistêmica (SAR) e/ou os genes relacionados à patogênese. Briggs, (1995) Current Biology 5(2):128 a 131, Pieterse e Van Loon, (2004) Curr.

Opin. Pant Bio. 7(4):456 a 464 e Somssich, (2003) Cell 113(7):815 a 816, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00126] Genes antifúngicos (Cornelissen e Melchers, (1993) Pl. Physiol. 101:709 a 712 e Parijs, et al., (1991) Planta 183:258 a 264 e Bushnell, et al., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2):137 a 149. Consultar também o documento de Patente no U.S. 09/950.933, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00127] Genes de desintoxicação, tais como para fumonisina, beauvericina, moniliformina e zearalenona e seus derivados estruturalmente relacionados. Por exemplo, consultar o documento de Patente no U.S. 5.792.931, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00128] Inibidores de cistatina e cisteína proteinase. Consultar o Pedido de Patente no de série U.S. 10/947.979, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00129] Genes de defensina. Consultar o documento no WO03/000863 e o Pedido de Patente no de série U.S. 10/178.213, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00130] Genes que conferem resistência aos nematódeos. Consultar o documento WO 03/033651 e Urwin et. al., (1998) Planta 204:472 a 479, Williamson (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4):327 a 331, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00131] Genes, tais como rcg1 que conferem resistência ao apodrecimento de caule de Antracnose, que é causado pelo fungo Colletotrichum graminiola. Consultar Jung et al., Generation-means analysis and quantitative trait locus mapping of Anthracnose Stalk Rot genes in Maize, Theor. Appl. Genet. (1994) 89:413 a 418, assim como o Pedido de Patente Provisório no U.S. 60/675.664, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00132] Genes de Traço que Conferem Resistência a um Herbicida, Por Exemplo:

[00133] Um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como uma imidazolinona ou uma sulfonilureia. Os genes exemplificativos nessa categoria codificam a enzima ALS e AHAS mutante conforme descrito, por exemplo, por Lee, et al., (1988) EMBO J. 7:1,241 e Miki, et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449, respectivamente. Também consultar as Patentes números U.S. 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870;

5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937 e

5.378.824 e publicação internacional WO 96/33270, que estão incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00134] Glifosato (resistência conferida por genes mutantes de 5-enolpiruvl-3-fosfiquimato sintase (EPSP) e aroA, respectivamente) e outros compostos de fosfono, tal como glufosinato (fosfinotricina acetil transferase (PAT) e genes de fosfinotricina acetil transferase de Streptomyces hygroscopicus (bar)) e ácidos piridinóxi ou fenóxi propriônicos e ciclos-hexonas (genes de codificação de inibidor de ACCase). Consultar, por exemplo, a Patente nº U.S. 4,940,835 atribuída a Shah, et al., a qual revela a sequência de nucleotídeos de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência ao glifosato. A Patente nº U.S. 5,627,061 de Barry, et al., também descreve os genes codificadores de enzimas EPSPS. Também consultar, os documentos de Patente no U.S. 6.566.587; 6.338.961;

6.248.876 B1; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908;

5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366;

5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE

37.287 E e 5.491.288 e publicações internacionais EP1173580; WO 01/66704; EP1173581 e EP1173582, que estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. A resistência a glifosato também é conferida a plantas que expressam um gene que codifica uma enzima glifosato oxidorredutase, conforme descrito mais completamente nas Patentes números U.S. 5.776.760 e 5.463.175, que estão incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Além disso, a resistência a glifosato pode ser conferida a plantas pela sobre-expressão de genes codificadores de glifosato N-acetiltransferase. Consultar, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0082770, WO 03/092360 e WO 05/012515, incorporada no presente documento a título de referência na sua totalidade. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida sob o no de Acesso da ATCC 39256 e a sequência de nucleotídeos do gene mutante é revelado documento de Patente no U.S.

4.769.061 para Comai, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. O Pedido de Patente número EP 0 333 033 de Kumada et al., e a Patente número U.S. 4.975.374 de Goodman et al., revelam sequências de nucleotídeo de genes de glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas, como L-fosfinotricina, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. A sequência de nucleotídeo de um gene fosfinotricina-acetil-transferase é fornecida nas Patente números EP 0 242 246 e 0 242 236 por Leemans et al., De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61, que descrevem a produção de plantas transgênicas que expressa os genes bar quiméricos que codificam a atividade de acetil transferase de fosfinotricina, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Consultar também as Patentes números US 5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265;

5.919.675; 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616 B1 e 5.879.903, incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Os genes exemplificativos que conferem resistência a ácidos fenóxi propiônicos e ciclos-hexonas, como setoxidim e haloxifope, são os genes Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3 descritos por Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00135] Um herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (genes psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene de nitrilase). Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade, descrevem a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos que codificam genes psbA mutantes. As sequências de nucleotídeos para genes nitrilase são reveladas na Patente número U.S. 4.810.648 por Stalker, incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade, e moléculas de DNA que contêm esses genes estão disponíveis sob os Números de Acesso ATCC 53435, 67441 e

67442. A clonagem e a expressão de DNA que codifica uma glutationa S- transferase são descritas por Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00136] Aceto-hidroxiácido sintase, que mostrou tornar plantas que expressam essa enzima resistentes a múltiplos tipos de herbicidas, foi introduzida em uma variedade de plantas (consultar, por exemplo, Hattori et al. (1995) Mol Gen Genet 246:419, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade). Outros genes que conferem resistência a herbicidas incluem: um gene que codifica uma proteína quimérica de citocromo de rato P4507A1 e oxidorredutase P450 de citocromo de NADPH de levedura (Shiota et al. (1994) Plant Physiol 106(1):17 a 23), genes para glutationa redutase e superóxido dismutase (Aono et al. (1995) Plant Cell Physiol 36:1.687 e genes para várias fosfotransferases (Datta et al. (1992) Plant Mol Biol 20:619), incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00137] Protoporfirinogênio oxidase (protox) é necessária para a produção de clorofila, que é necessária para a sobrevivência de todas as plantas. A enzima protox serve como o direcionamento para uma variedade de compostos herbicidas. Esses herbicidas também inibem o crescimento de todas as espécies diferentes de plantas presentes, causando sua destruição total. O desenvolvimento de plantas que contêm atividade de protox alterada que são resistentes àqueles herbicidas é descrito nos documentos de Patentes no U.S. 6.288.306 B1; 6.282.837 B1 e 5.767.373; e na Publicação Internacional no WO 01/12825, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00138] Genes que Conferem ou Contribuem para uma Característica de Grão Alterada, Tais Como:

[00139] Ácidos graxos alterados, por exemplo, por

[00140] Regulação decrescente de estearoil-ACP dessaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta. Consultar Knultzon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:2.624 e WO99/64579 (Genes for Desaturases to Alter Lipid Profiles in Corn), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência,

[00141] Elevar ácido oleico por meio de modificação de gene FAD-2 e/ou diminuir ácido linoleico por meio de modificação de gene FAD-3 (consultar os documentos de Patente no U.S. 6.063.947; 6.323.392;

6.372.965 e WO 93/11245, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência),

[00142] Alterar teor de ácido linolênico ou linoleico conjugado, tal como no documento no WO 01/12800, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência,

[00143] Alterar genes LEC1, AGP, Dek1, Superal1, mi1ps, de vários lpa, tal como lpa1, lpa3, hpt ou hggt. Por exemplo, consultar os documentos WO 02/42424, WO 98/22604, WO 03/011015, Patente número US 6.423.886, Patente número US 6.197.561, Patente número US

6.825.397, Publicações de Pedido de Patente números US 2003/0079247, 2003/0204870, WO02/057439, WO03/011015 e Rivera-Madrid et. al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:5.620 a 5.624, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00144] Teor de fósforo alterado, por exemplo, por

[00145] Introdução de um gene de codificação por fitase aprimoraria o rompimento de fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada. Por exemplo, consultar Van Hartingsveldt et al. (1993) Gene 127:87, para uma revelação da sequência de nucleotídeos de um gene de fitato de Aspergillus niger, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00146] Regulação crescente de um gene que reduz o teor de fitato. Em maís, isso, por exemplo, poderia ser alcançado por clonagem e, então, reintrodução de DNA associado a um ou mais dentre os alelos, como os alelos de LPA, identificados em mutantes de maís distinguidos por níveis baixos de ácido fítico, como em Raboy et al. (1990) Maydica 35:383 e/ou alterando-se atividade de inositol quinase como no documento WO 02/059324, Publicação de Pedido de Patente número US 2003/0009011, documento WO 03/027243, Publicação de Pedido de Patente número US 2003/0079247, documento WO 99/05298, Patente número US 6.197.561, Patente número US 6.291.224, Patente número US 6.391.348, documento WO2002/059324, Publicação de Pedido de Patente número US 2003/0079247, documentos WO98/45448, WO99/55882, WO01/04147, incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00147] Carboidratos alterados efetuado, por exemplo, alterando-se um gene para uma enzima que afeta o padrão de ramificação de amido ou um gene que altera tioredoxina, como NTR e/ou TRX (consultar a Patente nº U.S. 6.531.648 que é incorporada a título de referência em sua totalidade) e/ou uma gama zeína knock out ou mutante, como cs27 ou TUSC27 ou en27 (consultar a Patente número U.S. 6.858.778 e as Publicações de Pedido de Patente números US 2005/0160488 e 2005/0204418, que estão incorporadas a título de referência em sua totalidade). Consultar Shiroza et al. (1988) J. Bacteriol. 170:810 (sequência de nucleotídeo de gene frutosiltransferase mutante de Streptococcus), Steinmetz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (sequência de nucleotídeo de gene levansucrase de Bacillus subtilis), Pen et al. (1992) Bio/Tchnology 10:292 (produção de plantas transgênicas que expressam alfa-amilase de Bacillus licheniformis), Elliot et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (sequências de nucleotídeo de genes invertase de tomate), Søgaard et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (mutagênese sítio-dirigida de gene alfa- amilase de cevada) e Fisher et al. (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima de ramificação de amido de endosperma de maís II), documento nº WO 99/10498 (digestibilidade melhorada e/ou extração de amido através da modificação de UDP-D-xilose 4-epimerase, Frágil 1 e 2, Ref1, HCHL, C4H), Patente número U.S. 6.232.529 (método para produzir semente oleaginosa superior por modificação de níveis de amido (AGP)), incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Os genes de modificações de aminoácido mencionados acima podem ser também usados para afetar o teor de amido e/ou a composição através da inter-relação das trajetórias de amido e óleo.

[00148] Teor ou composição de antioxidante alterada, tal como alteração de tocoferol ou tocotrienóis. Por exemplo, consultar o documento de Patente no U.S. 6.787.683, a Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0034886 e o documento no WO 00/68393 que envolvem a manipulação de níveis de antioxidante através de alteração de uma fitl-prenil- transferase (ppt), o documento no WO 03/082899, através de alteração de uma homogentisate geranil-geranil-transferase (hggt), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00149] Aminoácidos de semente essenciais alterados. Por exemplo, consultar o documento de Patente no U.S. 6.127.600 (método para aumentar o acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), documento de Patente no U.S. 6.080.913 (métodos binários para aumentar acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), documento de Patente no U.S.

5.990.389 (alta lisina), documento no WO99/40209 (alteração de composições de aminoácido em sementes), WO99/29882 (métodos para alterar teor de aminoácido de proteínas), documento de Patente no U.S.

5.850.016 (alteração de composições de aminoácido em sementes), documento no WO98/20133 (proteínas com níveis de aminoácidos essenciais intensificados), documento de Patente no U.S. 5.885.802 (alta metionina), documento de Patente no U.S. 5.885.801 (alta treonina), documento de Patente no U.S. 6.664.445 (enzimas biossintéticas de aminoácido vegetal), documento de Patente no U.S. 6.459.019 (lisina e treonina aumentadas), documento de Patente no U.S. 6.441.274 (subunidade beta de sintase de triptofano vegetal), documento de Patente no U.S.

6.346.403 (enzimas metabólicas de metionina), documento de Patente no U.S. 5.939.599 (alto enxofre), documento de Patente no U.S. 5.912.414 (metionina aumentada), documento no WO98/56935 (enzimas biossintéticas de aminoácido vegetal), documento no WO98/45458 (proteína de semente projetada que tem porcentagem mais elevada de aminoácidos essenciais), documento no WO98/42831 (lisina aumentada), documento de Patente no U.S. 5.633.436 (teor de aminoácido de enxofre crescente), documento de Patente no U.S. 5.559.223 (proteínas de armazenamento sintéticas com estrutura definida que contém níveis de aminoácidos essenciais programáveis para melhoramento do valor nutricional de plantas), documento no WO96/01905 (treonina aumentada), documento no WO95/15392 (lisina aumentada), Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2003/0163838, Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2003/0150014, Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0068767, documento de Patente no U.S. 6.803.498, documentos no WO01/79516 e WO00/09706 (Ces A: sintase de celulose), documento de Patente no U.S. 6.194.638 (hemicelulose), documento de Patente no U.S. 6.399.859 e Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0025203 (UDPGdH), documento de Patente no U.S. 6.194.638 (RGP), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00150] Genes adicionais podem ser incluídos nos cassetes de expressão úteis nos métodos revelados no presente documento. Os exemplos não limitantes incluem:

[00151] Genes que criam um sítio para integração de DNA específica para sítios;

[00152] Isso inclui a introdução de sítios FRT que podem ser usados no sistema FLP/FRT e/ou sítios Lox que podem ser usados no sistema Cre/Loxp. Por exemplo, consultar Lyznik et al. (2003) Plant Cell Rep 21:925 a 932 e WO 99/25821, que estão incorporados aqui a título de referência em sua totalidade. Outros sistemas que podem ser usados incluem a recombinase Gin de fago Mu (Maeser et al., 1991; Vicki Chandler, The Maize Handbook ch. 118 (Springer-Verlag 1994), a recombinase Pin de E. coli (Enomoto et al., 1983), e o sistema R/RS do plasmídeo pSR1 (Araki et al., 1992), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00153] B. Genes que afetam resistência ao estresse abiótico (que incluem, porém, sem limitação, o desenvolvimento de flores, espiga e semente, intensificação de eficiência de utilização de nitrogênio, capacidade de resposta de nitrogênio alterada, resistência ou tolerância à seca, resistência ou tolerância ao frio e resistência ou tolerância ao sal) e rendimento aumentado sob estresse. Por exemplo, consultar o documento no WO 00/73475 em que a eficiência de uso de água é alterada através da alteração de malato; documento de Patente no U.S. 5.892.009, documento de Patente no U.S. 5.965.705, documento de Patente no U.S. 5.929.305, documento de Patente no U.S. 5.891.859, documento de Patente no U.S.

6.417.428, documento de Patente no U.S. 6.664.446, documento de Patente no U.S. 6.706.866, documento de Patente no U.S. 6.717.034, WO2000060089, documentos no WO2001026459, WO2001035725, WO2001034726, WO2001035727, WO2001036444, WO2001036597, WO2001036598, WO2002015675, WO2002017430, WO2002077185, WO2002079403, WO2003013227, WO2003013228, WO2003014327, WO2004031349, WO2004076638, WO9809521 e WO9938977 que descrevem genes, incluindo genes CBF e fatores de transcrição eficazes em mitigar os efeitos negativos de congelamento, alta salinidade e seca em plantas, assim como conferir outros efeitos positivos em fenótipo de planta; a Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0148654 e documento no WO01/36596 em que ácido abscísico é alterado em plantas que resultam em fenótipo de planta melhorado, tal como rendimento aumentado e/ou tolerância ao estresse abiótico aumentada; documentos no WO2000/006341, WO04/090143, Pedido de Patente no de série U.S. 10/817483 e documento de Patente no U.S. 6.992.237, em que a expressão de citocinina é modificada, o que resulta em plantas com tolerância ao estresse aumentada, tal como tolerância à seca, e/ou rendimento aumentado, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Consultar também os documentos no WO0202776, WO2003052063, JP2002281975, o documento de Patente no U.S. 6.084.153, WO0164898, documento de Patente no U.S. 6.177.275 e o documento de Patente no U.S. 6.107.547 (intensificação de utilização de nitrogênio e capacidade de resposta de nitrogênio alterada), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Para alteração de etileno, consultar a Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0128719, Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2003/0166197 e o documento no WO200032761, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Para fatores de transcrição vegetal ou reguladores transcricionais de estresse abiótico, consultar, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente n o U.S. 2004/0098764 ou Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0078852, incorporadas no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00154] C. Outros genes e fatores de transcrição que afetam crescimento vegetal e traços agronômicos, tais como rendimento, floração, crescimento vegetal e/ou estrutura vegetal, podem ser introduzidos ou introgredidos em plantas, consultar, por exemplo, os documentos n o WO97/49811 (LHY), WO98/56918 (ESD4), WO97/10339 e o documento de Patente no U.S. 6.573.430 (TFL), documento de Patente no U.S. 6.713.663 (FT), WO96/14414 (CON), WO96/38560, WO01/21822 (VRN1), WO00/44918 (VRN2), WO99/49064 (GI), WO00/46358 (FRI), WO97/29123, documento de Patente no U.S. 6.794.560, o documento de Patente no U.S.

6.307.126 (GAI), WO99/09174 (D8 e Rht) e WO2004076638 e WO2004031349 (fatores de transcrição), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00155] Conforme usado no presente documento, "orientação antissenso" inclui referência a uma sequência de polinucleotídeos que é operativamente ligada a um promotor em uma orientação em que o padrão antissenso é transcrito. A cadeia antissenso é suficientemente complementar a um produto de transcrição endógena, de modo que a tradução do produto de transcrição endógena seja frequentemente inibida. “Operativamente ligado" se refere à associação de dois ou mais fragmentos de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico para que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificante quando é capaz de afetar a expressão daquela sequência codificante (isto é, que a sequência codificante está sob o controle transcricional do promotor). As sequências codificantes podem estar operacionalmente ligadas às sequências reguladoras em uma orientação senso ou antissenso.

[00156] Uma sequência de nucleotídeos heterólogos operacionalmente ligada a um promotor e seus fragmentos ou variantes biologicamente ativos relacionados úteis nos métodos revelados no presente documento podem ser uma sequência antissenso para um gene direcionado. A terminologia "sequência de nucleotídeos de DNA antissenso” é destinada a significar uma sequência que está na orientação inversa à orientação normal de 5’ a 3' daquela sequência de nucleotídeos. Quando entregue em uma célula vegetal, a expressão da sequência de DNA antissenso evita expressão normal da sequência de nucleotídeos de DNA para o gene direcionado. A sequência de nucleotídeos antissenso codifica uma transcrição de RNA que é complementar e tem capacidade para hibridizar com o RNA mensageiro endógeno (mRNA) produzido através de transcrição da sequência de nucleotídeos de DNA para o gene direcionado. Nesse caso, a produção da proteína nativa codificada pelo gene direcionado é inibida de modo a obter uma resposta fenotípica desejada. As modificações das sequências antissenso podem ser feitas desde que as sequências se hibridizem e interfiram com a expressão do RNAm correspondente. Dessa maneira, construções antissenso que têm 70%, 80%, 85% de identidade de sequência com as sequências antissenso correspondentes podem ser usadas. Além disso, porções dos nucleotídeos antissenso podem ser usadas para perturbar a expressão do gene direcionado. De modo geral, as sequências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou mais podem ser usadas. Assim, um promotor pode ser ligado operacionalmente a sequências de DNA antissenso para reduzir ou inibir a expressão de uma proteína nativa na planta quando transformada pelos métodos revelados no presente documento.

[00157] "RNAi" se refere a uma série de técnicas relatadas para reduzir a expressão de genes (consultar, por exemplo, o documento de Patente no U.S. 6.506.559, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência). As técnicas mais velhas denominadas por outros nomes são ensinadas agora para depender do mesmo mecanismo, mas são dados nomes diferentes na literatura. Essas incluem "inibição antissenso", a produção de transcrições de RNA antissenso que têm capacidade para suprimir a expressão da proteína-alvo e "cossupressão" ou "supressão de sentido", que se referem à produção de transcrições de RNA senso que têm capacidade para suprimir a expressão de genes endógenos ou estranhos idênticos ou substancialmente similares (documento de Patente no U.S. 5.231.020, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Tais técnicas dependem do uso de construtos que resulta no acúmulo de RNA de fita dupla com uma fita complementar ao gene-alvo a ser silenciado.

[00158] Conforme usados no presente documento, os termos "promotor" ou "região de iniciação transcricional" significam uma região reguladora de DNA que compreende normalmente uma caixa TATA ou uma sequência de DNA que tem capacidade para direcionar RNA polimerase II para iniciar síntese de RNA no local de iniciação de transcrição apropriado para uma sequência codificante particular. Um promotor pode compreender adicionalmente outras sequências de reconhecimento posicionadas, de modo geral, a montante ou 5' da caixa TATA ou a sequência de DNA capaz de direcionar a polimerase II de RNA para iniciar a síntese de RNA, denominados elementos promotores a montante, que influenciam a taxa de iniciação de transcrição.

[00159] A região de iniciação de transcrição, o promotor, pode ser nativo ou homólogo ou externo ou heterólgo ao hospedeiro, ou poderia ser a sequência natural ou uma sequência sintética. Por externo pretende-se que a região de iniciação de transcrição não é encontrada no hospedeiro de tipo selvagem em que a região de iniciação de transcrição é introduzida. Um promotor nativo ou heterólogo pode ser usado em relação à sequência de codificação de interesse.

[00160] O cassete de transcrição (expressão) incluirá na direção 5'-3 'da transcrição, uma região de iniciação transcricional e translacional, uma sequência de DNA de gene de interesse/traço e uma região de terminação transcricional e translacional funcional em plantas. A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse, ou pode ser derivada de uma outra fonte. As regiões de terminação convenientes estão disponíveis junto ao gene de inibidor de proteinase da batata (PinII) ou sequências de plasmídeo de Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação nopalina sintase, octopina sintase e opalina sintase. Consultar também, Guerineau et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141 a 144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671 a 674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141 a 149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1.261 a 1.272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151 a 158; Ballas et al. 1989) Nucleic Acids Res. 17: 7.891 a 7.903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627 a 9639.

[00161] Os cassetes de expressão podem adicionalmente conter sequências líder 5' na construção do cassete de expressão. Tais sequências-líder podem atuar para aumentar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder de EMCV (região de não codificação 5’ de encefalomiocardite) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., e Moss, B. (1989) PNAS EUA, 86: 6.126 a

6.130); líderes de potivírus, por exemplo, líder de TEV (Vírus Etch do Tabaco) (Allison et al. (1986); líder de MDMV (Vírus Mosaico Anão de Maís); Virology, 154: 9 a 20), e proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP), (Macejak, D. G., e P. Sarnow (1991) Nature, 353: 90 a 94; líder não traduzido de MARNA de proteína de revestimento do vírus mosaico da alfafa (AMV RNA 4), (Jobling, S. A., e Gehrke, L., (1987) Nature, 325: 622 a 625; líder do vírus mosaico do tabaco (TMV), (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237 a 256, Gallie et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15:

3.257 a 3.273; líder de vírus de mancha clorótica do maís (MCMV) (Lornmel, S. A. et al. (1991) Virology, 81: 382-385). Consulte também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology, 84: 965 a 968; e sequências não traduzidas 5ʹ de maís endógenas. Outros métodos conhecidos para intensificar tradução e intensificar estabilidade de mRNA também podem ser utilizados, por exemplo, íntrons, tais como o íntron de Ubiquitina de maís (Christensen e Quail, (1996) Transgenic Res. 5:213 a 218; Christensen et al. (1992) Plant Molecular Biology 18:675 a 689) ou o íntron de AdhI de maís (Kyozuka et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 228:40 a 48; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353 a 357) e semelhantes, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00162] Os cassetes de expressão podem conter um ou mais de um gene ou sequência de ácidos nucleicos a ser transferido ou expresso na planta transformada. Desse modo, cada sequência de ácidos nucleicos será operativamente ligada a sequências reguladoras 5' e 3'. Alternativamente, múltiplos cassetes de expressão podem ser fornecidos.

[00163] Na preparação de cassetes de expressão úteis nos métodos da revelação, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no quadro de leitura adequado. Para este fim, podem ser utilizados adaptadores ou ligantes para juntar os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para proporcionar locais de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de locais de restrição ou semelhantes. Com esse propósito, a mutagênese in vitro, o reparo de iniciador, a restrição, o anelamento, as ressubstituições, por exemplo, transições e transversões podem ser envolvidos.

[00164] Os genes morfogênicos e/ou genes/polinucleotídeos de traço de interesse introduzidos em um explante pelos métodos revelados podem ser ligados operacionalmente a um promotor adequado. Um "promotor de planta" é um promotor com capacidade de iniciar a transcrição em células de planta independentemente de ser ou não de sua origem ser uma célula vegetal. Promotores de planta exemplificativos incluem, mas sem limitação, aqueles que são obtidos a partir de plantas, vírus de planta e bactérias que compreendem genes expressos em células de planta como de Agrobacterium ou Rhizobium. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que iniciam a transcrição, de preferência, em determinados tecidos, como folhas, raízes ou sementes. Tais promotores são denominados como "preferenciais para tecido". Os promotores que iniciam a transcrição apenas em determinados tecidos são denominados como "específicos a tecido". Um promotor específico para um "tipo de célula" aciona, principalmente, a expressão em determinados tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Promotores específicos a tecido, preferenciais para tecido, específicos a tipo de célula e induzíveis constituem a classe de promotores “não constitutivos”.

[00165] Um promotor "induzível" ou "reprimível" pode ser um promotor que está sob controle ambiental ou exógeno. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por meio de promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas ou determinados produtos químicos ou a presença de luz. Alternativamente, o controle exógeno de um promotor induzível ou reprimível pode ser afetado fornecendo-se um produto químico adequado ou outro agente que, por meio de interação com polipeptídeos-alvo, resulta em indução ou repressão do promotor. Os promotores indutíveis incluem promotores indutíveis por calor, promotores responsivos ao estradiol, promotores indutíveis por químicos e similares. Os promotores induzíveis por patógeno incluem aqueles provenientes de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), que são induzidas em seguida à infecção por um patógeno; por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase, etc. Consultar, por exemplo, Redolfi, et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245 a 254; Uknes et al. (1992) The Plant Cell 4: 645 a 656; e Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111-116. Os promotores indutíveis úteis nos presentes métodos incluem os promotores GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A e XVE.

[00166] O promotor quimicamente induzível pode ser reprimido pelo repressor de tetraciclina (TETR), pelo repressor de etametsulfurona (ESR) ou pelo repressor de clorsulfurona (CSR) e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. O repressor pode ser TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. (Gatz, C., Frohberg, C. e Wendenburg, R. (1992) Stringent repression and homogeneous de- repression by tetracycline of a modified CaMV 35S promoter in intact transgenic tobacco plants, Plant J. 2, 397 a 404). Alternativamente, o repressor pode ser ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona-metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona (US20110287936 incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade). Se o repressor é CSR, o ligante CSR é clorsulfuron. Consultar, Patente n o U.S. 8.580.556 incorporada em sua totalidade ao presente documento a título de referência.

[00167] Um promotor "constitutivo” é um promotor que é ativo sob a maioria das condições. Promotores úteis na presente revelação incluem aqueles revelados em WO2017/112006 e aqueles revelados no Pedido Provisório US 62/562.663. Os promotores constitutivos para uso na expressão de genes em plantas são conhecidos na técnica. Tais promotores incluem, mas sem limitação, promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (Depicker et al. (1982) Mol. Appl. Genet. 1: 561 a 573; Odell et al. (1985) Nature 313: 810 a 812), promotor de ubiquitina (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675 a 689), promotores dos genes como ribulose bisfosfato carboxilase (De Almeida et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 218: 78 a 98), actina (McElroy et al. (1990) Plant J. 2: 163 a 171), histona, DnaJ (Baszczynski et al. (1997) Maydica 42: 189 a 201), e semelhantes. Em vários aspectos, os promotores constitutivos úteis nos métodos da revelação incluem UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S e promotores ZM-

ADF PRO (ALT2).

[00168] Promotores úteis na presente revelação, listados na Tabela 4 abaixo, incluem aqueles revelados na Publicação do Pedido de Patente no U.S. 2017/0121722 e Patente no U.S. 8.710.206, incorporadas em sua totalidade ao presente documento a título de referência. Tabela 4. Nome Descrição ZM-PLTP Promotor PLTP de Z. mays SB-PLTP1 Promotor PLTP1 de Sorghum biocolor ZM-FBP1 Promotor de Z. mays para Frutose-1,6-bisfosfatase ZM-RFP Promotor de Z. mays para Proteína Rossmann-Fold de Ligação a NAD (P) ZM-APMP Promotor de Z. mays para proteína do tipo proteína associada à membrana de plasma de adipócito ZM-RfeSP Promotor de Z. mays para Proteína de domínio de ferro-enxofre Rieske [2Fe-2S] ZM-CRR6 Promotor de Z. mays para gene 6 de redução cloro respiratória ZM-GLYK Promotor de Z. mays para D-glicerato 3-quinase, gene de proteína do tipo cloro plástico ZM-CAB7 Promotor de Z. mays para Proteína de ligação a-b de clorofila 7, proteína do tipo cloro plástico ZM-UBR Promotor de Z. mays para gene da proteína reprimível ultravioleta B ZM-HBP Promotor de Z. mayss para proteína da família de heme ligação Soul ZM-PSAN Promotor de Z. mays para subunidade central de reação de Fotossistema I psi-N ZM-SDR Promotor de Z. mays para proteína de desidrogenase/redutase de cadeia curta AXIG1 Promotor de AXIG1 DR5 Promotor de DR5 ZM-PLTP1 Promotor PLTP1 de Z. mays ZM-PLTP2 Promotor PLTP2 de Z. mays SB-PLTP2 Promotor PLTP2 de Sorghum biocolor SB-PLTP3 Promotor PLTP3 de Sorghum biocolor SI-PLTP1 Promotor PLTP de Setaria italica OS-PLTP1 Promotor PLTP de Oryza sativa e OS-PLTP2 Promotor PLTP2 de Oryza sativa ZM-LGL PRO Promotor de Z. mays para o gene da lactoilglutationa liase ZM-LEA14-A Promotor de Z. mays para o gene que codifica a PRO proteína embriogênica tardia e abundante Lea-14-A ZM-LEA34-D Promotor de Z. mays para o gene que codifica a PRO proteína embriogênica tardia e abundante Lea34-D ZM-SDR PRO Promotor de Z. mays para a desidrogenase/redutase (longo) de cadeia curta (longa) OS-SDR PRO Promotor de O. sativa para a desidrogenase/redutase de cadeia curta SB-SDR PRO Promotor de S. bicolor para a desidrogenase/redutase de cadeia curta GM-EF1A PRO Promotor EF1A de Glycine max

[00169] Promotores adicionais úteis nos métodos da revelação estão listados na Tabela 5 abaixo. Tabela 5.

SEQ ID Nome do Descrição NO: Promotor 35 GM-HBSTART3 Sequência de promotor de Glycine max HBSTART3 (transfer3 de lipídio relacionado a Homeodomain StAR) 36 GM-HBSTART3 Sequência de promotor de Glycine max (TRUNCADO) HBSTART3 (transfer3 de lipídio relacionado a Homeodomain StAR) (TRUNCADO) 37 A-ML1 Sequência de promotor de Arabidopsis thaliana ML1 (CAMADA1 DE MERISTEMA) 38 Tipo GM-ML1 Sequência de promotor de Glycine max Tipo ML1 (Tipo CAMADA1 DE MERISTEMA) 39 Tipo GM-ML1 Sequência de promotor de Glycine max Tipo (TRUNCADO) ML1 (Tipo CAMADA1 DE MERISTEMA) (TRUNCADO) 40 ZM-HBSTART3 Sequência de promotor de Zea mays HBSTART3 (transfer3 de lipídio relacionado a Homeodomain StAR) 41 OS-HBSTART3 Sequência de promotor de Oryza sativa HBSTART3 (transfer3 de lipídio relacionado a Homeodomain StAR) 42 A-PDF1 Sequência de promotor de Arabidopsis thaliana PDF1 (FATOR1 PROTODÉRMICO) 43 GM-PDF1 Sequência de promotor de Glycine max PDF1 (FATOR1 PROTODÉRMICO) 44 GM-PDF1 Sequência de promotor de Glycine max PDF1 (TRUNCADO) (FATOR1 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO)

45 SB-PDF1 Sequência de promotor de Sorghum bicolor PDF1 (FATOR1 PROTODÉRMICO) 46 OS-PDF1 Sequência de promotor de Oryza sativa PDF1 (FATOR1 PROTODÉRMICO) 47 OS-PDF1 Sequência de promotor de Oryza sativa PDF1 (TRUNCADO) (FATOR1 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO) 48 PT-PDF1 Sequência de promotor de Populus trichocarpa PDF1 (FATOR1 PROTODÉRMICO) 49 PT-PDF1 Sequência de promotor de Populus trichocarpa (TRUNCADO) PDF1 (FATOR1 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO) 50 SI-PDF1 Sequência de promotor de Setaria italica PDF1 (FATOR1 PROTODÉRMICO) 51 SI-PDF1 Sequência de promotor de Setaria italica PDF1 (TRUNCADO) (FATOR1 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO) 52 A-PDF2 Sequência de promotor de Arabidopsis thaliana PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO) 53 GM-PDF2 Sequência de promotor de Glycine max PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO) 54 GM-PDF2 Sequência de promotor de Glycine max PDF2 (TRUNCADO) (FATOR2 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO) 55 ZM-GL1 Sequência de promotor de Zea mays GL1 (GLABROUS1) 56 A-PDF2a Sequência de promotor de Arabidopsis thaliana PDF2a (FATOR2a PROTODÉRMICO) 57 A-PDF2a Sequência de promotor de Arabidopsis

(TRUNCADO) thaliana PDF2a (FATOR2a PROTODÉRMICO) (TRUNCADO) 58 GM-PDF2a Sequência de promotor de Glycine max PDF2a (FATOR2a PROTODÉRMICO) 59 GM-PDF2a Sequência de promotor de Glycine max PDF2a (TRUNCADO) (FATOR2a PROTODÉRMICO) (TRUNCADO) 60 OS-PDF2 Sequência de promotor de Oryza sativa PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO) 61 OS-PDF2 Sequência de promotor de Oryza sativa PDF2 (TRUNCADO) (FATOR2 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO) 62 PT-PDF2 Sequência de promotor de Populus trichocarpa PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO) 63 PT-PDF2 Sequência de promotor de Populus trichocarpa (TRUNCADO) PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO) 64 VV-PDF2 Sequência de promotor de Vitis vinifera PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO) 65 VV-PDF2 Sequência de promotor de Vitis vinifera PDF2 (TRUNCADO) (FATOR2 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO) 66 ZM-PDF2 Sequência de promotor de Zea mays PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO) 67 SI-PDF2 Sequência de promotor de Setaria italica PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO) 68 SI-PDF2 Sequência de promotor de Setaria italica PDF2 (TRUNCADO) (FATOR2 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO) 69 VV-PDF2a Sequência de promotor de Vitis vinifera PDF2a (FATOR2a PROTODÉRMICO)

70 PT-PDF2a Sequência de promotor de Populus trichocarpa PDF2a (FATOR2a PROTODÉRMICO) 71 PT-PDF2a Sequência de promotor de Populus trichocarpa (TRUNCADO) PDF2a (FATOR2a PROTODÉRMICO) (TRUNCADO) 72 MT-PDF2 Sequência de promotor de Medicago trunculata PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO) 73 MT-PDF2 Sequência de promotor de Medicago (TRUNCADO) trunculata PDF2 (FATOR2 PROTODÉRMICO) (TRUNCADO) 74 A-HDG2 Sequência de promotor de Arabidopsis thaliana HDG2 (GLABROUS2 de HOMEODOMAIN) 75 GM-HDG2 Sequência de promotor de Glycine max HDG2 (GLABROUS2 de HOMEODOMAIN) 76 GM-HDG2 Sequência de promotor de Glycine max HDG2 (TRUNCADO) (GLABROUS2 de HOMEODOMAIN) (TRUNCADO) 77 SB-HDG2 Sequência de promotor de Sorghum bicolor HDG2 (GLABROUS2 de HOMEODOMAIN) 78 SB-HDG2 Sequência de promotor de Sorghum bicolor (TRUNCADO) HDG2 (GLABROUS2 de HOMEODOMAIN) (TRUNCADO) 79 A-CER6 Sequência de promotor de Arabidopsis thaliana CER6 (ECERIFERUM6) 80 A-CER60 Sequência de promotor de Arabidopsis thaliana CER60 (ECERIFERUM60)

81 A-CER60 Sequência de promotor de Arabidopsis (TRUNCADO) thaliana CER60 (ECERIFERUM60) (TRUNCADO) 82 GM-CER6 Sequência de promotor de Glycine max CER6 (ECERIFERUM6) 83 GM-CER6 Sequência de promotor de Glycine max CER6 (TRUNCADO) (ECERIFERUM6) (TRUNCADO) 84 PT-CER6 Sequência de promotor de Populus trichocarpa CER6 (ECERIFERUM6) 85 PT-CER6 Sequência de promotor de Populus trichocarpa (TRUNCADO) CER6 (ECERIFERUM6) (TRUNCADO) 86 VV-CER6 Sequência de promotor de Vitis vinifera CER6 (ECERIFERUM6) 87 VV-CER6 Sequência de promotor de Vitis vinifera CER6 (TRUNCADO) (ECERIFERUM6) (TRUNCADO) 88 SB-CER6 Sequência de promotor de Sorghum bicolor CER6 (ECERIFERUM6) 89 ZM-CER6 Sequência de promotor de Zea mays CER6 (ECERIFERUM6) 90 SI-CER6 sequência de promotor de Setaria italica CER6 (ECERIFERUM6) 91 SI-CER6 sequência de promotor de Setaria italica CER6 (TRUNCADO) (ECERIFERUM6) (TRUNCADO) 92 OS-CER6 sequência de promotor de Oryza sativa CER6 (ECERIFERUM6) 93 OS-CER6 sequência de promotor de Oryza sativa CER6 (TRUNCADO) (ECERIFERUM6) (TRUNCADO)

94 GM-HBSTART2 Sequência de promotor de Glycine max HBSTART2 (transfer2 de lipídio relacionado a Homeodomain) 95 GM-MATE1 Sequência de promotor de Glycine max MATE1 (proteína1 de extrusão multi- antimicrobiana ) 96 GM-NED1 Sequência de promotor de Glycine max NED1 (epimerase/desidratase1 dependente de NAD) 97 GM-LTP3 Sequência de promotor de Glycine max LTP3 (Proteína3 de Transferência de Lipídio) 98 SB-GL1 Sequência de promotor de Sorghum bicolor GL1 (GLABROUS1) 99 OS-GL1 Sequência de promotor de Oryza sativa GL1 (GLABROUS1) 100 A-GL1 Sequência de promotor de Arabidopsis thaliana GL1 (GLABROUS1) 101 GM-GL1 Sequência de promotor de Glycine max GL1 (GLABROUS1) 102 A-ANL1 Sequência de promotor de Arabidopsis thaliana ANL1 (ANTHOCYANLESS1) 103 ZM-OCL1 Sequência de promotor de Zea mays OCL1 (CAMADA CELULAR EXTERNA1) 104 OS-OCL1 Sequência de promotor de Oryza sativa OCL1 (CAMADA CELULAR EXTERNA1)

[00170] Conforme usado no presente documento, o termo "elemento regulador" também se refere a uma sequência de DNA, normalmente, porém nem sempre, a montante (5') da sequência codificante de um gene estrutural, que inclui sequências que controlam a expressão da região codificante fornecendo-se o reconhecimento para RNA polimerase e/ou outros fatores necessários para que a transcrição se inicie em um local particular. Um exemplo de um elemento regulador que fornece o reconhecimento para RNA polimerase ou outros fatores transcricionais para assegurar a iniciação em um local particular é um elemento promotor. Um elemento promotor compreende um elemento promotor nuclear, responsável pela iniciação de transcrição, assim como outros elementos reguladores que modificam a expressão genética. Deve ser entendido que as sequências de nucleotídeos, localizadas dentro de íntrons ou 3’ da sequência de região codificante também podem contribuir com a regulação de expressão de uma região codificante de interesse. Os exemplos de íntrons adequados incluem, mas sem limitação, o íntron IVS6 de maís ou o íntron de actina de maís. Um elemento regulador também pode incluir aqueles elementos localizados a jusante (3') do local de iniciação de transcrição ou dentro de regiões transcritas, ou ambos. No contexto dos métodos da presente revelação um elemento regulador pós-transcricional pode incluir elementos que são ativos depois da iniciação de transcrição, por exemplo, intensificadores traducionais e transcricionais, repressores traducionais e transcricionais e determinantes de estabilidade de mRNA.

[00171] Uma "sequência de nucleotídeos heteróloga", "polinucleotídeo heterólogo de interesse", "polinucleotídeo heterólogo" ou "gene de traço heterólogo", como usado ao longo da revelação, é uma sequência que não ocorre naturalmente com um promotor ou operacionalmente ligada ao mesmo. Embora esta sequência de nucleotídeos ou gene de traço seja heteróloga à sequência do promotor, a mesma pode ser homóloga ou nativa ou heteróloga ou estranha à planta hospedeira. Da mesma forma, a sequência de promotores pode ser homóloga ou nativa ou heteróloga ou estranha ao hospedeiro vegetal e/ou ao polinucleotídeo de interesse.

[00172] Os construtos de DNA/cassetes de expressão úteis nos métodos da revelação também podem incluir outros intensificadores, seja de tradução ou de transcrição, como possa ser necessário. Essas regiões intensificadoras são bastante conhecidas pelas pessoas versadas na técnica, e podem incluir o códon de iniciação ATG e sequências adjacentes. O códon de iniciação precisa estar sintonizado com o quadro de leitura da sequência codificante para assegurar tradução da sequência inteira. Os sinais de controle de tradução e códons de iniciação podem ter uma variedade de origens, tanto naturais quanto sintéticas. Regiões de iniciação translacionais podem ser fornecidas a partir da fonte da região de iniciação transcricional, ou a partir do gene estrutural. A sequência também pode ser derivada do elemento regulador selecionado para expressar o gene, e pode ser especificamente modificada para aumentar a tradução do mRNA. É reconhecido que para aumentar os níveis de transcrição, intensificadores podem ser utilizados em combinação com regiões promotoras. É reconhecido que para aumentar os níveis de transcrição, intensificadores podem ser utilizados em combinação com regiões promotoras. Intensificadores são sequências de nucleotídeos que atuam para aumentar a expressão de uma região promotora. Intensificadores são conhecidos na técnica e incluem a região intensificadora SV40, o elemento intensificador 35S e semelhantes. Alguns intensificadores também são conhecidos por alterar modelos de expressão de promotor normais, por exemplo, fazendo- se com que um promotor seja expresso constitutivamente quando não se tem o intensificador, o mesmo promotor é expresso apenas em um tecido específico ou em poucos tecidos específicos. Intensificadores úteis nos métodos da revelação estão listados na Tabela 6 abaixo. Tabela 6.

SEQ ID Descrição NO: 142 Intensificador de CaMV35S (CAMV35S ENH) 143 Intensificador do Vírus do Mosaico Amarelo Cítrico (CYMV ENH) 144 Intensificador do Vírus das Estrias da Bananeira (BSV(AY) ENH) 145 Intensificador do Vírus do Mosaico de Figwort (INTENS FMV) 146 Intensificador do Vírus da estria Clorótica do Amendoim (INTENS PCSV) 147 Intensificador do Vírus do Mosaico de Mirabilis (INTENS MMV)

[00173] Geralmente, um "promotor fraco" significa um promotor que aciona a expressão de uma sequência de codificação em um nível baixo. Um "nível baixo" de expressão é destinado a significar expressão em níveis de cerca de 1/10.000 transcrições a cerca de 1/100.000 transcrições a cerca de 1/500.000 transcrições. Em contrapartida, um promotor forte aciona a expressão de uma sequência de codificação em um nível alto, ou em cerca de 1/10 transcrições a cerca de 1/100 transcrições a cerca de 1/1.000 transcrições.

[00174] É reconhecido que as sequências úteis nos métodos da revelação podem ser usadas com suas sequências de codificação nativas, resultando assim em uma mudança no fenótipo da planta transformada. Os genes morfogênicos e genes de interesse revelados no presente documento, bem como variantes e fragmentos dos mesmos, são úteis nos métodos da revelação para a manipulação genética de qualquer planta. O termo "operacionalmente ligado" significa que a transcrição ou tradução de uma sequência de nucleotídeos heterólogos está sob a influência de uma sequência de promotor.

[00175] Em um aspecto da revelação, os cassetes de expressão compreendem uma região de iniciação da transcrição ou variantes ou fragmentos da mesma, ligados operacionalmente a um gene morfogênico e/ou uma sequência de nucleotídeos heteróloga. Tais cassetes de expressão podem ser dotados de uma pluralidade de locais de restrição para inserção da sequência de nucleotídeos que deve estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. Os cassetes de expressão podem adicionalmente conter genes marcadores selecionáveis assim bem como regiões de terminação 3’.

[00176] Os cassetes de expressão podem incluir, na direção 5'-3 'de transcrição, uma região de iniciação transcricional (ou seja, um promotor, ou variante ou fragmento do mesmo), uma região de iniciação translacional , um gene morfogênico e/ou uma sequência de nucleotídeos heteróloga de interesse, uma região de terminação translacional e, opcionalmente, uma região de terminação transcricional funcional no organismo hospedeiro. As regiões reguladoras (ou seja, promotores, regiões reguladoras transcricionais e regiões de terminação translacionais), o gene morfogênico e/ou o polinucleotídeo de interesse útil nos métodos da revelação podem ser nativos/análogos à célula hospedeira ou entre si. Alternativamente, as regiões reguladoras, o gene morfogênico e/ou o polinucleotídeo de interesse podem ser heterólogos para a célula hospedeira ou entre si. Como usado no presente documento, "heterólogo" em referência a uma sequência é uma sequência que origina a partir de uma espécie estranha ou, se a partir da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma nativa em composição e/ou locus genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente da espécie da qual o polinucleotídeo foi derivado ou, se for de espécie igual/análogo, uma ou ambas são substancialmente modificadas de sua forma e/ou locus genômico original ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo operacionalmente ligado.

[00177] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com o gene morfogênico ligado operacionalmente e/ou pode ser nativa com a sequência de DNA operacionalmente ligada de interesse, pode ser nativa com a planta hospedeira ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, o gene morfogênico e/ou a sequência de DNA sendo expressa, a planta hospedeira ou qualquer combinação dos mesmos). As regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Também consultar Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141 a 144; Proudfoot (1991) Cell 64:671 a 674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141 a 149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1.261 a

1.272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151 a 158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7.891 a 7.903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9.627 a 9.639, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00178] O cassete de expressão que compreende um promotor operacionalmente ligado a um gene morfogênico e/ou de modo opcional adicionalmente ligado operacionalmente a uma sequência de nucleotídeo heterólogo, um polinucleotídeo heterólogo de interesse, um nucleotídeo de polinucleotídeo heterólogo, uma sequência de interesse ou um gene de traço, pode ser usado para transformar qualquer planta. Alternativamente, um polinucleotídeo heterólogo de interesse, um nucleotídeo polinucleotídico heterólogo, uma sequência de interesse ou um gene de traço ligado operacionalmente a um promotor pode estar em um cassete de expressão separado posicionado fora do DNA de transferência (T-DNA). Dessa maneira, plantas, células vegetais, tecido vegetal, semente, raiz geneticamente modificados e semelhantes podem ser obtidos. O cassete de expressão que compreende as sequências da presente revelação também pode conter pelo menos uma sequência de nucleotídeos adicional para um gene, sequência heteróloga de nucleotídeos, polinucleotídeo heterólogo de interesse ou polinucleotídeo heterólogo a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, a sequência (ou sequências) de nucleotídeos adicional pode ser fornecida em outro cassete de expressão.

[00179] Quando apropriado, as sequências de nucleotídeos/genes de traço cuja expressão deve estar sob o controle de uma sequência de promotor e qualquer sequência (ou sequências) de nucleotídeos adicional pode ser otimizada para expressão aumentada na planta transformada. Isto é, essas sequências de nucleotídeos podem ser sintetizadas com o uso de códons preferidos de planta para expressão melhorada. Consultar, por exemplo, Campbell e Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1 a 11, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência, para uma discussão sobre uso de códon preferencial de hospedeiro. Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferenciais para plantas. Consultar, por exemplo, documentos de Patente no U.S. 5.380.831, 5.436.391 e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477 a 498, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.

[00180] As modificações de sequência adicionais são conhecidas por intensificar a expressão de gene em um hospedeiro celular. Essas incluem eliminação de sequências codificantes de sinais de poliadenilação artificiais, sinais de local de divisão de éxon e íntron, repetições tipo transposão e outras tais sequências bastante caracterizadas que podem ser prejudiciais à expressão genética. O teor de G-C de uma sequência de nucleotídeos heteróloga pode ser ajustado para níveis médios para um dado hospedeiro celular, como calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias em grampo previstas.

[00181] Conforme usado no presente documento, "vetor" se refere a uma molécula de DNA, tal como um plasmídeo, cosmídeo ou fago bacteriano para introduzir um construto de nucleotídeo, por exemplo, um cassete de expressão, em uma célula hospedeira. Vetores de clonagem contêm tipicamente um, ou um pequeno número de locais de reconhecimento de endonuclease de restrição nos quais sequências de DNA estranhas podem ser inseridas de uma maneira determinável sem a perda de função biológica essencial do vetor, assim como um gene marcador que é adequado para uso na identificação e seleção de células transformadas com o vetor de clonagem. Genes marcadores incluem tipicamente genes que fornecem resistência à tetraciclina, resistência à higromicina ou resistência à ampicilina.

[00182] Células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas de acordo com modos convencionais. Consultar, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81 a 84, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. Essas plantas podem, então, ser cultivadas e polinizadas com a mesma cepa transformada ou diferentes cepas, e a progênie resultante que tem expressão da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e, então, as sementes colhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido atingida. Dessa maneira, a presente revelação fornece a semente transformada (também denominada "semente transgênica") que tem um construto de nucleotídeo útil nos métodos da revelação, por exemplo, um cassete de expressão útil nos métodos da revelação, incorporado de modo estável em seu genoma.

[00183] Há uma variedade de métodos para a regeneração de plantas a partir do tecido da planta. O método particular de regeneração dependerá do tecido de planta de partida e da espécie de planta particular a ser regenerada. A regeneração, o desenvolvimento e o cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplasto de planta únicos ou de vários explantes transformados são bem conhecidos na técnica (Weissbach e Weissbach, (1988) em: Methods for Plant Molecular Biology, (Edições), Academic Press, Inc., San Diego, Calif., incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência). Esse processo de regeneração e crescimento inclui, tipicamente, as etapas de seleção de células transformadas, cultivar aquelas células individualizadas através dos estágios normais de desenvolvimento embriônico através do estágio de plântula enraizada. Embriões transgênicos e sementes são similarmente regenerados. Os brotos transgênicos com raiz resultantes são, depois disso, plantados em um meio de crescimento de planta adequado, tal como o solo. De preferência, as plantas regeneradas são autopolinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas. De outro modo, o pólen obtido a partir das plantas regeneradas é cruzado com plantas cultivadas a partir da semente de linhagens agronomicamente importantes. De modo contrário, o pólen de plantas dessas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica produzida pelos métodos da revelação contendo um polinucleotídeo de interesse desejado é cultivada com o uso de métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00184] São conhecidos na técnica métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em uma localização específica no genoma da planta. A inserção do polinucleotídeo em uma localização genômica desejada é conseguida utilizando um sistema de recombinação sítio-específico. Consultar, por exemplo, os documentos no WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, em que todos esses estão incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Resumidamente, um polinucleotídeo de interesse, flanqueado por dois locais de recombinação não idênticos, pode estar contido em um cassete de transferência de T-DNA. O cassete de transferência de T-DNA é introduzido em uma planta que tem um local-alvo estavelmente incorporado em seu genoma, o qual é flanqueado por dois locais de recombinação não idênticos que correspondem aos locais do cassete de transferência. É fornecida uma recombinase apropriada e o cassete de transferência é integrado no sítio alvo. O polinucleotídeo de interesse é deste modo integrado em uma posição cromossômica específica no genoma da planta.

[00185] Os métodos revelados podem ser usados para introduzir em explantes polinucleotídeos que são úteis para atingir um local específico para modificação no genoma de uma planta derivada do explante. As modificações específicas para local que podem ser introduzidas com os métodos revelados incluem aquelas produzidas com o uso de qualquer método para introduzir modificações específicas para local, incluindo, porém, sem limitação, através do uso de oligonucleotídeos de reparo de gene (por exemplo, Publicação no U.S. 2013/0019349) ou através do uso de tecnologias de quebra de fita dupla, tais como TALENs, meganucleases, nucleases de dedo de zinco, CRISPR-Cas e similares. Por exemplo, os métodos revelados podem ser usados para introduzir um sistema CRISPR- Cas em uma célula vegetal ou planta, com o propósito de modificação de genoma de uma sequência-alvo no genoma de uma planta ou célula de planta, para selecionar plantas, para deletar uma base ou uma sequência, para edição de genes e para inserir um polinucleotídeo de interesse no genoma de uma planta ou célula vegetal. Assim, os métodos revelados podem ser usados juntamente com um sistema de CRISPR-Cas para fornecer um sistema eficaz para modificar ou alterar sítios-alvo e nucleotídeos de interesse dentro do genoma de uma planta, célula vegetal ou semente. O gene de endonuclease Cas é uma endonuclease Cas9 otimizada vegetal, sendo que a endonuclease Cas9 otimizada vegetal tem capacidade para se ligar a e criar uma quebra de fita dupla em uma sequência-alvo genômica do genoma vegetal.

[00186] A endonuclease Cas é guiada pelo nucleotídeo- guia para reconhecer e, opcionalmente, introduzir uma quebra de fita dupla em um sítio-alvo específico no genoma de uma célula. O sistema de CRISPR-Cas fornece um sistema eficaz para modificar sítios-alvo dentro do genoma de uma planta, célula vegetal ou semente. São adicionalmente fornecidos métodos que empregam um sistema de polinucleotídeo- guia/endonuclease Cas para fornecer um sistema eficaz para modificar sítios-alvo dentro do genoma de uma célula e para editar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula. Uma vez que um sítio-alvo genômico é identificado, uma variedade de métodos pode ser empregada para modificar adicionalmente os sítios-alvo de modo que os mesmos contenham uma variedade de polinucleotídeos de interesse. Os métodos revelados podem ser usados para introduzir um sistema de CRISPR-Cas para editar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula. A sequência de nucleotídeos a ser editada (a sequência de nucleotídeos de interesse) pode estar localizada dentro ou fora de um sítio-alvo que é reconhecido por uma endonuclease Cas.

[00187] Os loci CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas) (também conhecidos como Repetições Diretas Interespaçadas SPIDRs--SPacer) constituem uma família de loci de DNA recentemente descrita. Os loci de CRISPR consistem em repetições de DNA curtas e altamente conservadas (tipicamente 24 a 40 pb, repetidas de 1 a 140 vezes-também denominadas repetições CRISPR) que são parcialmente palindrômicas. As sequências repetidas (usualmente específicas para uma espécie) são interespaçadas por sequências variáveis de comprimento constante (tipicamente 20 a 58 dependendo do lócus de CRISPR (WO2007/025097 publicado em 1 de março de 2007).

[00188] Os loci de CRISPR foram reconhecidos primeiro em E. coli (Ishino et al. (1987) J. Bacterial. 169:5429 a 5433; Nakata et al. (1989) J. Bacterial. 171 :3.553 a 3.556). As repetições de sequência curtas interespaçadas similares foram identificadas em Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena, e Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al. (1993) Mol. Microbiol. 10:1057 a 1065; Hoe et al. (1999) Emerg. Infect. Dis. 5:254 a 263; Masepohl et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:26 a 30; Mojica et al. (1995) Mol. Microbiol. 17:85 a 93). Os loci de CRISPR diferem de outros SSRs pela estrutura das repetições, as quais foram denominadas repetições espaçadas regularmente curtas (SRSRs) (Janssen et al. (2002) OMICS J. Integ. Biol. 6:23 a 33; Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244 a 246). As repetições são elementos curtos que ocorrem em agrupamentos que são sempre regularmente espaçados por sequências variáveis de comprimento constante (Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244 a 246).

[00189] O gene Cas inclui um gene que é geralmente acoplado, associado ou que está próximo ou na vizinhança de loci de CRISPR flanqueadoras. Os termos "gene Cas" e "gene associado a CRISPR (Cas)" são usados de forma intercambiável no presente documento. Uma revisão compreensiva da família de proteínas Cas é apresentada em Haft et al. (2005) Computational Biology, PLoS Comput Biol 1(6): e60. doi:10.1371/journal.pcbi.0010060.

[00190] Além das quatro famílias de genes inicialmente descritas, 41 famílias de genes associados a CRISPR (Cas) adicionais foram descritas na Publicação do Pedido de Patente no U.S. 2015/0059010, que é incorporado no presente documento a título de referência. Essa referência mostra que os sistemas de CRISPR pertencem às classes diferentes, com diferentes padrões de repetição, conjuntos de genes e gamas de espécies. O número de genes Cas em um dado locus de CRISPR pode variar entre espécies. A endonuclease Cas se refere a uma proteína Cas codificada por um gene Cas, em que a proteína Cas tem capacidade de introduzir uma ruptura de filamento duplo em uma sequência alvo de DNA. A endonuclease Cas é orientada pelo polinucleotídeo-guia para reconhecer e, opcionalmente, introduzir uma ruptura de filamento duplo em um sítio-alvo específico no genoma de uma célula. Conforme usado no presente documento, o termo “sistema de polinucleotídeo-guia/endonuclease Cas” inclui um complexo de uma endonuclease Cas e um polinucleotídeo-guia que tem capacidade de introduzir uma quebra de fita dupla em uma sequência-alvo de DNA. A endonuclease Cas desenrola o dúplex de DNA em estreita proximidade do sítio alvo genômico e cliva ambos os filamentos de DNA após o reconhecimento de uma sequência alvo por um nucleotídeo guia, mas apenas se o motivo adjacente ao protoespaçador correto (PAM) estiver aproximadamente orientado na extremidade 3' da sequência alvo (consultar a Figura 2A e a Figura 2B da Publicação de Pedido de Patente no U.S.

2015/0059010).

[00191] Em um aspecto, o gene de endonuclease Cas é uma endonuclease Cas9, tal como, porém, sem limitação, os genes Cas9 listados nas SEQ ID NOs: 462, 474, 489, 494, 499, 505 e 518 do documento nº WO2007/025097, publicado em 1 de março de 2007, e incorporado ao presente documento a título de referência. Em outro aspecto, o gene de endonuclease Cas é endonuclease Cas9 otimizada de planta, maís ou soja, tal como, porém, sem limitação, aquelas mostradas na Figura 1A da Publicação do Pedido de Patente no U.S. 2015/0059010.

[00192] Em outro aspecto, o gene de endonuclease Cas é ligado de modo operacional a um sinal de direcionamento nuclear de SV40 a montante da região de códon de Cas e um sinal de localização nuclear de VirD2 bipartido (Tinland et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:7.442 a

7.446) a jusante da região de códon de Cas.

[00193] Em um aspecto, o gene de endonuclease Cas é um gene de endonuclease Cas9 da SEQ ID NO:1, 124, 212, 213, 214, 215, 216, 193 ou nucleotídeos 2.037 a 6.329 da SEQ ID NO:5, ou qualquer fragmento funcional ou variante do mesmo, da Publicação do Pedido de Patente no U.S. 2015/0059010.

[00194] Conforme relacionado à endonuclease Cas, os termos "fragmento funcional", "fragmento que é funcionalmente equivalente" e “fragmento funcionalmente equivalente" são usados de modo intercambiável no presente documento. Esses termos se referem a uma porção ou subsequência da sequência de endonuclease Cas em que a capacidade para criar uma quebra de fita dupla é mantida.

[00195] Conforme relacionado à endonuclease Cas, os termos "variante funcional", "variante que é funcionalmente equivalente" e “variante funcionalmente equivalente" são usados de modo intercambiável no presente documento. Esses termos se referem a uma variante da endonuclease Cas em que a capacidade para criar uma quebra de filamento duplo é mantida. Os fragmentos e as variantes podem ser obtidos por meio de métodos, tais como mutagênese dirigida a sítios e construção sintética.

[00196] Em um aspecto, o gene de endonuclease Cas é um gene Cas9 de Streptococcus pyogenes otimizado por códon vegetal que pode reconhecer qualquer sequência genômica da forma N(12-30)NGG que pode, a princípio, ser direcionado.

[00197] Endonucleases são enzimas que clivam a ligação de fosfodiéster dentro de uma cadeia de polinucleotídeo, e incluem endonucleases de restrição que clivam DNA em locais especiais sem danificar as bases. As endonucleases de restrição incluem endonucleases do Tipo I, Tipo II, Tipo III e Tipo IV, que incluem, ainda, subtipos. Nos sistemas do Tipo I e Tipo III, as atividades tanto de metilase quanto de restrição estão contidas em um complexo único. Endonucleases também incluem meganucleases, também conhecidas como endonucleases de alojamento (HEases), que, assim como endonucleases de restrição, se ligam e cortam em um local de reconhecimento específico, no entanto, os locais de reconhecimento para meganucleases são tipicamente mais longos, cerca de 18 bp ou mais (Pedido de Patente PCT/U.S. 12/30061 depositado em 22 de março de 2012). As meganucleases foram classificadas em quatro famílias com base em motivos de sequência conservados, as famílias são as famílias de LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H e His-Cys box. Esses motivos participam da coordenação de íons metálicos e hidrólise de ligações fosfodiéster. As meganucleases são notáveis por seus longos sítios de reconhecimento e por tolerarem alguns polimorfismos de sequência nos seus substratos de DNA. A convenção de nomenclatura para meganucleases é similar à convenção para outras endonucleases de restrição. As meganucleases também são caracterizadas pelo prefixo F-, I- ou PI- para enzimas codificadas por ORFs, íntrons e inteínas independentes, respectivamente. Uma etapa no processo de recombinação envolve uma clivagem polinucleotídica no, ou próximo ao, sítio de reconhecimento. Essa atividade de clivagem pode ser usada para produzir uma ruptura de filamento duplo. Para revisões de recombinases específicas para sítios e seus sítios de reconhecimento, consulte, Sauer (1994) Curr Op Biotechnol 5:521 a 527; e Sadowski (1993) FASEB 7:760 a

767. Em alguns exemplos, a recombinase é das famílias Integrase ou Resolvase. As nucleases efetoras TAL são uma nova classe de nucleases específicas para sequências que podem ser usadas para realizar quebras de fita dupla em sequências-alvo específicas no genoma de uma planta ou outro organismo (Miller, et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148.) As nucleases de dedo de zinco (ZFN) são agentes de indução de quebra de fita dupla modificados compreendidos por um domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco e um domínio de agente de indução de quebra de fita dupla. A especificidade de sítio de reconhecimento é conferida pelo domínio de dedo de zinco, que compreende, tipicamente, dois, três ou quatro dedos de zinco, por exemplo, que tem uma estrutura C2H2, no entanto, outras estruturas de dedo de zinco são conhecidas e foram modificadas. Os domínios de dedo de zinco são propícios para projetar polipeptídeos que se ligam especificamente a uma sequência de reconhecimento de polinucleotídeo selecionada. ZFN incluem um domínio de dedo de zinco de ligação a DNA manipulado ligado a um domínio de endonuclease não específico, por exemplo, domínio de nuclease de uma endonuclease Tipo Ms, como Fokl. Funcionalidades adicionais podem ser fundidas ao domínio de ligação de dedo de zinco, incluindo domínios ativadores da transcrição, domínios repressores da transcrição e metilases. Em alguns exemplos, a dimerização do domínio de nuclease é exigida para a atividade de clivagem.

Cada dedo de zinco reconhece três pares de base consecutivos no DNA- alvo. Por exemplo, um domínio de 3 dedos reconheceu uma sequência de 9 nucleotídeos contíguos, com uma exigência de dimerização da nuclease, dois conjuntos de tripletos de dedo de zinco são usados para ligar uma sequência de reconhecimento de 18 nucleotídeos.

[00198] Um "Dead-CAS9" (dCAS9), como usado no presente documento, é usado para fornecer um domínio repressor transcricional. O dCAS9 foi mutado de forma que não pode mais cortar o DNA. O dCAS0 pode ainda se ligar quando guiado a uma sequência pelo gRNA e também pode ser fundido a elementos repressores (consultar Gilbert et al., Cell 18 de julho de 2013; 154 (2): 442 a 451, Kiani et al., novembro de 2015 Nature Methods Vol.12 No.11: 1051-1054). O dCAS9 fundido ao elemento repressor, como descrito no presente documento, é abreviado para dCAS9~REP, onde o elemento repressor (REP) pode ser qualquer um dos motivos repressores conhecidos que foram caracterizados em plantas (consultar Kagale e Rozxadowski, 20010 Plant Signaling & Behavior 5:6, 691 a 694 para revisão). Um RNA guia expresso (gRNA) se liga à proteína dCAS9~REP e visa a ligação da proteína de fusão dCAS9-REP a uma sequência de nucleotídeos predeterminada específica dentro de um promotor (um promotor dentro do T-DNA). Por exemplo, se esse for expresso além da fronteira com o uso de um cassete ZM-UBI PRO::dCAS9~REP::TERM PINII junto com um cassete U6-POL PRO::gRNA::U6 TERM e o gRNA é projetado para guiar a proteína dCAS9- REP para se ligar ao promotor SB-UBI no cassete de expressão SB-UBI PRO::moPAT::TERM PINII dentro do T-DNA, qualquer evento que tenha integrado a sequência além da fronteira seria sensível a bialafos. Os eventos transgênicos que integram apenas o T-DNA expressariam moPAT e seriam resistentes a bialafos. A vantagem de usar uma proteína dCAS9 fundida a um repressor (em oposição a um TETR ou ESR) é a capacidade de direcionar esses repressores a qualquer promotor dentro do T-DNA. TETR e ESR são restritos a sequências de ligação de operador cognato. Alternativamente, uma nuclease de dedo de zinco sintética fundida a um domínio repressor pode ser usada no lugar do gRNA e dCAS9~REP (Urritia et al., 2003, Genome Biol. 4:231) como descrito acima.

[00199] As bactérias e arqueias evoluíram defesas imunoadaptativas denominadas sistemas de repetições palindrômicas curtas, agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR)/associados a CRISPR (Cas) que usam RNA curto para direcionar a degradação de ácidos nucleicos estranhos (WO2007/025097, publicado em 1 de março de 2007). O sistema CRISPR tipo II/Cas de bactérias emprega um crRNA e tracrRNA para orientar a endonuclease Cas para o seu alvo de DNA. O crRNA (CRISPR RNA) contém a região complementar a uma fita do DNA-alvo de fita dupla e pares de base com o tracrRNA (CRISPR RNA de transativação) que formam um duplex de RNA que orienta a endonuclease Cas a clivar o DNA-alvo.

[00200] Conforme usado no presente documento, o termo “nucleotídeo-guia" refere-se a uma fusão sintética de duas moléculas de RNA, um crRNA (RNA de CRISPR) que compreende um domínio de direcionamento variável e um tracrRNA. Em um aspecto, o nucleotídeo-guia compreende um domínio de direcionamento variável de 12 a 30 sequências de nucleotídeos e um fragmento de RNA que pode interagir com uma endonuclease Cas.

[00201] Conforme usado no presente documento, o termo "polinucleotídeo-guia" se refere a uma sequência de polinucleotídeos que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas e permite que a endonuclease Cas reconheça e, opcionalmente, clive um local-alvo de DNA.

O polinucleotídeo-guia pode ser uma molécula simples ou uma molécula dupla. A sequência polinucleotídica-guia pode ser uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma combinação das mesmas (uma sequência de combinação de RNA-DNA). Opcionalmente, o polinucleotídeo-guia pode compreender pelo menos um nucleotídeo, ligação fosfodiéster ou modificação de ligação, tal como, mas sem limitação, Ácido Nucleico Bloqueado (LNA, do inglês “Locked Nucleic Acid”), 5-metil dC, 2,6- Diaminopurina, 2’-Fluoro A, 2’-Fluoro U, 2’-O-Metil RNA, ligação fosforotioato, ligação a uma molécula de colesterol, ligação a uma molécula de polietilenoglicol, ligação a uma molécula de espaçador 18 (cadeia de hexaetilenoglicol), ou ligação covalente 5’ para 3’ que resulta em circularização. Um polinucleotídeo-guia que compreende somente ácidos ribonucleicos também é denominado “nucleotídeo-guia".

[00202] O polinucleotídeo-guia pode ser uma molécula dupla (também denominada dúplex de polinucleotídeo-guia) que compreende um primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (denominado domínio de Direcionamento Variável ou domínio de VT) que é complementar a uma sequência de nucleotídeos em um DNA-alvo e um segundo domínio de sequência de nucleotídeos (denominado domínio de reconhecimento de endonuclease Cas ou domínio de CER) que interage com um polipeptídeo de endonuclease Cas. O domínio de CER do polinucleotídeo-guia de molécula dupla compreende duas moléculas separadas que são hibridadas ao longo de uma região de complementariedade. As duas moléculas separadas podem ser RNA, DNA e/ou sequências de combinação de RNA-DNA. Em um aspecto, a primeira molécula do polinucleotídeo-guia dúplex que compreende um domínio de VT ligado a um domínio de CER é denominada "crDNA" (quando composta por um trecho contíguo de nucleotídeos de DNA) ou "crRNA" (quando composta por um trecho contíguo de nucleotídeos de RNA) ou "crDNA-RNA" (quando composta por uma combinação de nucleotídeos de DNA e RNA). O crNucleotídeo pode compreender um fragmento do cRNA de ocorrência natural em Bactérias e Archaea. Em um aspecto, o tamanho do fragmento do cRNA de ocorrência natural em Bactérias e Arqueas que está presente em um crNucleotídeo revelado no presente documento pode variar de, mas sem limitação, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos.

[00203] Em um aspecto, a segunda molécula do polinucleotídeo-guia dúplex que compreende um domínio de CER é referida como "tracrRNA" (quando composta por uma extensão contígua de nucleotídeos de RNA) ou "tracrDNA" (quando composta por uma extensão contígua de nucleotídeos de DNA) ou "tracrDNA-RNA" (quando composta por uma combinação de nucleotídeos de DNA e RNA). Em um aspecto, o RNA que guia o complexo de RNA e endonuclease Cas9 é um RNA dúplex que compreende um dúplex de crRNA e tracrRNA.

[00204] O polinucleotídeo-guia também pode ser uma molécula única que compreende um primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (denominado domínio de Direcionamento Variável ou domínio de VT) que é complementar a uma sequência de nucleotídeos em um DNA- alvo e um segundo domínio de nucleotídeos (denominado domínio de reconhecimento de endonuclease Cas ou domínio de CER) que interage com um polipeptídeo de endonuclease Cas. Por “domínio” entende-se uma extensão contígua de nucleotídeos que pode ser uma sequência de RNA, DNA e/ou combinação de RNA-DNA. O domínio VT e/ou o domínio de CER de um polinucleotídeo-guia único pode compreender uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma sequência de combinação de RNA- DNA. Em um aspecto, o polinucleotídeo-guia único compreende um crNucleotídeo (que compreende um domínio VT ligado a um domínio de CER) ligado a um tracrNucleotídeo (que compreende um domínio de CER), em que a ligação é uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência de RNA, uma sequência de DNA, ou uma sequência de combinação de RNA-DNA. O polinucleotídeo-guia único que é compreendido por sequências do crNucleotídeo e tracrNucleotídeo pode ser denominado "nucleotídeo-guia único" (quando composto por um trecho contíguo de nucleotídeos de RNA) ou "DNA-guia único" (quando composto por um trecho contíguo de nucleotídeos de DNA) ou “DNA-nucleotídeo-guia único" (quando composto por uma combinação de nucleotídeos de RNA e DNA). Em um aspecto da revelação, o nucleotídeo-guia único compreende um cRNA ou fragmento de cRNA e um tracrRNA ou fragmento de tracrRNA do sistema CRISPR/Cas do tipo II que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas tipo II, em que o complexo de nucleotídeo-guia e endonuclease Cas pode direcionar a endonuclease Cas a um sítio-alvo genômico de planta, que possibilita que a endonuclease Cas introduza uma quebra de fita dupla no sítio-alvo genômico. Um aspecto do uso de um polinucleotídeo-guia único versus um polinucleotídeo-guia dúplex é que apenas um cassete de expressão precisa de ser preparado para expressar o polinucleotídeo-guia único.

[00205] O termo “domínio de direcionamento variável" ou "domínio de VT" é usado de modo intercambiável no presente documento e inclui uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma fita (sequência de nucleotídeos) de um sítio-alvo de DNA de fita dupla. A % de complementação entre o primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (domínio VT) e a sequência-alvo pode ser pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%,

80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. O domínio-alvo variável pode ter pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento. Em um aspecto, o domínio de direcionamento variável compreende uma extensão contígua de 12 a 30 nucleotídeos. O domínio de direcionamento variável pode ser composto por uma sequência de DNA, uma sequência de RNA, uma sequência de DNA modificada, uma sequência de RNA modificada ou qualquer combinação das mesmas.

[00206] O termo "domínio de reconhecimento de endonuclease Cas" ou "domínio de CER" de um polinucleotídeo guia é usado de modo intercambiável no presente documento e inclui uma sequência de nucleotídeos (como um segundo domínio de sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo guia), que interage com um polipeptídeo de endonuclease Cas. O domínio de CER pode ser composto por uma sequência de DNA, uma sequência de RNA, uma sequência de DNA modificada, uma sequência de RNA modificada (consultar, por exemplo, as modificações descritas no presente documento) ou qualquer combinação das mesmas.

[00207] A sequência nucleotídica que liga o crNucleotídeo e o tracrNucleotídeo de um polinucleotídeo-guia único pode compreender uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma sequência de combinação de RNA-DNA. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que liga o crNucleotídeo e o tracrNucleotídeo de um polinucleotídeo-guia único pode ter pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 78,

79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 nucleotídeos de comprimento. Em outro aspecto, a sequência nucleotídica que liga o crNucleotídeo e o tracrNucleotídeo de um polinucleotídeo-guia único pode compreender uma sequência de tetralaço, tal como, porém, sem limitação, uma sequência de tetralaço GAAA.

[00208] A modificação de sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo-guia, do domínio de VT e/ou do domínio de CER pode ser selecionada, mas sem limitação, dentre o grupo que consiste em um cap 5’, uma cauda poliadenilada de 3’, uma sequência de riboswitch, uma sequência de controle de estabilidade, uma sequência que forma um duplex de dsRNA, uma modificação ou sequência que direciona o polinucleotídeo-guia para uma localização subcelular, uma modificação ou sequência que fornece rastreamento, uma modificação ou sequência que fornece um local de ligação para proteínas, um Ácido Nucleico Bloqueado (LNA), um nucleotídeo 5-metil dC, um nucleotídeo 2.6-Diaminopurina, um nucleotídeo 2’-Flúor A, um nucleotídeo 2’-Flúor U; um nucleotídeo de RNA 2’-O-Metil, uma ligação fosforotioato, uma ligação a uma molécula de colesterol, uma ligação a uma molécula de polietilenoglicol, uma ligação a uma molécula de espaçador 18, uma ligação covalente 5’ a 3’ ou qualquer combinação das mesmas. Essas modificações podem resultar em pelo menos um recurso benéfico adicional, em que o recurso benéfico adicional é selecionado dentre o grupo de uma estabilidade modificada ou regulada, um direcionamento subcelular, rastreamento, uma identificação fluorescente, um local de ligação para uma proteína ou complexo de proteína, afinidade de ligação modificada a uma sequência-alvo complementar, resistência modificada à degradação celular e permeabilidade celular aumentada.

[00209] Em um aspecto, o nucleotídeo-guia e a endonuclease Cas têm capacidade para formar um complexo que permite que a endonuclease Cas introduza uma quebra de fita dupla em um local- alvo de DNA.

[00210] Em um aspecto da revelação, o domínio-alvo variável tem 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos em comprimento.

[00211] Em um aspecto da revelação, o nucleotídeo-guia compreende um fragmento de cRNA ou cRNA e um fragmento de tracrRNA ou tracrRNA do sistema CRISPR/Cas tipo II que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas tipo II, em que o complexo de nucleotídeo-guia e endonuclease Cas pode direcionar a endonuclease Cas para um sítio-alvo genômico da planta, possibilitando que a endonuclease Cas introduza uma ruptura de filamento duplo no sítio-alvo genômico. O nucleotídeo-guia pode ser introduzido em uma planta ou célula vegetal diretamente com o uso de qualquer método conhecido na técnica, tal como, porém, sem limitação, bombardeio de partículas ou aplicações tópicas.

[00212] Em um aspecto, o nucleotídeo-guia pode ser introduzido indiretamente introduzindo-se uma molécula de DNA recombinante que compreende a sequência de DNA-guia correspondente operavelmente ligada a um promotor específico para plantas que tem capacidade para transcrever o nucleotídeo-guia na célula vegetal. O termo “DNA-guia correspondente” inclui uma molécula de DNA que é idêntica à molécula de RNA, mas tem um “T” substituído para cada “U” da molécula de RNA.

[00213] Em um aspecto, o nucleotídeo-guia é introduzido por meio de bombardeamento de partículas ou com o uso dos métodos revelados para transformação mediada por Agrobacterium de um construto de DNA recombinante que compreende o DNA-guia correspondente operavelmente ligado a um promotor de U6 polimerase III de plantas.

[00214] Em um aspecto, o RNA que guia o complexo de RNA/endonuclease Cas9 é um RNA duplexado que compreende um crRNA- tracrRNA duplex. Uma vantagem do uso de um nucleotídeo-guia versus um crRNA-tracrRNA duplexado é que somente um cassete de expressão precisa ser produzido para expressar o nucleotídeo-guia fundido.

[00215] Os termos “local-alvo”, “sequência-alvo”, “DNA- alvo”, “locus-alvo”, “local-alvo genômico”, “sequência-alvo genômica” e “locus-alvo genômico” são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência de polinucleotídeos no genoma (incluindo DNA cloroplástico e mitocondrial) de uma célula vegetal na qual uma ruptura de fita dupla é induzida no genoma de célula vegetal por uma endonuclease Cas. O local-alvo pode ser um local endógeno no genoma de planta ou, alternativamente, o local-alvo pode ser heterólogo à planta e, assim, não ser de ocorrência natural no genoma, ou o local-alvo pode ser encontrado em uma localização genômica heteróloga em comparação ao local que a mesma ocorre na natureza.

[00216] Conforme usados no presente documento, os termos “sequência-alvo endógena” e “sequência-alvo nativa” são usados de modo intercambiável no presente documento e referem-se a uma sequência- alvo que é endógena ou nativa do genoma de uma planta e está na posição endógena ou nativa dessa sequência-alvo no genoma da planta. Em um aspecto, o sítio alvo pode ser semelhante a um sítio de reconhecimento de DNA ou sítio alvo que é especificamente reconhecido e/ou ligado por um agente de indução de quebra de fita dupla, como uma endonuclease LIG3-4 (Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2009/0133152) ou uma meganuclease MS26++ (Publicação do Pedido de Patente no U.S. 2014/0020131).

[00217] Um “sítio-alvo artificial” ou uma “sequência-alvo artificial” são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência-alvo que foi introduzida no genoma de uma planta. Tal sequência-alvo artificial pode ter sequência idêntica a uma sequência- alvo endógena ou nativa no genoma de uma planta, mas estar localizada em uma posição diferente (isto é, uma posição não endógena ou não nativa) no genoma de uma planta.

[00218] Um "sítio-alvo alterado", "sequência-alvo alterada", "sítio-alvo modificado" e "sequência-alvo modificada" são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência-alvo conforme revelada no presente documento que compreende pelo menos uma alteração em comparação com sequência-alvo não alterada. Tais "alterações" incluem, por exemplo: (i) substituição de pelo menos um nucleotídeo, (ii) uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, (iii) uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii).

[00219] Em um aspecto, os métodos revelados podem ser usados para introduzir em plantas polinucleotídeos úteis para supressão de gene de um gene-alvo em uma planta. A redução da atividade de genes específicos (também conhecidos como silenciamento de gene ou supressão de gene) é desejável por diversos aspectos de engenharia genética em plantas. Muitas técnicas para silenciamento de gene são bem conhecidas por aqueles versados na técnica, incluindo, porém, sem limitação, tecnologia antissenso (consultar, por exemplo, Sheehy et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8.805 a 8.809; e Patentes nos U.S. 5.107.065; 5.453.566; e

5.759.829); cossupressão (por exemplo, Taylor (1997) Plant Cell 9:1.245; Jorgensen (1990) Trends Biotech. 8(12):340 a 344; Flavell (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3.490 a 3.496; Finnegan et al. (1994) Bio/Technology 12: 883 a 888; e Neuhuber et al. (1994) Mol. Gen. Genet. 244:230 a 241);

interferência de RNA (Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279 a 289; Patente no U.S. 5.034.323; Sharp (1999) Genes Dev. 13:139 a 141; Zamore et al. (2000) Cell 101:25 a 33; Javier (2003) Nature 425:257 a 263; e Montgomery et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15.502 a 15.507), silenciamento de gene induzido por vírus (Burton, et al. (2000) Plant Cell 12:691 a 705; e Baulcombe (1999) Curr. Op. Plant Bio. 2:109 a 113); ribozimas específica para RNA-alvo (Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585 a 591); estruturas em forma de grampo (Smith et al. (2000) Nature 407:319 a 320; WO 99/53050; WO 02/00904; e WO 98/53083); ribozimas (Steinecke et al. (1992) EMBO J. 11:1.525; Patente no U.S. 4.987.071; e Perriman et al. (1993) Antisense Res. Dev. 3:253); modificação direcionada mediada por oligonucleotídeo (por exemplo, documentos WO 03/076574 e WO 99/25853); moléculas direcionadas por dedo de Zn (por exemplo, documentos WO 01/52620; WO 03/048345; e WO 00/42219); micro RNAs artificiais (US8106180; Schwab et al. (2006) Plant Cell 18:1.121 a 1.133); e outros métodos ou combinações dos métodos acima conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00220] Em um aspecto, os métodos revelados podem ser usados para introduzir em plantas polinucleotídeos úteis para a integração direcionada de sequências de nucleotídeos em uma planta. Por exemplo, os métodos revelados podem ser usados para introduzir cassetes de expressão de T-DNA que compreendem sequências de nucleotídeos de interesse flanqueadas por sítios de recombinação não idênticos que são usados para transformar uma planta que compreende um sítio-alvo. Em um aspecto, o sítio-alvo contém pelo menos um conjunto de sítios de recombinação não idênticos que correspondem àqueles no cassete de expressão de T-DNA. A troca das sequências de nucleotídeos flanqueadas pelos sítios de recombinação é efetuada por uma recombinase. Desse modo, os métodos revelados podem ser usados para a introdução de cassetes de expressão de

T-DNA para integração direcionada de sequências de nucleotídeos, em que os cassetes de expressão de T-DNA que são flanqueados por sítios de recombinação não idênticos reconhecidos por uma recombinase que reconhece e implanta a recombinação nos sítios de recombinação não idênticos. Consequentemente, os métodos revelados podem ser usados para aprimorar a eficácia e a velocidade de desenvolvimento de plantas contendo sítios de recombinação não idênticos.

[00221] Assim, os métodos revelados podem compreender adicionalmente métodos para a integração direcionada e direcional de nucleotídeos exógenos em uma planta transformada. Em um aspecto, os métodos revelados usam sítios de recombinação novos em um sistema de direcionamento de gene que facilita o direcionamento direcional de genes e sequências de nucleotídeos desejados para os sítios de recombinação correspondentes introduzidos anteriormente no genoma-alvo de planta.

[00222] Em um aspecto, uma sequência de nucleotídeos flanqueada por dois sítios de recombinação não idênticos é introduzida em uma ou mais células de um explante derivadas do genoma-alvo do organismo que estabelece um sítio-alvo para inserção de sequências de nucleotídeos de interesse. Uma vez que uma planta estável ou tecido cultivado é estabelecido, um segundo construto ou sequência de nucleotídeos de interesse, flanqueado por sítios de recombinação correspondentes como aqueles que flanqueiam o sítio-alvo, é introduzido na planta estavelmente transformada ou tecidos na presença de uma proteína recombinase. Esse processo resulta em troca das sequências de nucleotídeos entre os sítios de recombinação não idênticos do sítio-alvo e do cassete de expressão de T-DNA.

[00223] Reconhece-se que a planta transformada preparada dessa maneira pode compreender múltiplos sítios-alvo; isto é,

conjuntos de sítios de recombinação não idênticos. Dessa maneira, múltiplas manipulações do sítio-alvo na planta transformada estão disponíveis. Por sítio-alvo na planta transformada é pretendida uma sequência de DNA que foi inserida no genoma da planta transformada e compreende sítios de recombinação não idênticos.

[00224] Exemplos de sítios de recombinação para uso no método revelado são conhecidos na técnica e incluem sítios de FRT (Consulte, por exemplo, Schlake e Bode (1994) Biochemistry 33: 12.746 a

12.751; Huang et al. (1991) Nucleic Acids Research 19: 443 a 448; Paul D. Sadowski (1995) In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, volume 51, páginas 53 a 91; Michael M. Cox (1989) In Mobile DNA, Berg e Howe (editores) American Society of Microbiology, Washington D. C., páginas 116 a 670; Dixon et al. (1995) 18: 449 a 458; Umlauf e Cox (1988) The EMBO Journal 7: 1.845 a 1.852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 3.118 a 3.119; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9: 413 a 421. Rossant e Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592 a 594; Albert et al. (1995) The Plant J. 7: 649 a 659. Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353 a 361; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223: 369 a 378; e Dale e Ow (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 88: 10558 a 105620; todos os quais são incorporados no presente documento a título de referência.); Lox (Albert et al. (1995) Plant J. 7: 649 a 659; Qui et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91: 1.706 a 1.710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 901 a 913; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Gevet. 223: 369 a 378; Dale et al. (1990) Gene 91: 79 a 85; e Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353 a 361. O plasmídeo de dois mícrons encontrado na maioria das cepas de ocorrência natural de Saccharomyces cerevisiae, codifica uma recombinase específica a sítio que promove uma inversão do DNA entre duas repetições invertidas. Essa inversão desempenha um papel central na amplificação de número de cópias de plasmídeo.

[00225] A proteína, designada proteína FLP, catalisa os eventos de recombinação específicos a sítio. O sítio de recombinação mínimo (FRT) foi definido e contém duas repetições de par de 13 bases (bp) invertidas circundando um espaçador de 8 bp assimétrico. A proteína FLP cliva o sítio nas junções das repetições e do espaçador e é covalentemente ligado ao DNA por meio de um 3’ fosfato. As recombinases específicas a sítio como FLP clivam e religam o DNA em sequências-alvo específicas, resultando em uma recombinação precisamente definida entre dois sítios idênticos. Para funcionar, o sistema precisa dos sítios de recombinação e da recombinase. Nenhum fator auxiliar é necessário. Desse modo, todo sistema pode ser inserido em células de planta e funcionar nas mesmas. O sistema de recombinação específico a sítio FLP\FRT de levedura foi mostrado para funcionar em plantas. Até o momento, o sistema foi utilizado para a excisão de DNA indesejado. Consulte, Lyznik et at. (1993) Nucleic Acid Res. 21: 969-

975. Em contrapartida, a presente revelação utiliza FRTs não idênticos para a troca, direcionamento, disposição, inserção e controle de expressão de sequências de nucleotídeos no genoma de planta.

[00226] Em um aspecto, um organismo transformado de interesse, como um explante de uma planta, que contém um sítio-alvo integrado em seu genoma é necessário. O sítio-alvo é caracterizado por ser flanqueado por sítios de recombinação não idênticos. Um cassete de direcionamento é adicionalmente necessário contendo uma sequência de nucleotídeos flanqueada por sítios de recombinação não idênticos correspondentes como aqueles sítios contidos no sítio-alvo do organismo transformado. Uma recombinase que reconhece os sítios de recombinação não idênticos e catalisa a recombinação específica a sítio é necessária.

[00227] Reconhece-se que a recombinase pode ser fornecida por quaisquer meios conhecidos na técnica. Ou seja, isso pode ser fornecido no organismo ou célula de planta transformando-se o organismo com um cassete de expressão com capacidade de expressar a recombinase no organismo, por meio de expressão transiente, ou fornecendo-se RNA mensageiro (mRNA) para a recombinase ou a proteína recombinase.

[00228] Por "sítios de recombinação não idênticos" pretende-se que os sítios de recombinação de flanqueamento não sejam idênticos em sequência e não irão recombinar ou a recombinação entre os sítios será mínima. Ou seja, um sítio de recombinação de flanqueamento pode ser um sítio de FRT em que o segundo sítio de recombinação pode ser um sítio de FRT submetido à mutação. Os sítios de recombinação não idênticos usados nos métodos da revelação previnem ou suprimem enormemente a recombinação entre os dois sítios de recombinação de flanqueamento e a excisão da sequência de nucleotídeos contida nos mesmos. Consequentemente, reconhece-se que quaisquer sítios de recombinação não idênticos adequados podem ser utilizados na revelação, incluindo sítios de FRT e FRT mutante sites, FRT e sítios lox, lox e sítios lox mutantes, assim como outros sítios de recombinação conhecidos na técnica.

[00229] Por sítio de recombinação não idêntico adequado implica que, na presença de recombinase ativa, ocorre a excisão de sequências entre dois sítios de recombinação não idênticos, caso haja, com uma eficiência consideravelmente menor que a disposição de direcionamento de troca mediada de modo recombinante de sequências de nucleotídeos no genoma de planta. Desse modo, os sítios não idênticos adequados para uso na revelação incluem aqueles sítios em que a eficiência de recombinação entre os sítios é baixa; por exemplo, em que a eficiência é menor que cerca de 30 a cerca de 50%, de preferência menor que cerca de 10 a cerca de 30%, com mais preferência menor que cerca de 5 a cerca de

10%.

[00230] Conforme notado acima, os sítios de recombinação no cassete de direcionamento correspondem àqueles no sítio-alvo da planta transformada. Ou seja, se o sítio-alvo da planta transformada contiver sítios de recombinação não idênticos de flanqueamento de FRT e um FRT mutante, o cassete de direcionamento conterá os mesmos sítios de recombinação não idênticos de FRT e FRT mutante.

[00231] Reconhece-se, adicionalmente, que a recombinase, que é usada nos métodos revelados, dependerá dos sítios de recombinação no sítio-alvo da planta transformada e do cassete de direcionamento. Ou seja, os sítios de FRT são utilizados, a FLP recombinase será necessária. Da mesma maneira, quando os sítios lox forem utilizados, a Cre recombinase é necessária. Se os sítios de recombinação não idênticos compreenderem tanto um FRT quanto um sítio lox, tanto o FLP quanto a Cre recombinase serão necessários na célula de planta.

[00232] A FLP recombinase é uma proteína que catalisa uma reação específica a sítio que está envolvida na amplificação do número de cópias do plasmídeo de dois mícrons de S. cerevisiae durante a replicação de DNA. A proteína FLP foi clonada e expressa. Consulte, por exemplo, Cox (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 80: 4223-4227. A FLP recombinase para uso na revelação pode ser aquela derivada do gênero Saccharomyces. Pode ser preferencial sintetizar a recombinase com o uso de códons preferenciais para planta para expressão ideal em uma planta de interesse. Consulte, por exemplo, Pedido de nº de série nº US 08/972.258 depositado em 18 de novembro de 1997, intitulado "Novel Nucleic Acid Sequence Encoding FLP Recombinase", incorporado ao presente documento a título de referência.

[00233] A recombinase Cre de bacteriófago catalisa a recombinação específica a sítio entre dois sítios lox. A Cre recombinase é conhecida na técnica. Consultar, por exemplo, Guo et al. (1997) Nature 389: 40 a 46; Abremski et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1.509 a 1.514; Chen et al. (1996) Somat. Cell Mol. Genet. 22: 477 a 488; e Shaikh et al. (1977) J. Biol. Chem. 272: 5695-5702. Todos os quais estão incorporados ao presente documento a título de referência. Tal sequência Cre também pode ser sintetizada com o uso de códons preferenciais para planta.

[00234] Quando adequado, as sequências de nucleotídeos a ser inseridas no genoma de planta podem ser otimizadas para a expressão aumentada na planta transformada. Quando os genes de mamíferos, levedura ou bactérias forem usados na revelação, os mesmos podem ser sintetizados com ou uso de códons preferenciais para planta para expressão aprimorada. Reconhece-se que para a expressão em monocotiledôneas, os genes de dicotiledônea também podem ser sintetizados com o uso de códons preferenciais para monocotiledônea. Os métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferenciais para plantas. Consultar, por exemplo, Patentes nos U.S. 5.380.831, 5.436.391 e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17 : 477 a 498, incorporado ao presente documento a título de referência. Os códons preferenciais para planta podem ser determinados a partir dos códons utilizados mais frequentemente nas proteínas expressas na planta de interesse. Reconhece-se que as sequências preferenciais para monocotiledônea ou dicotiledônea podem ser construídas assim como sequências preferenciais para planta para espécies de planta específicas. Consulte, por exemplo, EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 88: 3.324 a

3.328; e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498. Patente nº US 5.380.831; Patente nº US 5.436.391; e semelhantes, incorporados ao presente documento a título de referência. É adicionalmente reconhecido que toda ou qualquer parte da sequência de gene pode ser otimizada ou sintética. Ou seja, as sequências otimizadas ou parcialmente otimizadas também podem ser usadas.

[00235] As modificações de sequência adicionais são conhecidas por intensificar a expressão de gene em um hospedeiro celular e podem ser usadas na revelação. As mesmas incluem a eliminação de sequências codificadoras de sinais de poliadenilação espúria, sinais de sítio de união de éxon-íntron, repetições semelhantes a transpósons e outras tais sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão de gene. O teor de G-C da sequência pode ser ajustado para níveis médios para um determinado hospedeiro celular, tal como calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de RNA secundárias em grampo previstas.

[00236] A presente revelação também abrange sítios-alvo de recombinação (FRT) de FLP novos. O FRT foi identificado como uma sequência mínima que compreende duas repetições de 13 pares-base, separadas por um espaçador de 8 bases, conforme segue: 5'- GAAGTTCCTATTC [TCTAGAAA] GTATAGGAACTTC3' em que os nucleotídeos dentro dos colchetes indicam a região do espaçador. Os nucleotídeos na região do espaçador podem ser substituídos por uma combinação de nucleotídeos, tão longa contanto que as duas repetições de 13 bases sejam separadas por oito nucleotídeos. Parece que a sequência de nucleotídeos real do espaçador não é crítica; no entanto, para a prática da revelação, algumas substituições dos nucleotídeos na região do espaçador podem funcionar melhor que outras. O espaçador de oito pares-base está envolvido no emparelhamento de DNA-DNA durante a troca de filamento. A assimetria da região determina a direção do alinhamento de sítio no evento de recombinação, que levará subsequentemente à inversão ou à excisão. Conforme indicado acima, a maior parte do espaçador pode ser submetida à mutação sem uma perda de função. Consulte, por exemplo, Schlake e Bode (1994) Biochemistry 33: 12.746 a 12.751, incorporado ao presente documento a título de referência.

[00237] Os sítios mutantes de FRT novos podem ser usados na prática dos métodos revelados. Tais sítios mutantes podem ser construídos por meio de mutagênese baseada em PCR. Embora os sítios de FRT mutante sejam conhecidos (consulte SEQ ID Nos 2, 3, 4 e 5 do documento WO1999/025821), reconhece-se que outros sítios de FRT mutante podem ser usados na prático da revelação. A presente revelação não é o uso de um sítio de FRT ou recombinação específico, mas, ao invés disso, sítios de recombinação não idênticos ou sítios de FRT podem ser utilizados para a inserção direcionada e expressão de sequências de nucleotídeos em um genoma de planta. Desse modo, outros sítios de FRT mutante podem ser construídos e utilizados com base na presente revelação.

[00238] Conforme discutido acima, juntando-se o DNA genômico que contém um sítio-alvo com sítios de recombinação não idênticos com um vetor que contém um cassete de expressão de T-DNA com sítios de recombinação não idênticos correspondentes, na presença da recombinase, resulta na recombinação. A sequência de nucleotídeos do cassete de expressão de T-DNA localizado entre os sítios de recombinação de flanqueamento é trocada com a sequência de nucleotídeos do sítio-alvo localizada entre os sítios de recombinação de flanqueamento. Dessa maneira, as sequências de nucleotídeos de interesse podem ser precisamente incorporadas no genoma do hospedeiro.

[00239] Reconhece-se que muitas variações da revelação podem ser praticadas. Por exemplo, os sítios-alvo podem ser construídos tendo múltiplos sítios de recombinação não idênticos. Desse modo, múltiplos genes ou sequências de nucleotídeos podem ser empilhados ou ordenados em locais precisos no genoma de planta. Igualmente, uma vez que um sítio- alvo foi estabelecido dentro do genoma, sítios de recombinação adicionais podem ser introduzidos incorporando-se tais sítios na sequência de nucleotídeos do cassete de expressão de T-DNA e a transferência dos sítios na sequência-alvo. Desse modo, uma vez que um sítio-alvo foi estabelecido, é possível adicionar, subsequentemente, sítios ou alterar sítios através de recombinação.

[00240] Uma outra variação inclui fornecer um promotor ou região de iniciação de transcrição operativamente ligada ao sítio-alvo em um organismo. De preferência, o promotor estará em 5' do primeiro sítio de recombinação. Transformando-se o organismo com um cassete de expressão de T-DNA que compreende uma região de codificação, a expressão da região de codificação ocorrerá mediante a integração do cassete de expressão de T-DNA no sítio-alvo. Esse aspecto fornece um método para selecionar células transformadas, particularmente células de planta, fornecendo-se uma sequência de marcador selecionável como a sequência de codificação.

[00241] Outras vantagens do presente sistema incluem a habilidade de reduzir a complexidade de integração de transgenes ou DNA transferido em um organismo utilizando-se cassetes de expressão de T-DNA conforme discutido acima e selecionando-se organismos com padrões de integração simples. Da mesma maneira, os sítios preferenciais no genoma podem ser identificados comparando-se diversos eventos de transformação. Um sítio preferencial dentro do genoma inclui um que não interrompe a expressão de sequências essenciais e fornece expressão adequada da sequência de transgene.

[00242] Os métodos revelados também fornecem os meios para combinar múltiplos cassetes expressão em um local dentro do genoma. Sítios de recombinação podem ser adicionados ou deletados em sítios-alvo dentro do genoma.

[00243] Quaisquer meios conhecidos na técnica para unir os três componentes do sistema podem ser usados na revelação. Por exemplo, uma planta pode ser estavelmente transformada para abrigar o sítio-alvo em seu genoma. A recombinase pode ser transientemente expressa ou fornecida. Alternativamente, uma sequência de nucleotídeos que tem capacidade de expressar a recombinase pode ser estavelmente integrada no genoma da planta. Na presença do sítio-alvo correspondente e da recombinase, o cassete de expressão de T-DNA , flanqueado por sítios de recombinação não idênticos correspondentes, é inserido no genoma da planta transformada.

[00244] Alternativamente, os componentes do sistema podem ser unidos cruzando-se sexualmente as plantas transformadas. Nesse aspecto, uma planta transformada, originária um, contendo um sítio- alvo integrado em seu genoma pode ser cruzada sexualmente com uma segunda planta, originária dois, que foi geneticamente transformada com um cassete de expressão de T-DNA que contém sítios de recombinação não idênticos de flanqueamento, que correspondem àqueles na planta um. Qualquer uma dentre planta um ou planta dois contém dentro de seu genoma uma sequência de nucleotídeos que expressa a recombinase. A recombinase pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou induzível. Dessa maneira, a expressão de recombinase e subsequente atividade nos sítios de recombinação podem ser controladas.

[00245] Os métodos revelados são úteis no direcionamento da integração de sequências de nucleotídeos transferidas para um sítio cromossômico específico. A sequência de nucleotídeos pode codificar qualquer sequência de nucleotídeos de interesse. Os genes de interesse específicos incluem aqueles que fornecem um recurso funcional analisável prontamente para a célula e/ou organismo hospedeiro, como genes de marcados, assim como outros genes que alteram o fenótipo das células recipientes, e semelhantes. Desse modo, os genes que afetam o crescimento da planta, a altura, a suscetibilidade à doença, insetos, valor nutritivo, e semelhantes, podem ser utilizados na revelação. A sequência de nucleotídeos também pode codificar uma sequência “antissenso” para desativar ou modificar a expressão de gene.

[00246] Reconhece-se que as sequências de nucleotídeos serão utilizadas em uma unidade de expressão funcional ou cassete de expressão de T-DNA. Por unidade de expressão funcional ou cassete de expressão de T-DNA pretende-se que a sequência de nucleotídeos de interesse com um promotor funcional e, na maioria dos casos, uma região de terminação. Há vários modos de obter a unidade de expressão funcional dentro da prática da revelação. Em um aspecto da revelação, o ácido nucleico de interesse é transferido ou inserido no genoma como uma unidade de expressão funcional.

[00247] Alternativamente, a sequência de nucleotídeos pode ser inserida em um sítio dentro do genoma que é 3' para uma região de promotor. Nesse último caso, a inserção da sequência de codificação 3' na região de promotor é tal que uma unidade de expressão funcional é obtida mediante integração. O cassete de expressão de T-DNA compreenderá uma região de iniciação de transcrição, ou promotor, operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de interesse. Tal cassete de expressão é dotado de uma pluralidade de sítios de restrição para inserção do gene ou genes de interesse para estar sob a regulação de transcrição das regiões reguladoras.

EXPERIMENTAL Exemplo 1: Plasmídeos

[00248] Consultar a Tabela 7 para uma descrição dos plasmídeos que compreendem os componentes indicados referenciados nos Exemplos. Os IDs de plasmídeo seguidos por um "+" compreendem T-DNA contendo os componentes indicados e componentes adicionais indicados localizados além da Borda Esquerda (LB) do T-DNA. Como está dentro do conhecimento na técnica, os componentes adicionais podem, alternativamente, estar localizados além da Borda Direita do T-DNA (RB). Tabela 7. SEQ ID de Componentes de Plasmídeo. ID Plasmídeo NO: 105 PHP87078 RB + INTENS FMV:INTENS PSCV:INTENS MMV:ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1 + SB-UBI PRO::ZS-VERDE1::TERM OS-UBI +

LB 106 PHP87598 RB + LOXP + INTENS FMV:INTENS PSCV:INTENS MMV:ZM-PLTP PRO::ZM- WUS2::TERM IN2-1 + ZM-HSP26 PRO::MOCRE EXON1:ST-LS1 INTRON:MO- CRE EXON2::TERM PINII + NOS PRO::CRC::TERM SB-GKAF + LOXP + LB 107 PHP88156 RB + INTENS FMV:INTENS PSCV:INTENS MMV:ZM-PLTP PRO:3xEME::ZM- WUS2::TERM IN2-1 + NOS PRO::CRC::TERM SB-GKAF + LB

108 PHP88157 RB + INTENS FMV:INTENS PSCV:INTENS MMV:ZM-PLTP PRO:1xEME::ZM- WUS2::TERM IN2-1 + NOS PRO::CRC::TERM SB-GKAF + LB 109 PHP88158 RB + INTENS FMV:INTENS PSCV:INTENS MMV:ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1 + NOS PRO::CRC::TERM SB-GKAF + LB 110 PHP86491 RB + SB-UBI PRO::ZS-VERDE1::TERM OS- UBI + SB-ALS PRO::ZM-HRA::TERM PINII +

LB 111 PHP81561 RB + ZM-UBI1 PRO::ZS-AMARELO::TERM PINII + ZM-UBI1 PRO::NPTII::TERM PINII + LB 112 PHP86295+ RB + LOXP + SI-UBI3 PRO::ZS- VERDE1::TERM PINII + SB-ALS PRO::ZM- HRA::TERM SB-PEPC1 + LB + ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1 + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::TERM OS-T28 113 PHP86296+ RB + LOXP + SI-UBI3 PRO::ZS- VERDE1::TERM PINII + SB-ALS PRO::ZM- HRA::TERM SB-PEPC1 + LB + ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1 114 PHP86297+ RB + LOXP + SI-UBI3 PRO::ZS- VERDE1::TERM PINII + SB-ALS PRO::ZM- HRA::TERM SB-PEPC1 + LB + ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2~T2A~ZM-ODP2::TERM OS- T28 115 PHP88194 RB + AT-UBQ10 PRO::CTP::SPCN::TERM

UBQ14 + GM-UBQ PRO::ZS-AMARELO N1::TERM NOS + LB 116 PHP90094 RB + CAMV35S PRO::HA-WUS::TERM OS- T28 + INTENSIFICADOR FMV:INTENSIFICADOR PCSV:INTENSIFICADOR MMV + LB 117 PHP88193 RB + AT-UBQ10 PRO::CTP::SPCN::TERM UBQ14 + GM-UBQ PRO::ZS-AMARELO1 N1::TERM NOS + LB 118 PHP0001+ RB + AT-UBQ10 PRO::CTP::SPCN::TERM UBQ14 + GM-UBQ PRO::ZS-AMARELO N1::TERM NOS + LB + INTENS FMV:INTENS PSCV:INTENS MMV:CAMV35S PRO::HA- WUS::TERM OS-T28 119 PHP80728 RB + GM-UBQ PRO::TAG-RFP::AT-TERM UBQ3 + GM-SAMS PRO::GM-HRA::TERM GM-ALS + LB 120 PHP81718+ RB + GM-UBQ PRO::TAG-RFP::AT-TERM UBQ3 + GM-SAMS PRO::GM-HRA::TERM GM-ALS + LB + GM-EF1A PRO::AT- WUS::TERM UBQ14 121 PHP0002+ RB + LOXP + SI-UBI3 PRO::ZS- VERDE1::TERM PINII + SB-ALS PRO::ZM- HRA::TERM SB-PEPC1 + LB + ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1 + ZM-PLTP PRO::WDV-RepA::TERM OS-T28 122 PHP0003+ RB + LOXP + SI-UBI3 PRO::ZS-

VERDE1::TERM PINII + SB-ALS PRO::ZM- HRA::TERM SB-PEPC1 + LB + ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1 + ZM-PLTP PRO::PKLamiRNA::TERM OS-T28 123 PHP5096 UBI1ZM PRO::FLPm::TERM PINII 124 PHP89030 ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::TERM OS-T28 + INTENSIFICADORES FMV & PCSV 125 PHP89179 ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1 126 PHP0004 FRT1:PMI:: TERM PINII + UBI1ZM PRO::DS- VERMELHO2::TERM PINII + FRT87 127 PHP0005+ RB + SI-UBI PRO::ZS-VERDE::TERM PINII + SB-ALS PRO::ZM-HRA::TERM SB-PEPC1 + LB + ZM-PLTP PRO::WUS2~T2A~WDV- RepA::TERM IN2-1 128 PHP38042+ RB + CAMV35S PRO:3xTET-OP:ADH1 INTRON1::MO-PAT~DS-VERMELHO EXPRESS::TERM PINII + LB + UBI1ZM PRO::REPRESSOR TET::TERM PINII 129 PHP89484+ RB + AT-UBQ10 PRO::CTP::SPCN::TERM UBQ14 + GM-UBQ PRO::DS- VERMELHO2::TERM UBQ3 + LB + CAMV35S PRO::HA-WUS::TERM OS-T28 + INTENS FMC::INTENS PCSV::INTENS MMV 130 PHP93161 RB + LOXP + INTENSIFICADOR FMV:INTENSIFICADOR PCSV:INTENSIFICADOR MMV::LTP2 PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1 + NOS

PRO::CRC::TERM SB-GKAF + LB 131 PHP92349 RB + LOXP + GM-QBU PRO::CTP:SPCN::TERM UBQ14 + GM-EF1A2 PRO::DS-VERMELHO2::TERM UBQ3 + LOXP + LB 132 PHP71539 pVIR9 133 dCAS9~EAR UBI1ZM PRO::UBI1ZM INTRON1::NLS:dCAS9:VIRD2 NLS:PROTEIN LINKER:ZM-PEPTÍDEO REPRESSOR ERF3::TERM OS-T28 Exemplo 2: Meios de Cultura.

[00249] Consultar as Tabelas 8, 9 e 10 para uma descrição das formações de meios para transformação, seleção e regeneração referenciadas nos Exemplos. Tabela 8. Componentes de Unid 12R 810 700 710 605 605T 562 289Q meio ades K A I J V por litro MISTURA DE SAL g 4,3 4,3 4,3 4,3 BASAL MS 4,3 SAIS BASAIS N6 g 4,0 MACRONUTRIENT ml 60, 60,0 ES N6 10X 0 NITRATO DE g 1,7 1,7

POTÁSSIO SAIS MENORES ml 0,6 0,6

B5H 1000X NaFe EDTA PARA ml 6,0 6,0 B5H 100X VITAMINAS 1000X ml 0,4 0,4 1,0

DA ERIKSSON ESTOQUE DE ml 6,0 6,0 VITAMINA S&H 100X TIAMINA.HCL mg 10,0 10, 0,5 0,5 0,5 0 L-PROLINA g 0,7 2,0 2,0 0,69 0,7 HIDROLISADO DE g 0,3 0,3 CASEÍNA (ÁCIDO) SACAROSE g 68,5 20, 20, 20,0 30,0 0 0 60,0 GLICOSE g 5,0 36,0 10, 0,6 0,6 0 MALTOSE g 2,4-D mg 1,5 2,0 0,8 0,8 2,0 ÁGAR g 15, 8,0 6,0 6,0 8,0 0 8,0 BACTO-AGAR g 15,0 FITAGEL g DICAMBA g 1,2 1,2 NITRATO DE mg 3,4 3,4 0,85

PRATA

Carbenicilina mg 100 AGRIBIO ,0 Timentina mg 150, 0 150,0 Cefotaxima mg 100, 0 100,0 MIO-INOSITOL g 0,1 0,1 0,1 ÁCIDO mg 0,5 0,5

NICOTÍNICO PIRIDOXINA.HCL mg 0,5 0,5 CASAMINOÁCIDO g 1,0

S DE ENSAIO DE

VITAMINA TAMPÃO MES g 0,5 ACETOSSIRINGO uM 100 100, NA ,0 0 ÁCIDO mg 10, ASCÓRBICO A 0 10MG/ML (7S) SOL. DE ml

ESTOQUE DE VITAMINA DE MS 5,0 ZEATINA mg 0,5 SULFATO mg CÚPRICO 1,3 IAA A 0,5 MG/ML ml (28A) 2,0

ABA A 0,1 mm ml 1,0 TIDIAZURONA mg 0,1 Carbenicilina mg AGRIBIO 100,0 PPT(GLUFOSINAT mg O-NH4) BAP mg 1,0 EXTRATO DE g 5,0 LEVEDURA (BD Difco) PEPTONA g 10,0 CLORETO DE g 5,0

SÓDIO ESPECTINOMICIN mg 50, 50,0 A 0 SULFATO ml 2,0 FERROSO.7H20 TAMPÃO DE AB ml 50, 20X (12D) 0 SAIS DE AB 20X ml 50, (12E) 0 TIMIDINA mg 50, 50,0 50,0 50,0 0 GENTAMICINA mg 50, 50,0 0 Benomila mg pH 6,8 5,2 5,8 5,8 5,8 5,8 5,6 Tabela 9. Componentes de meio Unid 20A 70A 70B 70C ades por litro MISTURA DE SAL g 4,3 4,3 4,3 4,3

BASAL MS TIAMINA.HCL mg 0,12 0,12 0,12 0,12 SACAROSE g 20 20 20 PVP40 g 0,5 0,5 0,5 ÁGAR TC g 5 5 5 NITRATO DE PRATA mg 2,0 2,0 2,0 Carbenicilina g 0,5 0,5 0,5

AGRIBIO Sal de Hemissulfato mg 40 40 40 de Adenina MIO-INOSITOL g 0,1 0,1 0,1 0,1 ÁCIDO NICOTÍNICO mg 0,57 0,57 0,57 0,57 PIRIDOXINA.HCL mg 0,57 0,57 0,57 0,57 Glicina mg 2,3 2,3 2,3 2,3 TAMPÃO MES g 0,5 0,5 0,5 0,5 ACETOSSIRINGONA uM 200 NAA mg 0,1 0,1 0,1 0,1 BAP mg 1,0 1,0 1,0 1,0

Ácido Giberélico ug 10 10 10 10 ESPECTINOMICINA mg 5 10 10 pH 5,5 5,7 5,7 5,7

[00250] As composições de vários meios usados na transformação de soja, cultura de tecido e regeneração são esboçados na Tabela 10. Nessa tabela, o meio M1 é usado para a iniciação de culturas de suspensão, se esse for o material de partida para a transformação. Os meios M2 e M3 representam meios de cocultivo típicos úteis para transformação de Agrobacterium da gama inteira de explantes listados acima. O meio M4 é útil para a seleção (com o agente seletivo apropriado), M5 é usado para a maturação de embrião somático e o meio M6 é usado para germinação para produzir T0 plântulas. Tabela 10.

M1 M2 M3 M4 M5 M6 O sal de MS com vitaminas 4,44 4,4 4,44 B5 g/L g/L g/L (PhytoTech M404) Meio basal de Gamborg 3,21 B-5 g/L (PhytoTech G398)

Sal de MS modificado 2,68 2,68 (PhytoTech g/L g/L M571) vitaminas B5 (1000X) 1 ml 1 ml 1 ml (PhytoTech G249) 2,4-D estoque a 10 4 ml 1 ml 1 ml 4 ml mg/ml 1,64 1,64 KNO3 g/L g/L

0,463 0,463 (NH4)2SO4 g/L g/L

Asparagina 1 g/L 1 g/L

68,5 85,6 20 Sacarose g/L g/L g/L

31,5 36 49,6 31,5 Glicose g/L g/L g/L g/l

60 Maltose g/L

0,75 MgCl2.6H2O g/L

Carvão ativado 5 g/L (PhytoTech C325) Hidrolisado de caseína 1 g/L 1 g/L (PhytoTech C184) pH 7,0 5,4 5,4 7,0 5,7 5,7 Acetosiringo 300 300 na µM µM Ágar TC 4 g/L 5 g/L Gelrita (Meios vegetais no 2 g/l 2 g/L de Cat 714246) Exemplo 3: Bombardeamento de Partícula.

[00251] PH184C puro Pioneer (revelado no documento US8445763) que contém no cromossomo-1 um sítio alvo de Integração Específico do Sítio pré-integrado (sítio alvo Chrom-1) composto de UBI PRO:FRT1:NPTII::TERM PINII + FRT87 é usado. Antes do bombardeio, 10 a 12 embriões DAP (dias após a polinização) imaturos são isolados de orelhas de PH184C puro Pioneer e colocados em meio de cultura 605J mais 16% de sacarose durante três horas para plasmolisar as células escutelares.

[00252] Quatro plasmídeos são normalmente usados para cada bombardeio de partículas: um plasmídeo doador (100 ng/µl) contendo um cassete de doador flanqueado por FRT para troca de cassete mediada por Recombinase, por exemplo, um plasmídeo contendo FRT1: PMI:: TERM PINII + UBI1ZM PRO::DS-VERMELHO2::TERM PINII + FRT87 (PHP0004); um plasmídeo (2,5 ng/µl) contendo o cassete de expressão UBI1ZM PRO::FLPm::TERM PINII (PHP5096); um plasmídeo (10 ng/µl) contendo o cassete de expressão ZM- PLTP PRO::ZM-ODP2::TERM OS-T28 + INTENSIFICADORES FMV & PCSV (PHP89030); e um plasmídeo (5 ng/ul) contendo o cassete de expressão ZM- PLTP PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1 (PHP89179).

[00253] Para fixar o DNA a 0,6 µm de partículas de ouro, os quatro plasmídeos são misturados adicionando-se 10 µl de cada plasmídeo juntos em um tubo de microcentrífuga de baixa aglutinação (Sorenson Bioscience 39640T) por um total de 40 µl. A essa suspensão, 50 µl de 0,6 µm de partículas de ouro (30 µg/µl) e 1,0 µl de Transit 20/20 (nº de Cat. MIR5404, Mirus Bio LLC) são adicionados, e a suspensão é colocada em um agitador giratório por 10 minutos. A suspensão é centrifugada a 10.000 RPM (~9.400 x g) e o sobrenadante é descartado. As partículas de ouro são ressuspensas em 120 µl de etanol 100%, sonicadas brevemente em baixa potência e 10 µl são pipetados em cada disco de transporte. Os discos de transporte são então secos com ar para remover todo o etanol restante. O bombardeamento de partículas é realizado com o uso de um Biolistics PDF- 1000, em 28 polegadas de Mercúrio com o uso de um disco de ruptura de 200 PSI. Após o bombardeamento de partículas, os embriões imaturos são selecionados em meio 605J modificado para conter 12,5 g/l de manose e 5 g/l de maltose e nenhuma sacarose. Após 10-12 semanas de seleção, as plântulas são regeneradas e analisadas com o uso de qPCR. Espera-se que a coentrega de PLTP::ODP2 (PHP89030) e PLTP::WUS2 (PHP89179) junto com os componentes SSI (DNA doador (PHP0004) + UBI::FLP (PHP5096)) produzirá altas frequências de integração específica do sítio do fragmento doador no sítio alvo Chrom-1 (ou seja, a taxas de 4 a 7% em relação ao número de embriões imaturos bombardeados). Exemplo 4: Transformação de milho mediada por Agrobacterium. Preparação de Placa Mestre de Agrobacterium.

[00254] Agrobacterium tumefaciens que acolhe um vetor de doador binário foi retirada de uma alíquota congelada a -80 °C para meio 12R sólido e cultivada a 28 °C no escuro por 2 a 3 dias para produzir uma placa mestre. B. Crescimento de Agrobacterium em meio sólido.

[00255] Uma única colônia ou várias colônias de Agrobacterium foram colhidas da placa mestre e retiradas para uma segunda placa que contém meio 810K e incubadas a 28 °C no escuro da noite para o dia.

[00256] O meio de infecção por Agrobacterium (700A; 5 ml) e 3'-5'-Dimetoxi-4'-hidroxiacetofenona 100 mM (acetossiringona; 5 µl) foram adicionados a um tubo cônico de 14 ml em uma capela. Cerca de 3 ciclos completos de Agrobacterium da segunda placa foram suspensos no tubo e o tubo foi, então, submetido a vórtice para produzir uma suspensão uniforme. A suspensão (1 ml) foi transferida para um tubo de espectrofotômetro e a densidade óptica (550 nm) da suspensão foi ajustada para uma leitura de cerca de 0,35 a 1,0. A concentração de Agrobacterium era aproximadamente

0,5 a 2,0 × 109 cfu/ml. A suspensão final de Agrobacterium foi colocada em alíquotas em tubo de microcentrífuga de 2 ml, sendo que cada um contém cerca de 1 ml da suspensão. As suspensões foram, então, usadas assim que possível. C. Crescimento de Agrobacterium em meio líquido.

[00257] Alternativamente, Agrobacterium pode ser preparada para transformação por meio de crescimento em meio líquido. Um dia antes da infecção, um frasco de 125 ml foi preparado com 30 ml de meio 557A (10,5 g/l de fosfato de potássio dibásico, 4,5 g/l de fosfato de potássio monobásico anidro, 1 g/l de sulfato de amônio, 0,5 g/l de desidrato de citrato de sódio, 10 g/l de sacarose, 1 mM de sulfato de magnésio) e 30 µl de espectinomicina (50 mg/ml) e 30 µl de acetossiringona (20 mg/ml). Um meio ciclo de Agrobacterium de uma segunda placa foi suspenso nos frascos e colocado em um agitador orbital definido em 200 rpm e incubado a 28 °C da noite para o dia. A cultura de Agrobacterium foi centrifugada a 5.000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi removido e o meio de infecção por Agrobacterium (700A) com solução de acetossiringona foi adicionado. As bactérias foram ressuspensas por vórtice e a densidade óptica (550 nm) da suspensão de Agrobacterium foi ajustada para uma leitura de cerca de 0,35 a 2,0. D. Transformação de Maís.

[00258] As espigas de um cultivar de maís (Zea mays L.) foram esterilizadas em superfície por 15 a 20 min em 20% (v/v) de alvejante (5,25% de hipocloreto de sódio) mais 1 gota de Tween 20 seguido por 3 lavagens em água estéril. Os embriões imaturos (IEs) foram isolados das espigas e foram colocados em 2 ml do meio de infecção por Agrobacterium (700A) com solução de acetossiringona. O tamanho ideal dos embriões varia com base no cruzamento consanguíneo, mas para transformação com WUS2 e ODP2 uma ampla faixa de tamanho de tamanhos de embrião imaturo poderia ser usada. O meio de infecção por Agrobacterium (810K) foi extraído e 1 ml da suspensão de Agrobacterium foi adicionada aos embriões e o tubo foi submetido a vórtice por 5 a 10 s. O tubo de microcentrífuga foi permitido a permanecer por 5 min na capela. A suspensão de Agrobacterium e embriões foram despejados no meio de cocultivo 710I (ou 562V) (consultar a Tabela 8). Quaisquer embriões deixados no tubo foram transferidos para a placa com o uso de uma espátula estéril. A suspensão de Agrobacterium foi extraída e os embriões foram colocados com o eixo geométrico virado para baixo nos meios. A placa foi incubada no escuro a 21ºC por 1 a 3 dias de cocultivo.

[00259] Os embriões foram transferidos para o meio de repouso (meio 605T) sem seleção. De três a 7 dias depois, os embriões foram transferidos para o meio de maturação (meio 289Q) complementado com um agente seletivo. Exemplo 5: Misturas de Agrobactérias para Recuperação de Eventos Transgênicos de Maís Contendo Apenas o T-DNA de Cassete de Expressão de Traço

[00260] Os experimentos a seguir demonstraram que a entrega de um plasmídeo contendo WUS2 juntamente com o plasmídeo contendo um cassete de expressão de traço melhorou a recuperação de plantas T0 transgênicas contendo apenas o T-DNA de traço e nenhuma estrutura de vetor (plasmídeo).

[00261] Embriões imaturos de maís HC69 puro não-Stiff- Stalk foram transformados com Agrobacterium cepa LBA4404 THY- (Consultar Patente no U.S. 8.334.429 incorporada em sua totalidade ao presente documento a título de referência ) (Agro1) contendo PHP86491, um T-DNA com dois cassetes de expressão DE "Traço" (ZS-VERDE e ZM-HRA) (Tabela 7). Esse Agrobacterium (Agro1) foi usado sozinho (Tratamento de

Controle) para infectar os embriões imaturos, ou como parte de uma mistura com outro Agrobacterium (Agro2) contendo um cassete de expressão WUS (PHP87598, PHP88156, PHP88157 ou PHP88158, consultar Tabela 7). Para os Tratamentos (Trts) 1 a 4, as duas Agrobacteria foram misturadas a uma razão de 95% de plasmídeo contendo Traço PHP86491 (Agro1) a 5% de plasmídeo contendo WUS (Agro2) (PHP87598, PHP88156, PHP88157 ou PHP88158, consultar Tabela 7). Como mostrado na Tabela 11 abaixo, quando apenas o Agrobacterium contendo o plasmídeo de T-DNA de Traço (PHP86491) (Agro1) foi usado para a transformação, a frequência de recuperação de plantas T0 com uma única cópia do T-DNA e nenhuma estrutura de plasmídeo (sequência fora das bordas do T-DNA) foi baixa (Trt C = 1,8%). No entanto, quando um segundo Agrobacterium (Agro2) contendo um T-DNA com um cassete de expressão WUS (PHP87598, PHP88156, PHP88157 ou PHP88158, consultar a Tabela 7) foi misturado em um título baixo com Agro1, a recuperação de plantas transgênicas T0 contendo apenas uma única cópia do T-DNA de Traço (PHP86491 - ZS-VERDE + ZM- HRA) sem integração do T-DNA contendo WUS (PHP87598, PHP88156, PHP88157 ou PHP88158, consultar a Tabela 7) ou a estrutura do plasmídeo foi observado em frequências substancialmente melhoradas (6,4% a 16,2% para Trts 1 a 4 na Tabela 11). Para Trt1 em que o T-DNA em Agro2, PHP87598, continha três elementos intensificadores virais (ENH) 5 'para o promotor ZM-PLTP que conduz a expressão de WUS junto com um promotor de choque térmico que conduz a expressão de CRE, um cassete de expressão de antocianina expressa constitutivamente (NOS PRO::CRC::TERM SB-GKAF) e sítios loxP flanqueando todos os três cassetes de expressão, a frequência de integração de uma única cópia do T- DNA de Traço e nenhuma estrutura de plasmídeo foi de 6,5%. Para PHP88156, PHP88157 e PHP88158, que continham, todos, um cassete de expressão WUS com um promotor 3xENH: PLTP (com ou sem um elemento intensificador derivado de maís (EME) posicionado próximo à caixa TATA do promotor PLTP (em triplicado (3xEME em PHP88156), como uma cópia única (EME em PHP88157) ou sem EME (EME- em PHP88158)) que conduz WUS e o cassete de expressão de antocianina expressa constitutivamente, a frequência de plantas T0 contendo apenas uma única cópia do T-DNA de Traço e nenhuma estrutura de plasmídeo foi 6,4 (PHP88156), 16,2 (PHP88157) e 12,1% (PHP88158). As fugas (plantas T0 não transgênicas regeneradas) foram 4% quando Agro2 continha PHP88157 e 1% quando Agro2 continha PHP88158. O 3X ENH tem um efeito no cassete de expressão NOS PRO::CRC::TERM SB-GKAF e se o T-DNA contém o cassete de expressão ENH e NOS PRO::CRC::TERM SB-GKAF integrado, os embriões eram de cor vermelha profunda e não produziram mudas.

Os tratamentos 2 a 4 (Tabela 11) demonstraram que a mistura de um segundo Agrobacterium contendo um cassete de expressão WUS em título baixo (5% em relação ao Agro1 contendo o T-DNA de Traço) forneceu uma alternativa eficaz para aumentar a recuperação de plantas T0 contendo apenas uma cópia única do T-DNA de Traço e nenhuma estrutura de plasmídeo sem a necessidade de acompanhar o processo de transformação com excisão do cassete de expressão WUS.

Tabela 11. Trt.

Plasmídeo de Plasmídeo Frequência Frequência de "Traço" em contendo de Fugas (%) Cópia única, sem Agro1 WUS em estrutura (%) Agro2 C PHP86491 Nenhum 0 1,8 1 PHP86491 PHP87598 0 6,5 2 PHP86491 PHP88156 0 6,4

3 PHP86491 PHP88157 4 16,2 4 PHP86491 PHP88158 1 12,1

[00262] Embriões imaturos de maís PH1V69 puro Stiff- Stalk, revelados na Patente US 8.907.160 e incorporados em sua totalidade ao presente documento a título de referência, foram transformados com a cepa de Agrobacterium LBA4404 THY- (Agro1) contendo PHP86491 (Tabela 7). Esse Agrobacterium (Agro1) foi usado sozinho (Tratamento de Controle) para infectar os embriões imaturos, ou como parte de uma mistura com outro Agrobacterium (Agro2) contendo um cassete de expressão WUS (PHP87598 ou PHP88156 ou PHP88157 ou PHP88157) (95% Agro1 a 5 % Agro2).

[00263] No Tratamento de Controle (Agro1 sozinho), nenhuma fuga (plantas T0 não transgênicas regeneradas) foi recuperada e nenhuma planta T0 foi recuperada que contivesse apenas uma única cópia do T-DNA de Traço e nenhuma estrutura de plasmídeo. Por outro lado, quando um segundo Agrobacterium (Agro2) contendo PHP87598 (Tabela 7) foi misturado com Agro1 e a mistura foi usada para transformação, ainda não havia fugas recuperadas e a frequência de plantas T0 contendo apenas uma única cópia da T-DNA de traço e sem estrutura de plasmídeo foi de 16,5%. Quando PHP87078 (Tabela 7) entrou em substituição no lugar de PHP87598 em Agro2, nenhuma fuga foi observada nas plantas T0 regeneradas e a frequência de plantas T0 contendo apenas uma única cópia do T-DNA de Traço e nenhuma estrutura de plasmídeo foi de 7,1%. Essas frequências representaram uma grande melhoria em na capacidade de usar cassetes de expressão de genes morfogênicos (por exemplo, 3xENH: PLTP::WUS2) sem integração do cassete de expressão contendo WUS para recuperar plantas T0 de alta qualidade (cópia única para Traços sem sequências estranhas sendo integradas (sem estrutura de plasmídeo ou qualquer sequência de T- DNA de Agro2)).

[00264] Embriões imaturos de maís PH1V69 puro Stiff-Stalk de foram transformados com Agrobacterium cepa LBA4404 THY contendo plasmídeo PHP86491 (Tabela 7). Esse Agrobacterium (Agro1) foi usado como parte de uma mistura com outro Agrobacterium (Agro2) contendo o plasmídeo PHP87598 (Tabela 7), que continha um cassete de expressão WUS. Duas razões diferentes de Agro1: Agro2 foram testadas, 50:50 ou 90:10. Quando a mistura 50:50 foi usada para transformação, não foram observadas fugas nas plantas T0 resultantes e uma frequência de plantas T0 contendo apenas uma única cópia do T-DNA de Traço e nenhuma estrutura de plasmídeo foi de 8,2%. Quando a mistura 90:10 foi usada para transformação, não foram observadas fugas nas plantas T0 resultantes e uma frequência de plantas T0 contendo apenas uma única cópia do T-DNA de Traço e nenhuma estrutura de plasmídeo foi de 26%. Esse resultado demonstrou que a concentração relativa de Agro1 e Agro2 na mistura de transformação impactou a frequência de plantas T0 contendo apenas uma única cópia do T-DNA de Traço e nenhuma estrutura de plasmídeo.

[00265] Embriões imaturos de quatro endogâmicas de maís tropical diferentes foram colhidos e transformados com um dos dois cassetes de expressão de "Traço" com o uso de PHP81561 (ZS-AMARELO + NPTII) ou PHP86491 (ZS-VERDE e ZM-HRA). Para todos os quatro cruzamentos consanguíneos, PH2KD1, PH44MH, PH4BAH e PH28SV, a taxa de transformação com a seleção G-418 ou seleção imazapir (para os genes NPTII ou HRA, respectivamente) foi efetivamente 0%. No entanto, quando um segundo Agrobacterium contendo (PHP88158, consultar Tabela 7) foi adicionado a um título de 10% em relação ao Agro1 contendo Traço (contendo PHP81561, consultar Tabela 7) e a seleção G-418 foi usada durante a maturação e germinação do embrião somático, a frequência de plantas T0 recuperadas com apenas uma única cópia do T-DNA e nenhuma estrutura de vetor (plasmídeo) foi de 30% para PH2KD1, 38% para PH44MH, 43% para PH4BAH e 3,2% para PH28SV, em relação ao número de embriões de partida. Quando o segundo Agrobacterium contendo PHP88158 foi adicionado a um título de 10% em relação ao Agro1 contendo ZS-VERDE e ZM-HRA (contendo PHP86491) e 0,1 mg/l de seleção de imazapir foi usado durante a maturação e germinação de embriões somáticos, a frequência das plantas T0 recuperadas com apenas uma única cópia do T-DNA e nenhuma estrutura de vetor (plasmídeo) foi de 15% para PH2KD1, 18% para PH44MH, 9,6% para PH4BAH e 0% para PH28SV, em relação ao número de embriões de partida. Estes resultados demonstraram que o uso de um cassete que expressa WUS dentro do T-DNA de Agro2 e a mistura de Agro2 a 10% em relação ao Agro1 contendo Traço (90%) resultou em um método eficaz para integrar o T-DNA de Traço resultando nas plantas T0 recuperadas contendo apenas uma única cópia do T-DNA e nenhuma estrutura de vetor (plasmídeo) em frequências extremamente eficazes. Exemplo 6: Uso de um cassete de expressão WUS2 fora das Bordas de T-DNA que contém Traço para estimular a transformação e seleção de plantas de maís T0 de cópia única que não continham cassete de expressão de WUS2 integrado em DNA cromossômico

[00266] Para esses experimentos, um conjunto de três projetos de plasmídeo foi testado. Todos os três plasmídeos continham o mesmo T-DNA (RB + LOXP + SI-UBI3 PRO::ZS-VERDE1::TERM PINII + SB- ALS PRO::ZM-HRA::TERM SB-PEPC1 + LB), mas diferiam nos cassetes de expressão WUS2 ou WUS2/ODP2 além da borda esquerda. Especificamente, o PHP86295 continha dois cassetes de expressão imediatamente fora da borda esquerda, ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1 + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::TERM OS-T28 (consultar a Tabela 7), PHP86296 continha um único cassete de expressão imediatamente fora da

Borda Esquerda, ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1, e PHP86297 continha um único cassete de expressão imediatamente fora da Borda Esquerda, ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2~T2A~ZM-ODP2::TERM OS-T28. Para o PH1V69 puro Stiff-Stalk Pioneer, após transformação mediada por Agrobacterium com esses respectivos T-DNAs e seleção em 0,05 a 0,1 mg/l de imazapir durante a maturação e regeneração do embrião somático, as plantas T0 foram analisadas por qPCR. Com base na análise de qPCR, o uso de PHP86295 resultou em 10,2% das plantas T0 recuperadas sendo uma cópia única para os genes de Traço dentro do T-DNA, ao mesmo tempo em que sem WUS integrado e/ou ODP2 sem contaminação da estrutura do plasmídeo, esses valores foram 12,2% e 12,3% para PHP86296 e PHP86297, respectivamente. Esses resultados demonstraram que o posicionamento dos cassetes de expressão WUS2 e/ou ODP2 fora da borda esquerda do T-DNA proporcionou a estimulação necessária da transformação sem a integração concomitante desses cassetes de expressão gênica morfogênica. Esse resultado demonstrou adicionalmente que WUS e/ou ODP2 podem ser expressos transitoriamente após a entrega "além da borda" para estimular a transformação do maís. Por outro lado, o uso desses mesmos vetores em HC69 puro não resultou em uma recuperação aumentada de eventos de T-DNA de Traço de cópia única sem estrutura de vetor (plasmídeo), isso é provavelmente devido à propensão deste endogâmico para produzir eventos de integração de múltiplas cópias com um alto grau de leitura de borda. Exemplo 7: Uso de múltiplas bordas esquerdas entre o T- DNA e os cassetes de expressão gênica morfogênica aumenta a frequência de eventos de integração T-DNA de Traço de cópia única

[00267] Cruzamentos consanguíneos de maís variam em muitas características morfológicas e fisiológicas. Uma manifestação desta variabilidade é a suscetibilidade do escutelo do embrião imaturo de diferentes cruzamentos consanguíneos à entrega e integração do T-DNA durante a infecção e cocultivo por Agrobacterium. Por exemplo, quando Agrobacterium cepa LBA4404 THY- é usado para transformar o HC69 puro Pioneer, uma alta frequência de plantas T0 transgênicas recuperadas contém várias cópias do T-DNA e foram submetidas a leitura na Borda Esquerda do T-DNA (LB) que resulta na integração da estrutura de vetor (plasmídeo). A introdução de várias bordas esquerdas atenuará essa tendência. Como exemplo, várias bordas esquerdas são introduzidas no PHP86296 entre o T-DNA contendo a Traço e o cassete de expressão WUS2 de flanco, resultando na seguinte configuração: RB + LOXP + SI-UBI3 PRO::ZS-VERDE1::TERM PINII + SB- ALS PRO::ZM-HRA::TERM SB-PEPC1 + LB + LB + LB + ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1. Quando LBA4404 contendo o T-DNA múltiplo de LB acima e o cassete de expressão WUS2 de flanco é usado para transformar HC69, espera-se que uma frequência substancialmente mais alta das plantas T0 recuperadas seja uma cópia única para o T-DNA sem cassete de expressão WUS2 integrado e não contendo estrutura de plasmídeo. Exemplo 8: Mutagênese da sequência da Borda Esquerda aumenta a frequência de eventos transgênicos de recuperação

[00268] Cruzamentos consanguíneos de maís variam em muitas características morfológicas e fisiológicas. Uma manifestação desta variabilidade é a suscetibilidade do escutelo do embrião imaturo de diferentes cruzamentos consanguíneos à entrega e integração do T-DNA durante a infecção e cocultivo por Agrobacterium. Por exemplo, quando Agrobacterium cepa LBA4404 THY- é usado para transformar PH28SV puro Pioneer, muito poucas células no escutelo recebem uma sequência de flanqueamento de LB, como o cassete de expressão WUS2 de flanco, e, portanto, não são estimuladas a formar rapidamente novos embriões somáticos. Ao mutagenizar seletivamente a sequência LB, a eficácia do LB pode ser alterada para permitir uma maior frequência de leitura de LB Quando usado para transformação, espera-se que uma frequência superior de embriões somáticos de formação rápida e plantas T0 resultantes contendo um gene de traço de cópia única sem estrutura de vetor (plasmídeo) sejam produzidos.

[00269] O cocultivo com Agrobacterium de variedades mais recalcitrantes à infecção pode tornar impraticável a entrega além da borda para a expressão de genes morfogênicos. Antecipa-se que o uso de cepas de Agrobacterium mais agressivas, tais como AGL1, EHA101, EHA105 ou qualquer cepa que possui o plasmídeo Ti supervirulento pTiBo54 poderia ser usada para resolver essa deficiência potencial. Além disso, o uso de um vetor binário com um número de cópias superior pode ser usado para entregar um número maior de moléculas de T-DNA por célula, amplificando assim além da leitura da borda e subsequente expressão do gene morfogênico. Exemplo 9: Misturas de Plasmídeo para Recuperação de Eventos Transgênicos de Canola Contendo Apenas o T-DNA de Traço

[00270] A semente de canola é esterilizada na superfície e germinada em meio MS de meia força para produzir plantas estéreis com uma semana de idade. Os hipocótilos são colocados em 10ml de meio 20A (Tabela 9) e cortados em segmentos de 2 mm. A cepa de Agrobacterium LBA4404 THY- é suspensa em meio 20A e ajustada para 0,6 OD550 e 10 a 200 µl dessa suspensão são adicionados a cada placa contendo os hipocótilos.

[00271] Os segmentos de hipocótilo são transformados com Agrobacterium cepa LBA4404 THY- (Agro1) contendo PHP88193, um T-DNA com dois cassetes de expressão de "Traço" (SPCN e ZS-AMARELO1 N1)

(Tabela 7). Este Agrobacterium (Agro1) é usado sozinho (Tratamento de Controle) para infectar os segmentos de hipocótilo, ou como parte de uma mistura com outro Agrobacterium (Agro2) contendo PHP90094 (SEQ ID NO: 116), um cassete de expressão HA-WUS (Tabela 7). A mistura contém 95% de Agro1 e 5% de Agro2. Após o cocultivo com Agrobacterium em meio 20A (Tabela 9) sob luz baixa e 21 oC, os segmentos de hipocótilo são transferidos para uma progressão de meio de seleção começando com meio 70A (Tabela 9) por duas semanas, meio 70B (Tabela 9) por mais duas semanas e, em seguida, em meio 70C (Tabela 9) por duas semanas. Para germinação e enraizamento contínuos, pequenos brotos são transferidos para meio sólido que consiste em sais de MS de meia força, 10 g/l de sacarose, 0,5 mg/l de IBA e 5 g/l de ágar TC ajustado para pH 5,7. Uma vez formadas as raízes adequadas, as plântulas são transferidas para o solo na estufa.

[00272] No tratamento de controle com Agro1 sozinho, espera-se que nenhuma fuga (plantas T0 não transgênicas regeneradas) seja recuperada devido à seleção rigorosa na espectinomicina, a frequência de recuperação de plantas T0 transgênicas será baixa (ou seja, <1,5%), o intervalo de tempo desde a infecção por Agrobacterium até a recuperação de plântulas T0 levará tipicamente entre 3 a 4 meses, e a frequência de plantas T0 que contêm apenas uma única cópia do T-DNA de Traço e nenhum vetor (plasmídeo) será baixa. Por outro lado, quando um segundo Agrobacterium (Agro2) contendo PHP90094 é misturado com Agro1 e a mistura é usada para transformação, espera-se que i) nenhuma fuga seja recuperada, ii) a frequência de recuperação de plantas T0 transgênicas seja aumentada, iii) o intervalo de tempo desde a infecção por Agrobacterium até a recuperação de plantas T0 seja substancialmente reduzido e iv) a frequência de plantas T0 que contêm apenas uma única cópia do T-DNA de Traço sem estrutura de vetor (plasmídeo) seja substancialmente aumentada.

Exemplo 10: Uso de um cassete de expressão WUS2 fora das bordas de T-DNA contendo Traço para estimular a transformação e seleção de plantas de canola T0 de cópia única que não contêm nenhum cassete de expressão WUS2

[00273] A transformação é realizada com o uso de uma única cepa de Agrobacterium contendo um único T-DNA, com os cassetes de expressão de "Traço" dentro das bordas direita e esquerda do T-DNA e um cassete de expressão WUS logo fora da borda esquerda. Por exemplo, um plasmídeo (PHP0001, consultar a Tabela 7) contendo um cassete de expressão PRO::WUS avançado-35S com a seguinte configuração pode ser usado: RB + AT-UBQ10 PRO::CTP::SPCN::TERM UBQ14 + GM-UBQ PRO::ZS-AMARELO N1::TERM NOS + LB + INTENS FMV:INTENS PSCV:INTENS MMV:CAMV35S PRO::HA-WUS::TERM OS-T28.

[00274] Para o tratamento de controle, PHP88193, em que o T-DNA contém os cassetes de expressão SPCN e ZS-AMARELO N1 sem nenhum cassete de expressão WUS, espera-se que nenhuma fuga (plantas T0 não transgênicas regeneradas) seja recuperada devido à seleção rigorosa na espectinomicina, a frequência de recuperação de plantas T0 transgênicas será baixa (ou seja, <1,5%), o intervalo de tempo da infecção por Agrobacterium até a recuperação de plântulas T0 normalmente levará entre 3 a 4 meses e a frequência de plantas T0 que contêm apenas uma -cópia do T-DNA de Traço e nenhuma estrutura de vetor (plasmídeo) será baixa. Por outro lado, quando o cassete de expressão aprimorado-35S PRO::WUS descrito acima é adicionado ao plasmídeo imediatamente fora da LB do T- DNA, após a transformação mediada por Agrobacterium espera-se que i) nenhuma fuga seja recuperada, ii) a frequência de recuperação de plantas T0 transgênicas seja aumentada, iii) o intervalo de tempo desde a infecção por Agrobacterium até a recuperação de plantas T0 seja substancialmente reduzido e iv) a frequência de plantas T0 que contêm apenas uma única cópia do T-DNA de Traço com nenhuma estrutura WUS ou vetor (plasmídeo) integrada seja substancialmente aumentada. Exemplo 11: Cassete de expressão WUS localizado de 3' à borda esquerda melhora a recuperação de eventos de soja transgênica contendo os componentes dentro do T-DNA

[00275] Para esse experimento, foi construído um vetor binário contendo a origem de replicação do PVS1 e um T-DNA único. Um vetor de controle (PHP80728) com dois cassetes de expressão dentro das bordas direita e esquerda do T-DNA foi construído. O primeiro cassete de expressão consistia no promotor UBQ de soja que dirige a expressão de TAG-RFP, seguido pelo terminador UBQ3 de Arabidopsis. O segundo cassete de expressão consistia no promotor de SAMS de soja que dirige a expressão de um gene ALS resistente a herbicida de soja (HRA) e o terminador de ALS de soja.

[00276] Um segundo vetor (PHP81718) foi construído contendo o mesmo gene ALS resistente a herbicida e cassetes de expressão TAG-RFP idênticos localizados dentro do T-DNA e, adicionalmente, continha um cassete de expressão além da borda esquerda: GM-EF1A PRO::AT- WUS::TERM UBQ14. Esses dois plasmídeos foram introduzidos na cepa AGL1 de Agrobacterium para comparação.

[00277] Após a transformação dos cotilédones imaturos da variedade de soja Pioneer 93Y21 com o plasmídeo de T-DNA de controle (PHP80728) ou o WUS além do plasmídeo de T-DNA da Borda Esquerda (PHP81718), os cotilédones foram cultivados por duas semanas, movidos para o meio de maturação M5 suplementado com o herbicida seletivo 10 µg/l clorsulfuron antes de enviar as mudas T0 para a estufa. As plantas T0 foram amostradas e rastreadas por PCR quanto à presença dos cassetes de expressão ALS, TAG-RFP e WUS.

[00278] O WUS além da borda esquerda do plasmídeo de T-DNA (PHP81718) melhorou muito a eficiência da embriogênese somática (consultar a Figura 1), aumentando a eficiência da formação de embriões de um valor médio de menos de 5% no controle TAG-RFP (PHP80728) para mais de 25% no tratamento WUS (PHP81718). Isso se traduziu diretamente em um aumento da frequência de embriões somáticos transgênicos maduros capazes de germinar para formar plantas T0 transgênicas.

[00279] A transformação com o uso do vetor de controle TAG-RFP (PHP80728) não produziu plantas T0. Em comparação, o tratamento WUS (PHP81718) produziu algumas plantas T0. Seis plantas T0 foram analisadas por qPCR e quatro plantas T0 continham os cassetes de expressão ALS e TAG-RFP, sem WUS integrado e sem contaminação da estrutura do plasmídeo. Esse resultado demonstrou que WUS pode ser expresso transitoriamente após a entrega "além da borda" junto com o T- DNA integrado em níveis altos o suficiente para estimular a formação de embriões somáticos, sem ser integrado ao genoma. Isso forneceu um método eficiente para o uso de WUS para a produção rápida de eventos de soja transgênica (transportando as características ALS e TAG-RFP) sem ter que extirpar o cassete de expressão WUS uma vez que o mesmo foi apenas transitoriamente expresso e nunca foi integrado. Exemplo 12: Uso de um cassete de expressão WUS2 e um cassete de expressão de Vírus do Mosaico do Trigo RepA fora das bordas de T-DNA contendo Traço para estimular a transformação e seleção de plantas de maís T0 de cópia única que não continha cassetes de expressão WUS2 ou RepA

[00280] Para esses experimentos, dois plasmídeos são comparados. O primeiro contém um T-DNA que compreende os seguintes componentes; RB + LOXP + SI-UBI3 PRO::ZS-VERDE1::TERM PINII + SB- ALS PRO::ZM-HRA::TERM SB-PEPC1 + LB com um cassete de expressão adicional imediatamente além da borda esquerda; ZM-PLTP PRO::ZM- WUS2:: TERM IN2-1 (Consultar PHP86296 na Tabela 7). O segundo plasmídeo contém um T-DNA que compreende os seguintes componente; RB + LOXP + SI-UBI PRO::ZS-VERDE1::TERM PINII + SB-ALS PRO::ZM- HRA::TERM SB-PEPC1 + LB com dois cassetes de expressão adicionais imediatamente além da borda esquerda; ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2:: TERM IN2-1 + ZM-PLTP PRO::WDV-RepA::TERM OS-T28 TERM (Consultar PHP0002 na Tabela 7) (WDV-RepA é o vírus do anão do trigo RepA, consultar a Patente no U.S. 6.284.947 incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Para o PH1V69 puro Stiff-Stalk Pioneer, após transformação mediada por Agrobacterium com esses respectivos T-DNAs e seleção em 0,05 a 0,1 mg/l de imazapir durante a maturação e regeneração do embrião somático, as plantas T0 são analisadas por qPCR.

Ao usar PHP86296, espera-se que a frequência de recuperação de plantas T0 (em relação ao número de embriões imaturos iniciais) que são uma única cópia para os genes de Traço dentro do T-DNA sem estrutura de vetor (plasmídeo) seja de aproximadamente 10%. Quando o PHP0002 é usado no Agrobacterium, espera-se que as frequências de transformação sejam maiores do que o controle (PHP86296), o crescimento de embriões somáticos transgênicos seja acelerado e a frequência de recuperação de plantas T0 que são uma cópia única dos genes de Traço dentro do T-DNA, embora não tenham WUS e RepA integrados e nenhuma estrutura de vetor (plasmídeo), seja aumentada em relação ao tratamento de controle (PHP86296). Espera-se que o posicionamento dos cassetes de expressão WUS2 e RepA fora da Borda Esquerda do T-DNA forneça uma estimulação aprimorada da transformação sem a integração concomitante desses cassetes de expressão de genes morfogênicos.

[00281] Alternativamente, espera-se que um T-DNA contendo um único cassete de expressão fora da LB que compreende RB + SI-UBI PRO::ZS-VERDE::TERM PINII + SB-ALS PRO::ZM-HRA::TERM SB- PEPC1 + LB + ZM-PLTP PRO::WUS2~T2A~WDV-RepA::TERM IN2-1 (PHP0005) seja igualmente eficaz com frequências de transformação mais altas do que o controle, com crescimento acelerado de embriões somáticos transgênicos e com maior frequência de recuperação Plantas T0 que são uma cópia única para os genes de traço dentro do T-DNA, embora não tenham WUS e RepA integrados e nenhuma estrutura de vetor (plasmídeo) em relação ao tratamento de controle. Exemplo 13: Uso tanto de um cassete de expressão WUS2 quanto de um cassete de expressão amiRNA visando o transcrito de maís PICKLE (PKL) fora das bordas de T-DNA contendo Traço para estimular a transformação e seleção de plantas de maís T0 de cópia única que não continham cassetes de expressão WUS2 ou RepA

[00282] Para esses experimentos, dois plasmídeos são comparados. O primeiro, PHP86296 contém um T-DNA que compreende os seguintes componentes; RB + LOXP + SI-UBI3 PRO::ZS-VERDE1::TERM PINII + SB-ALS PRO::ZM-HRA::TERM SB-PEPC1 + LB com um cassete de expressão adicional imediatamente além da borda esquerda; ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1.

[00283] O segundo plasmídeo contém um PHP86296 modificado com um cassete de expressão adicional, ZM-PLTP PRO::PKLamiRNA::TERM OS-T28, fora da borda esquerda (PHP0003 na Tabela 7). O componente PKLamiRNA é um micro-RNA artificial que visa uma sequência curta no transcrito PICKLE (PKL) de maís que desestabiliza o transcrito PKL provocando degradação. Para o PH1V5T puro Stiff-Stalk

Pioneer, após transformação mediada por Agrobacterium com esses respectivos T-DNAs e seleção em 0,05 a 0,1 mg/l de imazapir durante a maturação e regeneração do embrião somático, as plantas T0 são analisadas por qPCR. Espera-se que o uso de PHP86296 resulte na recuperação de plantas T0 que são uma única cópia para os genes de traço dentro do T-DNA e não terão WUS e PKLamiRNA integrados sem estrutura de plasmídeo a uma frequência de cerca de 1% (em relação ao número de embriões imaturos de partida). Quando o PHP0003 é usado no Agrobacterium, espera-se que as frequências de transformação sejam maiores do que para PHP86296, o crescimento de embriões somáticos transgênicos seja acelerado e a frequência de recuperação de plantas T0 que são uma cópia única dos genes de Traço dentro do T-DNA, embora não tenham WUS e RepA integrados e sem estrutura de plasmídeo seja aumentada em relação ao tratamento de PHP86296.

[00284] Quando o Agrobacterium contendo esses dois plasmídeos é usado para transformar o tecido da folha de maís do PH1V5T puro, seguido pela seleção de 0,05 a 0,1 mg/l de imazapir durante a maturação e regeneração do embrião somático, as plantas T0 são analisadas por qPCR. Espera-se que o uso de PHP86296 resulte na recuperação de calos transgênicos e que após duas a três semanas os embriões somáticos sejam formados com uma frequência de cerca de 1% (em relação ao número de embriões imaturos de partida). Quando o PHP0003 é usado no Agrobacterium, espera-se que as frequências de transformação sejam maiores do que para PHP86296, os embriões somáticos se formem rapidamente diretamente das células da folha (sem estágio de calo intermediário) e a frequência de recuperação de plantas T0 que são cópias únicas para os genes de Traço dentro do T-DNA, embora não tenham WUS e PKLamiRNA integrados e nenhum vetor (plasmídeo), seja aumentada em relação ao tratamento com PHP86296. Exemplo 14: Uso de um repressor de tetraciclina expresso constitutivamente fora das bordas do T-DNA contendo Traço junto com um promotor reprimível que dirige a expressão de moPAT~DsRED dentro do T-DNA para promover recuperação de eventos resistentes ao bialafos de cópia única que não contêm o cassete de expressão do repressor imediatamente além da LB.

[00285] Para esses experimentos, o plasmídeo PHP38042 (Consultar Tabela 7) contém um T-DNA que compreende os seguintes componentes; RB + CAMV35S PRO:3xTET-OP:ADH1 INTRON1::MO- PAT~DS-VERMELHO EXPRESS::TERM PINII + LB + UBI1ZM PRO::REPRESSOR TET::TERM PINII.

[00286] Para o PH1V5T puro Stiff-Stalk Pioneer, após a transformação mediada por Agrobacterium com esse T-DNA e seleção em 3,0 mg/l de bialafos durante a maturação e regeneração do embrião somático, as plantas T0 são analisadas por qPCR. Espera-se que o uso de PHP38042 resulte na recuperação de plantas T0 que são uma cópia única para os genes de Traço dentro do T-DNA e não terão REPRESSOR TET integrado sem estrutura de plasmídeo em uma frequência de cerca de 3 a 5% (em relação ao número de embriões imaturos iniciais), e as plantas T0 que não possuem o REPRESSOR TET integrado sejam tolerantes a herbicidas e expressem DS-RED. Exemplo 15: Uso de um cassete de expressão WUS2 e um cassete de expressão de fusão de dCAS~repressor (REP) expresso constitutivamente fora das bordas de T-DNA contendo gene Traço para estimular a transformação e seleção de plantas de maís T0 de Cópia única que não contêm cassetes de expressão de WUS2 ou RepA

[00287] Para esses experimentos, dois plasmídeos são comparados. O primeiro contém um T-DNA que compreende os seguintes componentes: RB + SI-UBI3 PRO::ZS-VERDE1::TERM PINII + SB-ALS PRO::ZM-HRA::TERM SB-PEPC1 + LB (o Plasmídeo de Controle). O segundo plasmídeo contém os mesmos componentes dentro do T-DNA (RB + SI-UBI3 PRO::ZS-VERDE1::TERM PINII + SB-ALS PRO::ZM-HRA::TERM SB-PEPC1 + LB) mais três adicionais cassete de expressão imediatamente além da borda esquerda: i) um cassete de expressão contendo ZM-U6 PRO::gRNA::TERM ZM-U6; ii) cassete de expressão ZM-UBI PRO::dCAS9~REP::TERM PINII e iii) um cassete de expressão PLTP PRO::ZM-WUS2:: TERM IN2-1 (o Plasmídeo de Teste). O gRNA dentro do primeiro cassete de expressão foi projetado para direcionar o dCAS9~REP para a sequência SB-ALS PRO que silencia transcricionalmente a expressão de HRA e torna a célula sensível ao imazapir.

[00288] Para o HC69 puro Stiff-Stalk Pioneer, após a transformação mediada por Agrobacterium com cepa LBA4404 THY- de Agrobacterium contendo o plasmídeo de controle, durante a maturação e regeneração do embrião somático, as plantas T0 são analisadas por qPCR. Com o uso do plasmídeo de controle no Agrobacterium, espera-se que a frequência de recuperação de plantas T0 (em relação ao número de embriões imaturos infectados por Agrobacterium) que são uma cópia única para os genes de Traço dentro do T-DNA sem estrutura de vetor (plasmídeo) seja de aproximadamente 5%. Quando o plasmídeo Teste é usado no Agrobacterium, espera-se que as frequências de transformação sejam maiores do que o controle, o crescimento de embriões somáticos transgênicos seja acelerado e a frequência de recuperação de plantas T0 que são uma cópia única para os genes de Traço dentro do T-DNA, embora não tenha WUS e dCAS9~REP integrados e nenhuma estrutura de vetor (plasmídeo) seja aumentada em relação ao tratamento de controle. Espera-

se que o posicionamento dos cassetes de expressão dCAS9~REP e WUS2 fora da Borda Esquerda do T-DNA forneça uma estimulação aprimorada da transformação sem a integração concomitante desses cassetes de expressão de gene morfogênico.

[00289] Alternativamente, uma nuclease de dedo de zinco sintética fundida a um domínio repressor pode ser usada no lugar do gRNA e dCAS9~REP (Urritia et al., 2003, Genome Biol. 4: 231) no exemplo acima. Exemplo 16: Transformação de Algodão

[00290] Algodão Delintado (Gossypium hirsutum) cv. As sementes do Coker 310 e 312 foram esterilizadas superficialmente com o uso de alvejante comercial 40% (v/v; 80 ml de água sanitária e 120 ml de água) e 1 gota de Triton X-100, por 30 min e enxaguadas com água estéril três vezes com intervalos de 2 minutos. Após o tratamento com alvejante, as sementes foram enxaguadas com etanol a 95% durante 1 minuto e novamente enxaguadas 3 vezes com água esterilizada. Em seguida, as sementes foram colocadas em uma toalha de papel estéril para secar as sementes.

[00291] Vinte sementes esterilizadas na superfície foram germinadas em 'Meio de Semente de Algodão' (CSM; (GH3210)) contendo sais de MS ½ força (2,2 g/l), vitaminas B5 ½ força, 0,9 g/l cloreto de magnésio hexa-hidratado, 15 g/l de glicose, 3,6 g/l Phytagel (Sigma) com pH ajustado para 5,8, a 28 ° C, com 5 sementes por phytatray, e incubado no escuro por cerca de 7 a 9 dias.

[00292] Após cerca de 3 dias, quando os tegumentos das sementes se rompem e as radículas emergem. Os tegumentos das sementes foram removidos com o uso de uma pinça estéril, beliscando suavemente a ponta arredondada (calazas) de todas as sementes na superfície do meio para expor os cotilédones dobrados, e as radículas foram inseridas no meio. As phytatrays foram novamente incubadas a 28 ° C para completar a germinação. Após 8 dias, explantes de hipocótilo e cotilédone foram cortados das mudas com tesoura. Explantes de hipocótilo e cotilédone foram colocados em uma placa de petri estéril e com o uso de uma lâmina de bisturi foram cortados em segmentos de 0,9 cm (para hipocótilos) e segmentos de 0,5 cm quadrado (para cotilédones). Os segmentos em seguida foram colocados em uma placa de Petri estéril de 100x25 mm (largura x profundidade) com 35 ml de meio de cocultivo líquido (sais MS, vitaminas B5, 30 g/l de glicose, 0,9 g/l de cloreto de magnésio hexa-hidratado, 1,9 g/l nitrato de potássio, 0,1 g/l de mio-inositol, pH 5,8) em preparação para o tratamento com Agrobacterium.

[00293] Nesse experimento, o plasmídeo PHP89484 continha o T-DNA com os seguintes componentes: RB + AT-UBQ10 PRO::CTP::SPCN::TERM UBQ14 + GM-UBQ PRO::DS- VERMELHO2::TERM UBQ3 + LB + CAMV35S PRO::HA-WUS::TERM OS- T28 + INTENS FMC::INTENS PCSV::INTENS MMV. O plasmídeo de controle (PHP88193) no qual um cassete de expressão WUS não estava presente continha um T-DNA com os seguintes componentes; RB + AT- UBQ10 PRO::CTP::SPCN::TERM UBQ14 + GM-UBQ PRO::ZS- AMARELO1 N1::TERM NOS + LB.

[00294] A cepa de Agrobacterium LBA4404 contendo PHP89484 foi preparada em meio mínimo 810K mais 100 ug/ml de espectinomicina e acetosiringona 200 µM. A cultura de Agrobacterium foi cultivada em um agitador incubador a 28 ° C e 280 rpm, durante a noite até atingir uma OD em 600 nm de 0,6 a 0,8. As células bacterianas foram granuladas por centrifugação a 4.000 rpm durante 15 min e ressuspensas em meio 700A para uma OD600 final de 0,6. Quarenta ml da solução de Agrobacterium foram adicionados a cada placa de Petri contendo os segmentos cortados e incubados por 30 minutos com agitação intermitente.

[00295] Após a infecção, aproximadamente 50 segmentos de hipocótilo ou 50 explantes de cotilédones foram colocados em placas de Petri com meio de cocultivo sólido 710I e cobertos com um papel de filtro estéril. O cocultivo foi realizado por quatro dias a 28 °C sob luz fraca (5 µE) e fotoperíodo de 16h. Os explantes em seguida foram transferidos diretamente para a superfície do "Meio de Indução de Calo" (CIM) (sais MS, vitaminas B5, 30g/l de glicose, 0,9 g/l de cloreto de magnésio hexa-hidratado, 1,9 g/l de nitrato de potássio, 0,1 g/l de mio-inositol, 0,1 mg/l de cinetina, 0,1 mg/l (0,45 µM) de 2, 4-D, 500 mg/l de carbenicilina, 3,6 g/l de Phytagel (pH 5,8)) sem agente de seleção. Após 14 dias, os explantes foram transferidos para CIM com 60 mg/l de Espectinomicina.

[00296] Após 7 dias de tratamento com Agro, a expressão transitória de RFP foi observada sob um estereomicroscópio epifluorescente. Focos que expressam fortemente DS-RED foram observados nos explantes tanto de cotilédones quanto de hipocótilos em toda a superfície de corte. A expressão de DS-VERMELHO foi observada em calos estáveis que mostraram estruturas de expressão de DS-VERMELHO multicelulares após 3 semanas. Em comparação, quando um T-DNA de controle (em PHP88193) foi usado na mesma cepa e sob as mesmas condições experimentais, a entrega de T-DNA foi semelhante com base na fluorescência, mas três semanas após o tratamento com Agro, nenhum crescimento de estruturas multicelulares foi observado. Exemplo 17: Uso de intensificadores virais com a cevada LTP2 PRO para conduzir expressão de WUS2 melhora adicionalmente a recuperação de eventos transgênicos de cópia única apenas para o T-DNA de "Traço".

[00297] Agrobacterium cepa LBA4404 THY- contendo o plasmídeo de virulência PHP71539 (SEQ ID NO: 132) foi usado em todos os tratamentos. PHP86491 (SEQ ID NO: 110) contendo um T-DNA com os cassetes de expressão de "Traço" (RB + SB-UBI PRO::ZS-VERDE1::TERM OS-UBI + SB-ALS PRO::ZM-HRA::TERM PINII + LB) também foi usado em todos os tratamentos. Como controle negativo, o Tratamento 1 (Trt. n o 1), uma cepa de Agrobacterium única (Agro1) contendo apenas PHP86491 foi usada. Como controle positivo, o Tratamento 2 (Trt. no 2), um segundo Agrobacterium (Agro2) contendo PHP88158 (SEQ ID NO: 109) (RB + INTENS FMV:INTENS PSCV:INTENS MMV:ZM-PLTP PRO::ZM- WUS2::TERM IN2-1 + NOS PRO::CRC::TERM SB-GKAF + LB) foi misturado com Agro1. Ambas as suspensões de Agrobacteria foram ajustadas para 0,7 OD550 e em seguida misturadas a uma razão de 90% de Agro1 para 10% de Agro2. Em um terceiro tratamento, o Tratamento 3 (Trt. no 3), PHP93161 (SEQ ID NO: 130) (RB + LOXP + INTENS FMV:INTENS PCSV:INTENS MMV::LTP2 PRO::ZM-WUS2::TERM IN2-1 + NOS PRO::CRC::TERM SB- GKAF + LB) foi usado para substituir PHP88158 no Agro2, e a razão de Agro1/Agro2 foi mantida a mesma tanto no Trt. no 2 quanto no Trt. no 3 (90%/10%).

[00298] No Trt. No 1, trezentos e cinquenta e oito (358) embriões imaturos de HC69 puros foram infectados com a mistura de Agrobacterium e produziram noventa e uma (91) plantas T0 transgênicas (25% de frequência de transformação), com 11% dessas plantas sendo uma cópia única para os traços (em relação ao número inicial de embriões). No Trt. No 2, tanto a frequência de transformação quanto a frequência de cópia única foram melhoradas em relação ao Trt. No 1 (de 25% para 31% e de 11% para 16%, respectivamente). A melhoria no valor final de "% de Cópia única para Traços" foi a medida final do sucesso em termos de entrega de plantas transgênicas férteis de alta qualidade para a estufa. Este valor foi impactado pelos resultados de uma série de etapas individuais durante o processo, incluindo a frequência de transformação inicial (produzindo uma célula transgênica), a frequência de regeneração (produzindo uma planta a partir da célula transgênica) e finalmente a análise molecular. A análise molecular confirmou que as plantas transgênicas i) eram eventos de integração independentes, ii) continham uma única cópia do T-DNA desejado e seus cassetes de expressão de traço compostos, iii) não continham T-DNA com o cassete de expressão gênica morfogênica e iv) não continham sequências de estrutura de plasmídeo Agrobacterium. Cada um desses resultados (frequência de transformação, frequência de regeneração e frequência de controle de qualidade molecular) contribuiu para o desgaste em movimento através do processo e é resumido pelas frequências de "% de cópia única para Traços", como mostrado na Tabela 12. Devido à importância deste resultado final - a frequência de produção de plantas T0 férteis de alta qualidade - uma melhoria de 11% no Trt. No 1 a 16% no Trt. No 2 representou uma melhoria importante e substancial na eficiência de transformação geral para este valioso cruzamento consanguíneo Pioneer.

[00299] Como descrito acima, no PHP93161 (SEQ ID NO: 130) o promotor usado para expressar o gene ZM-WUS2 foi trocado do promotor ZM-PLTP no Trt. No 2 para o promotor LTP2 (Kalla et al., 1994, The Plant J. 6: 849-860) no Trt. No 3. Os promotores de plantas tanto no Trt. No 2 quanto no Trt. No 3 foram precedidos por três elementos intensificadores de promotor de três vírus separados, a saber, o Vírus do Mosaico da Escrofulária, o Vírus da Estria Clorótica do Amendoim e o Vírus do Mosaico Mirabilis (as três sequências de elementos intensificadores nesta ordem abreviadas "3xENH" na Tabela 12). Quando o promotor LTP2 foi usado no Trt. No 3, as frequências de transformação e "% de cópia única para Traços" aumentaram em relação ao Trt. No 2 (de 31% para 45% e de 16% para 24%,

respectivamente). Isso demonstrou que promotores diferentes foram úteis nessa estratégia. Isso também reforçou a conclusão alcançada comparando o Trt. No 1 com o Trt. No 2; misturando-se um Agrobacterium (contendo cassetes de expressão de traço dentro do T-DNA) com outro Agrobacterium (contendo o cassete de expressão gênica morfogênica dentro do T-DNA), a frequência geral de produção de plantas T0 férteis de alta qualidade (eventos independentes com base na caracterização de PCR) foi aumentada quando comparada ao uso de um único Agrobacterium contendo o T-DNA apenas com Traços. Tabela 12. Trt Cassete de No de No de Frequência % de WUS/CR . Expressão Embriõ plantas de Cópia C No Gênica es Imat. T0 Tnx. Transform única contido Morfogênica ação para Traços 1 Nenhum 358 91 25% 11% NA 2 3xINTENS:ZM- 370 113 31% 16% 0 PLTP:WUS2 3 3xINTENS:LTP2: 370 168 45% 24% 1 WUS2

[00300] A Tabela 12 mostra a eficiência de transformação quando nenhum Agro2 (cassete de expressão gênica morfogênica) estava presente como no Trt. No 1, ou com o Agro2 contendo um cassete de expressão gênica WUS2 com dois promotores diferentes (Trt. No 2 e Trt. No 3). A frequência de transformação foi calculada com base no número de plantas T0 transgênicas (Tnx) recuperadas em relação ao número inicial de embriões imaturos. A análise de cópia única para os genes de traço (ZS- VERDE1 E HRA) e para o gene morfogênico (WUS2) foi determinada com o uso de PCR quantitativo para determinar a presença do gene e o número de cópias. Plantas T0 que continham apenas uma única cópia dos genes de traço sem gene WUS2 foram usadas para calcular os valores de "% de cópia única para Traços" em relação ao número inicial de embriões imaturos. Exemplo 18: Melhoria na Transformação do Eixo Embrionário de Girassol com o Uso de uma Mistura de um Agrobacterium Contendo Traço e um Agrobacterium Contendo Gene Morfogênico

[00301] Agrobacterium cepa LBA4404 THY- foi usado para transformação de girassol (Helianthus annuus variedade F1503LG). Sementes de girassol maduras secas foram esterilizadas em uma solução de alvejante (10 a 15% v/v em água com uma gota de detergente Tween) por quinze (15) minutos e depois enxaguadas três (3) vezes em água estéril. As sementes foram embebidas durante a noite. Os embriões foram removidos das cascas amolecidas. Uma vez que os embriões foram isolados, incisões foram feitas na base dos cotilédones para facilitar o isolamento do embrião, expondo assim os primórdios foliares que revestem o meristema apical. A ponta do radical foi deixada presa ao embrião. Após o isolamento, os eixos embrionários (EAs) foram transferidos para placas de Petri para infecção. Dois Agrobacteria (cada uma contendo um plasmídeo de T-DNA diferente) foram suspensos em meio de infecção líquido. O primeiro Agrobacterium abrigava o plasmídeo PHP92349 (SEQ ID NO: 131) com um T-DNA contendo cassetes de expressão de "Traço" para os genes SPCN (resistência à espectinomicina) e DS-VERMELHO2 (fluorescência), contendo especificamente RB + LOXP + GM-QBU PRO::CTP: SPCN::TERM UBQ14 + GM-EF1A2 PRO::DS-VERMELHO2::TERM UBQ3 + LOXP + LB. O segundo Agrobacterium abrigava PHP90094 com um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica morfogênica para HA-WUS, contendo especificamente RB + CAMV35S PRO::HA-WUS::TERM OS-T28 + INTENSIFICADOR FMV:INTENSIFICADOR PCSV:INTENSIFICADOR MMV + LB. Cada uma das cepas de Agrobacterium foi suspensa em meio 20A e a concentração das suspensões bacterianas foi ajustada para 0,5 DO550. As suspensões de Agrobacterium foram misturadas a uma razão de 1:1 e cinco (5) ml da suspensão foram adicionados aos EAs para cobrir os explantes. Os EAs em seguida foram colocados sob vácuo com agitação suave durante vinte (20) minutos. Os EAs foram removidos do Agrobacterium e inseridos na extremidade da radícula em meio 272AC (níveis de sais de MS e vitamina padrão (Murashige e Skoog, 1962, Physiol. Plant 15: 473-497), 0,1 g/l de mio- inositol, 50 mg/l de timidina, acetosiringona 100 uM, 0,1 mg/l de BAP, 40 g/l de sacarose, 6 g/l de Bacto Agar, pH 5,6), deixando a cúpula apical acima do meio 272AC e colocados sob luz fraca a 21 oC durante três dias de cocultivo. Após o cocultivo, os EAs foram transferidos para meio de seleção de espectinomicina 272AB (sais de MS e níveis de vitamina padrão (Murashige e Skoog, 1962, Physiol. Plant 15: 473 a 497), 0,1 g/l de mio-inositol, 10 mg/l meropeno, 0,1 mg/l de meta-topolina, 30 mg/l de dicloridrato de espectinomicina, 0,1 ug/l, 40 g/l de sacarose, 6 g/l de Bacto Agar, pH 5,6) sob plena luz a 28 oC.

[00302] Os EAs foram deixados para crescer, com podas periódicas das folhas branqueadas. Dentro de aproximadamente três semanas após a exposição à espectinomicina, setores verdes ou folhas verdes inteiras foram observados. Este tecido verde também expressou DS- VERMELHO, confirmando que o T-DNA do PHP92349 foi integrado. Para o enraizamento, os eventos transgênicos foram transferidos para um material de enraizamento Bio-Dome Sponge (Park Seed Co., 3507 Cokesbury Road, Hodges, SC). Após a transferência para o material de enraizamento Sponge Bio-Dome, as raízes se formaram em uma a três semanas e as plantas foram colocadas em vasos e transferidas para a estufa ou câmaras de crescimento.

[00303] No experimento de controle, onde apenas um único Agrobacterium contendo plasmídeo de "Traço" PHP92349 foi usado, apenas três (3) plantas T0 transgênicas foram recuperadas de oitocentos e vinte e três (823) EAs infectados com Agrobacterium e resultou em uma frequência de transformação de 0,4%. Quando a mistura 1:1 do Agrobacterium contendo PHP92349 (cassete de expressão de "Traço") e do Agrobacterium contendo PHP90094 (um cassete de expressão gênica morfogênica (WUS)) foi usada, seis plantas T0 transgênicas foram recuperadas de trezentos e setenta (370) Agrobacterium infectaram EAs e resultou em uma frequência de transformação de 1,6%. Além disso, nenhuma das plantas transgênicas T0 contendo "Traço" continha o cassete de expressão gênica morfogênica (WUS). Isso demonstrou que o uso de uma mistura de dois Agrobacteria para conferir a vantagem da estimulação morfogênica sem integração do cassete de expressão gênica morfogênica melhorou a eficiência de transformação em girassol. Exemplo 19: Coentrega de dois plasmídeos T-DNA de uma cepa bacteriana

[00304] Uma alternativa para entregar um cassete (ou cassetes) de expressão de gene de traço e cassete (ou cassetes) de expressão de gene morfogênico com o uso de uma mistura de dois Agrobacteria (cada um contendo um dos dois plasmídeos) é usar um único Agrobacterium contendo dois T-DNAs diferentes. Isso é conseguido construindo-se um único plasmídeo que contém dois T-DNAs ou com o uso de dois plasmídeos separados com um contendo um cassete (ou cassetes) de expressão de gene de traço de T-DNA e o outro plasmídeo contendo um cassete de expressão gênica morfogênica de T-DNA. Cruzamentos consanguíneos de maís variam em muitas características morfológicas e fisiológicas. Uma manifestação desta variabilidade é a suscetibilidade do escutelo do embrião imaturo de diferentes cruzamentos consanguíneos à entrega e integração do T-DNA durante a infecção e cocultivo por Agrobacterium. Por exemplo, quando misturas de plasmídeos contidas em duas cepas bacterianas são usadas para transformar HC69 puro Não-Stiff- Stalk, muitas células recebem apenas um dos plasmídeos e, portanto, não são estimuladas a formar rapidamente novos embriões somáticos e produzir eventos transgênicos com um traço. Em vez de diferentes razões de Agro1: Agro2 para entregar as misturas de plasmídeo, a entrega de misturas de plasmídeo da mesma célula bacteriana pode resultar em uma frequência mais alta de células que recebem ambos os T-DNAs e permitir uma frequência mais alta de produção de eventos transgênicos. Quando usado para transformação, espera-se que uma frequência mais alta de embriões somáticos de formação rápida e plantas T0 resultantes contendo um único cassete de expressão gênica de traço de cópia de T-DNA sem DNA de vetor (plasmídeo) e sem integração do cassete de expressão gênica morfogênica de T-DNA seja produzida. Exemplo 20: Uso de plasmídeos T-DNA com diferentes origens de replicação para modular o número de cópias do plasmídeo

[00305] Para esses experimentos, dois T-DNAs diferentes são entregues em razões variáveis (um em relação ao outro) a partir de uma única célula bacteriana abrigando-se esses T-DNAs em dois plasmídeos com diferentes origens de replicação (ORI). As ORIs diferentes variam no número de plasmídeos mantidos com uma célula bacteriana. As ORIs diferentes podem ser usadas para titulação do número de cópias do plasmídeo para atingir diferentes razões dos plasmídeos na mesma célula bacteriana. Nesse experimento, projeta-se um plasmídeo com uma ou mais ORI selecionadas das seguintes ORIs: BBR1 ORI; PSA ORI; PSA + PARDE ORI; PVS1 ORI;

repABC ORI; RK2 ORI; RK2 + PARDE ORI; ou RSF1010 ORI (Publicação de Patente US 20180216123 e WO2017078836, incorporadas em sua totalidade ao presente documento a título de referência ) residindo dentro da mesma célula bacteriana. Dentro dessas várias ORIs, foi previamente determinado que pVS1 confere alto número de cópias de plasmídeo (~20 cópias/célula) e repABC confere baixo número de cópias (~1 a 2 cópias/célula) em Agrobacterium (Zhi et al., 2015, Plant Cell Rep. 34:745 a 754). Tabela 13.

SEQ DESCRIÇÃO ID NO: 134 BBR1 ORI; Agrobacterium tumefaciens 135 PSA ORI; Agrobacterium tumefaciens 136 PSA + PARDE ORI; Agrobacterium tumefaciens 137 PVS1 ORI; Agrobacterium tumefaciens 138 repABC ORI; Agrobacterium tumefaciens 139 RK2 ORI; Agrobacterium tumefaciens 140 RK2 + PARDE ORI; Agrobacterium tumefaciens 141 RSF1010 ORI; Agrobacterium tumefaciens

[00306] Para validar este conceito, um primeiro plasmídeo é construído com uma ORI que resulta em alto número de cópias do plasmídeo (pVS1) e um T-DNA que contém cassetes de expressão de genes de traço, como ZS-VERDE e HRA. Um segundo plasmídeo é construído com uma ORI que resulta em baixo número de cópias (repABC) e um T-DNA que contém um cassete de expressão gênica morfogênica (WUS2). Ambos os plasmídeos são introduzidos em um único Agrobacterium. Quando os plasmídeos que residem na mesma célula bacteriana são coentregues na mesma célula vegetal, a razão relativa de T-DNAs entregues refletirá a razão estável desses plasmídeos no Agrobacterium.

[00307] Desta forma, um efeito semelhante é produzido quando comparado com o método de mistura de dois Agrobacteria diferentes contendo um cassete de expressão gênica de traço T-DNA ou um cassete de expressão gênica morfogênica de T-DNA (ou seja, em uma mistura de 90%/10% de Agro1 e Agro2). Semelhante ao método de mistura de Agrobacterium, a entrega de misturas de plasmídeos da mesma cepa bacteriana pode resultar em uma frequência mais alta de células que recebem ambos os T-DNAs e permitir uma frequência de transformação mais alta. Quando usado para transformação, espera-se que uma frequência mais alta de embriões somáticos de formação rápida e plantas T0 resultantes contendo um único cassete de expressão gênica de traço de cópia de T-DNA sem DNA de vetor (plasmídeo) e sem integração de cassete de expressão gênica morfogênica de T-DNA seja produzida. Exemplo 21. Uso de um Cassete de Expressão Gênica Repressora Fora do T-DNA para Reprimir a Expressão de um Marcador Selecionável Dentro do T-DNA

[00308] Agrobacterium cepa LBA4404 THY- abrigando um T-DNA carregado de plasmídeo contendo um marcador selecionável repressível/não repressível além de um cassete de gene de expressão de repressor cognato fora do T-DNA. Por exemplo, o plasmídeo Agrobacterium contém o seguinte T-DNA: RB + CAMV35S PRO:TOP3::NPTII::TERM PINII + LB, em que TOP3 indica que o promotor CAMV35S tem três sequências de ligação do repressor de tetraciclina (sequências de operador) que circundam a caixa TATA e se sobrepõem ao local de início da transcrição, e UBI1ZM PRO::TETR::PINII localizado fora da borda esquerda. Além dos cassetes de expressão descritos na configuração acima, um cassete de expressão gênica de traço (com o uso do traço exemplificativo ZS-VERDE1) dentro do T-DNA, e um cassete de expressão gênica morfogênica (com o uso de WUS2) fora do T-DNA podem ser adicionados, resultando no seguinte plasmídeo Agrobacterium: RB + SB-UBI PRO::ZS-VERDE1::TERM OS-UBI + CAMV35S PRO:TOP3::NPTII::TERM PINII + LB + UBI1ZM PRO::TETR::PINII + PLTP::WUS2::In2-1 TERM (abreviado RB + ZS-VERDE + NPTII REPRESSÍVEL + LB + TETR + WUS2).

[00309] Essa segunda configuração (RB + ZS-VERDE + NPTII REPRESSÍVEL + LB + TETR + WUS2) é introduzida pela infecção por Agrobacterium em embriões imaturos de maís de HC69 puro. Na maioria dos eventos transgênicos recuperados, espera-se que apenas o T-DNA (contendo o cassete de expressão gênica de traço e o cassete de expressão gênica de marcador selecionável) se integre, enquanto os cassetes de expressão do gene TETR e WUS2 não se integram, resultando na expressão transiente dos genes TETR e WUS2. Assim, a formação de embriões somáticos estimulada por WUS2 aumenta a frequência de transformação, enquanto a expressão transitória de TETR resulta em uma repressão temporária da expressão de NPTII. Após uma semana de cultura pós- infecção, as células transgênicas são transferidas para meio de cultura contendo 150 mg/l de G418. Espera-se que a formação de embriões somáticos contendo o T-DNA integrado (com o cassete de expressão gênica de traço e o cassete de expressão gênica de marcador selecionável) seja prontamente selecionada e altas frequências de plantas transgênicas férteis sejam produzidas. Exemplo 22. Uso de um dCAS9: Cassete de Expressão Repressor de Fusão Fora do T-DNA para reprimir a expressão de um Marcador Selecionável Dentro do T-DNA

[00310] É usado Agrobacterium cepa LBA4404 THY abrigando um T-DNA carregado de plasmídeo contendo um promotor constitutivo que dirige a expressão de um marcador selecionável além de um cassete de expressão de repressor dCAS9 fora do T-DNA. Por exemplo, o plasmídeo Agrobacterium contém o seguinte T-DNA: RB + UBI1ZM PRO::NPTII::TERM PINII + LB, e UBI1ZM PRO::dCAS:EAR::PINII localizado fora da borda esquerda, em que EAR indica uma sequência que codifica um peptídeo repressor fundido na estrutura ao dCAS9. Além dos cassetes de expressão descritos na configuração acima, um cassete de expressão gênica de traço (com o uso do traço exemplificativo ZS-VERDE1) dentro do T-DNA, e um cassete de expressão gênica morfogênica (com o uso de WUS2) fora do T-DNA podem ser adicionados, resultando no seguinte plasmídeo Agrobacterium: RB + SB-UBI PRO::ZS-VERDE1::TERM OS-UBI + CAMV35S PRO:TOP3::NPTII::TERM PINII + LB + UBI1ZM PRO::dCAS9:EAR::PINII + zmu6 pro::gRNA::ZMU6 TERM + PLTP::WUS2::In2-1 TERM (abreviado RB + ZS-VERDE + NPTII REPRESSÍVEL + LB + dCAS9:EAR + gRNA + WUS2).

[00311] A segunda configuração (RB + ZS-VERDE + NPTII REPRESSÍVEL + LB + dCAS9: EAR + gRNA + WUS2) é introduzida pela infecção por Agrobacterium em embriões imaturos de maís de HC69 puro. Na maioria dos eventos transgênicos recuperados, espera-se que apenas o T-DNA (contendo o cassete de expressão gênica de traço e o cassete de expressão gênica de marcador selecionável) se integre, enquanto os cassetes de expressão do gene dCAS9:EAR e WUS2 não se integram, resultando na expressão transiente dos genes dCAS9:EAR e WUS2. Assim, a formação de embriões somáticos estimulada por WUS2 aumenta a frequência de transformação, enquanto a expressão transitória de dCAS9:EAR resulta em uma repressão temporária da expressão de NPTII.

Após uma semana de cultura pós-infecção, as células transgênicas podem ser transferidas para meio de cultura contendo 150 mg/l de G418. Espera-se que a formação de embriões somáticos contendo o T-DNA integrado (com o cassete de expressão gênica de traço e o cassete de expressão gênica de marcador selecionável) seja prontamente selecionada e altas frequências de plantas transgênicas férteis sejam produzidas.

[00312] Conforme usado no presente documento, as formas singulares "um", "uma", "o” e "a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Desse modo, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de tais células e referência "à proteína" inclui referência a uma ou mais proteínas e seus equivalentes conhecidos por aqueles versados na técnica, e assim por diante. Todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta revelação pertence, a menos que claramente indicado de outro modo.

[00313] Todas as patentes, publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível dos versados na técnica à qual esta revelação pertence. Todas as patentes, publicações e pedidos de patente estão incorporados no presente documento a título de referência na totalidade tal como se cada patente, publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como estando incorporado a título de referência na sua totalidade.

[00314] Embora a revelação supracitada tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo com propósitos de clareza de entendimento, certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (127)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de produção de uma planta transgênica que tem uma cópia de um cassete de expressão gênica de traço caracterizado pelo fato de que compreende: o contato de uma célula vegetal com um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica de traço e um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica morfogênica; selecionar uma célula vegetal contendo o cassete de expressão gênica de traço e nenhum cassete de expressão gênica morfogênica; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato compreende o contato simultâneo de uma célula vegetal com um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica de traço em uma primeira cepa bacteriana e um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica morfogênica em uma segunda cepa bacteriana.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato compreende o contato de uma célula vegetal com uma cepa bacteriana contendo um plasmídeo que compreende um cassete de expressão gênica de traço dentro do T-DNA e um cassete de expressão gênica morfogênica fora do T-DNA.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato compreende o contato de uma célula vegetal com o T-DNA contendo um cassete de expressão gênica de traço e o T- DNA contendo um cassete de expressão gênica morfogênica em uma cepa bacteriana.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou

(ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo Babyboom (BBM) ou um polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2); ou (iii) uma combinação de (i) e (ii).

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2).

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionada de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2.

10. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2).

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9 e o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionado de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 5, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica de traço compreende: um gene de traço selecionado a partir do grupo de um gene que confere resistência a pragas, um gene que confere resistência a herbicidas, um gene que confere tolerância ao estresse, um gene que confere resistência à seca, um gene que confere eficiência no uso de nitrogênio (NUE), um gene que confere resistência a doenças e um gene que confere uma capacidade de alterar uma via metabólica.

13. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são a mesma cepa bacteriana.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a mesma cepa bacteriana é uma Rhizobiales selecionada do grupo de uma Agrobacteria desarmada, uma bactéria Ochrobactrum e uma bactéria Rhizobiaceae.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3.

18. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são cepas bacterianas diferentes.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que as cepas bacterianas diferentes são selecionadas de: (i) uma Agrobacteria desarmada e uma bactéria Ochrobactrum; (ii) uma Agrobacteria desarmada e uma bactéria Rhizobiaceae; e

(iii) uma bactéria Rhizobiaceae e uma bactéria Ochrobactrum.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2.

22. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 13 ou 18, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 50:50.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 13 ou 18, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 75:25.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 13 ou 18, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 90:10.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 13 ou 18, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 95:5.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 13 ou 18, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 99:1.

28. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente um promotor selecionado da Tabela 4 ou Tabela 5.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor HBSTART3 ligado operacionalmente a um gene WUS.

31. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor Ubiquitina ligado operacionalmente a um gene LEC1.

32. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene LEC1.

33. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene LEC1.

34. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente uma sequência viral ou intensificadora vegetal.

35. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene BBM.

36. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene RepA.

37. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a uma fusão PKLamiRNA.

38. Semente de planta caracterizada pelo fato de que contém o cassete de expressão gênica de traço, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

39. Método de produção de uma planta transgênica que tem uma cópia de um cassete de expressão gênica de traço e uma cópia de um cassete de expressão de marcador selecionável caracterizado pelo fato de que compreende: o contato de uma célula vegetal com uma cepa bacteriana contendo um plasmídeo que compreende um T-DNA que tem uma borda direita e uma borda esquerda flanqueando um cassete de expressão gênica de traço e um cassete de expressão de marcador selecionável, e fora do T-DNA um cassete de expressão gênica repressora, em que o cassete de expressão de marcador selecionável compreende um promotor que é reprimido por um polipeptídeo repressor expresso por um gene repressor; selecionar uma célula vegetal contendo o cassete de expressão gênica de traço e o cassete de expressão de marcador selecionável e nenhum cassete de expressão gênica repressora; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica repressora compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o repressor de tetraciclina (TETR), um repressor de etametsulfuron (ESR), um repressor de clorsulfuron (CSR) e uma fusão de repressor-dCAS9 que tem um RNA guia direcionado ao promotor no T-DNA.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica o repressor de tetraciclina (TETR) que reprime o promotor ligado operacionalmente ao marcador selecionável no T-DNA.

42. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica o repressor de etametsulfuron (ESR) que reprime o promotor ligado operacionalmente ao marcador selecionável no T-DNA.

43. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica o repressor de clorsulfuron (CSR) que reprime o promotor ligado operacionalmente ao marcador selecionável no T-DNA.

44. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica a fusão de repressor-dCAS9 que tem um RNA guia que reprime o promotor ligado operacionalmente ao marcador selecionável no T-DNA.

45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 44, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica de traço compreende: um gene de traço selecionado a partir do grupo de um gene que confere resistência a pragas, um gene que confere resistência a herbicidas, um gene que confere tolerância ao estresse, um gene que confere resistência à seca, um gene que confere eficiência no uso de nitrogênio (NUE), um gene que confere resistência a doenças e um gene que confere uma capacidade de alterar uma via metabólica.

46. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana é uma Rhizobiales selecionada do grupo de uma Agrobacteria desarmada, uma bactéria Ochrobactrum e uma bactéria Rhizobiaceae.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-.

48. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2.

49. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3.

50. Semente de planta caracterizada pelo fato de que contém o cassete de expressão gênica de traço, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 45.

51. Método de produção de uma planta transgênica que tem uma cópia de um cassete de expressão gênica de traço caracterizado pelo fato de que compreende: contato simultâneo de uma célula vegetal com um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica de traço em uma primeira cepa bacteriana e um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica morfogênica em uma segunda cepa bacteriana. em que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo Babyboom (BBM) ou um polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2); ou (iii) uma combinação de (i) e (ii). em que o cassete de expressão gênica de traço compreende: um gene de traço selecionado a partir do grupo de um gene que confere resistência a pragas, um gene que confere resistência a herbicidas, um gene que confere tolerância ao estresse, um gene que confere resistência à seca, um gene que confere eficiência no uso de nitrogênio (NUE), um gene que confere resistência a doenças e um gene que confere uma capacidade de alterar uma via metabólica; selecionar uma célula vegetal contendo o cassete de expressão gênica de traço e nenhum cassete de expressão gênica morfogênica; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A,

WOX4, WOX5 e WOX9.

54. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2).

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionada de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2.

56. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2).

57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9 e o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionado de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2.

58. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são a mesma cepa bacteriana.

59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a mesma cepa bacteriana é uma Rhizobiales selecionada do grupo de uma Agrobacteria desarmada, uma bactéria Ochrobactrum e uma bactéria Rhizobiaceae.

60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-.

61. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2.

62. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3.

63. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana são cepas bacterianas diferentes.

64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que as cepas bacterianas diferentes são selecionadas de: (i) uma Agrobacteria desarmada e uma bactéria Ochrobactrum; (ii) uma Agrobacteria desarmada e uma bactéria Rhizobiaceae; e (iii) uma bactéria Rhizobiaceae e uma bactéria Ochrobactrum.

65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-.

66. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2.

67. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3.

68. Método, de acordo com a reivindicação 58 ou 63, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 50:50.

69. Método, de acordo com a reivindicação 58 ou 63, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 75:25.

70. Método, de acordo com a reivindicação 58 ou 63, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 90:10.

71. Método, de acordo com a reivindicação 58 ou 63, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 95:5.

72. Método, de acordo com a reivindicação 58 ou 63, caracterizado pelo fato de que a primeira cepa bacteriana e a segunda cepa bacteriana estão presentes em uma razão de 99:1.

73. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente um promotor selecionado da Tabela 4 ou Tabela 5.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS.

75. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor HBSTART3 ligado operacionalmente a um gene WUS.

76. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor Ubiquitina ligado operacionalmente a um gene LEC1.

77. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene LEC1.

78. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene LEC1.

79. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente uma sequência viral ou intensificadora vegetal.

80. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene BBM.

81. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene RepA.

82. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a uma fusão PKLamiRNA.

83. Semente de planta caracterizada pelo fato de que contém o cassete de expressão gênica de traço, de acordo com a reivindicação

51.

84. Método de produção de uma planta transgênica que tem uma cópia de um cassete de expressão gênica de traço caracterizado pelo fato de que compreende: o contato de uma célula vegetal com uma cepa bacteriana contendo um plasmídeo que compreende um cassete de expressão gênica de traço dentro do T-DNA e um cassete de expressão gênica morfogênica fora do T-DNA; em que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo Babyboom (BBM) ou um polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2); (iii) uma combinação de (i) e (ii). em que o cassete de expressão gênica de traço compreende: um gene de traço selecionado a partir do grupo de um gene que confere resistência a pragas, um gene que confere resistência a herbicidas, um gene que confere tolerância ao estresse, um gene que confere resistência à seca, um gene que confere eficiência no uso de nitrogênio (NUE), um gene que confere resistência a doenças e um gene que confere uma capacidade de alterar uma via metabólica; selecionar uma célula vegetal contendo o cassete de expressão gênica de traço e nenhum cassete de expressão gênica morfogênica; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal.

85. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX.

86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9.

87. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2).

88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionada de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2.

89. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2).

90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9 e o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionado de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2.

91. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana é uma Rhizobiales selecionada do grupo de uma Agrobacteria desarmada, uma bactéria Ochrobactrum e uma bactéria Rhizobiaceae.

92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-.

93. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2.

94. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3.

95. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente um promotor selecionado da Tabela 4 ou Tabela 5.

96. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS.

97. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor HBSTART3 ligado operacionalmente a um gene WUS.

98. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor Ubiquitina ligado operacionalmente a um gene LEC1.

99. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene LEC1.

100. Método, de acordo com a reivindicação 95,

caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene LEC1.

101. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente uma sequência viral ou intensificadora vegetal.

102. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene BBM.

103. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene RepA.

104. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a uma fusão PKLamiRNA.

105. Semente de planta caracterizada pelo fato de que contém o cassete de expressão gênica de traço, de acordo com a reivindicação 84.

106. Método de produção de uma planta transgênica que tem uma cópia de um cassete de expressão gênica de traço caracterizado pelo fato de que compreende: o contato de uma célula vegetal com uma cepa bacteriana que compreende um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica de traço e um T-DNA contendo um cassete de expressão gênica morfogênica; em que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo Babyboom (BBM) ou um polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2); ou (iii) uma combinação de (i) e (ii). em que o cassete de expressão gênica de traço compreende: um gene de traço selecionado a partir do grupo de um gene que confere resistência a pragas, um gene que confere resistência a herbicidas, um gene que confere tolerância ao estresse, um gene que confere resistência à seca, um gene que confere eficiência no uso de nitrogênio (NUE), um gene que confere resistência a doenças e um gene que confere uma capacidade de alterar uma via metabólica; selecionar uma célula vegetal contendo o cassete de expressão gênica de traço e nenhum cassete de expressão gênica morfogênica; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal.

107. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX.

108. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9.

109. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2).

110. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionada de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2.

111. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e o polipeptídeo Babyboom (BBM) ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2).

112. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionada de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 e WOX9 e o polipeptídeo Babyboom (BBM) é selecionado de BBM2, BMN2 e BMN3 ou o polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 2 (ODP2) é ODP2.

113. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que a dita cepa bacteriana é uma Rhizobiales selecionada do grupo de uma Agrobacteria desarmada, uma bactéria Ochrobactrum e uma bactéria Rhizobiaceae.

114. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo fato de que a Agrobacteria desarmada é selecionada do grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-.

115. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo fato de que a bactéria Ochrobactrum é selecionada da Tabela 2.

116. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo fato de que a bactéria Rhizobiaceae é selecionada da Tabela 3.

117. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente um promotor selecionado da Tabela 4 ou Tabela 5.

118. Método, de acordo com a reivindicação 117,

caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS.

119. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor HBSTART3 ligado operacionalmente a um gene WUS.

120. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor Ubiquitina ligado operacionalmente a um gene LEC1.

121. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene LEC1.

122. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene LEC1.

123. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende adicionalmente uma sequência viral ou intensificadora vegetal.

124. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene BBM.

125. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS fundido a uma fusão do peptídeo viral T2A e gene RepA.

126. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica morfogênica compreende um promotor PLTP ligado operacionalmente a um gene WUS e um promotor PLTP ligado operacionalmente a uma fusão PKLamiRNA.

127. Semente de planta caracterizada pelo fato de que contém o cassete de expressão gênica de traço, de acordo com a reivindicação 106.