CN111675755B - 调控植物耐盐性的狗牙根转录因子CdWRKY50及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控植物耐盐性的狗牙根转录因子CdWRKY50及其应用，涉及基因工程领域。狗牙根转录因子CdWRKY50，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。狗牙根转录因子CdWRKY50的应用是：①获得耐盐性下降的转基因拟南芥的应用；②通过VIGS技术获得耐盐性提高的CdWRKY50沉默狗牙根的应用。本发明首次克隆得到了调控植物耐盐性的狗牙根转录因子CdWRKY50，功能验证发现过表达CdWRKY50降低了转基因拟南芥的耐盐性，而通过VIGS沉默CdWRKY50提高了狗牙根的耐盐性，说明该基因负调控植物的耐盐性；本发明CdWRKY50为通过基因工程技术快速、精准培育耐盐狗牙根种质提供了全新的基因资源。

Description

调控植物耐盐性的狗牙根转录因子CdWRKY50及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种调控植物耐盐性的狗牙根转录因子CdWRKY50及其应用。

背景技术

盐胁迫是影响植物生长发育和粮食产量的主要非生物胁迫之一。据统计，全球盐渍化土壤面积约8.3×10⁸公顷，占陆地面积的6％(Rengasamy,2016)。其中，我国盐渍化土壤面积高达3600万公顷，占全国可利用面积的4.88％(王佳丽等，2011)，严重制约了我国经济社会的发展。狗牙根(Cynodondactylon)属于禾本科狗牙根属多年生草本植物，具有质地细腻、色泽浓绿及根茎蔓延性强等特性，被广泛应用于庭院、公园、足球场、高尔夫球场等，是主要的暖季型建坪草种之一(范吉标等，2014)。由于其具有一定的耐盐碱能力，狗牙根也被选做盐碱地生态修复的主要草种(王善仙等，2011)。然而，由于近年来不合理的施肥灌溉等原因，土壤盐渍化的范围和程度在不断扩大，重度盐碱地盐离子浓度高达2.0％以上，对狗牙根的耐盐能力提出了更高的要求。因此，发掘耐盐基因，快速精准地培育狗牙根耐盐新种质，对实现经济社会的可持续发展具有重要的意义。

WRKY是植物中最大的转录因子家族之一，其成员含有一个或者两个保守的WRKY结构域和一个非典型的锌指结构。研究表明，WRKY转录因子在植物应答低温、高盐、干旱、高温等非生物胁迫中起到了重要作用(Dingetal.,2014；Caietal.,2015；Gongetal.,2015；Daietal.,2016)。当植物受到非生物胁迫时，WRKY基因通常能在短时间内被诱导表达，通过调控下游逆境响应基因的表达，从而增强植物的抗逆能力，其对于通过基因工程改良植物的耐逆性，包括耐盐性具有巨大的潜在应用价值。然而，狗牙根中至今未有耐盐相关的WRKY转录因子的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控植物耐盐性的狗牙根转录因子CdWRKY50及其应用。

本发明的目的是这样实现的：

根据前期狗牙根盐胁迫响应转录组数据，筛选到了一个受盐胁迫诱导的狗牙根WRKY转录因子；以‘WBG128’为材料并根据狗牙根全长转录组序列设计特异引物克隆获得该基因全长；对这个基因编码的蛋白序列进行分析发现它与高粱的WRKY50具有较高同源性，因此该基因被命名为CdWRKY50；在拟南芥中过表达CdWRKY50降低了转基因植株的耐盐性，而利用VIGS技术沉默内源CdWRKY50提高了狗牙根的耐盐性。

一、调控植物耐盐性的狗牙根转录因子CdWRKY50

其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，长度为435bp；编码的蛋白由144个氨基酸组成，序列如SEQIDNO.2所示。

二、调控植物耐盐性的狗牙根转录因子CdWRKY50的应用

1、获得耐盐性下降的转基因拟南芥的应用

通过以下步骤实现：

①构建35S::CdWRKY50过表达载体：将CdWRKY50基因的ORF克隆至带有35S强启动子的植物表达载体中；

②转化农杆菌：将构建好的35S::CdWRKY50过表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101；

③获得过表达CdWRKY50的转基因拟南芥：通过浸花法将CdWRKY50插入拟南芥染色体，通过抗性筛选和表达量鉴定获得过表达CdWRKY50的转基因拟南芥纯合系；

④转基因拟南芥耐盐性鉴定：以过表达CdWRKY50的转基因拟南芥纯合系为材料，检测分析其在盐胁迫条件下生理指标变化，结果显示与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的耐盐性下降。

2、通过VIGS技术获得耐盐性提高的CdWRKY50沉默狗牙根的应用

通过以下步骤实现：

①构建pCa-γ bLIC-CdWRKY50载体：将CdWRKY50基因的特异片段250bp连接至pCa-γ bLIC载体中；

②转化农杆菌：将pCaBS-α、pCaBS-β、pCa-γ bLIC-CdWRKY50质粒分别转化农杆菌EHA105；

③获得CdWRKY50沉默的狗牙根植株：含有pCaBS-α、pCaBS-β、pCa-γ bLIC-CdWRKY50质粒的EHA105等量混合后注射烟草叶片，将注射的烟草研磨液摩擦接种狗牙根叶片，获得CdWRKY50沉默的狗牙根植株；

④CdWRKY50沉默的狗牙根植株耐盐性鉴定：以CdWRKY50沉默狗牙根为材料，检测分析其在盐胁迫条件下的生理指标变化，结果显示CdWRKY50的沉默提高了狗牙根的耐盐性。

本发明具有下列优点和积极效果：

①利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了调控植物耐盐性的狗牙根转录因子CdWRKY50，功能验证发现过表达CdWRKY50降低了转基因拟南芥的耐盐性，而通过VIGS沉默CdWRKY50提高了狗牙根的耐盐性，说明该基因负调控植物的耐盐性。

②本发明提供的CdWRKY50为通过基因工程技术快速、精准培育耐盐狗牙根种质提供了全新的基因资源。

附图说明

图1是CdWRKY50与其他物种的WRKY50转录因子的氨基酸序列同源性分析，

(a)—序列比对；

(b)—进化树分析。

图2是CdWRKY50基因在盐胁迫下的表达分析，

图3是CdWRKY50转基因拟南芥定量检测及盐处理生理指标，

(a)—正常处理下拟南芥表型；

(b)—150mMNaCl处理的拟南芥表型；

(c)—转基因拟南芥中CdWRKY50的相对表达量；

(d)—鲜重；

(e)—相对电导率；

(f)—MDA含量。

图4是BSMV:CdWRKY50狗牙根定量检测及盐处理生理指标，

(a)—CdWRKY50表达量；

(b)—MDA含量；

(c)—H₂O₂含量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明：

1、植物材料：本发明所用植物材料为野生狗牙根种质‘WBG128’。

2、狗牙根WRKY50的克隆：

2.1、狗牙根叶片的总RNA提取：取适量狗牙根叶片，加入液氮研磨成粉末，转移到RNAase-free的离心管中，加入1mLTrizol，漩涡混匀，室温放置5min，4℃、12000rpm离心5min；取上清液转移到新的离心管中，加入200μL氯仿，充分混匀，室温放置10min，4℃、12000rpm离心20min；取上清液转移到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置10min，4℃、12000rpm离心10min；弃上清，加入1mL75％室温乙醇洗涤沉淀，4℃、12000rpm离心5min。弃上清，倒扣离心管，静置5～10min，加入30μLRNAase-free的ddH₂O溶解沉淀，即为总RNA。

2.2、cDNA的合成：利用MonScriptTMRTall-in-oneMix(withdsDNase)反转录试剂盒(莫纳，武汉，中国)进行cDNA第一链的合成，按顺序加入下列试剂：

混匀，依次37℃2min，55℃15min，85℃15s以终止反应。

2.3、CdWRKY50克隆引物设计：基于本实验室狗牙根盐胁迫响应转录组测序结果，我们筛选到一个受盐胁迫显著诱导的WRKY转录因子，根据狗牙根全长转录组序列设计一对扩增引物，引物序列如下：

CdWRKY50-F：5’-ATGGTGAACAGAGCGGCTGG-3’

CdWRKY50-R：5’-TCAGTAGGATGACTCGGAAG-3’

2.4、CdWRKY50的CDS扩增：以‘WBG128’的cDNA为模板，利用CdWRKY50-F和CdWRKY50-R引物进行PCR扩增，反应体系和扩增程序如下：

2.5、CdWRKY50的CDS序列获得：反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化扩增产物，连接TA/Blunt-Zero克隆载体(诺唯赞，南京，中国)，转化大肠杆菌DH5α，选取阳性克隆进行测序，成功获得了CdWRKY50基因的CDS全长序列，包含一个完整的开放阅读框(435bp)，核苷酸序列如SEQID：1所示。我们将含有CdWRKY50序列的重组载体命名为Blunt-CdWRKY50。

2.6、序列分析：基于所得到的CdWRKY50的蛋白序列(SEQID:2)，通过Blast分析发现其与其他物种的WRKY50序列具有高度同源性；对CdWRKY50和SbWRKY50、PhWRKY50、ZmWRKY50等进行氨基酸序列比对和进化树分析，结果显示CdWRKY50蛋白具有一个保守WRKY结构域和一个C₂H₂锌指结构(图1a)，且CdWRKY50与高粱的SbWRKY50亲缘关系最近(图1b)。

3、CdWRKY50在盐胁迫处理下的表达模式分析：

选取两个月苗龄的狗牙根进行高盐(200mMNaCl)处理，对不同处理时间的狗牙根进行取样(选取同一节位的叶片)，迅速置于液氮中速冻，并保存于-70℃冰箱中备用。具体方法如下：

3.1、RNA提取和cDNA合成(如步骤2.1和2.2所述)。

3.2、CdWRKY50定量引物设计：根据CdWRKY50的序列，设计特定量引物CdWRKY50-qRT-F和CdWRKY50-qRT-R，CdACT2为内参基因。引物序列如下：

CdWRKY50-qRT-F：5'-TGCTGCTGGTTATCACCACA-3'

CdWRKY50-qRT-R：5'-TCAGTAGGATGACTCGGAAG-3'

CdACT2-qRT-F：5'-TCTGAAGGGTAAGTAGAGTAG-3'

CdACT2-qRT-R：5'-ACTCAGCACATTCCAGCAGAT-3'

3.3、实时荧光定量PCR：以不同盐处理时间段的狗牙根cDNA为模板，利用定量引物进行qRT-PCR扩增，反应体系和扩增程序如下：

结果显示：CdWRKY50的表达量随着盐处理时间的增加先上升后下降，6h时CdWRKY50的表达量达到峰值(图2)。

4、CdWRKY50转基因拟南芥的获得及耐盐性表型分析：

4.1、35S::CdWRKY50过表达载体构建：根据CdWRKY50的编码区序列，设计带有酶切位点的特异性引物：

CdWRKY50-OE-F：5’-CTTCTAGAATGGTTAGCTTGCGGAGACG-3’

CdWRKY50-OE-R：5’-GGGGATCCCTAAGATGTCAAATTCTCGG-3’

以Blunt-CdWRKY50质粒为模板，利用高保真酶PrimeSTAR(宝生物，大连，中国)进行扩增，回收并纯化PCR产物，连接TA/Blunt-Zero克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌落PCR鉴定获得阳性单克隆送测，提取测序正确的质粒，命名为Blunt-CdWRKY50(OE)；分别对Blunt-CdWRKY50(OE)质粒和pMD35S过表达载体进行双酶切，体系如下：

混匀，稍离心，37℃酶切30min，回收并纯化目的片段。将回收的CdWRKY50片段与pMD35S酶切载体连接，体系如下：

混匀，稍离心，25℃连接30min，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，经过菌落PCR检测，获得阳性单克隆，提取酶切验证正确的质粒，即为pMD35S-CdWRKY50。

4.2、转化农杆菌GV3101：将构建好的pMD35S-CdWRKY50过表达载体采用冻融法转化农杆菌GV3101，具体步骤如下：

A.取-70℃保存的农杆菌GV3101感受态于冰上融化；

B.每100μL感受态加入2μL质粒pMD35S-CdWRKY50，稍混匀，依次冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰上5min；

C.加入1mL不含抗生素的LB液体培养基，28℃振荡培养2～3h；

D.6000rpm离心1min收菌，留取100μL左右上清液重悬菌体，均匀涂布于含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的LB固体培养基上，28℃倒置培养48h；

E.PCR扩增鉴定阳性菌落，接种阳性单菌落到LB液体培养基中(50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平)，28℃，250rpm培养48h，菌液用于拟南芥遗传转化或-70℃保存；

4.3、浸花法转化拟南芥：将含有pMD35S-CdWRKY50过表达载体的GV3101农杆菌转化拟南芥，具体步骤如下：

A.选取花序较多的拟南芥，剪掉荚果，用于转化；

B.挑取含有pMD35S-CdWRKY50质粒的农杆菌单菌落到10mL含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的LB液体培养基中，28℃，220rpm震荡培养过夜；

C.次日，将其按照1：50的比例转接到50mL新鲜的含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的LB液体培养基，28℃，220rpm震荡培养至其OD600＝0.6-0.8，8000rpm，离心8min收集农杆菌菌体；

D.将离心收集的农杆菌用5％的蔗糖溶液(含0.02％的SilwetL-77)重悬，混匀，即为浸花液；

E.将拟南芥花序放入浸花液中摇晃浸染30s，侵染过的拟南芥先在黑暗条件下培养24h，后转入生长室正常培养；

F.待种子成熟之后，收取T₀种子，37℃烘干，待筛选。

4.4、转基因拟南芥阳性苗的筛选及鉴定：将收获的T₀代拟南芥种子，经过75％乙醇消毒后均匀播撒在含有50μg/mL卡那霉素的MS培养基上进行筛选，挑取绿苗移栽至基质中培养，单株收取T₁代种子。取的T₁代种子经过75％乙醇消毒后均匀播撒在含有50μg/mL卡那霉素的MS培养基上筛选7～10d，为了保证单拷贝插入，选取绿苗：黄化苗为3：1的过表达拟南芥株系，取少量绿苗提取RNA，检测CdWRKY50的表达量，选取表达量较高的两个株系(OE7和OE12)转移到基质土中继续培养(图3c)，单株收取T₂代拟南芥种子；将T₂代拟南芥种子萌发于含50μg/mL卡那霉素的MS培养基，筛选获得纯合系。

4.5、转基因拟南芥耐盐性分析：

4.5.1、转基因拟南芥幼苗的耐盐性分析：将CdWRKY50转基因拟南芥株系(OE7和OE12)和野生型拟南芥的种子，在MS培养基上萌发7-10d；选择生长一致的幼苗转移到含有150mMNaCl的MS培养基中。培养10d后发现，与野生型相比，CdWRKY50转基因植株叶尖泛黄，叶片变小或卷曲，侧根数量明显减少(图3b)，生物量显著降低(图3d)，表明CdWRKY50基因降低了转基因拟南芥幼苗的耐盐性。

4.5.2、转基因拟南芥成苗的耐盐性分析：将CdWRKY50转基因拟南芥株系(OE7和OE12)和野生型拟南芥的种子，在MS培养基上萌发7-10d；选择生长一致地拟南芥移栽至直径10cm的塑料盆中，每盆九棵，于22℃的生长室进行培养；用250mM的NaCl溶液对3周苗龄的拟南芥进行盐处理，处理7天后分别测定植株的相对电导率(EL)和丙二醛含量(MDA)；结果显示，在对照条件下，EL和MDA含量在各野生型和过表达植株之间没有显著差异，而经过NaCl处理后，转基因拟南芥的EL和MDA含量均显著高于野生型，表明过量表达CdWRKY50降低了拟南芥成苗的膜系统稳定性，从而降低了拟南芥的耐盐性(图3e、f)。

5、CdWRKY50狗牙根沉默材料的构建及耐盐性表型分析：

5.1、pCa-γ bLIC-CdWRKY50载体构建：基于所获得的CdWRKY50的CDS序列，设计一对带有不依赖于连接的克隆位点的引物：

CdWRKY50-VI-F：5’-AAGGAAGTTTAAGGGGTCAAGAAGCGCGTCGAGA-3’

CdWRKY50-VI-R：5’-AACCACCACCACCGTTAGGATGACTCGGAAGAGT-3’

以TA-CdWRKY50质粒为模板，利用高保真酶PrimeSTAR(宝生物，大连，中国)扩增CdWRKY50的特异片段，长度为250bp，回收并纯化PCR产物；用T4DNA聚合酶消化CdWRKY50特异片段和ApaI-linearizedpCa-γ bLIC的回收产物，形成粘性末端，体系如下：

按上述体系加好，混匀，稍离心，25℃恒温反应30min，75℃反应10min使酶失活，迅速冰浴冷却。将具有粘性末端的CdWRKY50特异片段和ApaI-linearizedpCa-γ bLIC载体连接，反应体系如下：

按照上述体系加好，混匀，稍离心，66℃反应2min，室温冷却2min，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜。挑选单克隆菌落于400μL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm震荡培养6-8h，经菌液PCR鉴定成功后，提取pCa-γ bLIC-CdWRKY50重组质粒。

5.2、农杆菌的转化：用冻融法将质粒pCaBS-α，pCaBS-β，pCa-γ bLIC以及pCa-γbLIC-CdWRKY50分别转化农杆菌EHA105感受态，具体方法见4.2。

5.3、农杆菌渗透法转染烟草叶片并侵染狗牙根幼苗，具体步骤如下：

A.挑选阳性单菌落于1mL含有25μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养24h；

B.次日按1：50接种于50mL含上述同种抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养，直至OD600达到0.6～0.8；

C.4000rpm离心10min，弃上清，用侵染液(10mMMgCl2,10mM2-(N-morpholino)ethanesulfonicacid(MES)和0.1mMacetosyringone,pH＝5.2)重悬，调整OD600为0.5～0.6，28℃孵育2-3h；

D.将含pCaBS-α，pCaBS-β和pCa-γ bLIC-CdWRKY50的菌液等比例混合(简称BSMV:CdWRKY50)，用1mL无针头的注射器将混合菌液注射入健康幼嫩的8叶期的烟草叶片，以pCaBS-α，pCaBS-β和pCa-γ bLIC等比例组成的混合菌液作为对照(简称BSMV:00)；

E.24℃培养侵染的烟草7-10d，采集注射的叶片，用20mM的磷酸缓冲液(pH7.2)和1％的硅藻土中充分研磨，用双层纱布过滤后，离心去除残渣，收集研磨液；

F.将上述研磨液在金刚砂的辅助下转接狗牙根叶片。

5.4、CdWRKY50沉默的狗牙根植株耐盐性鉴定：将接种的狗牙根转移到28℃的恒温培养箱中，培养7d后用250mM的NaCl溶液处理，处理7d后取样用于检测CdWRKY50基因的表达情况以及MDA和H₂O₂含量。首先利用qRT-PCR技术分析CdWRKY50的表达情况，发现与对照BSMV:00狗牙根相比，BSMV:CdWRKY50狗牙根中CdWRKY50的转录水平显著降低，说明VIGS技术成功抑制了CdWRKY50的表达(图4a)；进一步，生理指标检测结果显示，在正常条件下，BSMV:CdWRKY50和BSMV:00狗牙根的MDA和H₂O₂含量没有显著差异，但是盐处理显著降低了BSMV:CdWRKY50的MDA和H₂O₂含量(图4b、c)，表明沉默狗牙根内源CdWRKY50的表达能够提高狗牙根的耐盐性。

序列表

<110> 中国科学院武汉植物园

<120> 调控植物耐盐性的狗牙根转录因子CdWRKY50及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 435

<212> DNA

<213> 狗牙根(Cynodondactylon)

<400> 1

atggtgaaca gagcggctgg tgagaacggc ggccaccacc gggcgacgcc gtcgcggatc 60

gggttccgga cgcggtcgga ggtggacgtg ttggacgacg ggttcaagtg gcgcaagtac 120

gggaagaagg cggtgaagag cagccccaac ccgaggaact actaccgctg ctccgtggag 180

ggctgcgggg tcaagaagcg cgtcgagagg gactgccacg accagcgcta cgtcatcacc 240

acctacgacg gcgtccacaa ccacgctgcc ggcagcgccg ctgctgctgg ttatcaccac 300

agcgccacgc cgcaaccggc ggctccgtac gccgcggcga cgacgacgtt ggcagccgaa 360

gctccttctg acatatgggg gatgcaacag atgcatgctg ctgcgatggc tcactcttcc 420

gagtcatcct actga 435

<210> 2

<211> 144

<212> PRT

<213> 狗牙根(Cynodondactylon)

<400> 2

Met Val Asn Arg Ala Ala Gly Glu Asn Gly Gly His His Arg Ala Thr

1 5 10 15

Pro Ser Arg Ile Gly Phe Arg Thr Arg Ser Glu Val Asp Val Leu Asp

20 25 30

Asp Gly Phe Lys Trp Arg Lys Tyr Gly Lys Lys Ala Val Lys Ser Ser

35 40 45

Pro Asn Pro Arg Asn Tyr Tyr Arg Cys Ser Val Glu Gly Cys Gly Val

50 55 60

Lys Lys Arg Val Glu Arg Asp Cys His Asp Gln Arg Tyr Val Ile Thr

65 70 75 80

Thr Tyr Asp Gly Val His Asn His Ala Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala

85 90 95

Gly Tyr His His Ser Ala Thr Pro Gln Pro Ala Ala Pro Tyr Ala Ala

100 105 110

Ala Thr Thr Thr Leu Ala Ala Glu Ala Pro Ser Asp Ile Trp Gly Met

115 120 125

Gln Gln Met His Ala Ala Ala Met Ala His Ser Ser Glu Ser Ser Tyr

130 135 140

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggtgaacag agcggctgg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagtaggatg actcggaag 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgctggtt atcaccaca 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagtaggatg actcggaag 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgaagggta agtagagtag 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcagcacat tccagcagat 20

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttctagaatg gttagcttgc ggagacg 27

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gggatcccta agatgtcaaa ttctcgg 27

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aggaagttta aggggtcaag aagcgcgtcg aga 33

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accaccacca ccgttaggat gactcggaag agt 33

Claims (4)

1.一种调控植物耐盐性的狗牙根转录因子CdWRKY50，其特征在于：

核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

2.按权利要求1所述调控植物耐盐性的狗牙根转录因子CdWRKY50的应用，其特征在于：

①获得耐盐性下降的转基因拟南芥的应用；

②通过VIGS技术获得耐盐性提高的CdWRKY50沉默狗牙根的应用。

3.按权利要求2所述狗牙根转录因子CdWRKY50的应用，其特征在于所述的步骤①获得耐盐性下降的转基因拟南芥的应用包括以下步骤：

A、构建35S::CdWRKY50过表达载体：将CdWRKY50基因的ORF克隆至带有35S强启动子的植物表达载体中；

B、转化农杆菌：将构建好的35S::CdWRKY50过表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101；

C、获得过表达CdWRKY50的转基因拟南芥：通过浸花法将CdWRKY50插入拟南芥染色体，通过抗性筛选和表达量鉴定获得过表达CdWRKY50的转基因拟南芥纯合系；

D、转基因拟南芥耐盐性鉴定：以过表达CdWRKY50的转基因拟南芥纯合系为材料，检测分析其在盐胁迫条件下生理指标变化，结果显示，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的耐盐性下降。

4.按权利要求2所述狗牙根转录因子CdWRKY50的应用，其特征在于所述的步骤②通过VIGS技术获得耐盐性提高的CdWRKY50沉默狗牙根的应用包括以下步骤：

a、构建pCa-γbLIC-CdWRKY50载体：将CdWRKY50基因的特异片段250bp连接至pCa-γbLIC载体中；

b、转化农杆菌：将pCaBS-α、pCaBS-β、pCa-γbLIC-CdWRKY50质粒分别转化农杆菌EHA105；

c、获得CdWRKY50沉默的狗牙根植株：含有pCaBS-α、pCaBS-β、pCa-γbLIC-CdWRKY50质粒的EHA105等量混合后注射烟草叶片，将注射的烟草研磨

液摩擦接种狗牙根叶片，获得CdWRKY50沉默的狗牙根植株；

d、CdWRKY50沉默的狗牙根植株耐盐性鉴定：以CdWRKY50沉默狗牙根为材料，检测分析其在盐胁迫条件下的生理指标变化，结果显示CdWRKY50的沉默提高了狗牙根的耐盐性。

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