CN1746307A - 一种编码调控暖季型草坪草狗牙根抗寒抗盐性的转录因子的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个编码具有调控草坪草狗牙根抗寒抗盐性转录因子的基因，其具有序列表SEQ ID No.1所示的碱基序列。该基因编码具有转录激活功能的调控狗牙根抗寒抗盐性的转录因子，其具有序列表SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。本发明公开的基因可用于转基因植物育种，激活下游目的基因的表达，具有调控植物抗逆性应答的功能。

Description

一个编码调控暖季型草坪草狗牙根抗寒抗盐性的转录因子的基因及其应用

技术领域

本发明是属于植物分子生物学的领域，涉及一个编码调控暖季型草坪草狗牙根(Bermuda grass)抗寒、抗盐性的转录因子的基因：包括该基因的核酸序列及根据碱基顺序推导出的氨基酸序列，所具有的功能以及可以在转基因领域中的应用。

背景技术

对于植物抗逆性方面的研究由来已久，以前的工作大都是停留在遗传育种方面。近年来植物基因工程的飞速发展，在植物抗逆性方面带来了前所未有的突破。但是植物的抗逆的特性并不是单个或少数几个基因表达就能够表现出来的，而是多个功能基因共同表达才能获得的。因此一个优良的转基因植物，也需要多个功能基因的导入和表达才能获得我们所需要的抗性，而传统的遗传转化方法是把逐个基因进行转化来提高植物对逆境胁迫的耐性。如果可以在转入一个基因后就可以同时调节几个基因的表达，就会给转基因操作带来事倍功半的效果。植物中调控对外界干旱、高盐、低温等逆境胁迫应答反应的转录因子DREB(drought-responsive element binding factor)就是这样一种基因，该转录因子可以和特定的顺势作用元件结合，激活在启动子中含有该元件或该元件核心序列的基因的表达。自1998年DREB基因从拟南芥中被分离出来以来(Liu等Plant Cell，1998，10(8)：1391-1406)，已受到广泛的关注和得到深入的研究，目前除拟南芥外，已从其它许多植物如棉花，玉米，小麦，水稻，大豆中分离到类似DREB的基因，这些基因也具有类似的功能。但在草坪草中这方面的研究鲜为报道。

随着生态环境的日益破坏，水资源的日益匮乏，草坪业的抗逆性研究具有更加广阔的研究前景和应用前景。狗牙根是一类优质的暖季型草坪草，色泽鲜绿，具有耐践踏，弹性好等特点，是优质的足球场和高尔夫球场的主要建群种，也是优质的园艺观赏草坪，提高狗牙根的抗逆性为其广泛种植提供了基础。本发明涉及克隆草坪草狗牙根中DREB基因，并鉴定其功能，为以后草坪草中抗逆基因的遗传转化作好前期性的工作。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一个编码具有调控狗牙根抗寒抗盐性的DREB转录因子的基因。

本发明的第二个目的是提供编码这种DREB转录因子的基因的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一个编码具有调控草坪草狗牙根抗寒抗盐性转录因子的基因(BeDREB)，其具有序列表SEQ ID No.1所示的碱基序列。

编码的具有转录激活功能的调控狗牙根抗寒抗盐性的转录因子，其具有序列表SEQID No.2所示的氨基酸序列。

本申请发明人经过深入研究，分离并获得了草坪草狗牙根的似DREB基因，并确定了其碱基序列，应用生物学软件进行同源性比较，发现与其它植物中已经报道的DREB基因序列具有较高的同源性，并具有DREB转录因子所特有的典型特征：具有一个含有57个氨基酸的AP2/EREBP保守区，其中第14位和第19位的氨基酸分别为缬氨酸和谷氨酸，这两个氨基酸被认为是DREB转录因子与DRE顺势作用元件特异性性结合的关键位点。将该似DREB基因的的编码区构建到特定的YepGAP载体中，构建表达载体，并使该表达载体导入本实验室已经构建好酵母菌株(YW4721)中与特定的顺势作用元件结合激活双报告基因的表达，从而鉴定出该似DREB基因具有DREB转录因子所特有的转录激活功能。

编码具有调控狗牙根抗寒抗盐性的转录因子的基因在转基因植物育种的应用：植物抗逆性并不是单个基因所控制的结果，而是多个基因表达共同作用的结果。BeDREB转录因子是一个受低温和高盐特异诱导的反式作用因子，能够与特定的DRE顺势作用元件结合，促进启动子中含有这一元件或该元件核心序列(A/GCCGAC)的多个与逆境胁迫相关的基因的表达，从而激活植物体内的多种抗逆机制。在DREB1A的转基因拟南芥的研究山发现，DREB1A转录因子超表达在提高植物耐逆性的同时，还会产生生长迟缓、植株矮化的负效应，但这种负效应在草坪草的生长过程中反而是有利的。通常，草坪草是三分种，七分养护，为保持草坪草的美观，需要经常对草坪草进行修剪，DREB类转录因子在转入草坪草中后既能够增强转基因草坪草的耐逆性，又能减少修剪的次数，从而节省了养护费用。

本发明的优点是：BeDREB转录因子能够与特定的顺势作用元件结合，激活多个与抗逆相关的基因，激发植物体内的多种耐逆机制，所以说，通过改良和增强一个关键的转录因子的调控能力，让转录因子调控多个与同类性状有关的基因的表达，以提高植物对逆境胁迫的耐性，是提高农作物抗逆性的最佳途径，因此BeDREB为通过基因工程改良植物的抗逆性提供了一种全新的技术途径，在草坪草的耐逆性的综合改良过过程中具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照以下内容所作的任何本领域的等同替换均属于对本发明专利权的侵犯。

附图说明

图1-1为冷诱导和盐诱导条件下BeDREB基因的诱导表达模式图，显示RT-PCR分析的诱导表达结果。

图1-2为图1-1同样条件和参数下扩增作为内参的狗牙根的actin的结果。

图1-3为图1-1和1-2做RT-PCR时模版RNA的量。

图2为BeDREB1转录激活的表达载体图和酵母单杂交的转录激活原理示意图。

图3-1为在0mM的3-AT的SD-Agar三缺培养基上BeDREB转录因子转录激活功能的检测结果图。

图3-2为在20mM的3-AT的SD-Agar三缺培养基上BeDREB转录因子转录激活功能的检测结果图。

图3-3为在30mM的3-AT的SD-Agar三缺培养基上BeDREB转录因子转录激活功能的检测结果图。

图3-4为在40mM的3-AT的SD-Agar三缺培养基上BeDREB转录因子转录激活功能的检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆实验指南》(第三版)，本申请发明人克隆到了狗牙根的DREB cDNA，并确定了其碱基序列(命名为BeDREB)。

实施例1.

1.实验材料的准备与胁迫处理

所选实验材料为普通型狗牙根(Bermuda grass)，草种由中科院遗传与发育研究所提供。播种前在水中浸种过夜，用0.1％的HgCl消毒12min，灭菌水冲洗4-5次，后在无菌操作条件下播种于含有1/2MS无机盐的08％的琼脂培养基上(pH5.8)，暗培养至种子发芽，后移至有固定光照控制和温度(26℃)的培养室中长至三周收获幼苗。将幼苗洗净(严防损伤幼苗)，置于4℃条件下冷诱导5小时，250mM的NaCl溶液中盐诱导5小时，速于液氮中冷冻，保存于-80℃的冰箱中，用于克隆目的基因。

2.BeDREB基因的克隆

根据对已报道的植物的AP2/EREBP转录因子的保守结构域的序列特征在有关的生物学软件中进行分析的结果，设计了与保守区两端相对应的特异性简并引物，分别以冷诱导和盐诱导5小时的狗牙根幼苗总的RNA 5ug为模板，做RT/PCR(TaKaRa RT-PCR Kit)，扩增两种胁迫下植物材料中的AP/EREBP保守区。

正向引物：5′-AA(G)TGGGTT(G)GCTGAGATCCGTG-3′

反向引物为：5′-GCGCCATACATTGCCCTTGC-3′

扩增到了冷诱导和盐诱导狗牙根的AP2/EREBP保守区的基因序列，保守区序列同源性为100％；根据该保守区的基因序列，设计引物分别在冷诱导和盐诱导的狗牙根中扩增3’端和5’端的基因序列(TaKaRa 5’-Full RACE Core Set，TaKaRa 3’-Full RACE CoreSet)，3’RACE引物

正向引物；①5-ATGGCTTGGTTCATTCCC-3

          ②5-TGGTTCATTCCCTACCGC-3

反向引物：oligo dT-3sites Adaptor Primer

5’RACE引物

反转录引物：5’-ATTGCCCTTGC-3’

正向引物：①5’-ATGGCTTGGTTCATTCCC-3’

          ②5’-TGGTTCATTCCCTACCGC-3’

反向引物：5’-TTGCCACGGTTGGGCTCACG-3’

分别扩增到冷诱导和盐诱导狗牙根中的5’端和3’端的序列，将所扩增到的AP2/EREBP保守域基因序列，5’端的序列，3’端的序列进行体外拼接，根据拼接的结果，再设计两对特异性引物：

冷诱导的正向引物：5-AATTAAGAGCTCTCGGACCAGTTGGAGGAAAT-3

        反向引物：5-AATTAAGTCGACCGCGGTTGGCTTATAGTATAGAG-3

盐诱导的正向引物：5-AATTAAGAGCTCAGACCAGTTGGAGGAAAT-3

        反向引物：5-AATTCCGTCGACTTGGGTTCAACGAGTAAA-3

分别在冷诱导和盐诱导的狗牙根的基因组cDNA中扩增到冷诱导和盐诱导条件下的草坪草狗牙根的似DREB全长基因，经过序列比较发现同源性达到97.5％，编码区的序列同源性为接近100％，基本可以认为是同一个基因，命名为BeDREB。

从草坪草狗牙根中分离到的BeDREB的cDNA的片段为1061bp，其中BeDREB的编码区的碱基序列为753bp，根据碱基序列推测的氨基酸为251个，含有1个由57个氨基酸组成的AP2/EREBP保守区(下划线部分)，第14位和第19位的氨基酸分别为缬氨酸(V)和谷氨酸(E)(以黑斜体字表示)。

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实施例2.逆境胁迫下BeDREB基因的表达模式

将上述方法(实施例1)培养的狗牙根幼苗洗净，分别置于4℃和250mM的NaCl溶液中，分别按0、1、2、4、8、12、小时的时间间隔取样，并立即用液氮速冻，置于-80℃冰箱中用于总RNA的分离。用Trizol(GIBCO公司)方法分离狗牙根植株的总RNA。

通过RT-PCR的方法来研究分析冷诱导和盐诱导条件下的BeDREB的诱导表达模式(所用试剂盒为TaKaRa realtime One-step RT-PCR kit)，RNA模板均为1.2ug，引物如下：

正向引物：5-AATTAAGAGCTCTCGGACCAGTTGGAGGAAAT-3

反向引物：5-AATTAAGTCGACCGGTTGGCTTATAGTATAGAG-3

在同样的参数条件及反应条件下扩增狗牙根的actin作为内参。反应体系及参数(25ul的反应体系)：

反应条件：

实验结果显示，在同样的反应条件和反应参数下，以同等量的RNA作为模板进行RT-PCR(图1-3)，作为内参的actin基因表达量恒定(如图1-2)，而BeDREB的表达量随着逆境胁迫时间的不同，显示出差异(如图1-1)：与没有诱导的对照control相比，BeDREB在冷诱导1小时和盐诱导1小时已有较高的表达量，且冷诱导条件下BeDREB的表达量稍高于盐诱导条件下的表达量，继续延长诱导时间，该基因持续表达，在胁迫诱导4小时时，无论是在冷诱导条件下或盐诱导条件下，BeDREB的表达都达到最高。其后随着诱导时间的延长，无论是在冷诱导条件下还是盐诱导条件下，BeDREB还在持续表达，但已表现为稍稍下降的趋势，至12个小时时仍维持一定的表达量。

实施例3.BeDREB转录激活载体的构建和BeDREB蛋白转录激活功能的检测

一.将实施例1中所扩增到的冷诱导和盐诱导的BeDREB基因用限制性内切酶Sall和Sacl(酶切位点在扩全长基因时已加在引物序列中)进行双酶切，同时将YepGAP112载体也用Sall和Sacl进行双酶切，将双酶切后的片段和载体用T4 DNA Ligase进行连接构建表达载体，将构建好的表达载体转化入含双报道基因的酵母菌株(YW4271，Clontech公司)中(如图2-1和2-2所示)。

二.BeDREB的转录激活实验

四个SD三缺培养基平板(-His/-Trp/-Ura)分别含0mM3-AT，20mM3-AT，30mM3-AT，40mM3-AT均被分成8份。每个平板上左侧的四个部分依次为：对照DREB1A，冷诱导材料中扩增的BeDREB，盐诱导材料中扩增的BeDREB，YEPGAP空载体转化野生型的酵母菌株的生长情况；右侧的四个部分为对照DREB1A，冷诱导狗牙根中扩增的BeDREB，盐诱导狗牙根中扩增的BeDREB，YEPGAP空载体转化突变型酵母菌株的生长情况。

用含3-AT的SD-Agar三缺培养基(三缺SD固体培养基，His^-Trp^-Ura^-，Clontech公司)检测其生长情况(用4个3-AT浓度0mM，20mM，30mM，40mM检测)，结果如图3-1至3-4所示，BeDREB在转化入野生型的酵母菌株(含野生型的DRE顺势作用元件)中后，可以和DRE顺势作用元件结合，在含20mM，30mM，40mM的3-AT的SD-Agar三缺培养基上生长良好，而将BeDREB转化入突变型的酵母菌株(将DRE元件突变)后，不能和突变的元件结合，而在含3-AT的SD-Agar三缺培养基上不能生长(在0mM的3-AT的三缺培养基平板上突变型的酵母菌株具有渗漏表达)。说明BeDREB蛋白能特异结合DRE顺势作用元件，激活下游目的基因的表达，具有调控草坪草狗牙根抗逆性应答的功能。

                           序列表

<110>北京扬华生物科技有限公司

<120>一个编码调控暖季型草坪草狗牙根抗寒抗盐性的转录因子的基因及其应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1061

<212>mRNA

<213>禾本科狗牙根属(Bermuda grass)

<400>1

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tgttgatatt gtacatttta ctcgttgaac ccaaaaaaaa a   1061

<210>2

<211>250

<212>PRT

<213>狗牙根属禾本科(Bermuda grass)

<400>2

Met Glu Arg Val Glu Val Gln Gly Gly Ala Ser Ser Ala Gly Gln Val

1                 5                  10                  15

Arg Lys Lys Arg Met Arg Arg Lys Ser Thr Gly Pro Asp Ser Ile Ala

             20                  25                  30

Glu Thr Ile Lys Arg Trp Lys Glu His Asn Gln Lys Ile His Glu Asp

         35                  40                  45

Arg Lys Ala Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Ala Gly Lys

     50                  55                  60

Gly Gly Pro Glu Asn Gly Asn Cys Ala Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg

 65                  70                  75                  80

Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg Gly Asn

                 85                  90                  95

Arg Leu Trp Leu Gly Ser Phe Pro Thr Ala Leu Glu Ala Ala His Ala

            100                 105                 110

Tyr Asp Glu Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly Pro Thr Ala Arg Val Asn

        115                 120                 125

Phe Ser Glu Ser Ser Ala Asp Ala Asn Ser Gly Cys Thr Ser Ala Leu

    130                 135                 140

Ser Leu Leu Ala Ser Asn Ile Pro Pro Ala Ser Gln Arg Ser Asp Asp

145                 150                 155                 160

Lys Asp Glu Val Glu Ser Val Glu Thr Glu Val His Glu Val Lys Met

                165                 170                 175

Glu Val Asn Asp Asp Met Arg Ser Val His Val Glu Arg Lys Thr Leu

            180                 185                 190

Glu Val Phe Gln Ser Glu Glu Ser Val Leu Arg Lys Glu Gly Asp Val

        195                 200                 205

Ser Tyr Asp Tyr Phe His Val Glu Asp Val Leu Glu Met Ile Ile Val

    210                 215                 220

Glu Leu Asn Ala Ala Lys Lys Ile Glu Val His Glu Glu Tyr Gln Asp

225                 230                 235                 240

Gly Asp Asp Gly Phe Ser Leu Phe Thr Tyr

                245                 250

Claims (3)

1.一个编码具有调控草坪草狗牙根抗寒抗盐性转录因子的基因，其具有序列表SEQ ID No.1所示的碱基序列。

2、编码的具有转录激活功能的调控狗牙根抗寒抗盐性的转录因子，其具有序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3、权利要求1所述的编码具有调控狗牙根抗寒抗盐性的转录因子的基因用于转基因植物育种的应用。

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