CN1264981C

CN1264981C - 紫花苜蓿Na+/H+反向转运蛋白基因及其克隆与应用

Info

Publication number: CN1264981C
Application number: CN 200410035915
Authority: CN
Inventors: 张宪省; 安宝燕; 李加瑞; 李祥
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2004-10-13
Filing date: 2004-10-13
Publication date: 2006-07-19
Anticipated expiration: 2024-10-13
Also published as: CN1632122A

Abstract

本发明涉及紫花苜蓿Na⁺/H⁺反向转运蛋白MsNHX1基因的克隆、重组及耐盐性功能分析与应用，属于分子生物学和生物技术领域。从紫花苜蓿根中提取总RNA，然后将1微克总RNA反转录成cDNA。根据其它植物中的Na⁺/H⁺反向转运蛋白中保守的氨基酸序列，设计一对简并引物，进行常规聚合酶链式反应(PCR)，PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化DH5α细胞，进行序列测定。然后进行3′和5′末端快速扩增获得全长的cDNA。进一步构建正义表达载体，转化拟南芥。转基因拟南芥具有较高的耐盐能力。因此，该基因转化苜蓿等双子叶作物，将会提高其耐盐能力，提高其产量和品质，从而可以扩大双子叶植物在盐碱地上的种植面积，产生巨大的经济效益和社会效益。

Description

紫花苜蓿Na+/H+反向转运蛋白基因及其克隆与应用

(一)技术领域：

本发明涉及紫花苜蓿中Na⁺/H⁺反向转运蛋白MsNHX1基因的克隆、重组及耐盐能力功能的分析及应用，属于分子生物学和生物技术领域。

(二)背景技术：

盐胁迫能引起离子渗透胁迫，产生活性氧，破坏植物的渗透势及离子分配的均衡，结果导致植物伤害，特别是影响农作物的产量。因此，提高作物的耐盐能力愈来愈受到人们的重视。在高盐条件下，植物通过产生胁迫蛋白和可溶性渗透调节物质来减轻盐胁迫造成的毒害。早期的耐盐基因工程主要集中在清除自由基和增加渗透调节物质两个方面，转基因植株的耐盐能力有所提高，但效果不太明显。最近，定位在质膜和液泡膜上的Na⁺/H⁺反向转运蛋白从许多植物中分离出来。研究结果表明质膜上的Na⁺/H⁺反向转运蛋白负责Na⁺的外排，从而保持植物细胞内低Na⁺水平。而液泡膜上的Na⁺/H⁺反向转运蛋白则负责将Na⁺运入液泡，维持细胞内的离子均衡。这大大促进了耐盐基因工程方面的研究工作，并取得突破性进展。Blumwald等利用基因工程手段在番茄和油菜中过量表达Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因，得到了世界上第一批真正意义上的耐盐植株(Hong-Xia Zhang，Eduardo Blumwald，2001，Nature biotechnology，19：765-768)。

由于Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因在耐盐过程中所起的作用，本发明人从耐盐植物紫花苜蓿中分离编码Na⁺/H⁺反向转运蛋白的基因。根据其它植物中发表的Na⁺/H⁺反向转运蛋白的氨基酸序列，设计引物，利用反转录-聚合酶链式反应，从紫花苜蓿中分离出编码液泡膜上的Na⁺/H⁺反向转运蛋白的基因。进一步构建正义表达载体，转化模式植物拟南芥，转基因植株具有较高的耐盐能力，可达200mM。该基因可用于双子叶植物的遗传转化，提高其耐盐能力。

(三)发明内容：

本发明首次从紫花苜蓿中分离出编码Na⁺/H⁺反向转运蛋白的基因MsNHX1的全长cDNA，将其连接到表达载体上，利用农杆菌侵染法转化拟南芥，获得的转基因植株可在含有200mM NaCl的培养基上正常生长。

该基因的全长cDNA为1752bp，其中开放阅读框部分为1626bp，由此推得具有541个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，表明与已发表的棉花、水稻和拟南芥的Na⁺/H⁺反向转运蛋白相比，氨基酸同源性分别为77.25％、72.69％和75.69％(见附图1)，表明经过上述克隆步骤得到了编码Na⁺/H⁺反向转运蛋白的基因。该基因的序列如下：

序列表

(1)SEQ ID NO 1的信息

(a)序列特征

*长度：1752碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：紫花苜蓿

(f)序列描述：

1 GACAGCTCAG AAACATAAAT ATCTGGGATT CATTATTACT ACTGGACTTT GAAATTTGGA 60

61 AATTCAGCAA TAATCTCAAT TTGTTTTTAA ATCTGCTTTT GAAATTTGTG GAGGGTGGAC 120

121 GACATCATGG CTATTGAAAT GACTTCTATT GTTTCAAAAC TATCAATGTT ATCCACTTCC 180

181 GATCATGCTT CTGTTGTTTC TATGAACTTG TTTGTGGCAC TTCTGTGTGC TTGTATTGTC 240

241 CTTGGTCATC TTCTCGAGGA GAATCGATGG ATGAATGAAT CCATCACTGC CCTTTTGATT 301

301 GGTATTTGCA CTGGTGTAGT GATTTTGCTG TTTAGTGGTG GAAAAAGTTC GCATATTCTT 360

361 GTTTTCAGTG AAGATCTTTT CTTTATATAC CTTCTGCCGC CTATTATATT CAATGCCGGG 420

421 TTTCAAGTAA AGAAAAAGCA GTTTTTTGTC AACTTCATGA CTATCACATC ATTTGGAGCT 480

481 ATTGGCACAT TAATATCTTG TGTCATTATA ACCACGGGTG CTACTTTTGC TTTTAAGAGG 540

541 ATGGATATTG GGCCACTGGA AATCGGCGAT TATCTAGCTA TTGGAGCAAT ATTTGCCGCA 600

601 ACAGACTCTG TTTGCACATT GCAGGTGCTA AATCAGGATG AGACACCTTT ATTGTATAGT 660

661 CTTGTATTTG GGGAAGGTGT TGTGAATGAT GCTACCTCAG TGGTTCTTTT CAATGCAATT 720

721 CAAAGCTTTG ATCTTAACCA ACTGAACCCT TCAATTGCAT TGCATTTCTT GGGCAACTTC 780

781 CTGTATTTGT TTGTAGCAAG CACACTCCTT GGCGTTGTGA CAGGTCTGCT CAGTGCTTAT 840

841 GTTATTAAAA AGCTGTACAT TGGCAGGCAC TCCACAGATC GTGAGGTTGC TCTTATGATG 900

901 CTAATGGCAT ACCTCTCCTA TATGCTGGCT GAGTTAACCT ATCTGAGTGG CATTCTTACC 960

961 GTATTCTTTT GTGGTATTGT TATGTCTCAT TATACTTGGC ATAATGTGAC GCAGAGTTCA 1020

1021 AGAATCACTA CCAAGCATTC TTTTGCTACC TTGTCCTTTG TTGCTGAGAT CTTTATCTTC 1080

1081 CTTTATGTTG GTATGGATGC CCTGGACATT GAAAAATGGA AGTTTGTTAG TGATAGTCCT 1140

1141 GGAACATCTA TAGCTGCAAG TTCAGTATTG TTGGGTCTAA TACTTCTTGG AAGAGCAGCG 1200

1201 TTTGTTTTTC CCTTATCCTT CTTATCCAAC TTGACTAAAA AATCACAACA TCAGAAGATT 1260

1261 TCCTTCAGAC AGCAAGTTAT CATTTGGTGG GCTGGTCTTA TGAGAGGTGC TGTTTCAATG 1320

1321 GCACTTGCGT ATAATCAGTT CACCATGTCG GGGCATACTC AACTACGTAG CAATGCAATC 1380

1381 ATGATAACCA GCACCATCAC TGTTGTCCTT TTCAGCACAG TGGTGTTTGG TTTGCTGACT 1440

1441 AAGCCACTCA TAAGGCTTCT ACTACCTCAT CCTAAAATCA CAAGCAGCAT GACAACCACA 1500

1501 GAATCGACTA CTCCAAAATC ATTCATTGTC CCACTTCTAG GAGATTCCCG AGATTCTGAA 1560

1561 GCTGATCTTG AAGGCCATGA AATTCACCGA CCGAACAGCC TTCGTGCTTT ACTATCAACT 1620

1621 CCAACTCACA CTGTTCATCG ATTATGGCGA AAGTTTGATG ATTCATTCAT GCGTCCTGTT 1680

1681 TTTGGTGGCA GAGGTTTTGT TCCTGTAGAA CCTGGCTCAC CAAGTGAACG CAATGGTAAT 1740

1741 CAATGGGGTT GA

(2)SEQ ID NO.2的信息

(a)序列特征

*长度：541氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述

001 MAIEMTSIVS KLSMLSTSDH ASVVSMNLFV ALLCACIVLG HLLEENRWMN ESITALLIGI 060

061 CTGVVILLFS GGKSSHILVF SEDLFFIYLL PPIIFNAGFQ VKKKQFFVNF MTITSFGAIG 120

121 TLISCVIITT GATFAFKRMD IGPLEIGDYL AIGAIFAATD SVCTLQVLNQ DETPLLYSLV 180

181 FGEGVVNDAT SVVLFNAIQS FDLNQLNPSI ALHFLGNFLY LFVASTLLGV VTGLLSAYVI 240

241 KKLYIGRHST DREVALMMLM AYLSYMLAEL TYLSGILTVF FCGIVMSHYT WHNVTQSSRI 300

301 TTKHSFATLS FVAEIFIFLY VGMDALDIEK WKFVSDSPGT SIAASSVLLG LILLGRAAFV 360

361 FPLSFLSNLT KKSQHQKISF RQQVIIWWAG LMRGAVSMAL AYNQFTMSGH TQLRSNAIMI 420

421 TSTITVVLFS TVVFGLLTKP LIRLLLPHPK ITSSMTTTES TTPKSFIVPL LGDSRDSEAD 480

481 LEGHEIHRPN SLRALLSTPT HTVHRLWRKF DDSFMRPVFG GRGFVPVEPG SPSERNGNQW 540

541 G 541

利用200mM氯化钠处理水培紫花苜蓿并分别提取叶片和根的总RNA做Northen杂交，结果表明该基因的表达受氯化钠胁迫诱导(见附图2)Southern杂交结果表明在苜蓿中存在一个Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因的家族(见附图3)。利用过量表达策略，该基因转化拟南芥，将筛选出的转基因苗在150mM和200mM氯化钠的培养基上培养。结果显示，与野生型植株很快死亡相比，转基因植株仍能正常生长，表明转基因植株具有较高的耐盐能力(见附图4)。

根据上述技术，从紫花苜蓿中分离出编码Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因MsNHX1，该基因过量表达能导致转基因拟南芥具有较高的耐盐能力。紫花苜蓿为双子叶植物，该基因在苜蓿或其它双子叶植物中表达，将会提高其耐盐能力，从而提高其产量和品质，可以扩大双子叶植物在盐碱地上的种植面积，具有非常重要的经济效益和社会效益。

(四)附图说明：

图1苜蓿与其它几个物种NHX1氨基酸序列的比较结果。其中相同的氨基酸残基用涂黑表示。基因银行的登记号及其物种的来源如下所示：MsNHX1(苜蓿，AY513732)，GhNHX1(棉花，AF515632)，OsNHX1(水稻，NM 186088)，AgNHX1(滨黎，AB038492)，AtNHX1(拟南芥，AF056190)。图2在200mM NaCl处理的叶和根中，紫花苜蓿Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因MsNHX1的表达上调。从水培10天的紫花苜蓿叶和根中提取总RNA(每孔20μg)，与经过³²P标记的MsNHX13’端进行杂交。

图3紫花苜蓿Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因MsNHX1的Southern杂交分析。提取苜蓿叶片总DNA(15μg)分别用EcoRV(泳道1)和EcoRI(泳道2)酶切，然后与经过³²P标记的MsNHX13’端进行杂交。

图4过量表达MsNHX1基因的转基因拟南芥与野生型拟南芥在含200mMNaCl的1/2MS培养基上的生长情况。

(A)野生型拟南芥在含200mM NaCl的1/2MS培养基上的生长情况。

(B)转基因拟南芥在含200mM NaCl的1/2MS培养基上的生长情况。

(五)具体发明实施方式：

实施方式1：紫花苜蓿Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因的克隆方法

(1)RNA的提取：采用CTAB法或RNA kit提取总RNA。

(2)DNA第一条链的合成：取1μg总RNA，加入5×反应缓冲液4μl，10mM脱氧核糖核酸(dNTP)2μl，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/μl)0.5μl，引物oligodT(1μg/μl)1μl，反转录酶(10u/μl)2μl，42℃条件下反应60分钟，然后在85℃条件下，放置10分钟，终止反应。

(3)PCR反应：聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为：

首先将下列试剂混在一起：

10×反应缓冲液 5μl

脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl

正向引物(5μM) 4μl

反向引物(5μM) 4μl

模板cDNA 4μl

Taq DNA聚合酶 0.5μl

总体积 50μl

PCR反应条件为：94℃3分钟；然后进入下列循环：94℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。

(4)基因克隆：取2μlPCR产物与pGEM-T easy载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T easy and pGEM-T easy Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中过夜培养。

(5)质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。

(6)序列测定：本工作在大连宝生物工程公司进行。

(7)3′和5′序列的分离：按Clontech公司的SMART RACE cDNAAmplification Kit说明书进行。

(8)同源检索：利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。

实施方式2：紫花苜蓿Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因(MsNHX1)的序列见“发明内容”部分。

实施方式3：表达载体的构建

(1)根据分离出的Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因的核苷酸序列，设计引物：

正向引物：5′-TATTCTAGACGAGGTGGCGACCGGCATGG-3′

反向引物：5′-GACGAGCTCCTTAACTACGGTCTTCTGC-3′

以根的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。

(2)取2μlPCR产物与pGEM-T easy载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T easy and pGEM-T easy Vector system说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。然后碱法提取质粒DNA，进行序列测定。

(3)用XbaI和SalI两个限制性内切酶将该基因从pGEM-T easy载体上切下，与相同酶酶切的pBI121连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。

(4)将构建好的表达载体转化农杆菌，所用菌株为EHA105。

实施方式4：转基因植物耐盐能力分析

(1)种植拟南芥。

(2)挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养。

(3)离心收集菌体，沉淀用渗透培养基(5％蔗糖，0.1M MgCl₂，0.5％Silwet L-77)悬浮，菌液OD₆₀₀值在0.8左右。

(4)将拟南芥花序浸入渗透液中，浸泡5分钟。

(5)收获的种子在筛选培养基(1×MS盐，1％蔗糖，pH5.7，0.8％琼脂，卡那霉素30μg/ml)上筛选，得到抗性植株。

(6)将T3代纯合株系种子种于150mM，200mM氯化钠培养基上培养，2周后观察生长状况。见附图4。

序列表

<110>山东农业大学

<120>紫花苜蓿Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因及其克隆与应用

<160>1

<170>patent in 3.1

<210>1

<211>1752

<212>DNA

<213>紫花苜蓿(Medicago sativa)

<221>1-1752

<400>1

gacagctcag aaacataaat atctgggatt cattattact actggacttt gaaatttgga 60

aattcagcaa taatctcaat ttgtttttaa atctgctttt gaaatttgtg gagggtggac 120

gacatcatgg ctattgaaat gacttctatt gtttcaaaac tatcaatgtt atccacttcc 180

gatcatgctt ctgttgtttc tatgaacttg tttgtggcac ttctgtgtgc ttgtattgtc 240

cttggtcatc ttctcgagga gaatcgatgg atgaatgaat ccatcactgc ccttttgatt 300

ggtatttgca ctggtgtagt gattttgctg tttagtggtg gaaaaagttc gcatattctt 360

gttttcagtg aagatctttt ctttatatac cttctgccgc ctattatatt caatgccggg 420

tttcaagtaa agaaaaagca gttttttgtc aacttcatga ctatcacatc atttggagct 480

attggcacat taatatcttg tgtcattata accacgggtg ctacttttgc ttttaagagg 540

atggatattg ggccactgga aatcggcgat tatctagcta ttggagcaat atttgccgca 600

acagactctg tttgcacatt gcaggtgcta aatcaggatg agacaccttt attgtatagt 660

cttgtatttg gggaaggtgt tgtgaatgat gctacctcag tggttctttt caatgcaatt 720

caaagctttg atcttaacca actgaaccct tcaattgcat tgcatttctt gggcaacttc 780

ctgtatttgt ttgtagcaag cacactcctt ggcgttgtga caggtctgct cagtgcttat 840

gttattaaaa agctgtacat tggcaggcac tccacagatc gtgaggttgc tcttatgatg 900

ctaatggcat acctctccta tatgctggct gagttaacct atctgagtgg cattcttacc 960

gtattctttt gtggtattgt tatgtctcat tatacttggc ataatgtgac gcagagttca 1020

agaatcacta ccaagcattc ttttgctacc ttgtcctttg ttgctgagat ctttatcttc 1080

ctttatgttg gtatggatgc cctggacatt gaaaaatgga agtttgttag tgatagtcct 1140

ggaacatcta tagctgcaag ttcagtattg ttgggtctaa tacttcttgg aagagcagcg 1200

tttgtttttc ccttatcctt cttatccaac ttgactaaaa aatcacaaca tcagaagatt 1260

tccttcagac agcaagttat catttggtgg gctggtctta tgagaggtgc tgtttcaatg 1320

gcacttgcgt ataatcagtt caccatgtcg gggcatactc aactacgtag caatgcaatc 1380

atgataacca gcaccatcac tgttgtcctt ttcagcacag tggtgtttgg tttgctgact 1440

aagccactca taaggcttct actacctcat cctaaaatca caagcagcat gacaaccaca 1500

gaatcgacta ctccaaaatc attcattgtc ccacttctag gagattcccg agattctgaa 1560

gctgatcttg aaggccatga aattcaccga ccgaacagcc ttcgtgcttt actatcaact 1620

ccaactcaca ctgttcatcg attatggcga aagtttgatg attcattcat gcgtcctgtt 1680

tttggtggca gaggttttgt tcctgtagaa cctggctcac caagtgaacg caatggtaat 1740

caatggggtt ga 1752

Claims

1.一种紫花苜蓿Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因MsNHX1，其特征在于它具有下述所示的序列：