CN1216904C

CN1216904C - 大豆乙烯应答结合蛋白转录因子及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1216904C
Application number: CN 02128818
Authority: CN
Inventors: 侯玉霞; 程宪国; 刘强
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2002-08-14
Filing date: 2002-08-14
Publication date: 2005-08-31
Anticipated expiration: 2022-08-14
Also published as: CN1475496A

Abstract

本发明公开了大豆乙烯应答结合蛋白转录因子及其编码基因与应用，目的是提供具有较强抗逆效果的来源于大豆的乙烯应答结合蛋白转录因子及其编码基因。本发明所提供的乙烯应答结合蛋白转录因子的名称为GmEREB，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列或者是将序列2的氨基酸残基序列经过1个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。GmEREB的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。本发明的基因对培育抗逆植物品种，提高农作物产量具有重要意义。

Description

大豆乙烯应答结合蛋白转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物转录因子及其编码基因与应用，特别是来源于大豆的转录因子及其编码基因与应用。

背景技术

病原、干旱、盐碱、低温等生物与非生物胁迫因素对植物的生长发育具有重要影响。在逆境胁迫下，植物体内通常会发生一系列的生理生化变化。植物先是通过多种途径感受外界环境的变化，并将细胞外的信号转移到细胞内部，经过一系列磷酸化级链式反应将信号传递给转录因子，转录因子再通过其特异性功能氨基酸与目的基因相互作用，启动对逆境胁迫产生应答的目的基因表达，从而提高植物的抗性。例如，含有ERF功能保守域的ERF类转录因子的某些基因能接受环境胁迫信号并启动逆境应答基因，使得植物抗性提高。已经证实，乙烯是胁迫应答的调节因子之一，胁迫因子诱导乙烯在植物体内的合成，一些受乙烯诱导的与防卫有关的基因能够与一个抗病原基因表达所需要的GCC合子核心序列结合，并启动抗病基因的表达，达到抗病及抗逆效果。

大豆作为一种重要的油料和粮食作物，改善其抗病性以及抗逆性具有重要的理论及现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供具有较强抗逆效果的来源于大豆的乙烯应答结合蛋白转录因子及其编码基因。

本发明所提供的乙烯应答结合蛋白转录因子的名称为GmEREB，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列或者是将序列2的氨基酸残基序列经过1个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。

乙烯应答结合蛋白转录因子GmEREB的编码基因，是序列表中序列1的DNA序列。

序列表中序列1的DNA序列由1599个碱基组成，该基因的读码框为第106到第1257位碱基，其表达主要受乙烯、干旱、低温以及高盐的瞬时诱导。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的编码转录因子GmEREB的基因导入植物细胞，可获得对干旱、低温和高盐胁迫耐受力得到增强的转基因细胞系及转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记。携带有本发明GmEREB基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞，被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基因对培育抗逆植物品种，特别是培育抗旱、抗寒和抗盐的植物品种，提高农作物产量具有重要意义。

附图说明

图1为GmEREB基因在大肠杆菌中的体外表达。

图2为Southern杂交分析结果。

图3为不同胁迫条件下Northern杂交检测的GmEREB基因表达特征。

具体实施方式

实施例1、大豆GmEREB转录因子cDNA的克隆与序列结构分析

生长10天的大豆幼苗经洗净后在室温下置于足够厚度的滤纸上脱水5小时，收集植株于液氮中研磨至精细程度，置于4mol/L异硫氰酸胍中，再用酸性苯酚/氯仿抽提混合物，取上清液，用异丙醇沉淀总RNA，再重复上述步骤一次，将RNA溶于DEPC水中，保存于-80℃(Davis等，分子生物学的基本方法：[Basic Methods inMolecular Biology]，pp.777，APPLETON & LANCE，Norwalk，Connecticut，USA，1994)。

取1μg总RNA通过4对特异简并性引物(四条正向引物与一条反向引物组合)进行各自独立的一步逆转录链式扩增反应(PCR)。四条对应于RAP2.2和RAP2.12的AP2/EREBP保守域N-端的5’-YRGIRQ-3’正向引物(Forward primers)是：

DF1：5’-TA(C/T)CGIGGIAT(A/C/T)CGICA(A/G)-3’

DF2：5’-TA(C/T)CGIGGIAT(A/C/T)AG(A/G)CA(A/G)-3’

DF3：5’-TA(C/T)AG(A/G)GGIAT(A/C/T)CGICA(A/G)-3’

DF4：5’-TA(C/T)AG(A/G)GGIAT(A/C/T)AG(A/G)CA(A/G)-3’

一条对应于AP2/EREBP保守域C-端的反向引物5’-AKVNFP-3’(Reverseprimers)是：DR1：5’-IGG(A/G)AA(A/G)TTIAC(C/T)TTIGC-3’

上述引物中，I(inosine)为次黄苷。PCR条件为：4℃，3分；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，1.5分-30循环；72℃，10分；4℃保存。PCR产物连接到pMD18-T载体上用于测序。

再以阳性克隆为模板，利用一对特异性引物，DFR：5’-CTGGCGGATTCCGCGATA-3’；DRF：5’-GCCAAGGTGAATTTCCCT-3’通过逆转录PCR反应扩增目的基因的5’端以及3’端。然后体外包装In vitro-GmEREB基因序列，再设计一对特异性引物GmF：5’-ATGTGTGGTGGTGCGATT-3’和GmR：5’-GAAGACTCCT GCCATGGA-3’扩增GmEREB-cDNA，PCR产物连接于pMD18-T载体进行测序，得到了一个与体外包装序列完全一致的cDNA克隆，命名为GmEREB，为序列表中的序列1。该基因插入片段1599bp，含有1152bp的开放阅读框架(106起始-1257终止)，编码384个氨基酸组成的多肽(序列表中的序列2)，其5’端为115bp，3’端为282bp。该基因含有一个典型的植物转录因子EREBP家族中所特有的AP2/ER EBP结构保守域，该结构域能够与乙烯应答元件GCC合子核心的顺式作用元件相互作用而启动目的抗逆基因的表达。

实施例2、大豆GmEREB基因在大场杆菌中的体外表达鉴定

根据序列1设计一对特异性引物GmERFF：331 5’-AAAAGAATTCTTTGGGTTCTCTCGCTCC-3’348和GmERFR：1044 5’-AAAACTCGAGCACCACATCCTGCGAGTT 1027，通过PCR扩增得到一个712bp的包含AP2/EREBP结构保守域的cDNA片段，并将其插入到蛋白表达载体pGEX-4T-1(GST)相对应的位点上，然后转化于大肠杆菌中，经IPTG在大肠杆菌中诱导，SDS-PAGE检测表明该基因能够在大肠杆菌中进行体外翻译表达，聚丙烯凝胶电泳谱带如图1所示，图中，M是Marker；1、3是经诱导的菌株；2是未经诱导的菌株。从图中可以看出，经诱导的菌株有蛋白条带出现，未经诱导的菌株没有蛋白条带出现。

实施例3、GmEREB基因在大豆中的拷贝数量分析

利用经同位素磷-32标记的GmEREB cDNA编码区为探针与经三种不同限制性内切酶(SalI，EcoRV和XhoI)消化的大豆植物基因组DNA进行Southern杂交分析，并经高严谨度洗膜(高严谨度的条件是：0.5×SSC，0.1×SDS，65℃)，结果如图2所示，每一种消化的DNA均有多条杂交带出现，表明GmEREB基因是一个多拷贝基因。

实施例4、大豆GmEREB基因在逆境胁迫条件下的表达特征。

生长2个星期的大豆幼苗分别置于4℃水、250mM NaCl水溶液以及2mM乙烯溶液中在室温下进行光照培养，干旱处理是将生长2个星期的大豆幼苗经水洗净后置于足以吸干水分的滤纸上在室温下脱水。对上述所有处理分别在1小时、5小时、12小时以及24小时取样，提取总RNA与GmEREB cDNA探针杂交。结果如图3所示，其中A是干旱处理的结果，B是4℃低温处理的结果，C是250mM NaCl处理的结果，D是2mM乙烯处理的结果，从图中可以看出，基因GmEREB的转录主要受乙烯与干旱强烈诱导，并不同程度受低温以及盐的诱导。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1599

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merr.)

<400>1

tgattgagcc aaagctttgt attttctgcg ataattttcc attgggtgga agaaagtctc 60

aacctttatt cgaaagagca aggatctgag ttgagttgag tgatcatgtg tggtggtgcg 120

attatctccg acttcatacc ggcaggtccc gccagcgggg cgcggcgcgt gaccgccgac 180

atcctgtggc cgagtttgag gaagcgcttc tcgaagccgc tgctggacga tgatttcgag 240

gctgggttca gagaattcaa ggatgattcg gaaatcgagg atgttgatga cgaggacgat 300

gaagacgagg aggagttgaa gaagaagccc tttgggttct ctcgctccag caacaaggct 360

gcttctaagc ctctctctcg tggagcaaca actgtgaaat ctgtggaatc aaaggggcaa 420

gctgagaagt gtgccaagag aaagaggaag aaccagtatc gcggaatccg ccagcgtcca 480

tggggaaagt gggctgctga gattcgcgac ccaagaaagg gggttcgtgt ttggcttgga 540

actttcagca ctgctgaaga agctgcaaga gcttacgatg ctgaagcaag gaggatccgt 600

ggcaagaaag ccaaggtgaa tttccctgat gagccttcag gcgctgcttc ctcaaaacgt 660

ctcaaggcga atccagaggc tcagccaatg aagaaaaatc tgaactctgt gaagccgaaa 720

ataaaccaga tgttcaattt tggtgacaat cttgagggct actacagccc tatagatcag 780

gtggaacaga aaccactggt taaccagtat gttaaccgtg ccccgtttgc tggaaatgga 840

gttcaagtct cacctgttac tccatctgct gatgttactg cttacttcag ctctgagcat 900

tcgagcaact cgtttgatta ttctgacctt ggatggggtg aacaagtccc caagaccccc 960

gagatctcat ccttgctttc tgctgctcct ttggagggtg ctgctgatca ggttcagaag 1020

accaacaact cgcaggatgt ggtggctgca caagatgatt ctgcaaaaac cctttccgaa 1080

gagcttgcag acattgaatc ccagctcaag ttctttgaga ccccttcttt tcttgatgaa 1140

gcctgggctg atgctacatt ggcgtctttg ctcggcggag acgcaactca tgacgccgcc 1200

ggaaacccta tgaacctttg gagcttcgac gacctgcctt ccatggcagg agtcttctga 1260

acacccttta tctccccttt tatgtaaata aagctacaag aattgtgatc gtgatgttgg 1320

tgatggagtc cacagccaag aaacctgctt aaagcttatg tggagtttat tttatcttgt 1380

agctaatgca gtagtatagg actatatata ggtttttatt atagggtatc cttttgtgaa 1440

ctcaaagacc tcgttttcag gggattttct gtttgatgtc cttaaggatt atcaattatg 1560

ttatatatgg tcttggataa aaataaaaaa aaaaaaaaa 1599

<210>2

<211>384

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merr.)

<400>2

Met Cys Gly Gly Ala Ile Ile Ser Asp Phe Ile Pro Ala Gly Pro

5 10 15

Ala Ser Gly Ala Arg Arg Val Thr Ala Asp Ile Leu Trp Pro Ser

20 25 30

Leu Arg Lys Arg Phe Ser Lys Pro Leu Leu Asp Asp Asp Phe Glu

35 40 45

Ala Gly Phe Arg Glu Phe Lys Asp Asp Ser Glu Ile Glu Asp Val

50 55 60

Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Glu Glu Glu Leu Lys Lys Lys Pro

65 70 75

Phe Gly Phe Ser Arg Ser Ser Asn Lys Ala Ala Ser Lys Pro Leu

80 85 90

Ser Arg Gly Ala Thr Thr Val Lys Ser Val Glu Ser Lys Gly Gln

95 100 105

Ala Glu Lys Cys Ala Lys Arg Lys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg Gly

110 115 120

Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp

125 130 135

Pro Arg Lys Gly Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Ser Thr Ala

140 145 150

Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Glu Ala Arg Arg Ile Arg

155 160 165

Gly Lys Lys Ala Lys Val Asn Phe Pro Asp Glu Pro Ser Gly Ala

170 175 180

Ala Ser Ser Lys Arg Leu Lys Ala Asn Pro Glu Ala Gln Pro Met

185 190 195

Lys Lys Asn Leu Asn Ser Val Lys Pro Lys Ile Asn Gln Met Phe

200 205 210

Asn Phe Gly Asp Asn Leu Glu Gly Tyr Tyr Ser Pro Ile Asp Gln

215 220 225

Val Glu Gln Lys Pro Leu Val Asn Gln Tyr Val Asn Arg Ala Pro

230 235 240

Phe Ala Gly Asn Gly Val Gln Val Ser Pro Val Thr Pro Ser Ala

245 250 255

Asp Val Thr Ala Tyr Phe Ser Ser Glu His Ser Ser Asn Ser Phe

260 265 270

Asp Tyr Ser Asp Leu Gly Trp Gly Glu Gln Val Pro Lys Thr Pro

275 280 285

Glu Ile Ser Ser Leu Leu Ser Ala Ala Pro Leu Glu Glv Ala Ala

290 295 300

Asp Gln Val Gln Lys Thr Asn Asn Ser Gln Asp Val Val Ala Ala

305 310 315

Gln Asp Asp Ser Ala Lys Thr Leu Ser Glu Glu Leu Ala Asp Ile

320 325 330

Glu Ser Gln Leu Lys Phe Phe Glu Thr Pro Ser Phe Leu Asp Glu

335 340 345

Ala Trp Ala Asp Ala Thr Leu Ala Ser Leu Leu Gly Gly Asp Ala

350 355 360

Thr His Asp Ala Ala Gly Asn Pro Met Asn Leu Trp Ser Phe Asp

365 370 375

Asp Leu Pro Ser Met Ala Gly Val Phe

380 384

Claims

1、乙烯应答结合蛋白转录因子GmEREB，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列或者是将序列2的氨基酸残基序列经过1个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于：它是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质。

3、乙烯应答结合蛋白转录因子GmEREB的编码基因，是序列表中序列1的DNA序列。

4、含有权利要求3所述基因的表达载体。

5、含有权利要求3所述基因的转基因细胞系。

6、权利要求3所述基因在培育抗逆境植物品种中的应用。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述逆境为旱害、寒害和盐害。