CN100430415C - 中间偃麦草erf转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中间偃麦草ERF转录因子及其编码基因。该中间偃麦草ERF转录因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：2；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病、抗逆性相关的蛋白质。编码该转录因子的基因的转录表达受小麦纹枯病菌、盐、旱、冷和乙烯等强烈诱导。本发明的TiERF1为人为控制抗病防卫基因、抗(耐)逆相关基因的表达提供基础，为植物抗病、抗逆基因工程育种提供新的基因资源，将在培育抗病性、抗(耐)逆性增强的植物基因工程中发挥重要的作用。

Description

中间偃麦草ERF转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物ERF转录因子及其编码基因与应用，特别涉及一种中间偃麦草的ERF转录因子及其编码基因，与该基因在培育抗病植物、抗逆植物中的应用。

背景技术

目前，各种病虫害等生物胁迫、与干旱、盐渍、低温等非生物逆境胁迫，是制约农作物、林草和蔬菜等生产发展的重要因素。例如，随着耕作制度、肥水条件和气候条件等因素的改变，小麦纹枯病、赤霉病等土传真菌病害和小麦白粉病、条锈病等气传真菌病害在我国小麦主产区的为害日益严重，轻则造成小麦减产20-30％，重则减产40-50％，甚至绝收。我国的干旱、半干旱耕地共计5.7亿亩，占全国耕地面积的38％，我国每年因缺水造成粮食减产700-800亿公斤。另外，我国每年因盐碱地而少产粮食约200亿公斤，还有5.54亿亩盐渍土壤有待开发利用或提高单产。

培育和推广抗病虫、抗逆植物品种是提高其产量与质量，保证国家粮食安全和改善生态环境的最有效途径。虽然利用植物自身抗病基因和一些抗逆相关基因，在抗病、抗逆育种方面取得了一些进展。但目前可利用的抗病和抗逆相关基因资源有限，并且存在着抗病品种短寿、抗逆品种不理想等问题，难以满足目前生产与生态改良的需求。近年来，有关植物抗病分子机制和抗逆反应机制特别是相关反应途径研究的进展以及基因工程技术的迅猛发展，为运用基因工程手段提高植物抗病性与抗逆性展示出诱人的前景。

植物在长期进化过程中发展了一系列应对生物胁迫和非生物逆境胁迫的反应机制，以保证其生长发育。对拟南芥等植物的大量研究结果表明，植物能通过抗病基因或其它基因感知和识别病原物或逆境胁迫信号，然后启动级联式的信号传导系统，进而诱导一系列下游的具有功能的防卫基因如病程相关(PR)基因，或抗逆基因表达。在信号传导过程中，转录因子具有重要的调控作用。ERF转录因子是植物特有的与防卫反应有关的一类重要转录因子。ERF转录因子(也称为EREBP，乙烯应答元件结合蛋白)，具有一个高度保守的DNA结合区，即ERF/AP2 DNA结台区的结构域，ERF/AP2结构域由60个左右的氨基酸组成。按照Sakuma等报道，ERF/AP2结构域第14位、第19位的2个氨基酸残基的差异，决定着转录因子与不同的顺式作用元件的特异结合(Allen等，1998，A novel mode of DNA recognition by a β-sheet revealed bythe solution structure of the GCC-box binding domain in complex with DNA，EMBO J，17：5484-5496；Sakuma et al，2002，DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs，transcription factors involved indehydration-and cold-inducible gene expression.Biochem.Biophys.Res.Comun.290：998-1009)，能与DRE顺式元件结合的AP2结构域第14氨基酸为颉氨酸(V)，第19位是谷氨酸(D)，而能与GCC-box结合的ERF/AP2结构域第14氨基酸为丙氨酸(A)，第19位是天冬氨酸(D)(Hao等1998，Unique mode of GCC-box recognitionby the DNA-binding domain of ethylene-responsive element，Bio.Chem.，273：26857-26861)。GCC-box是含有GCCGCC保守序列、并受乙烯调控的顺式作用元件，主要存在于大量碱性抗病防卫(PR)基因的启动子中，一些非生物胁迫应答基因的启动子中也含有GCC-box(Hao等1998，Unique mode of GCC-box recognition by theDNA-binding domain of ethylene-responsive element，Bio.Chem.，273：26857-26861；Ohme-Takagi等1995，Ethylene-inducble DNA binding proteins thatinteract with ethylene-responsive element，Plant Cell，7：173-182；Fujimoto等2000，Arabidopsis ethylene-responsive element binding act astranscriptional activators or respressors of GCC BOX-mediated geneexpression，Plant Cell，12：393-404)。番茄Pti4/5/6和拟南芥ERF1、AtERF1-AtERF5、AtERF13属于与抗病相关的ERF转录因子(Zhou等1997，The Pto kinase conferringresistance to tomato bacterial speck disease interacts with proteins that binda cis-element of pathogen attack and osmotic stress in tobacco，EMBO J，16：3207-3232；Solano等1998，Nuclear events in ethylene signaling：atranscritional cascade mediated by EHYLENE-INSENSITIVE 3 andEHYLENE-RESPONSE-FACTOR1，Genes DEV.，3703-3714；Fujimoto等2000，Arabidopsisethylene-responsive element binding act as transcriptional activators orrespressors of GCC BOX-mediated gene expression，Plant Cell，12：393-404；Gutterson and Reuber，2004，Regulation of disease resistance pathways byAP2/ERF transcription factors，Current Opinion in Plant Biology，7：465-471)。许多ERF基因在植株中超表达能提高植物的抗病能力。Pti的超表达可提高烟草、番茄和拟南芥等植物对细菌性和真菌性病害的抗性(Thara等1999，Pseudomonassyringae pv.tomato induces the expression of tomato EREBP-like genes Pti4 andPti5 independent of ethylene，salicylate acid and jasmonate，PlantJ，20：475-484；Gu等，2002，Tomato transcript ion factors Pti4，Pti5 and Pti6activate defense responses when expressed in Arabidopsis，Plant Cell，14：817-831；Fujimoto等2000，Arabidopsis ethylene-responsive element bindingact as transcriptional activators or respressors of GCC BOX-mediated geneexpression，Plant Cell，12：393-404)，并具有一定的广谱效应。拟南芥ERF1过表达能提高对坏死营养型真菌Botrytis cinerea和Plectosphaeralla cucuneria以及土传真菌Fusariam Oxysporum的抗性(Berroecal-Lobo等2002，Constitutiveexpression of EHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 in Arabidopsis confers resistance toseveral necrophic fungi，Plant J，29：23-32；Berrocal_Lobo等2004，EHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 mediates Arabidopsis resistance to the soilbornefungus Fusarium oxysporum，MPMI，17(7)：763-770)。有些ERF转录因子可能是抗病与抗逆反应的多个信号传导途径的交汇点。如烟草EREBP Tsil基因可同时在植物防卫反应和非生物胁迫应答抗盐反应中起作用(Park等，2001，Overexpression ofthe tobacco Tsil gene encoding an EREBP/AP2-type transcription factorsenhances resistance against pathogen attack and osmotic stress in tobacco，Plant Cell，13：1035-1046)。烟草AP2/EREBP转录因子OPBP1过表达可提高烟草对Pseudomonas syringae和Phytophthora parasitica病原菌的抗性和耐盐能力(Guo等，2004，Overexpression of the AP2/EREBP transcription factor OPBP1 enhancesdisease resistnce and salt tolerance in tobacco，Plant Mol.Biology，55：607-618)，因此，从一些抗病、耐逆植物中分离克隆ERF类转录因子，通过基因工程有目的地培育过表达上述ERF类转录因子的植物，不仅可以改进植物的抗病性，还可改进植物的抗盐性、抗旱性或耐冷性。

小麦近缘野生植物中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)，具有抗小麦条锈病、白粉病、黄矮病、条斑花叶病、赤霉病和纹枯病等多种抗病基因，而且具有耐旱、耐寒、耐盐碱等性状。因此，从中间偃麦草中分离克隆ERF类转录因子，研究其特性和作用机制，对于提高重要作物及其它植物的抗病性及抗逆性具有重要的理论意义及实用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种中间偃麦草ERF转录因子及其编码基因。

本发明所提供的中间偃麦草ERF转录因子，名称为TiERF1，来源于中间偃麦草，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性、抗逆性相关的蛋白质。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

其中，序列表中的序列2由293个氨基酸残基组成。ERF/AP2 DNA结合结构域位于自序列2的氨基端第144至202位氨基酸残基，该保守域第14位(自序列2的氨基端第157位)氨基酸残基为丙氨基酸(A)，第19位(自序列2的氨基端第162位)氨基酸为天冬氨酸(D)，该结构域能够与乙烯应答元件GCC核心的顺式作用元件相互作用而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因的表达。序列2的C端(自序列2的氨基端第243位至247位氨基酸残基)有一个碱性的核定位信号区(KRRKR)，N端含有1个酸性的激活区域(自序列2的氨基端第51位至75位氨基酸残基)。

上述中间偃麦草ERF转录因子的编码基因(TiERF1)也属于本发明的保护范围。

上述中间偃麦草ERF转录因子的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在杂交液中65℃杂交，于0.1×SSC(0.1×SSPE)和0.1％SDS的溶液中，65℃条件下洗膜。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由1418个脱氧核苷酸组成，自5′端第10位至891位脱氧核苷酸为编码序列。

TiERF1 cDNA序列NCBI比较表明，TiERF1部分cDNA序列与水稻的ERF基因BiERF3(AY831394)同源，利用DNAMAN将TiERF1全长cDNA序列与BiERF3全长序列进行比较，其同源性仅为50％，TiERF1的核苷酸序列与其他功能明确的ERF基因的核苷酸序列的同源性很低，没有比对上。TiERF1的氨基酸序列在NCBI进行比较，结果表明，TiERF1与一些具抗病功能的ERF转录因子：拟南芥AtERF1、ERF1、番茄Pti4、LeERF1、ERF5、TSRF1、Pti5及烟草ERF2、NtERF1在AP2 DNA结构域保守区具73-90％同源性，但与这些蛋白的全长序列仅有20-38％同源性，与水稻BiERF3氨基酸(AAV98702.1)的同源性为67.3％，这些表明TiERF1为1个新的中间偃麦草ERF转录因子。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的TiERF1基因可用现有的方法导入、构建到现有的植物的表达载体中，可在其转录超始核苷酸前加上包括组成型启动子、增强启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异性启动子在内的任何一种启动子，被转化的植物不仅限于单子叶植物、也可以是双子叶植物。如，将本发明的TiERF1基因与其它1种或几种基因重组，构建多价基因的表达载体并转入植物；与其它1种或几种基因融合，构建表达载体并转入植物；与其它1种或几种基因相协同，分别构建表达载体，同时或分别转入同一植物受体。可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体与导入方法，将本发明的TiERF1基因导入植物或其细胞或组织中，以获得具有抗病、抗逆能力的植物。

实验证明本发明的TiERF1基因的转录表达受到病原菌、盐、乙烯等强烈的诱导，也受旱、冷的诱导。酵母单杂交分析实验表明，本发明的TiERF1可以特异地结合、调控含有ERF顺式元件(核心序列：AGCCGCC)基因的转录表达，本发明的TiERF1可为人为控制抗病防卫基因、抗(耐)逆相关基因的表达提供基础，为植物抗病、抗逆基因工程育种提供新的基因资源，将在培育抗病性、抗(耐)逆性增强的植物中发挥重要的作用。

附图说明

图1为用基因特异引物PCR扩增TiERF1全长基因的结果。

图2A为半定量RT-PCR检测纹枯病菌对TiERF1基因表达的影响。

图2B为Northern杂交检测NaCl对TiERF1基因表达的影响。

图2C为半定量RT-PCR检测干旱对TiERF1基因表达的影响。

图2D为半定量RT-PCR检测低温对TiERF1基因表达的影响。

图2E为半定量RT-PCR检测乙烯对TiERF1基因表达的影响。

图3为TiERF1基因在大肠杆菌中的体外表达电泳检测图谱

图4为酵母单杂交分析TiERF1基因与GCC-BOX特异结合的情况

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。应该指出的是，本发明的实施例只对本发明起说明作用而无限制作用。

实施例1、中间偃麦草ERF转录因子基因的克隆与序列分析

中间偃麦草在室温下(26度)生长三周，一部分植株采用牙签和摩擦法接种小麦纹枯病菌到中间偃麦草幼苗的叶鞘处和叶片上，一部分植株的根系置于250mm NaCl水溶液中浸泡处理。取接种纹枯病菌24小时或NaCl处理5小时的中间偃麦草叶片，利用Trizol(Invitrogen公司产品)方法，提取总RNA，溶于DEPC水中，经琼脂糖凝胶电泳检测。取5ug质量好、无DNA污染的总RNA，采用Invitrogen公司的Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒(Invitrogen)，以Oligo d(T)_12-18为引物，按照试剂盒说明书方法操作进行cDNA第一链的合成。根据小麦EST片段(NCBI登陆号CN010562.1，CK195316.1，CN012725，AL821943，CN011872.1)设计1对引物，序列如下：上游引物pER-U1：5′-ACG GCG AGG ATG CTGCTG AAC-3′，下游引物pER-U2：5′-CGA TCT CGG AGC GGA TGC GGA-3′。以上述中间偃麦草的第一链cDNA为模板，进行PCR扩增，25μL扩增体系为：1×GC缓冲液，1μL cDNA(100ng)，200μmol/L dNTPs，0.2μmol/L每条引物，1 U LA-Taq酶；扩增条件为先94℃预变性1min；然后94℃  30秒，62℃ 30秒，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物经回收、纯化后连接到pMD18-T载体(购自Takara公司)上，转化到大肠杆菌TOPO 10中，利用上述pER-U1和pER-U2引物进行菌落PCR，挑选5个阳性克隆测序。经序列分析结果表明，获得了中间偃麦草ERF转录因子TiERF1基因5′端基因片段(自序列1的5′端第1位-第637位脱氧核苷酸)。

采用GIBCO-BRL的3′-RACE试剂盒(产品目录号为#18373-019)，按照其提供的方法操作克隆TiERF1基因3′端序列。为保证3′-RACE PCR产物确为特异的目的基因的3′端序列，采用巢式PCR扩增策略，即根据目的基因TiERF1 5′端基因片段的核苷酸序列，设计2条3′-RACE的上游引物RP₁、RP₂：RP₁引物序列：5′-AGTTCGCGGCGGAGATC-3′，RP₂引物序列：5′-ACCTACGACACCGCCGAGGA-3′，先用RP₁上游引物和试剂盒中的AUAP引物(下游引物，AUAP引物序列：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′)，以3′-RACE试剂盒反转录合成中间偃麦草的第一链cDNA作为模板进行第一轮扩增，然后再用稀释50倍的第一轮PCR产物作模板，以RP₂(上游引物)和AUAP(下游引物)进行第二轮PCR扩增，回收纯化PCR产物，连接克隆到pMD18-T载体上，通过菌落PCR，挑选5个阳性克隆测序，序列分析结果表明，获得TiERF1基因的3′端序列(自序列1的5′端第529位-第1418位脱氧核苷酸)。其中，第一轮PCR反应条件：先94℃ 1min；然后94℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 1min30s，共10个循环；再94℃ 30s→56℃ 30s→72℃ 1min30s，共25个循环；最后72℃ 5min。25μL反应体系为：1×GC缓冲液，1μL cDNA(100ng)，200μmol/L dNTPs，0.2μmol/L每条引物，1 U LA-Taq酶。

第二轮PCR反应条件：先94℃预变性2min；然后94℃ 30s，63℃ 30s，72℃2min，共10个循环；再94℃ 30s→61℃ 30s→72℃ 2min，共25个循环；最后72℃ 5min。25μL反应体系为1×GC缓冲液，1μL cDNA(100ng)，200μmol/L dNTPs，0.2μmol/L每条引物，1 U LA-Taq酶。

将TiERF1 5′端序列和3′端序列在体外包装，得到TiERF1全长cDNA序列。为获得可表达的TiERF1基因克隆，据TiERF1全长cDNA序列，再设计1对特异性引物TiE-F：5’-ACG GCG AGG ATG CTG CTG AAC-3’，TiE-R 5′-GGTTGCTTTGCCGGATTGCTC-3′，以中间偃麦草cDNA或基因组DNA为模板，进行PCR扩增，25μL PCR的反应体系为：1×GC缓冲液，1μL DNA(100ng)，200μmol/L dNTPs，0.2μmol/L每条引物，1 U LA-Taq酶。反应程序为：先94℃预变性2min；然后94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 2min，共10个循环；再94℃ 30s→63℃ 30s→72℃ 2min，共25个循环；最后72℃ 10min。扩增产物进行琼脂糖电泳，结果如图1所示，表明以中间偃麦草cDNA或基因组DNA为模板得到的PCR产物大小相同。图中泳道1为中间偃麦草cDNA为模板；2为中间偃麦草基因组DNA为模板；M为100bp ladder分子量标记(天为时代生物工程公司产品)。将得到的PCR产物连接于pMD18-T载体中进行测序，得到一个具有序列表中序列1的序列且与体外包装序列完全一致的cDNA克隆，将具有序列表中序列1的基因命名为TiERF1。该基因全长cDNA序列为1418bp(序列表中的序列1)，含有882bp的开放阅读框，起始于10bp，终止于891bp，编码由293个氨基酸残基(序列表中的序列2)组成的TiERF1，ERF/AP2DNA结合域编码序列位于自5′端第439-615bp(编码序列2的自氨基端第144至202位氨基酸残基)，该保守域第14位氨基酸为丙氨基酸(A)，第19位氨基酸为天冬氨酸(D)，该结构域能够与乙烯应答元件GCC核心的顺式作用元件相互作用而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因的表达。

TiERF1的C端(自序列2的氨基端第243位至247位氨基酸残基)有一个碱性的核定位信号区(KRRKR)，N端含有1个酸性的激活区域(自序列2的氨基端第51位至75位氨基酸残基)。

TiERF1 cDNA序列NCBI比较表明，TiERF1部分cDNA序列与水稻的ERF基因BiERF3(AY831394)同源，利用DNAMAN将TiERF1全长CDNA序列与BiERF3全长序列进行比较，其同源性仅为50％，TiERF1的核苷酸序列与其他功能明确的ERF基因的核苷酸序列的同源性很低，没有比对上。TiERF1的氨基酸序列在NCBI进行比较，结果表明，TiERF1与一些具抗病功能的拟南芥AtERF1、ERF1、番茄Pti4、LeERF1、ERF5、TSRF1、Pti5及烟草ERF2、NtERF1在AP2 DNA结构域保守区具73-90％同源性，但与这些蛋白的全长序列仅有20-38％同源性，与水稻BiERF3氨基酸(AAV98702.1)的同源性为67.3％，这些表明TiERF1为1个新的植物ERF转录因子。

实施例2、TiERF1基因的诱导表达分析

将中间偃麦草分别进行以下胁迫处理：病原菌、250mM NaCl、干旱、低温、2mM乙烯利溶液(ET)处理，具体处理方法如下：

病原菌处理：用摩擦及牙鉴法在生长三周的中间偃麦草叶片上分别接种小麦纹枯病菌丝，分别于接种后0h、2h、5h、12h、24h取叶片，液氮冷冻、-70度保存。

盐处理：将生长四周的中间偃麦草植株的根系分别置于250mM NaCl水溶液中，于0h、2h、5h、10h、24h后取叶片，液氮速冻，-70度保存备用。

干旱处理：将生长四个星期的中间偃麦草幼苗经水洗净后置于足以吸干水分的滤纸上在室温下脱水0h、2h、5h、10h后取叶片，液氮速冻，-70度保存备用。

低温胁迫处理：将生长四周的中间偃麦草植株置于4℃(低温)处理0h、2h、5h、10h后取叶片，液氮速冻，-70度保存备用；

2mM乙烯利溶液(ET)溶液中，分别在处理后0h、2h、24h取叶片，液氮速冻，-70度保存备用。

采用Trizol法提取上述叶片中的总RNA，取1ug总RNA反转录合成第一链cDNA，先用组成性表达的Actin基因引物扩增各样品，使扩增模板mRNA/cDNA的起始浓度一致(即均一化)，然后用TiERF1基因特异引物TiE-F和TiE-R扩增各样品cDNA，进行半定量RT-PCR，以研究该基因的表达特征；或以TiERF1基因cDNA序列(序列1)作探针，按分子克隆方法进行Northern杂交。结果表明TiERF1基因的转录表达受纹枯病菌的诱导，在正常条件下，检测不到TiERF1基因的表达，纹枯病菌侵染2小时后，TiERF1基因的表达量开始增加，在侵染5小时达到最大值，侵染12小时和24小时的表达量稳定在最大值(图2A)；TiERF1基因的转录表达受盐胁迫的诱导，在正常条件下，检测不到TiERF1基因的表达，250mM NaCl水溶液处理2小时后，TiERF1基因的表达量开始增加，胁迫5小时达到最大值，胁迫10小时和24小时的表达量稳定在最大值(图2B)；TiERF1基因的转录表达受干旱的诱导，在正常条件下，检测不到TiERF1基因的表达，干旱胁迫2小时后，TiERF1基因的表达量增加，胁迫5小时和胁迫10小时的表达量与胁迫2小时的表达量一致(图2C)；TiERF1基因的转录表达也受低温的诱导，在正常条件下，检测不到TiERF1基因的表达，冷胁迫2小时后，TiERF1基因的表达量增加，胁迫5小时和胁迫10小时的表达量与胁迫2小时的表达量一致(图2D)；TiERF1基因的转录表达受乙烯的诱导，在正常条件下，检测不到TiERF1基因的表达，乙烯处理2小时的表达量最高，24小时的表达量有所下降(图2E)。以上实验表明TiERF1基因的转录表达受到纹枯病菌、盐、旱、冷、乙烯等诱导。

实施例3、中间偃麦草TiERF1基因在大肠杆菌中的体外表达

根据序列表中的序列1设计1对特异性引物，并在上、下游引物两端加上酶识别位点EcoRI和XhoI，具体序列如下AP1 5’-CCGAATTCCCGACGACTCCGACGACA-3’，AP25’-TTCTCGAGCTAGCTGACCAGCTGCTGC-3’；通过PCR扩增TiERF1的包含AP2 DNA结构域及两侧序列，得到约700bp的cDNA片段，用EcoRI和XhoI(Takara)酶切目的基因扩增片段和融合蛋白表达载体PGEX-4T-1(购自Amersham公司)，纯化、回收目的基因片段和载体片段。通过T₄ DNA ligase将TiERF1插入到PGEX-4T-1的GST位点之后，然后转化到大肠杆菌BL21细胞中，挑取单菌落，培养，提取质粒，用AP1和AP2引物对进行PCR鉴定，并测序，把经鉴定确认的含TiERF1基因的菌株命名为PGST-ERF1。将PGST-ERF1在LB液体培养基中37℃培养，加入1mM IPTG进行诱导，诱导4h后离心收集菌体；按照Microspin GST Purification Moduleprotocol(Amersham)方法纯化、回收诱导表达的融合蛋白。经过SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果图3所示，表明经诱导的菌株有一融合蛋白带约43KD(箭头示)，说明TiERF1能够在大肠杆菌中进行表达翻译。图3中，M为marker，0为未诱导的融合蛋白表达载体细胞总裂解物，4C为诱导4小时的融合蛋白表达载体细胞总裂解物，4P为诱导4小时的纯化的融合蛋白。

实施例4、TiERF1与GCC-BOX序列的特异结合

人工合成2份顺式作用元件GCC-box(ATAAGAGCCGCCACTAAATAAGAGCCGCCACTAA)，并两端加上BamHI和PstI酶切位点的(GGATCC ATAAGAGCCGCCACTAAATAAGAGCCGCCACTAACTGCAG)，将其连接到报告载体pHIS2(Clontech.)中HIS报告基因上游的多克隆位点的BamHI和PstI酶切位点间，按照Clontech实验手册转化到酵母菌株Y187(Clontech.)中，作为报告子酵母Y187-GCC。

制备报告子酵母感受态细胞：接种直径为2-3mm的含报告基因(GCC-BOX)的酵母菌株Y187-GCC菌落到1mL YPD液体培养基中，剧烈振荡2分钟，分散团块后将悬浮液转至含有50mL YPD液体培养基的三角瓶中，30℃ 250rpm，培养过夜至OD₆₀₀为1.6，将该培养物转移到300mL YPD中，30℃ 250rpm培养约3小时至OD₆₀₀为0.3-0.4，1000g离心5min，收集菌体，弃上清，用100mL 1×TE悬浮，离心，弃上清，用1.5mL1×TE/LiAc溶液悬浮细胞沉淀，充分混匀即为酵母感受态细胞液。

按照Clontech的操作手册，将TiERF1基因cDNA序列(序列1)插入到酵母GAL4活化结构域表达载体pGADT7-RAC2(Clontech.)的多克隆位点，并把鉴定正确的含有TiERF1基因cDNA序列的融合载体命名为pGAD-ERF1，转化，提取质粒。

转化(按照Clontech方法)：取出2.5μg pGAD-ERF1质粒DNA(以pGADT7-RAC2为对照)、5μL鲑鱼精DNA(10mg/ml)，500μL报告子酵母Y187-GCC感受态细胞液和500μL LiAc/PEG，充分混合后，高速振荡20秒，30℃培养30分钟，每隔10分钟振荡1次，加入20μl DMSO，轻轻颠倒混合，42℃水浴热休克15分钟，每隔5分钟轻轻混合1次，冰上冷冻2分钟，高速离心15秒，弃上清，加入1ml YPD-培养基(购自Clontech.)重新悬浮，30℃保温90分钟，高速离心15秒，弃上清，用1mLNaCl(0.9％)重新悬浮细胞。涂布150μl转化的细胞到含有3-AT(His3基因产物的竞争抑制剂)的营养缺陷培养基(-His/-Ura/-Trp/SD)培养基(购自Clontech.)上，30℃培养3-4天。结果如图4所示，表明转入pGAD-ERF1的酵母能够在含5mM 3-AT的-His/-Ura/-Trp/SD培养基上生长；而转入pGADT7-RAC2的酵母不能在含5mM 3-AT的-His/-Ura/-Trp/SD培养基上生长。说明TiERF1基因编码的蛋白能特异地与HIS报告基因上游的顺式作用元件GCC-box结合，进而有效地激活HIS报告基因的转录。图4中1和2为转入对照质粒pGADT7-RAC2的酵母在含3-AT的-His/-Ura/-Trp/SD培养基上不能够生长情况，3和4为转入pGAD-ERF1质粒的酵母在含3-AT的-His/-Ura/-Trp/SD培养基上生长情况。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1418

<212>DNA

<213>中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)

<400>1

acggcgagga tgctgctgaa cccggcctcg gaggcgctgg tgctcgacag catcaggcag     60

cacctcatgg aggagacggc ggccgtggcg gcgccggcgg aggcgaggag gcagaggccg    120

gcctactgcc ggagcaccag cttcgggagc ctggtggccg accagtggag cgagtcgctc    180

ccgttccgcg ccgacgactc cgacgacatg gtcgtctacg gcgcgctccg cgacgccttc    240

tcctgcggct ggctccccga cggctccttc gccgccgtca agccggagcc cctgccttcc    300

ccggactcct acgcgtgcga cggcccgtcg tgcttcggtt tcctcgagcc ggagacgcct    360

ccggccacgc ccccgggcga gggcgaggag gccacggcgt tcatgggcga ggcggccgcc    420

gcggtggcca gggggaagca ctaccgaggg gtgcggcagc ggccgtgggg caagttcgcg    480

gcggagatcc gggacccggc caagaacggc gcgcgcgtgt ggctcggcac ctacgacacc    540

gccgaggacg ccgccgtggc gtacgaccgc gccgcgtacc gcatgcgcgg ctcccgcgcg    600

cttctcaact tcccgctccg catcggctcc gagatcgccg ccgcaaaagc cgcggccgcg    660

gccgccggcg acaagcgtcc gtcgcccgag cccgcgacct cggactcgtc ctcctcctcc    720

tcgtccgggt ccccgaaaag aaggaagagg ggcgaggccg cggccgcgtc catggccatg    780

gcgctggtgc cgccgccctc ccagctgagc cggccggccc aggcgtggta ccccgccgcg    840

ccggtcgagc aggtggccat ggcgccgcgc gtgcagcagc tggtcagcta ggccccgcgt    900

gccagccacc gggcgcacga tcgtaaaaga caatgcgcaa gtgcaatgga tcgatcagca    960

agtgcatgga cgcgacagca acatgagccc gcctttcact gttgcacggt gcaaggtggt   1020

gatggcaatg gagtgcgatg ccgatcgagc gagcgagcaa tccggcaaag caaccttagc   1080

gacggctcca tttggatatt tggatgggcc gagaaaggaa gataagctcg gagcaactgg   1140

gtgctgcaat ttggtctgga atgacagttc ctcctctgtc tgctcggtgc aactcgccca   1200

agtggatcaa agcgaaactg tgctagtagt atcgggtcgt cgtggtccgt tgtgagtcgt   1260

agggttatat ttgcgtcgct gtcagagtgc gtgtggtaaa aattacaccc ttgtgatcga   1320

gct taatgga agttgtgaaa ctgtacaagc atctgtagag agaattccag ggagtgaatt  1380

cttaccccat  catcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa                          1418

<210>2

<211> 293

<212>PRT

<213>中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)

<400>2

Met Leu Leu Asn Pro Ala Ser Glu Ala Leu Val Leu Asp Ser Ile Arg

1               5                   10                  15

Gln His Leu Met Glu Glu Thr Ala Ala Val Ala Ala Pro Ala Glu Ala

            20                  25                  30

Arg Arg Gln Arg Pro Ala Tyr Cys Arg Ser Thr Ser Phe Gly Ser Leu

        35                  40                  45

Val Ala Asp Gln Trp Ser Glu Ser Leu Pro Phe Arg Ala Asp Asp Ser

    50                  55                  60

Asp Asp Met Val Val Tyr Gly Ala Leu Arg Asp Ala Phe Ser Cys Gly

65                  70                  75                  80

Trp Leu Pro Asp Gly Ser Phe Ala Ala Val Lys Pro Glu Pro Leu Pro

                85                  90                  95

Ser Pro Asp Ser Tyr Ala Cys Asp Gly Pro Ser Cys Phe Gly Phe Leu

            100                 105                 110

Glu Pro Glu Thr Pro Pro Ala Thr Pro Pro Gly Glu Gly Glu Glu Ala

        115                 120                 125

Thr Ala Phe Met Gly Glu Ala Ala Ala Ala Val Ala Arg Gly Lys His

    130                 135                 140

Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Phe Ala Ala Glu Ile

145                 150                 155                 160

Arg Asp Pro Ala Lys Asn Gly Ala Arg Val Trp Leu Gly Thr Tyr Asp

                165                 170                 175

Thr Ala Glu Asp Ala Ala Val Ala Tyr Asp Arg Ala Ala Tyr Arg Met

            180                 185                 190

Arg Gly Ser Arg Ala Leu Leu Asn Phe Pro Leu Arg Ile Gly Ser Glu

        195                 200                 205

Ile Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asp Lys Arg Pro

    210                 215                 220

Ser Pro Glu Pro Ala Thr Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly

225                 230                 235                 240

Ser Pro Lys Arg Arg Lys Arg Gly Glu Ala Ala Ala Ala Ser Met Ala

                245                 250                 255

Met Ala Leu Val Pro Pro Pro Ser Gln Leu Ser Arg Pro Ala Gln Ala

            260                 265                 270

Trp Tyr Pro Ala Ala Pro Val Glu Gln Val Ala Met Ala Pro Arg Val

        275                 280                 285

Gln Gln Leu Val Ser

    290

Claims (10)

1、一种中间偃麦草ERF转录因子，是下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且与植物抗病性、抗逆性相关的蛋白质。

2、权利要求1所述的中间偃麦草ERF转录因子的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述中间偃麦草ERF转录因子编码基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

4、含有权利要求2或3所述中间偃麦草ERF转录因子编码基因的表达载体。

5、含有权利要求2或3所述中间偃麦草ERF转录因子编码基因的转基因细胞系。

6、含有权利要求2或3所述中间偃麦草ERF转录因子编码基因的宿主菌。

7、权利要求1所述的中间偃麦草ERF转录因子在培育抗病植物中的应用。

8、权利要求2或3所述的中间偃麦草ERF转录因子编码基因在培育抗病植物中的应用。

9、权利要求1所述的中间偃麦草ERF转录因子在培育抗逆植物中的应用。

10、权利要求2或3所述的中间偃麦草ERF转录因子编码基因在培育抗逆植物中的应用。

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