CN101736012B

CN101736012B - 一种来源于甘蓝型油菜的抗逆erf转录因子基因

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Publication number: CN101736012B
Application number: CN2008102035353A
Authority: CN
Inventors: 熊爱生; 姚泉洪; 庄静; 彭日荷; 薛永; 高峰; 付晓燕; 李贤�; 田永生; 赵伟; 朱波; 金晓芬
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2008-11-27
Filing date: 2008-11-27
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2028-11-27
Also published as: CN101736012A

Abstract

本发明提供了一种甘蓝型油菜抗逆ERF转录因子基因及其制备方法和用途。所述的油菜抗逆ERF转录因子基因是BnaERFB1-2-Hy15，其碱基序列如SEQ ID No 1。本发明利用聚合酶扩增技术从油菜幼苗中克隆

Description

一种来源于甘蓝型油菜的抗逆ERF转录因子基因

技术领域

本发明涉及作物遗传育种领域，更具体地说涉及一种来源于甘蓝型油菜抗逆相关的基因序列。

背景技术

植物的一生处于多种非生物胁迫之中，如干旱、高盐和极端温度等逆境，这些胁迫都对植物的生长发育产生不利的影响而最终影响其产量和品质。植物感应胁迫信号，通过一系列信号转导最后启动相关基因表达，协助植物适应或抵御逆境，相关基因表达的产物在逆境耐受和响应中起作用，其中有些基因仅被水份胁迫诱导，有些基因仅被低温诱导，有些基因同时被水和低温胁迫诱导(Shinozaki和Yamaguchi，Curr Opin Plant Biol，2000，3：217-22；Yamaguchi和Shinozaki，Annu Rev Plant Biol，2006，57：781-803)。转录因子(Transcription Factor)又称反式作用因子，是和专一性DNA序列结合并能激活或抑制其他功能基因转录的蛋白质分子(Riechmann和Meyerowitz，Biol Chem，1998，379：633-646)。AP2/ERF是植物中普遍存在的一类重要转录因子，在逆境诱导基因的表达中起信号转导的作用(Riechmann等，Science，2000，290：2105-2110；Sakuma等，Biochem Biophys Res Commun，2002，290：998-1009；Zhuang等，BiochemBiophys Res Commun，2008，371：468-474)。

我国油菜产业的发展对世界菜籽油及制品市场影响巨大。由于我国庞大的人口，尽管是油菜生产大国，但同时又是食用植物油短缺的国家，据统计，全国城乡人均植物油年消费量为8.5公斤，植物油总需求量1400多万吨，并保持以每年50万吨的速度增长，而目前我国总生产量只900多万吨。预计2020年我国年需植物油将达2040万吨，缺口较大，需要依靠大量进口来弥补国内产需缺口。同时油菜还是一种潜在的生物能源，关系到我国的能源安全和环境安全(王汉中.中国油料作物学报，2002，24(2)：82-86；王汉中.中国油料作物学报，2005，27(4)：100-105)。

油菜杂种优势利用和常规育种研究方面我国在世界上具有较强的地位，但在基因工程、分子标记、以及基因组等研究方面仍处于起步阶段，与油菜育种密切相关的基础研究工作和技术则相对落后(王汉中，2004)。虽然科学栽培技术能够较大幅度的提高油菜产能，但是油菜遗传育种仍然是提高油菜总产量最关键的因素(傅寿仲等，中国油料作物学报，2006，28(1)：86-91)。油菜遗传育种中提高油菜品种的抗逆能力仍然是重要的育种目标之一，而通过杂交和回交等手段在品种间和种间进行抗逆性目的基因的转移和遗传重组，需要漫长的时间，加上抗逆遗传基础的复杂性使得常规育种难以奏效。转录因子与相关顺式元件的结合，激活了有关功能基因的表达，转录因子就相当于一个开关，功能基因是一个灯泡，大功率的灯泡只有开关打开了才能发出耀眼的亮光，而且一个开关可以管若干灯泡。由此可见，分离研究抗逆境转录因子的意义有时要大于单纯功能基因的研究。

植物体内存在大量的转录因子，仅对拟南芥(Arabidopsis thaliana)第4号染色体的基因组序列进行分析，发现15％的基因编码或可能编码转录因子(Riechmann Science，2000，290：2105-2110)。近年来，相继分离出大量不同类型的转录因子，根据转录因子保守DNA结合域的不同，又可分为十几类或家族，如：AP2/ERF类、bZIP类、bHLH类、HSF类、MYB类、MYC类、NAC类、WRKY类等(Shinozaki和Yamaguchi，Curr Opin PlantBiol，2000，3：217-22；Yamaguchi和Shinozaki，Annu Rev Plant Biol，2006，57：781-803)。其中有些转录因子类又可根据DNA结合域保守氨基酸残基的特点再分为亚类，如：AP2/ERF转录因子家族分为五个亚族：AP2(APETALA2)、RAV(related to ABI3/VP)、DREB/CBF(Dehydration-Responsive-Element-Binding/CRT-Binding-Factor)、ERF(Ethylene-Responsive-Element-Binding-Factor)和其它类别，其中ERF亚族又分B1、B2、B3、B4、B5和B6六个小亚族，DREB亚族又分A1、A2、A3、A4、A5和A6六个小亚族(Sakuma等，Biochem Biophys Res Commun，2002，290：998-1009；Nakano等，Plant Physiol，2006，140：411-432；Zhuang等，Bio-chem Biophys Res Commun，2008，371：468-474)。AP2/ERF类转录因子通过参与乙烯、脱落酸、茉莉酸和水杨酸等信号转导途径，调控下游基因的表达，从而提高植物的抗性和耐受性。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘蓝型油菜抗逆ERF相关转录因子基因。

所说的甘蓝型油菜抗逆相关转录因子基因，是BnaERFB1-2-Hy15，它具有SEQ ID NO.1的序列。

上述的转录因子基因编码的蛋白质，它具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

上述的转录因子基因BnaERFB1-2-Hy15能用于植物转化，在制备抗逆的转基因植物中的应用。

上述所说的甘蓝型油菜抗逆相关转录因子基因BnaERF B1-2-Hy15，是通过以下方法得到：

1.油菜cDNA文库的构建

本发明将油菜种子经1％(v/v)NaOCl消毒后种植在黑土：珍珠岩：蛭石(1:1:1)混合基质中，22℃、16h光照培养生长20d。选生长健壮的幼苗提取总RNA。以总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，参照东洋纺(上海)生物科技有限公司cDNA合成试剂盒说明(http://www.bio-toyobo.cn/)，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA。

2.引物的设计与合成

木发明设计一对引物，引物两端分别引入Bam HI和Sac I的酶切位点。BnaERFB1-2-F：5’-GGATCCATGAGGAAAGGGAGAGGCTCCTC-3’；BnaERFB1-2-R：5’-GAGCTCTCAGAATTCAAGACGTAGATCGGTGCAGTGG-3’。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成(http://www.sangon.com/)。

3.PCR的方法获得甘蓝型油菜抗逆相关转录因子BnaERFB1-2-Hy15基因片段

本发明PCR扩增采用大连宝生物工程有限公司(http://takara.com.cn/)的PCR试剂在50μl的体系中进行PCR反应，反应参数为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共扩增30个循环，再72℃延伸10min。经过1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约700bp的片段。

4.克隆鉴定与序列测定

扩增片段采用杭州维特洁生化技术有限公司(www.axygen.com.cn/)DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后克隆到大连宝生物工程有限公司(http://takara.com.cn/)的pMD-18-Simple T载体上进行克隆鉴定和序列测定。

5.序列分析

本发明通过核苷酸序列测定分析，最终获得甘蓝型油菜抗逆相关转录因子基因BnaERFB1-2-Hy15，它具有如下的碱基和氨基酸序列信息。

碱基序列：

1 ATGAGGAAAG GGAGAGGCTC CTCCGCCGTT GCACCCGCCC TTCCGGTAAC CGCCAACGGA

61 TCCGCGAAGG AGCCGAGGTA TAGAGGCGTT AGGAAGAGAC CATGGGGCCG TTTCGCCGCA

121 GAGATCCGCG ATCCGTTAAA GAAATCCCGA GTCTGGCTCG GCACGTTCGA CTCCGCCGTG

181 GAAGCTGCAC GCGCCTACGA TCAAGCCGCT CGCAACCTCC GTGGTCCCAA GGCCAAGACC

241 AACTTCCCGA TCGACTGCTC TCCGTCTTCC CCTCTCCAAC CACTCTATCA CCAGAATCTT

301 CGATCGGCGA ATCAGAGCCA GATCGATCCG TTCATGGACC ACCGGTTATA CGGCGGAGGA

361 GGCGAGCAGC AGATTATCAG CCGCCCGGCG AGCAGCAGCA TGAGCAGCAC CGTGAAATCG

421 TTCAGCGGGC AGAGACCGTC TTCTTCCGTG GCGAAGCCGT TAGCCGCCGC GAAGAGGTAT

481 CCGCGGACTC CGCCGGTGGC TCCGGAGGAT TGCCACAGCG ACTGCGATTC GTCGTCGTCG

541 GTGATTGATG ATGGAGACGA CATCGTTTCG TCGTCTACGA GAAGGAAACC GCCGTTTCAG

601 TCTGATCTTA ATTTTCCGCC GTTGGATGGC GTTGACTTAT TCGATGATGA TCTCCACTGC

661 ACCGATCTAC GTCTTTGA

氨基酸序列：

1 MRKGRGSSAV APALPVTANG SAKEPRYRGV RKRPWGRFAA ETRDPLKKSR VWLGTFDSAV

61 EAARAYDQAA RNLRGPKAKT NFPIDCSPSS PLQPLYHQNL RSANQSQIDP FMDHRLYGGG

121 GEQQIISRPA SSSMSSTVKS FSGQRPSSSV AKPLAAAKRY PRTPPVAPED CHSDCDSSSS

181 VIDDGDDIVS SSTRRKPPFQ SDLNFPPLDG VDLFDDDLHC TDLRL*

本发明所述的转录因子基因BnaERFB1-2-Hy15能用于植物转化，在培育提高植物抗逆性中的应用。

本发明实现的有益效果：

本发明克隆了甘蓝型油菜BnaERFB1-2-Hy15转录因子基因，为了进一步分析该基因在低温逆境中的作用与功能，我们比较了转BnaERFB1-2-Hy15基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株对低温胁迫的耐受性。结果表明，野生型和转BnaERFB1-2-Hy15基因拟南芥植株在存活率上有明显的差异，转基因植株比野生型拟南芥有明显的抗冻能力，这也表明BnaERFB1-2-Hy15的转入提高了拟南芥植株的抗低温的能力。

附图说明

图1.琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物的结果。

图2.琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

双低甘蓝型油菜沪油15(Brassica napus L.Huyou15)的种子经过1％(v/v)NaOCl消毒后种植在黑土：珍珠岩：蛭石(1:1:1)的基质中，22℃，光照培养(16h光照，8h黑暗，冷光源)生长20天。

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存。克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。

下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行(Sambrook J，Frets E F，Mannsdes T et al.In：Molecular Cloning.2nd ed.Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)。

实施例1：双低甘蓝型油菜沪油15幼苗RNA的抽提和cDNA合成

(一)试验方法：

1、RNA的抽提

加入100mL提取缓冲液(油菜RNA提取缓冲液配方：CTAB 3％(W/V)；PVP 3％(W/V)(Mw 4000)；EDTA 25mM；NaCl 2.0M；Tris-HCl100mM，pH8.0；Spermidine 0.5g/L；DEPC 0.1％(V/V)；0.1％ DEPC处理的SDS 0.5％(W/V)；0.1％DEPC处理的LiCl 10M)到50mL聚丙烯管，65℃预热；

称取5g植物材料倒入液氮使材料始终保持冻结和易碎的状态，研磨；

研磨后细粉转移至预先加入65℃预热的提取缓冲液的50mL离心管；

将离心管放入65℃水浴45min，并偶尔摇动以混合各成分；

加入等体积氯仿-异戊醇混合液，轻柔地上下颠倒混合约10min；

在18℃，于12000g离心10min；

吸取上清液，重复5，6步骤操作；

吸取上清液，加入1/4体积的10M LiCl溶液，彻底混匀，4℃放置12h；

在4℃，12000g离心30min；

RNA沉淀用500μL 0.5％ SDS轻柔溶解，用氯仿-异戊醇混合液抽提，4℃，12000g离心30min；

上清液转移至另一新的管子，加入2倍体积-20℃冰冷的无水乙醇，充分混合，放置在-20℃条件下2h，沉淀总RNA；

12000g，4℃离心30min，用75％乙醇漂洗两次，保留RNA，真空风干；

用200μL DEPC处理的去离子水重新溶解，取少量用于RNA质量和浓度的检测，其余储存于-70℃，备用。

2cDNA合成

加入Oligo(dT)20(10pmol/μL)1μl；总RNA：10～100ng；补足RNaseFree H2O到12μL。

65℃，5min后，立即置于冰上。

再加入5×RT Buffer 4μL；dNTP Mixture(各10mM)2μL；RNaseInhibitor(10U/μL)1μL；反转录酶1μL。

反转录反应过程为：30℃ 10min；42℃ 20min；85℃ 5min；4℃ 5min。

瞬间离心，保存。

(二)试验结果：

采用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物的结果见图1，图中可见明显的RNA条带。

实施例2：PCR的方法获得甘蓝型油菜抗逆相关转录因子BnaERFB1-2-Hy15基因片段

(一)试验方法：

本发明设计一对引物(BnaERFB1-2-F和BnaERFB1-2-R)，为了克隆鉴定等构建的需要，引物两端分别引入Bam HI和Sac I的酶切位点。

PCR反应体系：10×PCR buffer 5.0μL；dNTPs(各2.5mM)4μL；双低甘蓝型油菜沪油15的cDNA模板1μL(20ng)；引物BnaERFB1-2-F 0.5μL；引物BnaERFB1-2-R 0.5μL；Ex-Taq 0.4μL(预变性后加入)；加无菌水定容至50μL。PCR反应程序：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共扩增30个循环，再72℃延伸10min。

(二)试验结果：

经过1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约700bp的片段(图2)。

实施例3：克隆鉴定、序列测定

(一)试验方法：

扩增片段采用杭州维特洁生化技术有限公司DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后克隆到大连宝生物工程有限公司的pMD-18-Simple T载体上进行克隆鉴定和序列测定。

本发明通过核苷酸序列测定分析，最终获得甘蓝型油菜抗逆相关转录因子BnaERFB1-2-Hy15基因，具有如下的碱基和氨基酸序列信息。

(二)试验结果：

测序分析结果显示甘蓝型油菜抗逆相关转录因子BnaERFB1-2-Hy15基因编码阅读框由678bp组成，编码一个225个氨基酸的蛋白质。

实施例4：拟南芥转化

(一)试验方法：

1 农杆菌的准备

1)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250转/分钟培养20h。

2)取1mL菌液转接入20-30mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250转/分钟培养约12h，测OD 600≈1.5。

3)8000转/分钟，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)并稀释至OD 600≈0.8。

2 拟南芥蘸花法转化

1)将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约10s后取出，个部转化完毕后，托盘中加入水，用保鲜膜罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置22℃避光培养，24h去掉保鲜膜直立培养。

2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。

3)生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱贮存待用。

(二)试验结果：

经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。

实施例5：拟南芥种子的筛选

(一)试验方法：

1)称25—30mg种子放入1.5mL离心管。

2)1mL 75％乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000转/分钟离心5s，去上清。

3)加入1mL过滤后的漂白粉(5％)消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)，8000转/分钟离心5s，去上清。

4)无菌水洗涤3—4次。

5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(潮霉素50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16h光照培养6天。

6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(T₀)培养至开花结实，收集T₀植株上所结T₁种子。

实施例6：转录因子基因BnaERFB1-2-Hy15转化植物后的抗逆分析

将转基因拟南芥自交纯合2代，获得3个纯合转化株系，收取种子。播种后，幼苗生长10-20天，转入4℃低温驯化24小时，然后转入—20℃处理30分钟，然后再移置到正常温度，观察植物的耐冷效果。

(二)试验结果：

结果表明，野生型和转BnaERFB1-2-Hy15基因拟南芥植株在存活率上有明显的差异，转基因植株比野生型拟南芥抗冻能力有明显提高。经过抗冻处理的转基因与野生型拟南芥的存活率如表1所示。

表1 转基因与野生型拟南芥的抗冻后存活率

编号	存活率(％)
		对照	22.4
转BnaERFB1-2-Hy15基因株系1	56.5
		转BnaERFB1-2-Hy15基因株系2	55.3
转BnaERFB1-2-Hy15基因株系3	57.1

序列表

<110>上海市农业科学院

<120>一种甘蓝型油菜抗逆ERF转录因子基因

<130>0811543

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>SEQ ID No 1

<211>678

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<210>SEQ ID No 2

<211>225

<212>PRT

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

Claims

1.一种甘蓝型油菜抗逆ERF转录因子基因，其碱基序列如SEQ ID No 1。

2.权利要求1所述的甘蓝型油菜抗逆ERF转录因子基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No 2。

3.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜抗逆ERF转录因子基因的制备方法，包括如下步骤：

1)油菜cDNA文库的构建：选取油菜幼苗提取总RNA，以总RNA为模板、Oligo dT为引物，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA；

2)设计一对引物BnaERFB1-2-F：5’-GGATCCATGAGGAAAGGGAGAGGCTCCTC-3’和BnaERFB1-2-R ：5’-GAGCTCTCAGAATTCAAGACGTAGATCGGTGCAGTGG-3’，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，获得油菜抗逆ERF转录因子BnaERFB1-2-Hy15基因片段；

3)上述扩增片段回收后克隆入T载体，测序后获得油菜抗逆ERF转录因子BnaERFB1-2-Hy15基因。

4.如权利要求1所述的转录因子基因在制备抗冻能力的转基因植物中的应用。