CN101792488A - 棉花抗病相关转录因子mereb2及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棉花抗病相关转录因子MEREB2及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，命名为MEREB2，来源于海岛棉，是如下1)或2)的蛋白：1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与植物抗病相关的有1)衍生的蛋白质。将本发明提供的蛋白的编码基因导入烟草或棉花中，得到的转基因植物体内的抗病相关基因的表达量提高。MEREB2蛋白能够特异地结合GCC-box，从而激活目的基因的表达。MEREB2蛋白是抗病相关转录因子，可在培育抗病植物中得到广泛应用。

Description

棉花抗病相关转录因子MEREB2及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种棉花抗病相关转录因子及其编码基因与应用。

背景技术

棉花是我国最重要的经济作物之一，但黄萎病对棉花种植的影响非常严重，使棉花的产量和品质受到了巨大破坏；为解决这个问题，人们尝试利用分子生物学的手段来提高棉花自身的抗病性。近年来，研究发现ERF类转录因子在植物抗逆机制和植物分子改良中具有重要意义。ERFs参与了植物对生物和非生物胁迫应答反应，在乙烯等信号转导途径中发挥了关键的调控作用。研究表明，ERFs可与GCC-box等顺式作用元件发生互作从而激活病程相关蛋白基因的表达从而提高植物抗病能力。因此，ERF类转录因子可应用于农作物对生物和非生物胁迫抗(耐)性的改良。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白。

本发明提供的蛋白，命名为MEREB2，来源于海岛棉，是如下1)或2)的蛋白：

1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与植物抗病相关的有1)衍生的蛋白质。

为了使1)中的MEREB2便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的MEREB2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的MEREB2的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第1-669位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

序列表中序列2氨基酸残基是由222个氨基酸残基组成的蛋白质。所述序列2中自氮端到碳端第26位到第86位氨基酸残基保守结构域是转录因子MEREB2的ERF功能保守域。

编码上述蛋白的cDNA，命名为MEREB2，也在本发明的保护范围内。

本发明提供的编码基因基因是如下1)或2)或3)的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1；

2)在严格条件下与1)限定的基因杂交且编码与植物抗病相关蛋白的核苷酸序列；

3)与1)限定的基因具有90％以上的同源性，且编码与植物抗病相关的核苷酸分子。

所述的严格条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。

上述4)中的基因与1)的基因最好有95％以上的同源性。

序列表中MEREB2基因cDNA全长为669个碱基组成，开放阅读框自3’端第1到669位碱基，其表达主要受黄萎病菌等真菌或真菌毒素的诱导。

扩增MEREB2基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述基因的重组载体也属于本发明的保护范围之内。

可用现有的植物表达载体构建含有MEREB2基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN、pBY505或其它衍生植物表达载体。

使用MEREB2基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)、Actin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

上述重组载体具体是将上述的基因插入载体pBI121的多克隆位点，得到的重组载体。

含有上述基因的重组菌也属于本发明的保护范围之内。

含有上述基因的转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。

本发明的另一目的在于提供一种培育抗病相关基因表达增强的转基因植物的方法。

本发明提供的一种培育抗病相关基因表达增强的转基因植物的方法，是将上述的基因导入目的植物中得到转基因植物，所述转基因植物中的抗病相关基因的表达量高于目的植物。

上述的基因是通过上述的重组载体导入目的植物中的；所述植物是双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物是棉花、烟草、拟南芥、大豆或油菜；所述单子叶植物是水稻或小麦。携带有本发明的MEREB2基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、如基因枪法、花粉管通道、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

所述抗病相关基因为烟草抗性相关基因或棉花抗性相关基因；所述烟草抗性相关基因是：序列3所示的PR1a基因、序列4所示的PR2基因或序列5所示的PR5基因；所述棉花抗性相关基因是：序列6所示的PR蛋白基因、序列7所示的几丁质酶基因或序列8所示的β-1，3-葡聚糖酶基因。

本发明的又一目的在于提供一种培育抗病转基因植物的方法。

本发明提供的一种培育抗病转基因植物的方法，是将上述的基因导入目的植物中，得到抗病的转基因植物。

上述的基因是通过上述的重组载体导入目的植物中的。携带有本发明的MEREB2基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、如基因枪法、花粉管通道、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

上述抗病的转基因植物是抗黄萎病的转基因植物

上述植物是双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物是棉花、烟草、拟南芥、大豆或油菜；所述单子叶植物是水稻或小麦。

本发明的MEREB2蛋白含有一个高度保守的AP2/ERF结构域、一个核定位信号和一个激活域，属于AP2/ERF类家族转录因子的新成员。MEREB2基因在棉花根、茎和叶中都表达，同时MEREB2基因的表达受黄萎病菌诱导，MEREB2的mRNA累积速度较快。EMSA实验证明，MEREB2蛋白可与GCC-box探针混合物可以发生凝胶阻滞，而与突变体GCC-box探针不能发生阻滞，这说明MEREB2蛋白能够特异地结合GCC-box，从而激活目的基因的表达。同时转MEREB2基因烟草体内PR基因表达量明显提高。MEREB2蛋白是抗病相关转录因子，可在培育抗病植物中得到广泛应用。

附图说明

图1为MEREB2在各组织中诱导前后表达量的变化情况，以UBQ7为参照，其中a是MEREB2在诱导前各组织中的表达情况；b是MEREB2在诱导后各组织中的表达情况。

图2为MEREB2探针与基因组DNA Southern blotting图。

图3为原核表达载体pGEX4T-1/EREB2的构建图。

图4为双元表达载体pBI121/MEREB2构建图。

图5为融合蛋白GST/EREB1与GCC-box探针的结合。

图6为转基因植物，其中图A是转pBI121/MEREB2的烟草；图B是转pBI121/MEREB2的陆地棉；C是转pBI121/MEREB2的烟草植株的PCR检测，CK：野生型植株扩增结果，1-5：阳性植株扩增结果，M：Marker DL2000。

图7为qRT-PCR分析正常生长条件下转pBI121/MEREB2的烟草中PR基因表达，图中显示出基因的相对表达量，其中图7A是PR1a表达；图7B是PR2的表达；图7C是PR5的表达。

图8为普通生长状态下转pBI121/MEREB2的棉花植株体内抗病基因的表达，其中A是MEREB2表达、B是几丁质酶基因的表达、C是β-1，3-葡聚糖酶基因的表达、D是PR基因的表达、E是UBQ7内标。

图9为黄萎病菌侵染2周后的转pBI121/MEREB2的棉花叶片照片，其中A是野生型对照、B、C是转pBI121/MEREB2的棉花株系的叶片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。所用试剂均可从商业途径获得。

下述实施例中，所述含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

本发明所用的遗传资源如下：

棉花(新海20)，于2002年3月购自新疆农科院经济作物研究所天成公司(邮编：830000新疆乌鲁木齐南昌路38号)，因为购买的，所以其原始来源不清楚。

实施例1、棉花抗病相关转录因子MEREB2的cDNA的序列分析、拷贝数分析和表达模式分析

一、棉花抗病相关转录因子MEREB2的cDNA的序列分析

用Promega RNAgents

总RNA提取试剂盒提取生长两周的棉花(新海20)(购自新疆农科院经济作物研究所天成公司)幼苗的总RNA，用Promaga反转录试剂盒试进行反转录。

以ERF族转录因子的保守域设计简并性引物，MHF1：5-TA(C/T)AG(A/G)GGTIAG(A/G)-3；MHR1：5’-IGG(A/G)AA(A/G)TIAG(C/T)CTIGC-3；I为次黄甘酸(inosine)，PCR条件为94℃，3分；94℃30秒，60℃30秒，72℃90秒-30循环；72℃10分；4℃保存。PCR产物连接到pMD18-T载体上用于测序，以上述反转录的cDNA为模板扩增出EST序列；通过Genebank网上同源性序列比对及利用RACE法扩增基因5’和3’非编码区，最终获得基因全长cDNA，测序结果发现，该基因cDNA克隆编码的蛋白含有AP2/ERF结构域，且具有完整的编码框，命名为MEREB2。该基因全长cDNA序列为669bp，具有一个单一的编码阅读框，编码由222个氨基酸残基组成的蛋白。另外，在MEREB2编码蛋白的氨基酸序列上，发现了转录因子的其它典型特征，例如，N-末端区域的碱性氨基酸序列，C-末端的酸性区域，其可能是一个转录激活结构域。因此，MEREB2能编码一个能与DNA结合的ERF转录因子，从而作为转录调控子在棉花中起到抗逆功能。

二、棉花抗病相关转录因子MEREB2的拷贝数分析

参照DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche)提供的方法用地高辛标记探针MEREB2基因编码区全长片段(669bp)为探针。采取培养5周的海岛棉幼嫩叶片10g，用CTAB法提取基因组DNA，经RNase A消化后进行纯化。将纯化后的基因组DNA用限制性内切酶EcorV、HindIII、XbaI过夜酶切，用乙醇沉淀法浓缩产物，终产量为1ug/ul，总体积为100ul，制备0.8％琼脂糖凝胶(每胶孔加入DNA量为33ul)，经电泳分离，转移到尼龙膜上，和地高辛标记探针进行Southern杂交。由最终杂交效果图可以观察到每条酶切带只有一条明显的杂交亮带，这表明MEREB2基因在棉花基因组中是一个单拷贝基因(图2，E、H和X分别代表内切酶EcoRI、HindIII和XbalI的酶切)。

三、棉花抗病相关转录因子MEREB2的表达模式分析

将在28℃恒温培养箱中培养两周的棉花(新海20)幼苗，小心地拔出幼苗以进行伤根处理。采用黄萎病菌分生孢子悬浮液蘸根法对伤根处理后的材料进行毒素诱导处理；将培养一周的黄萎病菌用无菌水稀释后经4层纱布过滤，在显微镜下统计滤液孢子数，3次重复，配成浓度为1×10⁷mL^-1的孢子悬浮液，现用现配。接菌后棉苗环境温度保持在23～28℃，保持土壤湿度，以利于发病；取诱导48h后的植物叶片，迅速置于液氮中-80℃存放；分别采集植株的根、茎、叶和全株；用CTAB法提取总RNA，胁迫处理后将材料放入液氮速冻，-80℃保存备用。

通过Promga公司RNA提取试剂盒提取了胁迫处理后的棉花幼苗根、茎、叶组织的总RNA和不同胁迫处理下的棉花幼苗的总RNA。总RNA纯度与质量都较高，每个样品的RNA的A₂₆₀/A₂₈₀都在1.8以上，浓度在0.8μg/μL以上。经1％琼脂糖凝胶电泳检测，28S rRNA与18S rRNA条带非常清晰，表明所提取的RNA样品能用于RT-PCR反应。

用组成型表达基因ubiquitin(UBQ-7)作为内标，以5’-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3’和5’-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3’为引物，通过RT-PCR分析分析MEREB2基因在黄萎病菌胁迫条件下的表达，以及MEREB2基因在棉花根、茎和叶中的表达情况。结果如图1和2所示。MEREB2基因在棉花植株中的表达呈现了组织特异性的特点；MEREB2在根、茎中的表达量相对最高，而在叶中的表达量较低(图1)。MEREB2的表达受黄萎病菌的诱导，能诱导MEREB2的高效表达，特别是在根部和茎部。

上述结果说明MEREB2参与了黄萎病菌胁迫信号转导途径。

实施例2、抗病转基因烟草的获得及其功能分析与机理分析

一、抗病转基因烟草的获得

1、棉花抗病相关转录因子MEREB2的cDNA的克隆

人工合成一对引物，在其5’端分别加上BamHI和Xba I酶切位点：

上游引物：5’-GCTCTAGAATGGCTCCCC AAGACAAAAATGCGA-3’；

下游引物：5’-CGCGGATCCATCAAGCATCGACTGGAGGAGGAAG-3’。

以棉花(新海20)的基因组为模板，用上述的上下游引物进行PCR扩增，得到669bp的片段，命名为MEREB2，将得到的PCR产物回收，连接T载体(北京全式金生物技术有限公司pEASY-T3)，命名为pMEREB2，热激转入E.coli BL21(DE3)，通过PCR、酶切筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行测序验证，测序结果表明PCR扩增得到的片段具有序列2的自5′端第1-669位的核苷酸序列。

2、重组载体的构建

构建过程如图4所示。

将步骤1中经验证正确的pMEREB2经BamHI和Xba I双酶切得到目的基因片段，然后与经同样酶切过的pBI121载体连接(购于Clontech公司)，命名为pBI121/MEREB2，这样MEREB2即插入到35S启动子下游。经测序鉴定，pBI121/MEREB2构建正确。

3、抗病转基因烟草的获得

1)转入农杆菌

用冻融法将步骤2的重组表达载体pBI121/MEREB2转化农杆菌LBA4404(invitrogen)。

其中冻融法的步骤如下：取出-70℃保存的农杆菌LBA4404感受态细胞，冰浴融化；取10-20μl pBI121/MEREB2质粒DNA(约1-2μg)，加入到200ml融化的农杆菌感受态细胞中，用灭菌枪头搅匀，静置数分钟；置于液氮中1min，37℃水浴5min，加入700-800μl LB液体培养基，28℃、200rpm、震荡4h；1000g 30sec，去部分上清，留100-150μl，用枪头吸打重新悬浮，涂布于含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、34mg/L氯霉素的LB平板上，28℃倒置培养2d。

2)转入烟草

通过农杆菌侵染法将步骤1)中的农杆菌转入烟草Nc89(中烟种子有限责任公司)，得到转pBI121/MEREB2的烟草。

PCR鉴定阳性转基因烟草：以得到的转基因烟草为模板，用下述的引物进行PCR扩增：

上游引物：5’-ATGGCTCCCC AAGACAAAAA TGCG-3’；

下游引物：5’-ATCAAGCATC GACTGGAGGA GGAAG-3’。

结果如图6C所示，筛选得到阳性植株，挑取4株(如图6A)进行以下实验，命名为E2-1、E2-2、E2-3和E2-4。

二、功能分析

以野生型烟草作为对照。

1、抗病转基因烟草的抗病相关基因(PR基因)的表达分析

将苗龄为两周的上述的四个转pBI121/MEREB2烟草株系以及野生型烟草在普通生长条件(26℃，光照18小时)培养14天，以Actin基因为内参基因(Thangavelu，M.，Belostotsky，D.，Bevan，M.W.，Flavell，R.B.，Rogers，H.J.andLonsdale，D.M.，，Partial characteri--zation of the Nicotiana tabacum actin genefamily：evidence for pollen-specific expression of one of the gene familymembers Mol.Gen.Genet.1993.240(2)，290-295)，利用实时荧光定量PCR(RealTime Quantitative PCR)，检测并分析了各烟草在正常生长情况下，抗病相关基因(PR基因)转录水平表达量变化情况，其中检测PR基因所用引物如下：

PR1a基因(登录号X06362)：

F：5’-TTATGT TTCTCAATTG GCTGCAGAC-3’

R：5’-GGACTTTGGCCTATGACATTACC-3’

PR2基因(登录号M60460)：

F：5’-CAACATATTCAGGGATCTTAGCGAAT-3’

R：5’-CATTTCCAGG TTTCTTTGGA GT-3’

PR5(登录号AF154636)：

F：5’-ATTAGGCAAAGGCATATCAGAGTTG-3’

R：5’-CAAAACATTT CTAACACGCG ACAG-3’

通过qRT-PCR检测(三次重复)海岛棉ERF基因调控PR基因表达的情况并将得到的结果利用Excel软件制表总结，结果如图7所示，MEREB2基因转入烟草中后，在普通生长条件下，转基因烟草PR基因(PR1a基因如序列3所示，PR2基因如序列4所示，PR5基因如序列5所示)的表达相对于野生型烟草中表达明显增强，这证明了海岛棉ERF基因在调控抗病相关基因的过程中发挥了重要作用，可由此推测ERF基因在植物中超表达会有效增强抗病相关基因的表达，从而提高植株的抗病性，这为MEREB2基因的开发与利用提供了理论依据。

实施例3、抗病转基因棉花的获得及其功能分析

一、抗病转基因棉花的获得

1、棉花抗病相关转录因子MEREB2的cDNA的克隆

MEREB2的cDNA的克隆与实施例2步骤一的步骤1相同。

2、重组载体的构建

重组载体的构建与实施例2步骤一的步骤2相同。

3、抗病转基因棉花的获得

利用花粉管通道法将重组表达载体pBI121/MEREB2转入陆地棉(中棉所24，购自中棉所科技贸易公司)，得到转pBI121/MEREB2的棉花。

花粉管通道法是指当植物授粉后，向子房注射含目的基因的溶液，利用植物形成的花粉管通道，将外源基因导入受精卵细胞，从而进一步地被整合到受体细胞的基因组中，最终随着受精卵的发育而成为转基因植株。

PCR鉴定阳性转基因棉花：以得到的转基因棉花为模板，用实施例2中步骤3中的PCR鉴定阳性转基因烟草所用的引物进行PCR扩增：筛选得到阳性植株，挑取3株(如图6B)进行以下实验。

二、功能分析

以野生型棉花中棉所24作为对照。

1、抗病转基因棉花的抗病相关基因(几丁质酶基因、β-1，3-葡聚糖酶基因和PR蛋白基因)的表达分析

将苗龄为两周的上述的3个转pBI121/MEREB2棉花株系以及野生型棉花在普通生长条件(26℃、光照18h)培养14天，提取各棉花不同组织的总RNA，用组成型表达基因ubiquitin(UBQ7)作为内标，分别以下述陆地棉抗病相关基因的对应引物扩增转基因植株cDNA模板，通过RT-PCR分析MEREB2基因转入棉花超表达后对抗病相关基因表达的影响。其中，PR蛋白基因所用引物是5’-ATGGGTGTTGTCACTTATGACTATG-3’和5’-CTAGTTGCAGGCTTCGGGATTAG-3’；几丁质酶基因所用引物是5’-GGGGATACTGCTACAATAGGGAATTG-3’和5’-CTACATTGAGTCCACCGAGACT-3’；β-1，3-葡聚糖基因所用引物是5’-AGTGCAAACCTTGAATCCGTTGC-3’和5’-GAGAGCATAG TCAAGAGGAAC-3’。

检测结果表明：在普通生长状态下，转入MEREB2的陆地棉植株体内抗病相关基因(序列6所示的PR蛋白基因、序列7所示的几丁质酶基因、序列8所示的β-1，3-葡聚糖基因)与野生型对照相比，表达量明显得到了增强(图8)。

2、黄萎病菌孢子侵染实验

用黄萎病菌孢子(Verticillium wilt)浓度为1×10⁷个mL^-1(由中国农科院棉花研究所植保室提供)对转pBI121/MEREB2棉花株系以及野生型棉花的叶片进行了侵染，发病后观察植株叶片。结果如图9所示，转pBI121/MEREB2棉花(2株)的叶片已经表现出了较强的抗病性，与野生型对照相比，叶片病斑数量较少，且枯萎程度较低，这初步证明了转入MEREB2后提高了植株的抗病性。

三、机理分析

MEREB2与GCC-box元件结合能力的验证

ERF类转录因子可与GCC-box结合是ERF转录因子在逆境胁迫信号转导途径中对其下游基因表达进行调控的关键因素。对转录因子MEREB2的DNA结合域进行表达并通过体外凝胶阻滞(Electrophoreticmobility shift assay，EMSA)进行验证是非常必要的。利用含有GCC-box元件的探针，并设计突变体：

阳性GCC-box探针：

5’CATAAgAgCCgCCACTAAAATAAgACCgATCAAATAAgAgCCgCCAT-3’

突变体mGCC-box探针：

5’-CATAAgATCCTCCACTAAAATAAgACCgATCAAATAAgATCCTCCAT-3’

扩增MEREB2基因ERF保守域所用上、下游引物分别添加BamHI和XhoI酶切位点和保护碱基：

上、下游引物分别为：

ERD2F：5’-CGCGGATCCATGGCTCCCCAAGACAAAAATGCGA-3’；

ERD2R：5’-CCTCTCGAGTACTGCCCCG GACAAGGTGTTG-3’。

以棉花(新海20)的基因组为模板，以ERD2F和ERD2R为引物，进行PCR扩增，条件：94℃变性30秒，60℃退火40秒，72℃延伸1分钟，30个循环，产物经1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，得到MEREB2中含有ERF保守功能域的片段，如序列1中自5’端第1-375位，命名为EREB2，然后将EREB2插入到原核表达载体pGEX4T-1(Amersham)的BamHI和XhoI酶切位点之间(图3)，并转化到高效表达菌株BL21中，通过PCR、酶切筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行测序验证，检测确认片段的插入，最终得到了含有ERF保守域片段的pGEX4T-1原核表达载体阳性菌株。用0.5mMIPTG诱导GST蛋白和融合蛋白表达，用超声波法裂解诱导的细菌以及MicroSpincolumns(Amersham)回收纯化蛋白；最终得到了目的蛋白。进行凝胶阻滞实验，结果如图5(1：GST与正常GCC-box探针的混合物；2：融合蛋白GST/EREB2与正常GCC-box；3：融合蛋白GST/EREB2与突变GCC-box探针的混合物；箭头A所指为目的蛋白与探针混合物)所示，含有MEREB2中ERF保守域的融合蛋白与ERF顺式作用元件(GCC-box)混合后，在凝胶电泳中形成了清晰的滞后带而融合蛋白与突变体GCC-box(将G8G11G40G43分别突变为TTTT)的混合物却没有形成滞后带，同时可观察到GST蛋白与探针混合物没有出现滞后带，说明其无结合能力，排除了GST蛋白可能对融合蛋白的结合特性造成影响。这些结果说明：MEREB2蛋白在体外能够与ERF顺式元件特异性结合从而造成了电泳过程中的运行滞后。融合蛋白与突变体ERF顺式元件(mGCC)凝胶阻滞实验结果表明，MEREB2与mGCC(G突变成T)均不能形成明显的滞后带，验证了海岛棉EREBs蛋白与ERF顺式元件结合具有特异性。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所

<120>棉花抗病相关转录因子MEREB2及其编码基因与应用

<130>CGGNARL92661

<160>8

<210>1

<211>669

<212>DNA

<213>海岛棉(Gossypium barbadense L)

<400>1

atggctcccc aagacaaaaa tgcgagcaaa accttgaaga aagctaacgg tactggaagt  60

acgagcagcc aagaggtgca tttcagggga gtaaggaaga ggccatgggg taggtacgct  120

gccgaaatca gagatcccgg caagaaaagc cgtgtttggc ttggtacttt cgatacggct  180

gaggaagctg ccaaagccta cgacgcggcg gcgcgtgagt ttcgtggacc taaggctaag  240

accaacttcc ctttaccgga tgaaaccaac tgttacaagg gccagaacca gcagagccct  300

agccaaagca gcacggtgga ggaatctgga agcccaacgg tggagcgtgg agtcaacacc  360

ttgtccgggg cagtagggag attccctttc gcgtgccacc agcagctggc tctgggtggt  420

ggagtcgcta atggtgggat tagcggggtg acccggtcgc ggccggttct atttttcgaa  480

gcgttggggg gagctggcgt tgttggtcag gtttatccgg ttcggttcga tccggtggga  540

gtacagttgg gtatgggatt tgcaagtgta gtccgaagtg aaccggactc ttcatcggcc  600

attcattgca aggcaaggag acctggcctt gccctcgatc ttaaccttcc tcctccagtc  660

gatgcttga                                                          669

<210>2

<211>222

<212>PRT

<213>海岛棉(Gossypium barbadense L)

<400>2

Met Ala Pro Gln Asp Lys Asn Ala Ser Lys Thr Leu Lys Lys Ala Asn

1               5                   10                  15

Gly Thr Gly Ser Thr Ser Ser Gln Glu Val His Phe Arg Gly Val Arg

            20                  25                  30

Lys Arg Pro Trp Gly Arg Tyr Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Gly Lys

        35                  40                  45

Lys Ser Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Glu Ala Ala

    50                  55                  60

Lys Ala Tyr Asp Ala Ala Ala Arg Glu Phe Arg Gly Pro Lys Ala Lys

65                  70                  75                  80

Thr Asn Phe Pro Leu Pro Asp Glu Thr Asn Cys Tyr Lys Gly Gln Asn

                85                  90                  95

Gln Gln Ser Pro Ser Gln Ser Ser Thr Val Glu Glu Ser Gly Ser Pro

            100                 105                 110

Thr Val Glu Arg Gly Val Asn Thr Leu Ser Gly Ala Val Gly Arg Phe

        115                 120                 125

Pro Phe Ala Cys His Gln Gln Leu Ala Leu Gly Gly Gly Val Ala Asn

    130                 135                 140

Gly Gly Ile Ser Gly Val Thr Arg Ser Arg Pro Val Leu Phe Phe Glu

145                 150                 155                 160

Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Val Gly Gln Val Tyr Pro Val Arg Phe

                165                 170                 175

Asp Pro Val Gly Val Gln Leu Gly Met Gly Phe Ala Ser Val Val Arg

            180                 185                 190

Ser Glu Pro Asp Ser Ser Ser Ala Ile His Cys Lys Ala Arg Arg Pro

        195                 200                 205

Gly Leu Ala Leu Asp Leu Asn Leu Pro Pro Pro Val Asp Ala

    210                 215                 220

<210>3

<211>306

<212>DNA

<213>烟草(Nicotiana tabacum)

<400>3

ttatgtttct caattggctg cagactgcaa cctcgtacat tctcatggcc aatacggcga  60

aaacctagct cagggaagtg gcgatttcgt gatgaccgct aaggccgtcg agatgtgggt  120

caatgagaaa cagtactatg accatgactc aaatacttgt gcacaaggac aggagtgtgg  180

acactatact caggtggttt ggcataactc ggttcatgtt ggatgtgcta gggttcagtg  240

caacaatgga ggatatgttg tctcttgcaa ctatgatcct ccaggtaatg tcataggcca  300

aagtcc                                                             306

<210>4

<211>426

<212>DNA

<213>烟草(Nicotiana tabacum)

<400>4

caacatattc agggatctta gcgaatacca acccgcccaa agatagtatt tttcgaggag  60

aattcaatag tttcattaat cccataatcc aatttctagt acaacataac cttccactct  120

tagccaatgt ctatccttat tttggtcaca ttttcaacac tgctgatgtc ccactttctt  180

atgctttgtt cacacaacaa gaagcaaatc ctgcaggata tcaaaatctt tttgatgccc  240

ttttggattc tatgtatttt gctgtagaga aagctggagg acaaaatgtg gagattattg  300

tatctgaaag tggctggcct tctgaaggaa actctgcagc aactattgaa aatgctcaaa  360

cttactatga aaatttgatt aatcatgtga aaagcggggc aggaactcca aagaaacctg  420

gaaatg                                                             426

<210>5

<211>272

<212>DNA

<213>烟草(Nicotiana tabacum)

<400>5

attaggcaaa ggcatatcag agttggtagg caggtggtga atgttccttc ttttatggtg  60

agactggact cccagaagca cattgacttc tctctcatca gtccttttgg tggtgggcgc  120

cctggaagag tgaagagaaa gaaccaaaag gctgctgcaa agaaggcatc tggtggcgac  180

ggagacgagg aagatgaaga atgagctctt atgtttattt gcatttggat cttatacttc  240

gcctatttag tactttcttg ttttatgttt tg                                272

<210>6

<211>480

<212>DNA

<213>棉花(Gossypium hirsutum)

<400>6

atgggtgttg tcacttatga ctatgagaat acctccccag tcgcccctgc caggcttttc  60

aaggccttta ctgttgaagc tccgaaagtt tggcccacgg ctgcaccaaa tgcagtcaag  120

agcattgagg ttgaagctaa tcctagctct ggaagtatag taaaaatcaa ctttgttgaa  180

ggccttccat tccaatatat gaagcaccag atcggaggac atgatgaaag taatttttca  240

tacagttacg atttaatcga aggtgggcct ttgggggata agcttgaaaa aattagctat  300

gagaacaagt ttgaggcagc tgcaggtgga ggaagtattt gcaagagctc aatgaaattc  360

tacactgttg gcgataatgt tatcactgaa gacgaaatca aggctctcat taaagggagt  420

gaaggagttt acaagcctgt tgaagcttac ctcttggcta atcccgaagc ctgcaactag  480

<210>7

<211>399

<212>DNA

<213>棉花(Gossypium hirsutum)

<400>7

ggggatactg ctacaatagg gaattgaatc ccccttcatc ttattgcgct tcggatccaa  60

attacccttg tgctcctggt aaacaatatt ttggccgggg tcccatgcaa ctttcttggt  120

aatagcatga tctttcacca ttcgtttctt ctcttgaaat gacatattta tggtaagatg  180

ttgactttct aatataatta atccactttg gtgtttcagg aactacaact acgggcagtg  240

tggaagggcc ataggggtcg acttgttaaa caacccagac ctgctatcaa gtgatcccac  300

aatttccttc aagtctgcgt tttggttttg gatgactcca caatcaccga agccatcttg  360

ccacaatgtg atcatcggag catggtcacc ctccagtag                         399

<210>8

<211>411

<212>DNA

<213>棉花(Gossypium hirsutum)

<400>8

agtgcaaacc ttgaatccgt tgctgcgagt caagccaatg ctgatcaatg ggttgaagac  60

aacataaaga aatacaacac tgttaatttc cgatacatcg ctgtcgggaa tgaagtaaag  120

cctacagatt catttgctca atcccttttt ccggcaatgc agaacattcg taccgcaata  180

gttaatgcag gcctagggga tcagatcaaa gtttccaccg ctacgttttt cgctgctatt  240

gataaatcat ctttccctcc atcgaagggc agtttagatc ctgaatatca gaaacttctt  300

ggccaagtca taactttctt gagggacaat caagctccat tgcttgttaa cacgtatccc  360

tactttagcc acatcggaga ccccgaacat gttcctcttg actatgctct c           411

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下1)或2)的蛋白：

1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与植物抗病相关的有1)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)的基因：

1)编码序列是序列表中序列1；

2)在严格条件下与1)限定的基因杂交且编码与植物抗病相关蛋白的核苷酸序列；

3)与1)限定的基因具有90％以上的同源性，且编码与植物抗病相关的核苷酸分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体或重组菌或转基因细胞系。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将权利要求2或3所述的基因插入载体pBI121的多克隆位点，得到的重组载体。

6.一种培育抗病相关基因表达增强的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的基因导入目的植物中得到转基因植物，所述转基因植物中的抗病相关基因的表达量高于目的植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的基因是通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物中的；

所述目的植物是双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物是棉花、烟草、拟南芥、大豆或油菜；所述单子叶植物是水稻或小麦。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述抗病相关基因为烟草抗性相关基因或棉花抗性相关基因；所述烟草抗性相关基因是：序列3所示的PR1a基因、序列4所示的PR2基因或序列5所示的PR5基因；所述棉花抗性相关基因是：序列6所示的PR蛋白基因、序列7所示的几丁质酶基因或序列8所示的β-1，3-葡聚糖酶基因。

9.一种培育抗病转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的基因导入目的植物中，得到抗病的转基因植物；权利要求2或3所述的基因是通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物中的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述抗病的转基因植物是抗黄萎病的转基因植物；所述目的植物是双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物是棉花、烟草、拟南芥、大豆或油菜；所述单子叶植物是水稻或小麦。

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