CN102978221A - 一种水稻分蘖及株高相关蛋白htdf及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

一种水稻分蘖及株高相关蛋白HTDF及其编码基因与应用,属于水稻遗传育种技术领域。本发明所提供的水稻分蘖及株高相关蛋白HTDF及其编码基因在失去功能或表达量下降的条件下可引起水稻分蘖数增加及株高降低,因此,通过基因工程的方法能利用该基因有效地调节、控制和改良水稻的株型,对进一步提高水稻产量、培育植物新品种等具有重要的潜在作用。

Description

一种水稻分蘖及株高相关蛋白HTDF及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于水稻遗传育种技术领域,涉及一种水稻分蘖及株高相关蛋白HTDF及其编码基因与应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一,提高水稻产量一直是水稻育种的主要目的。株型是水稻高产的一个重要影响因素,分蘖数和株高是水稻株型构成的重要组成部分,水稻分蘖能力的强弱直接关系到有效穗数的数量和质量,合适的分蘖能力一直是水稻理想株形育种的一个主要指标;在水稻高产育种及株型改良过程中,分蘖数和株高一直是育种家们关注的重点。
通过对一些影响水稻分蘖的基因克隆及其功能研究,人们对于控制水稻分蘖发生的分子生物学机制已经有了一定的了解,在腋芽的形成和生长过程中,激素起着重要的调节作用。其中生长素(Auxin)和独脚金内酯(Strigolactones)起主要作用。水稻分蘖突变体主要分为两类,一类是少分蘖突变体,monoculm1是一个典型的少分蘖突变体,MOC1是第一个被克隆的控制水稻分蘖的基因,它是番茄和拟南芥中控制侧枝发生的Lateral suppressor基因的同源基因,表达的蛋白属于GRAS家族的转录因子;另一类是多分蘖突变体,表现为单株分蘖数目的增加,多分蘖突变体中分蘖的增多总是和植株的矮化协同出现。目前,已经鉴定了一系列矮杆多蘖突变体,其中一些基因已经克隆。D3,D10,D14/D88/HTD2,D17/HTD1和D27与独脚金内酯的作用相关,其中D10,D17/HTD1和D27参与独脚金内酯的合成,D3,D14/D88/HTD2参与独脚金内酯的信号识别或传递。OsPIN1基因与生长素的运输相关,敲除之后会导致水稻分蘖数目的增加。
随着DWARF1(D1)、D61、D2等株高相关基因的克隆和功能分析,关于控制水稻株高的分子机制已经逐渐为人们所认识,这些基因主要是通过影响赤霉素(GA)、油菜素内酯(BRs)等内源激素合成或信号传导来发挥作用的。D1编码一个异源三聚体G蛋白α亚基,通过参与赤霉素的信号传导控制水稻的株高;D2为编码BRs合成过程中的关键酶。
虽然关于控制水稻分蘖和株高等重要农艺性状的分子机制研究取得了一定的进展,但仍有大量控制分蘖和株高的基因有待于被发现和研究,水稻株型的遗传改良也迫切需要更多的基因资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻分蘖及株高相关蛋白HTDF及其编码基因与应用。
本发明提供的蛋白质(HTDF蛋白),来自粳稻品种台北309(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Taipei 309),编码所述蛋白的基因(HTDF基因)可以是分离的、合成的或重组的DNA分子,其包括:
a)SEQ ID NO:2或3所示的序列;b)DNA分子,其编码与SEQ ID NO:2或3所示序列所编码的多肽相比,具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽;c)与SEQ ID NO:2或3所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其酶活性片段的序列;d)与SEQ ID NO:2或3所示序列互补的序列;e)由于遗传密码的简并性而衍生自SEQ IDNO:2或3所示序列的序列之一。
本发明提供的蛋白质(HTDF蛋白)是可以分离的、合成的或重组的多肽,其包括:
a)SEQ ID NO:1所示的序列;b)上述分离的、合成的或重组的DNA分子编码的氨基酸序列;c)上述分离的、合成的或重组的DNA分子编码的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且与水稻分蘖及株高性状相关的由a)或b)衍生的多肽。
为了使上述蛋白质便于纯化,可在上述多肽的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的一个或几个标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述多肽可以是人工合成的,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。上述多肽也可通过将SEQ ID NO:2或3所示序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变,和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明还提供了含有上述DNA分子或上述多肽的表达载体,所述表达载体具体可为将所述基因插入载体pCAMBIA3300的多克隆位点而获得的。本发明还提供了扩增上述DNA分子的引物对;含有上述DNA分子或上述多肽的转基因细胞系或重组菌。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域,即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子,它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用;此外,使用本发明的基因构建植物表达载体时,还可使用增强子,包括翻译增强子或转录增强子,这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等,但必需与编码序列的阅读框相同,以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用植物表达载体进行加工,如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因,直接根据表型筛选目的植物。
本发明还将上述DNA分子或上述多肽在调控(如改变)水稻株高或分蘖中的应用。本发明还提供了一种调控(如改变)水稻株高和/或分蘖数的方法,该方法是将上述DNA分子或上述多肽导入目的水稻组织或细胞中,得到株高和/或分蘖数改变的转基因水稻;其中株高可以是提高或降低的,分蘖数可以是增加或减少的。本发明还提供了一种培育矮杆和/或分蘖数增加的水稻的方法,该方法是沉默目的水稻中所含有的上述DNA分子或上述多肽,得到株高降低和/或分蘖数增加的转基因水稻。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法,是将所述基因或所述多肽导入目的植物中,得到转基因植物;所述转基因植物与所述目的植物相比,分蘖增加、株高降低。所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物,优选单子叶植物,更优选水稻。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻,如籼稻品种Kasalath。
本发明的水稻分蘖及株高相关基因在失去功能或表达量下降的条件下可引起水稻分蘖数增加及株高降低,因此,通过基因工程的方法能利用该基因有效地调节、控制和改良水稻的株型,对进一步提高水稻产量具有重要的潜在作用。本发明公开的基因及其编码的多肽对培育植物新品种、改良株型具有重要意义。
附图说明
图1所示为突变体htdf与野生型(台北309)对照的整体表型比较。
图2所示为突变体htdf与野生型对照株高的比较分析,其中A图为直观表型对比图,B图为对株高进行分区后的分区对比图。
图3所示为HTDF基因的图位克隆过程示意图。
图4所示为互补实验转基因植株的表型的恢复。
图5所示为HTDF基因编码一个可能的脂酶。
图6所示为水稻HTDF基因的组织表达分析(水稻的Actinl基因作为内参)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次或以上重复实验,结果取平均值。
实施例1、水稻分蘖及矮秆相关蛋白及其编码基因的获得
1、水稻分蘖及矮秆相关基因HTDF的遗传分析
我们在田间发现一个新的水稻矮杆多分蘖突变体,与野生型品种台北309(TP309)相比,该突变体主要呈现分蘖多、植株矮化等性状,故将其命名为htdf(high tillering and dwarf)(图1)。在水稻成熟期,突变体htdf的平均分蘖数(35.43±5.39个)较野生型品种台北309(19.3±1.21个)显著增多(图1);突变体的植株高度也明显降低,约为野生型品种的73.8%(图2)。
突变体htdf与台北309的正交和反交的F1代植株的株高和分蘖性状与台北309表现相似,说明F1代植株的株高和分蘖性状均表现正常。突变体htdf与明恢63杂交,F1所有单株表型与野生型一致,自交的F2群体中出现正常表型(358株)和矮杆多分蘖(97株)两种表型单株,分离比例接近3∶1(X2=3.29<X2 0.05(1)=3.84),分离比符合孟德尔单基因分离定律,表明该矮杆多分蘖突变体表型是由单一隐性核基因控制。
2、水稻分蘖相关基因HTDF的精细定位
利用htdf/明恢63组合F2群体中的525株具有多分蘖矮秆表型的植株作为定位群体,将该基因初步定位于水稻第1号染色体的2个SSR标记R1M37和R1M47之间,具体方法为找出一系列和目的性状连锁的分子标记,应用Mapmaker分析软件对这些分子标记构建分子遗传图谱,将目的基因限定在一定的区间。为了进一步缩小目的基因的界定区间,在R1M37和R1M47之间继续设计特异性引物,发展新的分子标记(表2)。htdf被一步定位在2个CAPS标记C1和C7之间,C1和C7都为1株交换株。通过CAPS标记的逼近,我们最终将htdf定位于C1和C7之间的90kb区间内(图3)。
在HTDF精细定位中,根据日本晴和9311的基因组DNA的籼粳差异设计的CAPS引物及特定的限制内切酶如表2。
表2.本发明过程中所创制的CAPS标记和引物
Figure BDA00002507854900051
3、HTDF候选基因的鉴定
通过图位克隆,HTDF基因被定位在90Kb的DNA区间内。根据相关水稻基因组注释计划网站上的基因注释信息,发现在这90kb区间内存在10个候选基因。通过对突变体htdf和野生型台北309的相应基因组DNA序列进行测序比较分析,发现突变体htdf在SEQ ID NO:3所示的序列中存在375bp的缺失,这块片段缺失导致该基因的转录发生剪接错误,从而确定为本发明的HTDF的候选基因。
4、功能互补实验
为了鉴定上述基因的功能,即控制分蘖和/或株高的功能,我们以水稻粳稻品种日本晴(Oryzasativa L.subsp.japonica cv.Nipponbare)的基因组DNA为模板,扩增了一段大小为5.7kb的基因序列,这段序列包括HTDF上游大约2kb的启动子区域以及下游1kb的基因序列。将这段序列转入pCAMBIA3300(购自Cambia公司)表达载体,从而构建遗传互补载体pCAMBIA3300-HDTF。
通过电击的方法将pCAMBIA3300-HDTF转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404(Cat.No.18313-015,Invitrogen公司)中。利用多蘖矮杆突变体htdf的成熟胚诱导愈伤组织进行农杆菌转化,共获得18个独立的T0株系。农杆菌介导的水稻转化方法参见文献:Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal 6:271-282.。
对T0转基因植株进行形态观察,结果表明这18个株系T0转基因植株的分蘖数恢复正常,株高也恢复正常(图4)。对其中在3个T0株系的各自T1代进行观察,发现它们T1代中都分别有突变体和野生型植株的分离,且分离与转基因连锁。这些结果证实了上述基因具有增加水稻分蘖和/或降低株高的功能。
5、HTDF基因的分子特征
通过比较日本晴的HTDF的cDNA及基因组DNA序列,发现该基因的起始密码子至终止密码子的基因组全长为2634bp(序列3的5’端第211位到第2844位碱基),共有2个外显子(序列3的5′端起:211-438,1837-2844),1个内含子(序列3的5′端起:439-1836);其cDNA全长为1553bp(序列2),其开放阅读框架(ORF)为序列2自5′端第148至1383位共有1236碱基;该基因编码多肽长度为411个氨基酸。(图3,阴影框代表基因的外显子,黑线代表基因内的内含子。)该基因编码一个可能的脂酶。突变体在第二个外显子与内含子区域有375bp的缺失。
实施例2、HTDF的表达分析
为了研究HTDF基因的表达模式,通过定量RT-PCR分析它在粳稻品种台北309(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Taipei309)的根、幼苗、节、节间、叶片、穗、愈伤组织等组织中的表达。将HTDF基因的荧光信号(以Ct值表示)与Actin1基因(内参基因)的荧光信号(以Ct值表示)根据公式(相对表达量=2-ΔCt,其中ACt=Ct目的基因-Ct内参基因)计算出的值作为HTDF基因的相对表达量,结果见图6。结果表明,HTDF基因在检测的组织中都有表达,在穗和愈伤组织中的表达量相对较高。
实施例3、培育矮杆和/或分蘖数增加的水稻
利用KOME全长cDNA克隆(编号:AK108569)为模板,通过PCR扩增、酶切,连接到带有Ubiquitin启动子的表达载体pTCK303上,构建干扰载体RNAi-HDTF,通过电击的方法将RNAi-HDTF转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404(Cat.No.18313015,Invitrogen公司)中,筛选得到含有干扰载体RNAi-HDTF的重组农杆菌菌株,利用野生型水稻品种TP309成熟胚诱导愈伤组织进行农杆菌转化,共获得8个独立的T0株系。
对转RNAi-HDTF基因的T1代转基因植株与对照TP309植株进行株型统计分析,发现转RNAi-HDTF基因的T1代转基因植株的分蘖数明显增加,株高明显降低。说明利用本实施例的方法,能够改变水稻的株高和分蘖数,培育矮杆和/或分蘖数增加的水稻品种。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>三峡大学
<120>一种水稻分蘖及株高相关蛋白及其编码基因与应用
<130>2012
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>411
<212>PRT
<213>水稻属水稻(Oryza sativa var.Nipponbare)
<400>1
Met Ala Ile Asp Leu Ala Pro Leu Ala Gly Glu Leu Glu Val Ala Gly
1                  5                       10                   15
Ala Ala Val Gly Gly Lys Lys Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Gly Gly
               20                    25                    30
Val Cys Gly Gly Glu Ala Val Val Val Ala Ala Ala Asp Ala Glu Val
         35                    40                     45
Glu Gly His Pro Tyr Asp Phe His Val Ser Gly Pro Arg Asn Leu Pro
    50                      55                     60
Pro Pro Asn Trp Arg Glu Ile Ile Arg Ser Ser Trp Lys Asp Pro Asn
65                     70                       75                80
Tyr Lys Arg Met Val Met Ala Cys Phe Ile Gln Ala Val Tyr Leu Leu
                  85                     90                    95
Glu Leu Asp Arg Gln Asp Glu Lys Gly Glu Glu Asp Gly Leu Ala Pro
             100                    105                   110
Lys Trp Trp Lys Pro Phe Lys Tyr Lys Val Thr Gln Thr Leu Val Asp
          115                   120                    125
Glu Arg Asp Gly Ser Ile Tyr Gly Ala Val Leu Glu Trp Asp Arg Ser
    130                    135                     140
Ser Ala Leu SerAsp Leu Ile Leu Ile Arg Pro Ser Gly Ala Pro Arg
145                    150                     155               160
Ala Val Leu Ala Leu Arg Gly Thr Leu Leu Gln Lys Pro Thr Ile Lys
                  165                     170                  175
Arg Asp Leu Gln Asp Asp Leu Arg Phe Leu Val Trp Glu Ser Leu Lys
             180                    185                   190
Gly Ser Val Arg Tyr Ile Gly Ala Leu Glu Ala Leu Lys Thr Ala Val
         195                      200                  205
Glu Arg Phe Gly Ser Ala Asn Val Ser Val Ala Gly His Ser Leu Gly
    210                    215                    220
Ala Gly Phe Ala Leu Gln Val Cys Lys Glu Leu Ala Lys Gln Gly Val
225                   230                    235                   240
Phe Val Glu Cys His Leu Phe Asn Pro Pro Ser Val Ser Leu Ala Met
                  245                     250                   255
Gly Val Arg Ser Met Ser Glu Lys Ala Ser Tyr Leu Trp Lys Lys Val
              260                     265                   270
Lys Ala Ser Leu Pro Leu Thr Glu Glu Ala Leu Pro Asp Ser Thr Lys
         275                     280                    285
Glu Glu Gly Ser Ala Lys Lys Lys Leu Arg Ala Asp Lys Lys Trp Val
     290                     295                   300
Pro His Leu Tyr Val Asn Asn Ser Asp Tyr Ile Cys Cys His Tyr Asn
305                    310                    315                 320
Ala Pro Asn Cys Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Asp Gly Ala
                  325                  330                    335
Ser Asp Glu Gln Gln Gln Gln Arg Lys Ala Ser Glu Ile Ala Gly Asp
              340                   345                     350
Val Val Ala Lys Leu Phe Val Thr Ser Lys Gly Pro Gln Lys Phe Leu
          355                   360                     365
Glu Ala His Gly Leu Glu Gln Trp Trp Ser Asp Gly Met Glu Leu Gln
    370                     375                    380
Leu Ala Val Tyr Asp Ser Lys Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Lys Ser Leu
385                     390                  395                   400
Tyr Thr Ala Thr Ala Pro Ser Pro Pro Ala Lys
              405                          410
<210>2
<211>1236
<212>DNA
<213>水稻属水稻(Oryza sativa var.Nipponbare)
<400>2
atggcgatcg acctggcgcc gctggctggg gagttggagg tcgcgggggc ggcggttgga  60
gggaagaaag aggaggggga gggggaggag ggcggggtgt gcggcgggga ggccgtggtg  120
gtggccgcgg cggacgcgga ggtggagggc cacccctacg acttccacgt gtccgggccg  180
cggaacctgc cgccgcccaa ctggagggag atcatccgtt cgagctggaa ggatcccaat  240
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caagatgaga aaggagaaga ggatggcctt gctccaaaat ggtggaagcc cttcaaatac  360
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<210>3
<211>3130
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Figure IDA00002507855800041
Figure IDA00002507855800051

Claims (10)

1.分离的、合成的或重组的DNA分子,其包括:
a)SEQ ID NO:2或3所示的序列;
b)DNA分子,其编码与SEQ ID NO:2或3所示序列所编码的多肽相比,具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽;
c)与SEQ ID NO:2或3所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其酶活性片段的序列;
d)与SEQ ID NO:2或3所示序列互补的序列;
e)由于遗传密码的简并性而衍生自SEQ ID NO:2或3所示序列的序列之一。
2.分离的、合成的或重组的多肽,其包括:
a)SEQ ID NO:1所示的序列;
b)权利要求1所述DNA分子编码的氨基酸序列;
c)权利要求1所述DNA分子编码的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且与水稻分蘖及株高性状相关的由a)或b)衍生的多肽。
3.含有权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述多肽的表达载体或表达盒。
4.根据权利要求3所述的表达载体,其特征在于:所述表达载体为权利要求1所述DNA分子插入载体pCAMBIA3300的多克隆位点而获得的。
5.扩增权利要求1所述DNA分子的引物对。
6.含有权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述多肽的转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
7.权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述多肽在调控水稻株高或分蘖中的应用。
8.一种调控水稻株高和/或分蘖数的方法,是将权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述多肽导入目的水稻组织或细胞中,得到株高和/或分蘖数改变的转基因水稻。
9.一种培育矮杆和/或分蘖数增加的水稻的方法,是沉默目的水稻中所含有的权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述多肽,得到株高降低和/或分蘖数增加的转基因水稻。
10.一种培育转基因植物的方法,是将权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述多肽导入目的植物中,得到转基因植物;所述转基因植物与所述目的植物相比,分蘖增加、株高降低。
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