CN111378672A - 一种水稻矮化、多分蘖基因Os11g0587000突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水稻矮化、多分蘖基因Os11g0587000突变体及其应用。所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，基因具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，该蛋白质源于水稻基因组中一段基因序列，通过破坏其编码蛋白的生物学功能降低其株高、分蘖表型。本发明通过CRISPR/Cas9技术定点敲除了水稻矮化、多分蘖基因Os11g0587000，获得了该基因功能缺失突变体种质，该突变体不仅分蘖数多，而且单蘖分生能力强，可以用于解决水稻基础研究受自然环境制约，建立室内大规模种植的研究体系，同时水稻矮化育种，能够解决抗倒性、耐密性。

Description

一种水稻矮化、多分蘖基因Os11g0587000突变体及其应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种水稻Os11g0587000基因突变体，、其编码的氨基酸序列、植株及该突变体的创制方法。

背景技术

随着基因组学和功能基因组学研究的深入进展，与双子叶模式植物拟南芥相比，水稻作为单子叶模式植物，它的研究一直需要依赖于大空间的田间大田或温度，同时还受自身较长的生长周期和自然环境的影响，大大制约了水稻分子生物学基础研究的快速发展。因此开展矮化、多分蘖基因资源的挖掘及其分子遗传机制的研究，对打破自然环境对水稻基础研究的束缚将起着至关重要的作用。

水稻株高和分蘖是水稻株型的两个重要组成部分，也是决定杂种产量优势形成的主要因素。当前研究主要基于突变体的图位克隆、QTL定位或BSA性状分析克隆获得重要基因，但是通常由于多个遗传通路参与水稻分蘖生长发育的调控，其遗传机制还不明晰。因此，对于开展水稻矮化、分蘖基因的克隆和功能研究，将对创制新的种质资源和研究“理想株型”具有重要的意义。

随着分子生物学、系统生物学等学科的迅速发展，大规模基因资源挖掘和利用得以开展，分子设计育种催生大量新品种的产生，尤其是利用CRISPR/Cas9技术突破了原有的技术瓶颈，改变作物产量、抗性等农艺性状。基因组编辑技术就是利用位点特异性核酸酶在特异性靶位点处打断染色体DNA序列，当DNA双链断裂发生后，植物细胞会采用DNA修复机制对断裂点进行修复，随机对目的基因发生特定类型的突变或插入，从而实现基因定点编辑。基因组定点编辑技术作为分子育种的重要手段，已经可以实现快速改良品种的目标性状，对水稻品种的定向改良方面具有非常巨大的潜力。

发明内容

本发明的目的是一种水稻Os11g0587000基因突变体，、其编码的氨基酸序列、植株及该突变体的创制方法。

为实现上述目的采用以下技术方案：

一种水稻矮化、多分蘖基因Os11g0587000突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的水稻矮化、多分蘖基因Os11g0587000突变体编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或该序列经替换、缺失或添加个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

上述水稻粒型相关蛋白或编码基因在控制水稻株高矮化、增加水稻分蘖方面的应用。

所述水稻矮化、多蘖基因Os11g0587000突变体的创制方法，包括以下步骤：

（1） RNA靶点序列设计：根据水稻水稻矮化、多分蘖基因Os11g0587000的基因组序列和CRISP/Cas9技术的设计靶位点的原则，设计1个引导RNA靶点序列，其序列为5’-CATCTCAAGAATCTTCAGTC -3’；

（2）CRISPR/Cas9-gRNA载体的构建：

（3）农杆菌介导水稻愈伤组织遗传转化：把步骤（2）构建好的CRISPR/Cas9-gRNA载体转化到水稻品种明恢86中，获得了不含有CRISPR元件T-DNA成分的纯合Os11g0587000基因突变体。

所述步骤（1）中，靶位点设计在基因的第一个外显子上；所述的引导RNA靶点序列的寡核苷酸序列为：

D86F:5'-cag ：CATCTCAAGAATCTTCAGTC-3'；

D86R:5'-aac ：GACTGAAGATTCTTGAGATG -3'。

一种水稻矮化、多分蘖基因Os11g0587000突变体植株，是通过将所述的靶点CRISPR/Cas9-sgRNA载体转化入水稻成熟胚愈伤组织，获得转基因阳性植株。

用于检测敲除基因Os11g0587000的转基因植物的引物对，所述的引物对由RTSF和RTSR组成；即：

RTSF: 5’- GGACTTCATTAACACTGTAGCATC -3‘；

RTSR:5’- GTACTTACCATTGTGAGGATGTAG -3‘。

与现在技术相比，本发明的有益成果在于：

(1)本发明为创制矮化、多分蘖水稻品种的培育提供了一种通过基因编辑方法打靶水稻基因Os11g0587000来获得新的水稻品种；(2)本发明水稻株型调控基因调控效果好，缩小水稻的种植空间，有助于实现在室内建立大规模研究体系。

附图说明

图1.水稻Os11g0587000基因的序列分析及基因编辑靶点设计。黑色方框表示外显子，黑色线条表示内含子,白色方框表示非翻译区。Cas9识别序列位于第2外显子2133-2153处。

图2. Cas9介导的Os11g0587000不同基因型的检测分析结果。WT为野生型序列，阿拉伯数字表示发生缺失或增加的碱基数（数字前面加“-”表示碱基缺失，数字前面加“+”表示碱基增加），加黑碱基为替换碱基，加黑序列TGG为靶位点的PAM。

图3. Os11g0587000基因不同基因型的表型考察。WT为明恢86野生型对照植株，D86-1和D86-2为不同基因型突变植株。

图4. Os11g0587000基因突变株与野生型种子表型分析。WT为明恢86野生型对照植株，D86-1和D86-2为不同基因型突变植株。

图5. Os11g0587000基因突变株与野生型分蘖数分析。WT为明恢86野生型对照植株，D86-1和D86-2为不同基因型突变植株。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中所使用的实验验方法如没有特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的的实验材料如无特别说明均为市面购买产品。

实施例1：水稻Os11g0587000基因的序列分析及基因编辑靶点设计

水稻Os11g0587000基因(来源于国家水稻数据中心数据库（http://www.ricedata.cn/gene/）)的序列如SEQ ID NO .1所示。序列分析显示，该基因含有7个外显子，分别为序列表中第222-525（第1外显子）、第2082-2221（第2外显子）、第2438-2530（第3外显子）、第2891-2952（第4外显子）、第3514-3620（第5外显子）、第4977-5066（第6外显子）、第5150-5190（第7外显子）。

本发明所实验品种为明恢86，Cas9识别位点在该品种Os11g0587000基因的第2外显子2133-2153处，如图1。设计获得识别靶序列gRNA为： CATCTCAAGAATCTTCAGTC。

实施例2：打靶载体构建及水稻遗传转化

采用基因编辑技术，人工合成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA线性载体（本实验购于北京唯尚立德生物科技有限公司：单子叶植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒，No.VK005-01），构建方法按试剂盒手册操作。其中玉米Ubi启动子表达Cas9蛋白，水稻U6启动子表达gRNA，35S启动子表达潮霉素抗性。gRNA片段通过引物PCR形成二聚体后，DNA连接酶连接到重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA（环形载体）。

具体构建方法：

1） Oligo二聚体的合成：(20μl体系）

上游引物 D86F 5μl

下游引物 D86R 5μl

H₂O 15μl

混匀后，按照如下程序处理：

95 ℃ 3min, 95 ℃到25 ℃缓慢冷却（按-1/20s）,16 ℃ 5min。

2）载体构建：(10μl体系）

Cas9/gRNA Vector 0.5μl

oligo二聚体 2μl

Solution I 1μl

Solution II 1μl

H₂O 5.5μl

16 ℃水浴反应2 h。

3）大肠杆菌转化：

将连接产物加入到100μl DH5a感受态细胞中，冰浴30 min后，在42 ℃热激90 s，冰上静置2 min，加入无抗LB₀培养基500μl，置于37℃恒温摇床上，200rpm复苏1h后涂在Kan⁺平板。次日，挑选单克隆测序。测序引物为：Cp: 5'-GATGAAGTGGACGGAAGGAAGGAG-3'。

将上述构建载体pCXUN-Cas9-gRNA转化籼稻愈伤组织作为遗传转化的受体材料，农杆菌介导水稻成熟胚种子愈伤组织实现遗传转化，通过抗性愈伤的筛选、分化和生根等步骤生长阳性植株，以下明恢86为例进行介绍，具体步骤如下：

种子消毒：成熟种子做剥壳处理后，转移到50 mL三角瓶中，先用75%酒精漂洗2 min，再后3%次氯酸钠摇床100 rpm处理30 min，无菌水清洗3～5次，移到高压滤纸的培养皿中吹干。

愈伤诱导：转移种子到N6-C（N6+2,4-D 4mg/L)愈伤诱导培养基上，每个培养皿放置15～20粒种子，28 ℃度暗条件下放置3～4周生长胚性愈伤。

农杆菌侵染：从甘油保存的菌株中挑取农杆菌划板，2天后挑取单菌落在含50mg/ml利福平和50mg/ml卡那霉素的液体培养基中，摇床上230 rpm培养24～36 h后，调整OD600读数在0.6～1.0之间；4000×g离心力离心5 min收集菌，并重悬于N6-AS液体培养基中（N6培养基+乙酰丁香酮终浓度为200uM），获得农杆菌侵染液，OD600读数在0.6～1.0之间。转移18 g胚性愈伤组织到50 mL离心管中，加30 mL农杆菌侵染液，28 ℃培养箱中静置30 min充分感染，倒出液体培养物，将胚性愈伤在滤纸上吹干，转至N6-AS固体培养基上，26 ℃暗培养3～4天。

抗性愈伤筛选：将侵染的愈伤组织从共培养转移到250 mL三角瓶中，加入终浓度250 mg/L羧苄青霉素，28 ℃暗培养静置30 min，用无菌水清洗3～5次，转移到筛选培养基N6-S（N6培养基+50mg/ml 1 mL潮霉素）上，28 ℃暗培养生长抗性愈伤。

再生植株生长：将抗性愈伤转移到N6-R（MS基础培养基+0.5mg/L 6-BAP+0.2mg/LNAA）植物再生培养基中，28 ℃光培养15～25天，后转移到生根培养基MS-RG（MS培养基）中，28 ℃光培养生长植株，最终获得两种突变体植株，命名为D86-1、D86-2。

实施例3：Os11g0587000基因编辑体的基因型检测及表型考察

提取前述步骤中获得转基因水稻阳性植株D86-1、D86-2，以及野生型植株WT水稻叶片基因组DNA，利用引物HptF（5'-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3'）和HptR（5'-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'）进行PCR扩增，检测获得转基因阳性植株，同时目的基因的引物RTSF1(5'-GGACTTCATTAACACTGTAGCATC-3')和RTSR1(5'-GTACTTACCATTGTGAGGATGTAG -3')PCR扩增阳性植株DNA，回收PCR产物，送公司进行测序分析。突变体D86-1、D86-2序列与野生型比对分析结果表明Os11g0587000基因产生6种不同类型的基因型，其中包含了插入、突变和缺失三种类型的编辑方式。表型观察表明，植株矮化，分蘖数增多，粒型变小，叶片变细（见图3-5）。

本发明中利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得Os11g0587000基因突变体，整个实验过程操作简便，大多数普通分子生物实验室均可操作。本发明获得的矮化、多分蘖水稻品种经过T₁和T₂代自交分离，可筛选获得无外源基因的重组纯合体，与转统育种相比，缩短了育种时间，是一种材料创制新的分子育种方法。

以上所述，仅为本发明优化的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院生物技术研究所

<120> 一种水稻矮化、多分蘖基因Os11g0587000突变体及其应用

<130> 10

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5390

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attcccacca caaccaagat gccctctcca tgccatttgg tctcttctct ctccctcctt 60

gcaaattgca tgaccctctc tctctctctc cacttctctc tataaacctt cctctctccc 120

ataacttctt tccattttca acctacaaat atactaatct ctctctagct agtcttcacc 180

tacaaatctc tctctctctc tctctctctc tctctctctt catggagacc accacgcttg 240

tgctgcttct tcctcatggc ggcgccggcg gcgtacggcc ggcggcagcg gcaacggcga 300

agcgaagcta cgtgatgagg aggtgttgct cgacggtgag ggcggtcatg gcgaggccgc 360

aagaggcgcc ggcgtcggcg ccggccaaga agacggagac ggcggcgatg atgtcgacgg 420

tgcagacgga gacggcggcg gcgccgccgg cgacggtgta ccgggacagc tggttcgaca 480

agctcgccat tggttacctg tccaggaacc ttcaagaagc ttctggttcg tgcctataat 540

ctactgaata tatctgatgt attgtgtgca tgtacatgca atctttcgga tgaattaatg 600

aatgatcaaa tcaaccatgc atgcatatat gtgtgtattt atgatgtttt tgccatggct 660

gatttgattt tttgagtgga agaaataaca tatatatggt gaataaacca atgttcttca 720

gttatttttg tgacaattaa attatatgtg tattctacga tcatcctttt cttcttatcg 780

tttggttatt aatacccttc tcgtccatgt ggaacataaa ttctttgatt ttttttatta 840

catgttgctt tggccagcgt gggtgtactt gcaattgcat gctttctgtc atattataat 900

tgaattagct cttgattttt acatgcaaaa gaataattta tttattgagt tgctgatgat 960

cacgtaagcc tatgcatgtg agatgtgatg tgttctccgg cctaattaag tatcgacgta 1020

ctatatatat gcacgtacat caagtacggc cgtatttcat aatttgatta ttgttactgt 1080

accagacaaa cctagtgctt aattattgac atatacccaa catcgattaa agtcagtgtg 1140

acacaattgg cagaagaaga taacaaaaat catagaagac atatatacca caacagtaaa 1200

aattacagtg caaaaaggga taccagaagc ttcttaatta ggtgaatggt cacatttagt 1260

agtagtaata cacagtaata acacattatt tgacgaataa attaagcgga agtgcatgat 1320

cagcagcata taagcaagca actacgagag gtcaaccgtt gatccgtgaa aatgtgaggt 1380

tcacattcta ggaatctttt agtgcttgaa tctaatcctt tcgtttgttt tcccgtggac 1440

tttttacttt gatcgaataa acttatctga ataatgcgaa ggtcaaacat cacatgtacg 1500

tgcccggttc ttcttctaga aattcagccg cttactataa tcgatgctgg tttttgaatt 1560

tttttaaaga catttatttt ggaacaactt aaaaaaagtg cacaaaccag ggtttaccaa 1620

accgtttgaa gtgaggttac tgccactcca tggtttggca attatcacga ggtgcgtcgt 1680

ggttccaaaa actaataagg ttatcgtatg tgataaccgc gataactgac ggttttgtaa 1740

accctgcaca gacaacataa ttatatttac aggactgttt ggacttcatt aacactgtag 1800

catccactac atccgtcacc tccttggctc tcttacatgt ttagcaaagt caatcataca 1860

gacaaaccag aaaagttccc aacagacaca gaatgctact tttctagtat gggtaattaa 1920

gcatataaga gaaacttgaa agcatacagg aaaccgatgt tcactagtcc tgagtttttt 1980

tttggtgttg ttcaggtgca aattaactgc aaaggttgat tccctgaaag gaacttgtag 2040

cacttgctga ctgacacgaa catgcatgca atgtaatgca gggctaaaga atgaaaagga 2100

tggctacgag agcctgatag atgccgccct agccatctca agaatcttca gtctggataa 2160

acaaagcgag attgtgaccc aagctcttga aagagcactt ccaagctaca tcctcacaat 2220

ggtaagtacc ataatccatg acaattggca atcatgtatg aattattgaa atttaaaaaa 2280

cctaaaactt ttttttattt gaacaggaag taaaattcag catttattct ctcttttttt 2340

tttgaggaaa atacagaact tctgtaaagg gaggaaactt taaaagttct cttcttttat 2400

ttcttacctc aactttgatt gagaattctg tcggcagatc aaggtgatga tgccaccttc 2460

aagattttcc agggagtact ttgctgcatt caccacgata ttttttcctt ggttggttgg 2520

gccgtgtgag gtatatatta catacacagt tcctcctttt gttacttcag ttcagaaagg 2580

aatagctgcc tgatacctga ttagtgcgtc ttcacaagaa tgaattcatg attgtgcctc 2640

tgctgaaggt agccctgcag aatgaattga tacgaagcca cacgttaatt tgagaaatat 2700

tgctacagaa gatcttaaaa tgctgttgaa tgtaggttgc gacatataat atctctttgt 2760

tttcaggaca ttacattgtt taaagtagtt gtacgaagca tttgtggtgc aaatatcata 2820

taaagtatgg aataaatgcc cttgtatgga taacttgtct tctgagtgat cattctgtca 2880

ttgaacaaag gttatggaat ctgaagttga aggaaggaaa gagaaaaacg tggtatatat 2940

ccccaaatgc aggtaattca atcatcatca agaaattgtt tcacaagttt gactaggagg 3000

aacatttgta aagaaaattt cttcaactgc tgggtatcac gtaacatatc ggtcaaacgg 3060

tttcctactc ccagctcttc ataggcagac tacaaaaatt ttcaggtcta taagtagtaa 3120

cctgatgatt tgcaattaac atatgactct gcagccatca attagttctg aatgaattgt 3180

tgcagtatgt caactcttac tcaagttaat ccactcatga aaaacaaatt gaagaactat 3240

ggctgggaca caagttgtat tgtcaacgtc gtaattgtgg caactgacaa tcctactcac 3300

actccacaag ctgcttatta tcaattctac ccacgttaga caaactacca tgattaacac 3360

tgggttaaga aaaaaataga attttaagtg cagatatatc aataaatact gaagaaccac 3420

cttaaaaata cataaatact gaagaacagg atttctactg gtgttgctgt ttttcttttc 3480

ttttttttta atctccaatc ctatttgtgg cagatttctg gaaagtacaa attgtgttgg 3540

tatgtgcaca aacctttgca agattccatg ccagaagttc atccaagatt cacttggcat 3600

gaaggtctac atgtctccca gtaagcttcc tctgctctga ttcatcagga aagcctgaat 3660

atcagtgggt aaacacaaca acttaaatat aatttggtag aataaggtaa aaataatcaa 3720

actccattcc tttgcataaa gttggcaaga aactaataat ggattgtcat atcaacatca 3780

tctcaaagtt gaaaatttgg gttgaaacct ggtgtgcctc taacttctca ggacattgac 3840

ctaattttac tatagcggat cattatacgg actgccgcta aaacataagt gaactcaaaa 3900

tatcaacttt cgactttaag cagaattagt gaagtaaagt tgaatcaatg taataggtcc 3960

atagaccacc aacggtttag agctatgaga aatacagaac ttaatttgac atattaattt 4020

catgccacct ctacctaccg acaatctgag gactgtgccc tttttgggta tgggaaccac 4080

tggccaccat tcaggaaaca gaaagggctg aagtggggcc aacatgtttg caggttacta 4140

cctccgtttt ttaatttata acgtcgatga ctttttagat atatatgatc attcgtctta 4200

ttcaaaaaaa aatgcaatta tcatttattt tattgtgact taatttatca tcaaatgttc 4260

tttaagcatg acttaaattt tttttatatt tgcacaataa ttttgaataa gatgaatggt 4320

caaatgtttg tcaaaaagtc aacaacgtca tacattaaaa aacggaggga gtacaaagca 4380

atcacaagca agttgtacag aagaagaaag tgctagcccc tacttgtcat tcttagtggg 4440

aaacggcaaa ttgcatggac aagttgtgga acagtagtgt gaaatccaga aatccacaat 4500

gtagtgctgt gaaaatacag tacaagcacc ttcacatggc agtgacgagc cagcatgtct 4560

cgataatcag agcaatatgg ttcaatttca cttatgagaa gcactagttt tgaatgttag 4620

tcttctatgg tgatacactg aatatttcaa catcaatcat tttttctagg tcaaaagata 4680

ctgatatttt atgacatcac cccacagaat cagatatcaa cctctgttgg aatttgcaag 4740

gctctctttc ctttttatcc tgtcgagtgg ttagatctag gagtaagcaa tgaatgttat 4800

ttactgccag tgctactaaa tagtcctata cagcttattt ccaattaagc aagaaggttt 4860

tttccaatac taggtcaata aaaacgagaa taaagcagag tccctaaaga taatagtgaa 4920

tgtatcaaga gaaatgtaac ataattactt acatcaacta tatatttatt cttcagattt 4980

tgaagacatg agctgtgaga tgatatttgg acagcaacct cctgaagatg accctgcatt 5040

gaagcagcca tgcttccgga caaaatgtaa ggaattccgc actgaggcac cttcatggat 5100

tcaatcaaca ctcctctata ttcatacttt ttacttcgtg tatatgcagg cgtcgcaaag 5160

cagaatcatg gtgtgaattg ctccatctga tctgaaagaa attatcaata gatagatttc 5220

aaatcagtaa aatgccttaa gctccatttc ctttattcct ttggaaaaaa aattagcacc 5280

atcattgttt ttgcccacaa caccagcatg tttggaacat acactcttca ttgtaatcca 5340

aaagtaatct aagaggaaat gaaaggccca acagtaacca ttttaaggta 5390

<210> 2

<211> 837

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggagacca ccacgcttgt gctgcttctt cctcatggcg gcgccggcgg cgtacggccg 60

gcggcagcgg caacggcgaa gcgaagctac gtgatgagga ggtgttgctc gacggtgagg 120

gcggtcatgg cgaggccgca agaggcgccg gcgtcggcgc cggccaagaa gacggagacg 180

gcggcgatga tgtcgacggt gcagacggag acggcggcgg cgccgccggc gacggtgtac 240

cgggacagct ggttcgacaa gctcgccatt ggttacctgt ccaggaacct tcaagaagct 300

tctgggctaa agaatgaaaa ggatggctac gagagcctga tagatgccgc cctagccatc 360

tcaagaatct tcagtctgga taaacaaagc gagattgtga cccaagctct tgaaagagca 420

cttccaagct acatcctcac aatgatcaag gtgatgatgc caccttcaag attttccagg 480

gagtactttg ctgcattcac cacgatattt tttccttggt tggttgggcc gtgtgaggtt 540

atggaatctg aagttgaagg aaggaaagag aaaaacgtgg tatatatccc caaatgcaga 600

tttctggaaa gtacaaattg tgttggtatg tgcacaaacc tttgcaagat tccatgccag 660

aagttcatcc aagattcact tggcatgaag gtctacatgt ctcccaattt tgaagacatg 720

agctgtgaga tgatatttgg acagcaacct cctgaagatg accctgcatt gaagcagcca 780

tgcttccgga caaaatgcgt cgcaaagcag aatcatggtg tgaattgctc catctga 837

<210> 3

<211> 278

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Glu Thr Thr Thr Leu Val Leu Leu Leu Pro His Gly Gly Ala Gly

1 5 10 15

Gly Val Arg Pro Ala Ala Ala Ala Thr Ala Lys Arg Ser Tyr Val Met

20 25 30

Arg Arg Cys Cys Ser Thr Val Arg Ala Val Met Ala Arg Pro Gln Glu

35 40 45

Ala Pro Ala Ser Ala Pro Ala Lys Lys Thr Glu Thr Ala Ala Met Met

50 55 60

Ser Thr Val Gln Thr Glu Thr Ala Ala Ala Pro Pro Ala Thr Val Tyr

65 70 75 80

Arg Asp Ser Trp Phe Asp Lys Leu Ala Ile Gly Tyr Leu Ser Arg Asn

85 90 95

Leu Gln Glu Ala Ser Gly Leu Lys Asn Glu Lys Asp Gly Tyr Glu Ser

100 105 110

Leu Ile Asp Ala Ala Leu Ala Ile Ser Arg Ile Phe Ser Leu Asp Lys

115 120 125

Gln Ser Glu Ile Val Thr Gln Ala Leu Glu Arg Ala Leu Pro Ser Tyr

130 135 140

Ile Leu Thr Met Ile Lys Val Met Met Pro Pro Ser Arg Phe Ser Arg

145 150 155 160

Glu Tyr Phe Ala Ala Phe Thr Thr Ile Phe Phe Pro Trp Leu Val Gly

165 170 175

Pro Cys Glu Val Met Glu Ser Glu Val Glu Gly Arg Lys Glu Lys Asn

180 185 190

Val Val Tyr Ile Pro Lys Cys Arg Phe Leu Glu Ser Thr Asn Cys Val

195 200 205

Gly Met Cys Thr Asn Leu Cys Lys Ile Pro Cys Gln Lys Phe Ile Gln

210 215 220

Asp Ser Leu Gly Met Lys Val Tyr Met Ser Pro Asn Phe Glu Asp Met

225 230 235 240

Ser Cys Glu Met Ile Phe Gly Gln Gln Pro Pro Glu Asp Asp Pro Ala

245 250 255

Leu Lys Gln Pro Cys Phe Arg Thr Lys Cys Val Ala Lys Gln Asn His

260 265 270

Gly Val Asn Cys Ser Ile

275

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catctcaaga atcttcagtc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catctcaaga atcttcagtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gactgaagat tcttgagatg 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggacttcatt aacactgtag catc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtacttacca ttgtgaggat gtag 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tacacagcca tcggtccaga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

taggagggcg tggatatgtc 20

Claims (5)

1.一种水稻矮化、多分蘖基因Os11g0587000突变体，其特征在于，所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的水稻矮化、多分蘖基因Os11g0587000突变体编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或该序列经替换、缺失或添加个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

3.权利要求1所述水稻矮化、多蘖基因Os11g0587000突变体的创制方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1） RNA靶点序列设计：根据水稻水稻矮化、多分蘖基因Os11g0587000的基因组序列和CRISP/Cas9技术的设计靶位点的原则，设计1个引导RNA靶点序列，其序列为5’-CATCTCAAGAATCTTCAGTC -3’；

（2）CRISPR/Cas9-gRNA载体的构建：

（3）农杆菌介导水稻愈伤组织遗传转化：把步骤（2）构建好的CRISPR/Cas9-gRNA载体转化到水稻品种明恢86中，获得了不含有CRISPR元件T-DNA成分的纯合Os11g0587000基因突变体。

4.根据权利要求3所述所述水稻矮化、多蘖基因Os11g0587000突变体的创制方法，其特征在于：所述步骤（1）中，靶位点设计在基因的第一个外显子上；所述的引导RNA靶点序列的寡核苷酸序列为：

D86F:5'-cag ：CATCTCAAGAATCTTCAGTC-3'；

D86R:5'-aac ：GACTGAAGATTCTTGAGATG -3'。

5.一种水稻矮化、多分蘖基因Os11g0587000突变体植株，其特征在于：是通过将权利要求3所述的靶点CRISPR/Cas9-sgRNA载体转化入水稻成熟胚愈伤组织，获得转基因阳性植株。

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