CN109852634B - 一种培育高结瘤固氮转基因植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育高结瘤固氮转基因植物的方法，在植物体内过表达序列表中的SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，获得与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。经试验验证，利用本发明构建的过表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的结瘤固氮能力，对提高大豆产量具有重大的实际意义。本发明的技术方案在基础科研和农林应用两个方面均具有实际价值。

Description

一种培育高结瘤固氮转基因植物的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种能够提升植物结瘤固氮能力的基因及其应用。

背景技术

大豆起源于中国，是我国重要的经济粮油作物。大豆作为豆科植物，具有特殊的根部侧生器官根瘤。大豆可以通过和根瘤菌互利合作进行共生固氮，将空气中的氮气转化为可供植物吸收利用的氮素营养，既减少氮肥的施用量又保证了大豆的产量和品质。因此共生固氮是维持大豆高产稳产的一种重要性状。

现有技术中，已存在诸多通过转基因技术提高大豆结瘤固氮能力的研究。但是尚没有关于GH3介导大豆共生固氮菌植互作过程机理的报道。本研究开发了一个与既往基因类群不同的全新的方向。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种培育高结瘤固氮转基因植物的方法

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种培育高结瘤固氮转基因植物的方法，在植物中过表达SEQ ID NO：1所示的基因，培育出具高结瘤固氮能力的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，首先构建含有SEQ ID NO：1所示基因的重组过表达载体，然后利用此重组过表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选得到与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述重组过表达载体的空载体为pTF101质粒。

作为本发明的一种优选技术方案，利用限制性内切酶Xba I和BamH I将SEQ IDNO：1所示基因连接到空载体上构建重组过表达载体。

作为本发明的一种优选技术方案，所述转化体为农杆菌。

作为本发明的一种优选技术方案，所述目的植物为大豆。

作为本发明的一种优选技术方案，该方法包含如下步骤：

A、构建含有SEQ ID NO：1所示基因的重组表达载体：

A-1、首先以大豆叶片DNA为模板，扩增获得SEQ ID NO：1所示多核苷酸序列并连接至T载体上，然后用限制性内切酶Xba I和BamH I酶切所得T载体质粒，回收酶切产物；

A-2、用限制性内切酶Xba I和BamH I酶切空载体pTF101质粒，回收载体骨架；

A-3、用T4连接酶将步骤A-1的酶切产物和步骤A-2的载体骨架连接，连接产物热激转化大肠杆菌感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序验证，得到重组表达载体。

B、采用液氮冻溶法转化农杆菌制备转化体：

B-1、取出冻存的200 μL 感受态农杆菌细胞，融化后加入5-10 μL步骤A所得重组表达载体的质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上静置20-30 min；

B-2、上步所得放入液氮中5 min后取出，转入37℃、5 min 融化后，加入800 μLYEP液体培养基，28℃ 低速振荡、150 rpm，4-5 h；

B-3、离心操作，10000 rpm，30 sec， 去上清，加100 μL YEP 液体培养基，悬浮菌体后涂板；

B-4、上步所得置于28℃ 培养至白色转化子长出，挑取阳性单克隆摇菌，得到用于大豆子叶节转化的转化体。

本发明还涉及扩增SEQ ID NO：1所示基因的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示。

本发明还涉及含有SEQ ID NO：1所示基因的重组过表达载体和转化体。

本发明还涉及过表达SEQ ID NO：1所示基因并具有高结瘤固氮能力的转基因植物。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

本研究在植株层面验证了转基因大豆的高结瘤固氮能力，开发了一个与既往基因类群不同的全新的方向。本发明的技术方案在基础科研和农林应用两个方面均具有重要的实际价值。

参看下述实施例1，本发明构建的过表达载体能够特异的过表达SEQ ID NO：1所示基因，此基因定位在大豆11号染色体上；通过大豆子叶节转化得到的稳定转化苗的结瘤分析显示，SEQ ID NO：1所示基因的过表达可以显著促进大豆根系结瘤数目的增加；利用本发明构建的过表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的结瘤固氮能力，对提高大豆产量具有重大的意义。

附图说明

图1A为对GmGH3.1转基因植株Bar基因检测，图1B为对GmGH3.1草甘膦涂抹结果，结果显示Bar基因检测和草甘膦涂抹均为阳性，证明转基因植株材料为阳性转化。

图2为过表达GmGH3.1后对大豆结瘤的表型分析，在转基因株系中目的基因GmGH3.1的表达水平和野生型中的表达相比有明显提高（图2A），过表达GmGH3.1的转基因植株同W82（威廉姆斯82）相比，根瘤数量显著增多（图2B）。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、Wilimas82大豆组织中总RNA的提取。

研钵经 180 ℃高温处理8小时或经燃烧处理以消除RNA酶污染；氯仿、异丙醇，乙醇等试剂使用新开封未被污染的；其它器材如枪头、离心管和试剂如超纯水、NaAc，均经1‰ DEPC水处理过夜后121 ℃高温湿热灭菌30分钟，枪头，离心管65 ℃烘干备用；采用Trizol法提取大豆总RNA。

（1）取 50 mg 材料（叶片）用液氮研磨材料，加入1 mLTRI pure试剂，充分匀浆后，将匀浆液吸入1.5 mL离心管，室温放置5 min；

（2）加入200 μL氯仿，震荡混匀，静置5 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；

（3）取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，振荡混匀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；

（4）弃上清，用1 mL 75%的乙醇（DEPC处理过的无菌水配制）洗涤，4 ℃，12000 r/min，离心10 min，重复两次，室温风干10 min左右，加20 μL左右 DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀。

实施例2、反转录PCR。

（1）在用DEPC 处理过的的200 μL PCR管中顺序加入5μL RNA 和3μL oligo dt；4μL dNTPs，65 ℃温育5 min 后迅速置于冰上冷却；

（3）按以下顺序加入以下溶液：5X M-MLV buffer（invitrogen公司出品）4 μL，RNase inhibitor 1μL，M-MLV 1 μL，0.1M DTT 2 μL；

（4）将上述反应液混匀，37 ℃反应30 min；

（5）反应结束后，70 ℃处理10 min灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA 第一条链可用作PCR反应模板。

实施例3、构建重组表达载体。

（1）GmGH3.1基因片段的克隆。

根据GmGH3.1的编码序列（SEQ ID NO;1）设计引物对用于过表达载体构建，根据载体pTF101上的多克隆位点，引物末端分别引入Xba I和BamH I酶切识别位点；以大豆测序品种W82的cDNA为模板进行PCR，扩增GmGH3.1长为1782 bp的基因片段（SEQ ID NO:1）；引物序列为：

正向引物: CGCGGATCCATGGCCGTTGATTCTGAG（SEQ ID NO:2）；

反向引物：GCTCTAGATCAACGACGACGTTCTGG（SEQ ID NO:3）；

扩增程序为：95 ℃ 5分钟；95 ℃ 30 秒，56 ℃ 30秒，68 ℃ 2分钟，30 个循环；72 ℃ 70秒；

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1782bp左右的条带；

回收的 DNA 片段与Blant3-T载体（Takara 公司）连接，10 μL体系中加入Tvector 1 μL，回收片段4 μL，混匀混合液，16 ℃连接过夜，热击法转入E.coli大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交上海生工测序。

（2）重组表达载体的构建。

a. 提取含有正确测序的GmGH3.1 1782 bp基因序列的T载体质粒，用Xba I和BamHI酶切获得核苷酸序列；

b.用Xba I和BamH I酶切pTF101质粒，获得线状的pTF101核苷酸序列 ；

c. 用T4连接酶将步骤a和步骤b的酶切产物的载体骨架连接；

d. 将连接产物热激转化大肠杆菌感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒35S::GmGH3.1。

实施例4、农杆菌EHA101介导的大豆子叶节稳定转化。

（1）农杆菌的转化，采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作为：

a. 取出冻存的200 μL感受态细胞，融化后加入5-10 μL质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30 min；

b. 放入液氮中5 min后取出，将管转入37 ℃（5 min）融化后，加入800 μL LB（无抗性）液体培养基，28 ℃低速振荡 （150 r/min） 4-5 h；

c. 4000 r/min，30 sec, 去上清，加100 μL LB 液体培养基，悬浮菌体后涂板（含50 mg/mL 卡那霉素）；

d. 置28 ℃培养至白色转化子长出，用于大豆子叶节的转化。

（2）农杆菌EHA105介导的大豆子叶节遗传转化；

a.以大豆品种W82为材料，取种子材料用氯气消毒16小时；

b.在B5培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8％琼脂粉（sigma），1×GAMBORG B-5BASAL（Phyto Technology Laboratories，货号：G398），pH调至5.7 左右）上萌发16h，手术刀片将萌发好的大豆上胚轴切断，后沿两片子叶正中间将两片子叶分开，在活化的农杆菌EHA105中侵染30 min（OD₆₀₀=0.8）；

c.将外植体转至共培养培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8％ 琼脂粉（sigma），1.67 mg/L 6-BA, 0.25 mg/L GA3, 0.1×GAMBORG B-5 BASAL（Phyto TechnologyLaboratories，货号：G398，pH调至5.4 左右）上共培生长4天左右，再转至诱导培养基上诱导丛生芽（培养基配方：2％蔗糖，0.8％ 琼脂粉（sigma），1.67 mg/L 6-BA, 10 mg/Lglufosinate,1×GAMBORG B-5 BASAL（Phyto Technology Laboratories，货号：G398）pH调至5.7 左右）；

d.在诱导丛生芽后2周，取已生成的分生组织，在生长点的基部作新的切口（水平方向的），并将培养组织移入伸长培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8％ 琼脂粉（sigma），0.1mg/L IAA, 1 mg/L Zeatin, 0.5 mg/L GA3, 10 mg/L glufosinate, 1×MURA SHIGE &SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS（Phyto Technology Laboratories，货号：M404），pH调至5.7 左右）；

e.每两周将培养物向新的培养基上转移一次；每次转移时在外植体的基部作一个新的水平切口；

f.在6-8周培养以后，将伸长的芽（一般剪取芽长＞4cm）在1 mg/mL IBA中蘸根后移入生根培养基上生根（培养基配方：2％蔗糖，0.8％ 琼脂粉（sigma），0.5×MURA SHIGE &SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS（Phyto Technology Laboratories，货号：M404），pH调至5.7 左右）；培养大约2-4周，长出足量的根系时，进行移栽；

g.将生根的小苗小心移入小花盆中，花盆里放入（进口土:营养土=1:1）培养土；移栽后用盖子罩住一周，使苗习惯于土壤的新环境并保持湿度，培养间的温度于26℃，一周后取下盖子；

h.待转基因苗恢复生长后用Bar基因检测、草丁膦glufosinate（SIGMA，45520）涂抹叶片，两种方法进行转化鉴定，收获Bar基因阳性转基因株系，在T1代的阳性植株进行目的基因的表达分析以及表型的鉴定。

实施例5、转基因植株的分子鉴定。

对T1代阳性的植株后代进行了较为系统的选择Bar基因表达及基因产物功能的鉴定。其中包括纯合株系PCR鉴定Bar基因、叶片涂抹草丁膦和目的基因表达量检测。

（1）PCR检测反应法:提取大豆基因组DNA 用于PCR 检测。检测Bar基因是否转入大豆基因组中。Bar基因引物:

F: CTACATCGAGACAAGCACGGTCAA（SEQ ID NO:4），

R: AGAAACCCACGTCATGCCAGTTC（SEQ ID NO:5）。

（2）大豆叶片DNA提取方法如下：

a. 大豆组织于研钵中用液氮研磨，将充分研磨的粉末移至1.5 mL 离心管中；加入650 mL CTAB提取液（100 mM，Tris-HCl（pH 8.0），4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA（pH8.0），2% CTAB，使用前加入2 mL /100 mL β-巯基乙醇），混匀；

b. 65 ℃水浴30 min，中间轻微振荡几次；

c. 置于冰上5 min；

d. 加等体积的氯仿：异戊醇（24:1），轻轻混匀；

e. 室温，静置10 min，12000 rpm 冷冻离心15 min，取上清；

f. 加2倍体积冰乙醇，混匀，-20℃静置30 min；

g. 离心，排出上清液；

h. 70%乙醇1 mL 漂洗2次，晾干，无菌水100 μL 溶解，-20℃冰箱长期保存。

（2）除草剂涂抹法: 将Basta原液稀释为浓度130 mg/L，在大豆第一对三出复叶完全展开时，以主叶脉为分界线，用记号笔标记半片叶子，然后用棉签蘸取草丁膦液体擦拭已标记的半片叶子，5 天后观察叶片对除草剂的反应。如为阳性植株则除草剂涂抹过的叶片与未涂抹的叶片相比没有太大变化，如为阴性植株则涂抹过除草剂的叶片明显变黄甚至枯萎。

（3）实时荧光定量PCR分析：使用TaKaRa公司出品的SYBR Premix Ex TagTM进行定量PCR分析；在20 μL体系中加入用上诉大豆总RNA提取及反转PCR方法所得转基因根系的RNA模板2 μL、正反向引物各0.4 μL、SYBR Primix Ex taqTM(2×) 10 μL、ROX ReferenceDye II (50×)0.4 μL、ddH₂O 6.8 μL；扩增程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，45 cycles；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s；其中

正向引物为：CTCATCATCATGGCCGTTGA（SEQ ID NO：6）；

反向引物为：TTGGGTGAGAATCTCGGTGAG（SEQ ID NO：7）；

实施例6、结果观察。

（1）Bar基因检测结果：对T1代阳性的植株后代进行了较为系统的选择Bar基因表达及基因产物功能的鉴定。其中对PCR鉴定纯合的株系（图1A）进行了草丁膦涂抹（图1B）。从图中可见，PCR阳性的转基因植株也呈现了对草丁膦的抗性，说明Bar基因正常表达，

（2）GmGH3.1在转基因植株当中的表型鉴定：在转基因株系中目的基因GmGH3.1的表达水平和野生型中的表达相比有明显提高（图2A）,GmGH3.1过表达转基因植株同对照野生型W82相比地下的根瘤数目显著增多（图2B和2C）。因此，GmGH3.1是决定大豆根瘤发育及形成的重要基因。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种培育高结瘤固氮转基因植物的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1782

<212> DNA

<213> 大豆属大豆(Glycine max)

<400> 1

atggccgttg attctgaggt ccctcgtgcc gagaggagcg caaaggctct tcagttcatc 60

gaggaagtta caaaaaacac tgactccgtc caggagagag tcctcaccga gattctcacc 120

caaaacgccg agacggagta cctcaaacgc ttcggcctca acggcgccac cgaccgtgac 180

actttcaagt ccaaggttcc cgtcgtgacc tacgaggatc tgcaacctga tattcagcgc 240

attgcaaatg gtgacagctc tcccatcttg tgctctcacc caatctctga gtttctcacc 300

agttctggaa catctgccgg cgagagaaag ttgatgccaa ccattcatga agaaatggac 360

cgtcgtcagt tactgtacag cctgctcatg cctgtgatga accaatacgt gtctgatttg 420

gacaaaggca aggcgcttca cttcctgttc attaaggcag aggccaagac acccggcggg 480

ttagtggcgc gtccagtgct gacaagctac tacaagagcg agcaattcag gaaaagacca 540

ttcgaccctt acaacgtcct cactagcccc aacgaagcca tcctttgccc cgattccttc 600

cagagcatgt acactcagat gctctgcggc ctcatcatgc gccacgaggt tctccgtgtc 660

ggagccgtct tcgcctccgg ccttctccgt gccataaggt tccttcagct caattgggaa 720

caactttccc atgatatcct caccggaacc ctaaacccaa agatcactga accttccatc 780

aaggaacgca tgtccaagat cttgaaaccc gaccctcaac tcgccgcttt cattaaaaac 840

gaatgctccg tggaaaactg ggagcgtata attgtgagga tttggcctaa cacaaaatac 900

cttgacgtta tagtcactgg agccatggct cagtatattc ccacactcga ttactacagt 960

ggtggcctac ctaaaccctg taccatgtac gcttcttctg agtgtttttt cggcctcaac 1020

ctcaaaccca tgtccgaacc ctctgacgtg tcttacacca ttttacccaa catgggttac 1080

ttcgagtttt taccccatga tgattcctct cctgttactc tctccaagga ctcaccgcct 1140

cgcttggtgg aactcgctga cgtggaactt ggtaaatact atgaactcat tatcaccacc 1200

tattcaggtc tttgccgtta cagggtcggt gacatactcc aagtaactgg tttccacaac 1260

tccgaccctc aattccgttt cgtgaggcga aagaacgttt tgctgagcat tgactcggac 1320

aaaaccgatg aagcggaact gcaaaaggcc atcgagaatg cctcggagtt gctgaaggag 1380

ttcaatacca gcgttgtgga gtacacgagc ttcgctgaca cgaaatccat tccggggcat 1440

tacgtgattt actgggagct catgatgaag gactcgtctc accctccaac gaaccaagtt 1500

ctgaaccagt gctgcttggt gatggaagag tcgctgaact cggtttatag acaagggaga 1560

gttgcggata actctattgg gccgttggag atacgagtgg tgaagaatgg aacgtttgag 1620

gagttgatgg actacgctat ctcgcgtggt gcgtcgataa accagtacaa agtgccaagg 1680

tgcgtgagct tcacgcccat aatggagcta cttgactcta gggtggtttc ttttcatttt 1740

agcccagctg caccgcactg gaccccagaa cgtcgtcgtt ga 1782

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcggatcca tggccgttga ttctgag 27

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctctagatc aacgacgacg ttctgg 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctacatcgag acaagcacgg tcaa 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agaaacccac gtcatgccag ttc 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcatcatca tggccgttga 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgggtgaga atctcggtga g 21

Claims (6)

1.一种培育具有高结瘤固氮能力转基因植物的方法，其特征在于：在植物中过表达SEQID NO：1所示的基因，培育出具有高结瘤固氮能力的转基因植物；所述植物为大豆。

2.根据权利要求1所述的培育具有 高结瘤固氮能力 转基因植物的方法，其特征在于：首先构建含有SEQ ID NO：1所示基因的重组过表达载体，然后利用此重组过表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选得到与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。

3.根据权利要求2所述的培育具有 高结瘤固氮能力 转基因植物的方法，其特征在于：所述重组过表达载体的空载体为pTF101质粒。

4.根据权利要求3所述的培育具有 高结瘤固氮能力 转基因植物的方法，其特征在于：利用限制性内切酶Xba I和BamH I将SEQ ID NO：1所示基因连接到空载体上构建重组过表达载体。

5.根据权利要求2所述的培育具有 高结瘤固氮能力 转基因植物的方法，其特征在于：所述转化体为农杆菌。

6.根据权利要求1所述的培育具有 高结瘤固氮能力 转基因植物的方法，其特征在于：该方法包含如下步骤：

A、构建含有SEQ ID NO：1所示基因的重组表达载体：

A-1、首先以大豆叶片DNA为模板，扩增获得SEQ ID NO：1所示多核苷酸序列并连接至T载体上，然后用限制性内切酶Xba I和BamH I酶切所得T载体质粒，回收酶切产物；

A-2、用限制性内切酶Xba I和BamH I酶切空载体pTF101质粒，回收载体骨架；

A-3、用T4连接酶将步骤A-1的酶切产物和步骤A-2的载体骨架连接，连接产物热激转化大肠杆菌感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序验证，得到重组表达载体；

B、采用液氮冻溶法转化农杆菌制备转化体：

B-1、取出冻存的200 μL 感受态农杆菌细胞，融化后加入5-10 μL步骤A所得重组表达载体的质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上静置20-30 min；

B-2、上步所得放入液氮中5 min后取出，转入37℃、5 min 融化后，加入800 μL YEP液体培养基，28℃低速振荡、150 rpm，4-5 h；

B-3、离心操作，10000 rpm，30 sec，去上清，加100 μL YEP 液体培养基，悬浮菌体后涂板；

B-4、上步所得置于28℃培养至白色转化子长出，挑取阳性单克隆摇菌，得到用于大豆子叶节转化的转化体。

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