CN116897961B - 一种植物分枝调节剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物分枝调节剂及其应用，植物分枝调节剂通过调控芽相关的基因、生长素运输相关的基因、独脚金内酯生物相关的基因和细胞分裂素合成酶基因，从而对植物分枝进行调节；植物分枝调节剂的应用为将植物分枝调节剂应用于对植物分枝进行抑制，或将植物分枝调节剂的应用于对植物分枝抑制的机理研究，通过调节植物中相互作用的基因而对分枝进行调节，提供一种新的调控思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物分枝调节剂及其应用，属于植物培育技术领域。
背景技术
植物侧枝发育是植物形态建成的重要组成部分，受植物生长遗传因子、环境因素、植物激素等多因素综合影响，其中植物激素介导了遗传和环境信号，在分枝调控中起到重要作用。为了解释生长素对侧生分生组织生长的影响，提出了两种主要的机制：生长素转运模型，该模型认为生长素从一个细胞转移到另一个细胞中的过程中形成生长素流，侧芽中的生长素流受主茎中的极性运输(polar auxin transport PAT)所调控，通过主茎和侧芽相互竞争输出PAT流，从而调控侧芽的生长。第二信使模型(SM-model)，该模型的观点认为生长素是通过调节根部到茎中的移动信号来发挥作用，这种信号可以通过从木质部等组织向上移动进入侧芽，从而对侧芽的活性起到直接调节作用，以此来调节侧芽的生长发育，由此可见，激素对于调控植物侧枝生长机理是非常复杂的，植物中激素之间相互作用的具体机制也在被不断探索。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种植物分枝调节剂，通过调节植物中相互作用的基因而对分枝进行调节，提供一种新的调控思路。
本发明的第二个目的在于提供一种上述植物分枝调节剂的应用，对植物分枝进行抑制，并且进一步对植物分枝的机理研究提供了新思路和启发。
实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种植物分枝调节剂，植物分枝调节剂通过调控芽相关的基因、生长素运输相关的基因、独脚金内酯生物相关的基因和细胞分裂素合成酶基因，从而对植物分枝进行调节。
进一步地，芽相关的基因为抑制芽生长基因CmBRC1(SEQ ID NO.1)和促进芽分化基因CmDRM1(SEQ ID NO.2)；生长素运输相关的基因为CmPIN1(SEQ ID NO.3)和CmTIR3(SEQID NO.4)；独脚金内酯生物相关的基因为独脚金内酯生物合成基因CmMAX1(SEQ ID NO.5)和独脚金内酯信号途径基因CmSMXL6(SEQ ID NO.6)；细胞分裂素合成酶基因为CmIPT3(SEQID NO.7)。
进一步地，植物分支调节剂为浓度90-110μM的IAA。
进一步地，植物分支调节剂使得CmBRC1、CmDRM1、CmPIN1、CmTIR3、CmMAX1和CmSMXL6的表达量上升，CmIPT3的表达量下降。
进一步地，植物分支调节剂为浓度9-11μM的GR24。
进一步地，植物分支调节剂使得CmBRC1、CmMAX1和CmSMXL6的表达量上升，CmDRM1、CmPIN1、CmTIR3、CmIPT3的表达量下降。
进一步地，植物为菊花。
实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种植物分枝调节剂的应用，将植物分枝调节剂应用于对植物分枝进行抑制；植物分枝调节剂通过调控芽相关的基因、生长素运输相关的基因、独脚金内酯生物相关的基因和细胞分裂素合成酶基因，从而对植物分枝进行调节。
进一步地，植物分枝调节剂为浓度9-11μM的GR24，每3d喷施植物叶片1次，总处理时间≤8d。
进一步地，植物分枝调节剂为浓度90-110μM的IAA，每3d喷施植物叶片1次，总处理时间≤8d。
或，实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种植物分枝调节剂的应用，将植物分枝调节剂的应用于对植物分枝抑制的机理研究；植物分枝调节剂通过调控芽相关的基因、生长素运输相关的基因、独脚金内酯生物相关的基因和细胞分裂素合成酶基因，从而对植物分枝进行调节。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明通过调节植物中相互作用的基因而对分枝进行调节，提供一种新的调控思路；
2、本发明对植物生长特性的改良提供理论基础。同时对不同激素影响侧枝生长的调控网络进行初步研究。
附图说明
图1为处理后除去菊花叶片的分枝表型图；图2为处理后的侧芽直径图示；图3为处理后菊花15个节的侧芽长度图示；图4-10为处理后分枝相关基因表达量；图11为CmSMXL6基因扩增电泳图；图12为CmSMLX6氨基酸分布；图13为CmSMXL6蛋白亲水性/疏水性预测；图14为CmSMXL6蛋白保守结构域预测；图15为CmSMXL6蛋白跨膜结构预测；图16为CmSMXL6蛋白信号肽预测；图17为CmSMXL6蛋白磷酸化位点预测；图18为CmSMXL6蛋白二级结构预测分析；图19为CmSMXL6蛋白的三级结构预测分析；图20为CmSMLX6系统进化树；图21为CmSMXL6基因在菊花不同组织中的表达模式；图22为CmSMXL6在独脚金内酯激素下的表达模式分析；图23为CmSMXL6基因的亚细胞定位；图24为潮霉素基因片段检测；图25为CmSMXL6基因片段检测；图26为转基因拟南芥分枝生长表型；图27为拟南芥莲座叶片数量；图28为拟南芥一级分枝数目；图29为拟南芥二级分枝数目；图30为CmSMXL6转基因拟南芥中分枝相关基因表达量。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
1试验过程：
1.1试验设计：
选取菊花‘巴尔塔萨’为试验材料，在生长健壮的菊花上剪取大小一致的侧芽到穴盆中扦插生根，于10d后定植移栽到花盆中，用营养土和蛭石(2:1)混合培养，在长日照(16h光照/8h黑暗)条件下种植于基地大棚中，以定植后25d长势一致的菊花为试验材料。将定植后25d长势一致的菊花分为4组，每组为15株材料，所有菊花用经酒精消毒的手术刀片快速切除植株顶芽进行打顶处理，并进行激素处理。
1.2工作溶液的配制：
称取0.0875g的IAA粉末于烧杯中，加入5mL的95％v/v乙醇搅拌至完全溶解，将溶解后的溶液移至容量瓶中并用蒸馏水定容至50mL，得到浓度为10mM的IAA母液，取上述母液1.5mL，用蒸馏水定容至150mL，配制成终浓度为100μM的IAA处理溶液。
称取0.1126g的6-BA粉末于烧杯中，往其加入1mol/L的盐酸溶液直至粉末溶解，将溶解后的溶液移至容量瓶中并用蒸馏水定容至50mL，得到浓度为10mM的6-BA母液，取上述母液1.5mL，用蒸馏水定容至150mL，配制成终浓度为100μM的6-BA处理溶液。
用丙酮作为溶剂加入到5mg的GR24粉末，在避光条件下将其充分溶解，配制成10mM的母液，取上述母液150μL，用蒸馏水定容至150mL，配制成终浓度为10μM的GR24处理溶液。
1.3激素处理：
CK：对照喷施蒸馏水；
组1：喷施浓度为100μM IAA溶液；
组2：喷施10μM GR24溶液；
组3：喷施100μM 6-BA溶液。
每三天处理一次，共喷施3次，在傍晚光照渐弱时，将配制好的工作溶液均匀的喷施在菊花植物的叶片表面，以完全湿润叶片两侧，直至叶片上有水珠滴落。在第10d测量完数据后采集各处理组的植物RNA样品，每份样品设置三个重复。
2检测内容：
2.1侧芽长度统计：
统计方法参考赵凤等(2018)并略作改进。在去顶后的发出的第一侧芽所在的节为侧芽统计的起始节位，并依次向下统计15个节位的侧芽长度，将其命名为1～15节位侧芽。有效侧枝数的测量，侧芽长度大于1cm为有效侧芽，在长度1cm以下的视为侧芽未发生。每个处理15个生物学重复。
2.2总RNA提取与检测：
cDNA合成：
(1)在RNase-free离心管中将1μg RNA加RNase-free ddH2O至8μL，在65℃的PCR仪中反应5min，迅速置于冰上静置2min。
(2)往上述离心管中加入2μL的5×gDNA wiper Mix，用移液器轻轻吹打混匀，在42℃的PCR仪中反应2min。
(3)在冰上配制以下反应液：
第(2)步的混合液10μL
10×RT Mix 2μL
HiScript III Enzyme Mix 2μL
Random hexamers 1μL
RNase-free ddH2O 5μL
Total 20μL
(4)用移液器轻轻吹打混匀后，按照25℃，5min；37℃，45min；85℃，5s条件进行第一链cDNA合成反应。反应完成后，将cDNA放入-20℃冰箱保存。
基因相对表达量分析：
在CFX ConnectTMReal-Time System(Bio-Rad，美国)荧光定量PCR仪中进行实时荧光定量实验，qPCR反应体系：
2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL
Primer1(10μM)0.4μL
Primer2(10μM)0.4μL
cDNA 1μL
RNase free ddH2O To 20μL
qPCR反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。在PCR循环反应结束后，根据溶解曲线峰值分析PCR的反应结果，以内参基因荧光值作为内标，对荧光定量结果用相对定量法2-ΔΔCt法进行分析，每个反应设置3次生物重复。用于表达量检测的基因的特异性引物序列如表格1所示：
表格1所用引物序列
| 引物名称 | 引物序列 |
| q-CmBRC1-F | GTCGATTAGGGTCTTGGATC |
| q-CmBRC1-R | TAGACGTCGCGGATGAAGT |
| q-CmDRM1-F | ACTACTTTGATAGCCCTAAGCACG |
| q-CmDRM1-R | ACGATGTTTGCTCCTTGTGTC |
| q-CmPIN1-F | TGGCATTGCAACCAAGGATC |
| q-CmPIN1-R | AAATGGAAGCAGCAGCCATG |
| q-CmTIR3-F | TCATCAGATAAAGAGCCAGGAG |
| q-CmTIR3-R | AGCACAGACTTGCCACCA |
| q-CmIPT3-F | TAAAGTAGTAGTCGTTATGGGTGCT |
| q-CmIPT3-R | CATCGTAAGAGAAGCCGTGC |
| q-CmMAX1-F | TAGTGGCAAGGGAAACATC |
| q-CmMAX1-R | CTTCATCACAAATCGGGTC |
| q-CmSMXL6-F | TGATTGGTTATGCGGAAAG |
| qCmSMXL6-R | GAAGAACATGAAGATCCCAC |
| 18S-F | AAACGGCTACCACATCCAAG |
| 18S-R | ACTCGAAAGAGCCCGGTATT |
| Actin-F | GACTGATGCGTTGATGAAGA |
| Actin-R | TCATGAATACCAGCAGCT |
3结果与分析：
3.1激素处理后菊花分枝相关表型分析：
激素是影响植物侧枝生长重要的影响因子，为了明确在菊花中生长素、SLs(独脚金内酯)和细胞分裂素对侧枝生长的作用，对菊花外施植物激素进行100μM IAA、10μMGR24、100μM6-BA处理。由图1可知，在100μM 6-BA处理下菊花植株的分枝有促进的作用，而在100μM IAA和10μM GR24处理组与对照组相比的菊花均出现了抑制的作用，其中GR24处理组对分枝的抑制作用大于100μM IAA处理组。由图2可知，100μM 6-BA处理下菊花芽的直径大于对照组，100μM IAA和10μM GR24处理组的芽直径均小于对照组。从图3可知，在处理后第10d时，100μM 6-BA处理组菊花的第15节侧枝长度小对照组，而第14、13节侧枝长度要大于对照组，但未达到显著水平。100μM IAA和10μM GR24处理组菊花的侧枝长度均小于100μM6-BA组和对照组，且在第14、13节侧枝长度开始有明显的抑制作用。100μM IAA处理组菊花的第14节侧枝长度为29.31mm，比对照组减短10.5mm。10μM GR24处理组菊花的第14节侧枝长度为27.62mm，比对照组减短12.2mm。100μM 6-BA处理的菊花有效分枝数目最多为10.75枝，10μMGR24处理组的有效分枝数目最少为4.75枝，与对照组相比均呈显著性差异。可见外源100μMIAA、10μM GR24处理会抑制菊花侧枝的生长，外源100μM 6-BA处理菊花会促进侧枝的生长。
3.2第二侧芽生长速率分析：
分别在3d、5d、8d、10d测量其第二节侧芽的生长速率，结果如表格2所示：
表格2第二节的侧芽生长速率
在100μM 6-BA处理的前8d，菊花侧芽生长速率最快，明显促进了侧芽生长；而10μMGR24处理后的前8d生长速率最慢，与对照组相比减缓了侧芽生长速率。第8d时菊花侧芽生长速率明显升高，100μM IAA处理组的生长速率为16.38mm/d，是对照组的0.83倍；10μMGR24处理组的生长速率为14.38mm/d，是对照组的0.73倍；100μM 6-BA处理组的生长速率为19.93mm/d，与对照组的侧芽生长速率相比变化不明显。在第10d时，100μM 6-BA处理的侧枝生长速率降低，对照组的侧芽生长速率是它的1.45倍，10μM GR24和100μM IAA处理组的侧芽生长速率与对照组相比差异不明显。
3.3激素处理后菊花分枝相关基因表达变化分析：
通过三种激素处理后，在表型中可以看出在6-BA的处理下，菊花的侧芽分多，10μMGR24和100μM IAA的处理下呈抑制的情况，为进一步分析其作用，选出基因，在分子层面剖析其功能。对芽生长相关基因CmBRC1和CmDRM1，生长素转运基因CmPIN1和CmTIR3，细胞分裂素合成酶基因CmIPT3以及独脚金内酯生物合成基因CmMAX1和信号途径基因CmSMXL6，设计特异引物，进行定量分析，结果如图4-10所示，图上不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。与芽生长相关的基因CmBRC1和CmDRM1在不同激素处理中存在着不同的表达模式。抑制芽生长基因CmBRC1在100μM IAA和10μM GR24的处理下均表达上调，100μM IAA处理下的相对表达量最高，为对照组的1.86倍；在100μM 6-BA处理下，基因CmBRC1的表达量下调，是对照组的0.43倍。而在IAA和6-BA这两个激素处理下促进芽分化基因CmDRM1的相对表达量增加，100μM 6-BA处理下的相对表达量最高，是对照组的2.97倍，在10μM GR24处理下，基因CmDRM1的表达量下调，是对照组的0.66倍。对生长素转运基因相关基因CmPIN1和CmTIR3定量分析结果可以看到，CmPIN1在10μM GR24和100μM6-BA处理下表达量下降，在100μM IAA处理下相对表达量增加，是对照组的1.61倍。而CmTIR3基因在三种激素处理下相对表达量没有显著性差异，在100μM IAA和100μM 6-BA处理下微量上调，10μM GR24处理下表达量下降。对独脚金内酯生物合成基因CmMAX1和独脚金内酯信号途径基因CmSMXL6进行定量分析，三种激素处理后CmMAX1、CmSMXL6的相对表达量均有不同程度的上调，IAA、GR24、6-BA处理后CmMAX1的相对表达量分别是对照组的1.73、1.49、1.43倍，差异达到显著，GR24和6-BA处理组CmSMXL6的相对表达量分别是对照组的2.43和2.80倍，差异达到显著，而IAA处理组CmSMXL6的相对表达量与对照组相比上调，差异未达到显著。细胞分裂素合成酶基因CmIPT3，结果看到100μM IAA和10μM GR24处理下CmIPT3的相对表达量显著下降，分别为对照组的0.23倍和0.29倍，100μM 6-BA处理下的相对表达量是对照组的2.08倍，达到了显著性差异。
在施用生长素100μM IAA的处理组中，芽生长相关基因CmBRC1、CmDRM1和独脚金内酯相关基因CmMAX1、CmSMXL6在处理组中较对照组CK的表达量均有不同程度的上调，抑制分枝基因CmBRC1表达量是对照组的1.86倍，而细胞分裂素合成酶基因CmIPT3则表达量下调，表明了IAA与SLs在侧芽生长起到协同作用，IAA促进了SLs信号传导。因此用IAA处理植株后促进了芽相关基因和独脚金内酯相关基因的表达，以此起到了抑制了侧枝生长的作用。
本研究中，施用100μM 6-BA的处理后，抑制分枝基因CmBRC1的表达量显著降低了，但SLs信号途径基因CmMAX1和CmSMXL6的相关表达量上调，说明SLs信号转导受6-BA的影响。施用独脚金内酯类似物GR24的处理后，抑制分枝基因CmBRC1的表达量较对照组CK的表达量上调了1.64倍，而CmDRM1、CmPIN1、CmTIR3和CmIPT3在处理组中较对照组CK的表达量均有不同程度的下调，其中CmPIN1的表达量明显下降，表明GR24降低了生长素运输能力，SLs与IAA协同控制植物的分枝。另外CmIPT3的相对表达量显著下降，表明SLs可通过反馈调节影响细胞分裂素的生物合成过程，从而起到抑制分枝的作用。以上结果表明，这三种激素除了通过影响关键的抑制分枝基因CmBRC1的表达来调控植物的分枝，还会相互影响它们之间的合成或运输等的相关基因，以此构成一个复杂的网络最终影响植物的表型。
4菊花CmSMXL6基因克隆和表达模式分析：
4.1试验材料：
菊花‘巴尔塔萨’由广州厚德农业科技有限公司白云基地所提供。在生长健壮的菊花上剪取大小一致的侧芽到穴盆中扦插生根，于10d后定植移栽到花盆中，用营养土和蛭石(2:1)混合培养，在长日照(16h光照/8h黑暗)条件下种植于基地大棚中，以定植后25d长势一致的菊花为试验材料。
4.2试验方法：
4.2.1总RNA提取并检测；
4.2.2反转录cDNA；
4.2.3基因克隆：
根据菊花基因组数据库(http://www.amwayabrc.com/zh-cn/index.html)中的基因组数据比对拟南芥和水稻D53/SMXL6同源基因，获得相似度较高的D53/SMXL6的基因全长序列，将其命名为CmSMXL6，利用Primer Premier 5.0设计合成基因全长扩增上、下游引物，将设计好的序列送到上海生物工程有限公司合成部合成。CmSMXL6基因克隆引物序列：
CmSMXL6-F：ATGCCTACGCCCGTAAACCTAG
CmSMXL6-R：TGTCATTATGACCTTATCAGGAAGGAG
用获得的cDNA为模板进行PCR扩增。
PCR反应体系：
2×Phanta Max Master Mix 25μL
Primer F(10μM)2μL
Primer R(10μM)2μL
cDNA/质粒2μL
RNase-free H2O To50μL
PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸3min，进行32个循环；72℃彻底延伸5min。
4.2.4基因表达分析：
为研究CmSMXL6在菊花不同组织中的表达模式，使用RNA提取试剂盒对定植生长25d后的菊花根、茎、叶、节和顶芽的总RNA进行提取，每个样品均做3个生物学重复，利用1％琼脂糖凝胶电泳和酶标仪检测其质量和完整性，利用反转录试剂盒合成cDNA。利用PrimerPremier 5.0设计定量引物(表格1)，以Actin作为内参基因。使用ChamQ Universal SYBRqPCR Master Mix(Vazyme，诺唯赞生物科技有限公司，南京)荧光定量试剂盒，在CFXConnectTMReal-Time System(Bio-Rad，美国)荧光定量PCR仪进行荧光定量实验，每个反应设置3次生物重复，荧光定量结果用相对定量法2-ΔΔCt法进行分析。
为了研究CmSMXL6在独脚金内酯激素中的响应机制，用独脚金内酯类似物GR24 20(10μM)喷施处理定植生长25d的菊花，分别在处理0h、1h、3h、6h、9h、12h取菊花的茎进行总RNA的提取，进行荧光定量实验方法同上。
4.2.5琼脂糖凝胶电泳胶及回收；
4.2.6质粒提取；
4.2.7大肠杆菌转化；
4.2.8农杆菌转化；
4.2.9TA克隆：
(1)连接：检测胶回收纯化后的PCR产物的浓度，在室温下按照以下反应体系连接进载体pCE2-TA/Blunt-Zero vector：
5×TA/Blunt-Zero Cloning Mix 1μL
PCR纯化产物1-4μL
ddH2O To5μL
用移液器轻轻吹打混匀，低速离心10s将液体收集于管底，在室温中静置5min，反应结束得到连接产物，将离心管放置冰上。
(2)将连接产物转化到大肠杆菌感受态DH5α中。
(3)阳性克隆鉴定：进行菌液PCR鉴定，用接种环挑取单菌落，将其置于装有3mL LB培养液的摇菌管中，在37℃/200rpm的恒温震荡培养箱中培养10h，使用进行Taq酶(2×TaqMaster Mix)进行PCR反应，PCR扩增程序同上，PCR体系如下：
2×Taq Master Mix 12.5μL
M13 Primer F(10μM)1μL
M13 Primer R(10μM)1μL
cDNA/质粒1μL
RNase-free H2O To25μL
4.2.10生物信息学分析：
利用ExPASy的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在线分析工具预测CmSMXL6蛋白的理化性质，用ProtScale网站预测该蛋白的亲水性/疏水性；利用SingnalP5.0 Server在线工具预测信号肽；利用TMHMM-2.0Server在线工具预测跨膜区；利用NCBI数据库的CDD(Conserved Domain Database)预测蛋白质保守结构域；利用NetPhos3.1 Server在线工具对CmSMXL6蛋白的磷酸化位点进行预测；利用SOPMA和SWISS-MODEL预测CmSMXL6蛋白质二级、三级结构。在NCBI数据库中获取不同物种的SMXL6蛋白质序列，利用MEGA-X软件分析并采用邻接法(neighbor-joining method，NJ)构建系统发育树，校验参数Bootstrap method值设为1000。
4.2.11烟草亚细胞定位：
1)载体构建：
选用带有融合绿色荧光蛋白GFP标签的pNC-Green-SubN载体作为定位表达载体。在CmSMXL6基因全长引物两端加带20bp的通用接头序列，设计新的构建载体引物：
pNC-CmSMXL6-F：AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTATGCCTACGCCCGTAAACCTAG
pNC-CmSMXL6-R：
GGTCTCAGCAGACCACAAGTTGTCATTATGACCTTATCAGGAAGGAG
(1)按照4.2.3的PCR反应体系，以含目的基因的质粒为模板，使用高保真酶进行PCR扩增，获得带有通用接头CmSMXL6基因全长序列的扩增产物。
(2)扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化后与表达载体进行连接，于PCR仪中50℃反应30min，载体连接反应体系：
PCR产物 20-80ng
NC系统表达载体 40-120ng
Nimble Mix 5μL
ddH2O To 10μL
(3)重组转化和菌落阳性PCR同TA克隆，将阳性克隆使用带有Kana(50mg/mL)抗性的LB液体培养基中过夜培养，菌液送至上海生工生物进行测序验证。测序验证无误后，将正确的菌液扩大培养后进行质粒提取，保存与-20℃备用。
2)烟草亚细胞定位：
将构建好的质粒转化到农杆菌感受态细胞中，在带有Kana(50mg/mL)和Rif(25mg/mL)抗性的YEB液体培养基中扩摇，在28℃/240rpm的摇床中摇菌至OD600为0.5-0.6，4000rpm离心收集菌液，并用MMA悬浮液(10mM MES，10mM MgCl2，10μM乙酰丁香酮)重悬农杆菌，将重悬液OD600调至0.8左右，在冰上放置3h。通过1mL注射器在提前暗培养3h的烟草叶背面缓慢注入重悬液，使其渗透进整个叶片，在黑暗条件下培养16h，随后再转到正常培养。转化后的48h-72h，撕下叶片下表皮细胞，利用DAPI染色，在荧光显微镜下观察细胞荧光信号。
4.3结果与分析：
4.3.1CmSMXL6基因的克隆：
根据菊花基因组数据得到的SMXL6同源基因信息，设计特异引物，以菊花‘巴尔塔萨’组织中提取RNA反转录得到cDNA为模板，通过PCR扩增出该基因全长序列。将扩增条带切胶回收后，链接到TOPO克隆载体并转化，对阳性菌株进行测序。测序结果可知，CmSMXL6基因全长为2823bp，如图11所示。
4.3.2CmSMXL6蛋白的理化性质分析：
利用ProtParam进行理化性质分析，分析结果显示，该蛋白由940个氨基酸组成(SEQ ID NO.8)，各类氨基酸的比例如图12。该蛋白共含14617个原子，氨基酸分子量为104.28kDa，理论等电点5.76。此蛋白的不稳定指数为40.44，说明此蛋白为不稳定性蛋白。利用ProtScal进一步分析CmSMXL6蛋白的亲水性/疏水性分析(图13)，疏水值最大为2.411(第643位氨基酸)，最小值位-2.989(第109位氨基酸)，蛋白的亲和性(GRAVY)的平均水平为-0.194，因此推测为亲水性蛋白。
4.3.3CmSMXL6蛋白的保守结构域分析：
利用NCBI数据库中Conserved Domains对CmSMXL6蛋白序列进行功能结构域分析。从图14可知，该蛋白含有P-loop NTPase超家族结构域。
4.3.4CmSMXL6蛋白跨膜区域与信号肽分析：
使用TMHMM2.0在线软件对CmSMXL6蛋白跨膜区域进行分析，分析结果如图15，分别为蛋白跨膜结构和信号肽预测，表明该蛋白不存在跨膜结构，为非跨膜蛋白。利用SignalP5.0在线软件对CmSMXL6蛋白进行信号肽的预测，分析结果如图16，表明氨基酸序列均不含有信号肽，为非分泌蛋白。
4.3.5CmSMXL6蛋白的磷酸化位点分析：
使用NetPhos3.1对CmSMXL6磷酸化位点分析，结果可知该蛋白存在个110磷酸化位点，丝氨酸(Ser)77个，苏氨酸(Thr)24个，酪氨酸(Tyr)9个(图17)。
4.3.6CmSMXL6蛋白的二级结构与三级结构分析：
通过在线软件SOPMA对CmSMXL6蛋白质的二级结构预测分析，结果如图18，蓝色：α-螺旋；紫色：无规则卷曲；红色：延伸片段；绿色：β-转角，图中显示该蛋白含有39.68％的α-螺旋(Alpha helix)，11.28％延伸链(Extended strand)，3.51％β-转角(Beta turn)，45.53％无规则卷曲(Random coil)。利用SWISS-MODEL对CmSMXL6蛋白进行同源建模，获得蛋白的三级结构模型如图19。
4.3.7构建CmSMXL6系统进化树分析：
使用MEGA X软件构建不同物种SMXL6蛋白的系统进化树。由图20可见，CmSMXL6与南瓜(Cucurbita moschata)与小果胡桃(Juglans microcarpa)最近，其次是向日葵(Helianthus annuus)番茄(Solanum lycopersicum)辣椒(Capsicum annuum)，和豌豆(Pisum sativum)的进化亲缘关系较远。
4.3.8CmSMXL6基因的表达模式分析：
4.3.8.1CmSMXL6基因的组织特异性表达分析：
为了探究CmSMXL6基因在菊花不同组织器官中的表达模式，用荧光定量PCR分析菊花的根、茎、叶、节和顶芽中CmSMXL6基因的表达量，结果如图21所示，R：根；S：茎；L：叶；N：节；TB：顶芽；不同小写字母表示CmSMXL6基因表达量在菊花不同组织间差异显著(P<0.05)。CmSMXL6基因在不同组织中均有表达，该基因在茎中的相对表达量最高，其次是茎的节，在顶芽中相对表达量最低，CmSMXL6在茎中表达量约是顶芽的19倍。与茎组织相比，根和叶中CmSMXL6的表达量均比较低。
4.3.8.2CmSMXL6在独脚金内酯激素处理下的表达分析：
对CmSMXL6基因在独脚金内酯类似物GR24处理下茎中表达量进行分析，结果发现CmSMXL6在处理后表达水平均上调，其中，在处理9h时表达量最高，为0h的16.86倍，随后表达量开始降低，在12h时，表达量降低为对照组的8.83倍(图22)。因此，对菊花进行外源独脚金内酯激素处理后，CmSMXL6基因会被诱导表达，表明CmSMXL6参与了SLs信号传导途径。
4.3.9CmSMXL6亚细胞定位：
通过农杆菌将构建好的载体瞬时转化烟草叶片下表皮细胞进行亚细胞定位，同时使用pNC-Green-SubN空载作为对照。结果显示，pNC-Green-CmSMXL6融合蛋白在烟草叶片下表皮细胞的细胞核上检测到了绿色荧光信号，说明CmSMXL6定位在细胞核中，如图23所示。
4.3.10小结：
克隆出的菊花基因CmSMXL6的cDNA长度为2820bp，编码940个氨基酸，分子量为104.28kDa，属于亲水性非分泌蛋白。生物信息学分析表明，CmSMXL6含有P-loop NTPase超家族结构域，系统进化分析表明CmSMXL6与南瓜同源蛋白亲缘关系最近。利用RT-qPCR对CmSMXL6在不同组织表达水平进行分析，结果显示，CmSMXL6在茎中表达量最高，在顶芽中表达量最低，并在叶片和根系也有少量表达。用独脚金内酯类似物GR24处理实验后，CmSMXL6基因在GR24处理后表达量上调，在9h表达量最高，表明CmSMXL6参与了SLs信号传导途径。亚细胞定位实验显示，CmSMXL6在细胞核中表达。
5菊花CmSMXL6基因功能初步研究：
5.1材料和方法：
5.1.1供试材料为拟南芥哥伦比亚野生型。
5.1.2载体构建：使用CmSMXL6基因全长作为构建表达载体的目的基因，选用pNC-Cam1304-MCS35S作为过表达载体，方法同上。
5.1.3拟南芥的遗传转化与筛选鉴定：
(1)花序浸染法转化拟南芥：
将编码菊花CmSMXL6基因的cDNA序列转入哥伦比亚生态型拟南芥中。步骤如下：
①在农杆菌感受态细胞中成功转化带有的CmSMXL6基因的质粒后，挑选取出单菌落在含有Kana(50mg/mL)和Rif(25mg/mL)抗性的5mL YEB液体培养基中，在28℃培养箱上培养1d，得到含有目的基因的种子液。
②在上述获得的种子液取2.5mL菌液转接到250mL的新鲜含有Kana和Rif的YEB液体培养基培养，摇至菌液OD600值至1.0时停止摇菌和备用。
③在室温25℃、4000rpm的离心机中离心15min，弃掉部分上清液收集菌体。加入同等体积的5％蔗糖水溶液，用移液器吹打重悬菌体，加入0.02％silwet-77，调整OD600值至1.0，待用。
④侵染前对拟南芥进行处理，将拟南芥上的种荚和已开花完全的花用剪刀剪掉，保留只露白的未开花的花蕾，菌液放置在磁力搅拌器上进行搅动，放入拟南芥花序浸泡2min，随后用吸水纸轻轻吸去残余的菌液。
⑤将侵染完成的拟南芥在黑暗条件下倒置培养2d，随后继续在植物培养箱中培养至种子成熟，用收种袋收集拟南芥的果荚种子。
(2)拟南芥纯合植株的筛选：
T1代的筛选：在侵染后的拟南芥果荚上收取T1代种子。将T1代的种子用70％乙醇消毒1min，然后用1mL5％的次氯酸钠溶液分批次消毒10min。种子经消毒后用无菌水重悬，用1mL的移液枪吸取种子点播于含有50mg/L潮霉素1/2MS固体培养基上。将培养基封口后放置在4℃冰箱2d进行种子的春化，随后移入植物培养箱中进行培养。
T2代的筛选：在已通过鉴定的含有目的基因T1代植株中进行分株收种，将收获的T2代种子跟T1代种子筛选方法相同，在含50mg/L潮霉素1/2MS固体培养基上培养，得到的种子在平板中阳性苗和阴性苗的比例为3：1，随后将阳性苗移栽到营养土中，然后培养箱中继续培养，待转基因拟南芥种子成熟变黄后，分株收种，即获得T3代种子。具有潮霉素抗性的阳性植株可以在培养基中生长正常，待幼苗长至3～4片真叶时，将筛选到的绿色幼苗置于营养土中继续生长。在温室长至4周后，取莲座叶提取野生型和阳性苗的总RNA，并反转录获得cDNA，再进行PCR鉴定以进一步确定基因转入拟南芥中，筛选后每个阳性植株单独收种，单独播种。将提取T2代阳性苗的RNA反转录为cDNA，稀释3倍作为模板使用。用拟南芥Actin基因作为内参，再用CmSMXL6的特异引物对阳性拟南芥株系进行qRT-PCR检测转基因拟南芥株系的CmSMXL6表达情况。另外对CmSMXL6转基因拟南芥株系中分枝相关基因AtBRC1、AtMAX1、AtMAX2、AtMAX3、AtMAX4的表达量进行检测，用Primer5设计其特异性引物，分析CmSMXL6的表达与其他分枝相关基因表达量的关系。
荧光定量PCR分析的引物序列：
q-AtBRC1-F：CAGCAGAACGGACAGGCACAG
q-AtBRC1-R：ACAACTCTTTGGCGACATCTAGCG
q-AtMAX1-F：GGGACATGGGTTTGGTTAGCACTAG
q-AtMAX1-R：ACCGAATGGGATGAAAGCGTATGG
q-AtMAX2-F：TGAACACTGTGGTGGTTTCCTTGAG
q-AtMAX2-R：CGTCAGCATAGCGGAGAAGCAC
q-AtMAX3-F：TGAAATGGGCTGGGCGATTGC
q-AtMAX3-R：CGACGGTATCCAACGATCCAGATTC
q-AtMAX4-F：TCTTCGACGGCTACTCCACACTC
q-AtMAX4-R：CCTATTGTGTTTCTTGGCGGCTTTG
q-CmSMXL6-F：TGATTGGTTATGCGGAAAG
q-CmSMXL6-R：GAAGAACATGAAGATCCCAC
AtActin-F：CGTGACCTTACTGATTAC
AtActin-R：TTCTCCTTGATGTCTCTT
5.2结果与分析：
5.2.1转基因拟南芥的获得：
利用农杆菌介导的花粉管通道法侵染拟南芥尚未绽放的花序，将35S::CmSMXL6基因转化拟南芥野生型获得T1代种子。用含有30μg/mL潮霉素的1/2MS培养基筛选T1代种子，得到含有抗性拟南芥株系，移栽培养后，采用CTAB法对拟南芥莲座叶片进行DNA的提取，使用CmSMXL6基因的特异性引物和抗潮霉素基因的特异性引物进行PCR扩增验证，筛选拟南芥的阳性株系，结果分别检测到L1、L2、L3、L5、L6等T1代阳性株系，图24为：潮霉素基因片段检测，图25为CmSMXL6基因片段检测，L1～L9指不同的CmSMXL6转基因株系，WT为拟南芥野生型。
5.2.2拟南芥阳性植株表型的观测：
选取L1和L5株系进行分枝表型的观察，分别选取15株生长35d的野生型拟南芥和CmSMXL6过表达拟南芥L1和L5株系，对其莲座叶数目、拟南芥一级、二级分枝数目进行统计。结果发现如图26-29所示，过表达CmSMXL6增加了拟南芥一级和二级的分枝数目，L5株系的拟南芥莲座叶数目有所增加，但差异不明显。在拟南芥一级分枝数目的统计中可以看出，拟南芥的过表达株系在一级分枝数5个以上的拟南芥数明显增加。另外，在拟南芥主枝的二级侧枝数目的统计中，过表达植株的二级分枝数目同样增多，与野生型相比，二级分枝数目为二的拟南芥数明显减少，二级分枝数目大于3个的数量明显增加。因此，以上结果表明CmSMXL6参与植物分枝的调控过程。
5.2.3转基因拟南芥中分枝基因相对表达量：
为了更深入研究CMSMXL6基因对独脚金内酯信号途径的响应和分枝生长方面的调控机制，检测CmSMXL6转基因株系中SLs信号途径和分枝生长的相关基因的表达情况。如图30所示，抑制分枝的基因AtMAX1、AtMAX2、AtMAX3和AtBRC1在CmSMXL6转基因株系中相对表达量均有不同程度的下调，其中AtMAX3表达量下调最显著，是野生型表达量的0.3～0.4倍；AtMAX1的表达量是野生型的0.3～0.7倍；AtMAX2的表达量是野生型的0.4～0.9倍；AtBRC1的表达量是野生型的0.7～0.8倍。但独脚金内酯信号途径中的AtMAX4基因在CmSMXL6转基因株系中表达量升高，AtMAX4的表达量是野生型表达量的3.8～4.8倍。因此，CmSMXL6转基因株系的多分枝表型可能是与抑制分枝基因和独脚金内酯信号途径相关基因的表达有关。
5.2.4小结：
对CmSMXL6转基因拟南芥植株的分枝情况进行量化统计，发现在拟南芥异源过表达CmSMXL6后，转基因拟南芥植株的一级和二级分枝数与野生型相比均有所增加。对独脚金内酯合成途径和抑制分枝相关基因的表达量进行检测，发现CmSMXL6转基因植株中AtBRC1的相对表达量与野生型相比也有不同程度的下调，BRC基因属于CYC1类支，是TCP基因家族的一个亚簇，在拟南芥中的BRC1是植物的分枝抑制基因，AtBRC1相对表达量下调说明其受CmSMXL6的调控，从而抑制植物分枝。另外，独脚金内酯合成基因AtMAX1、AtMAX2、AtMAX3在CmSMXL6转基因拟南芥植株中的相对表达量均有不同程度的下调，这与拟南芥多分枝表型的结果相一致，说明CmSMXL6能通过影响独脚金内酯合成MAX1、MAX2和MAX3基因，正向调控植物分枝。但本研究中还发现AtMAX4的相对表达量上调，这与在豌豆中的研究结果不一致，由于SMXL6在SLs信号途径中的双重抑制子，能抑制下游转录因子同时能抑制自身启动子，会形成维持SLs通路稳态的负反馈调控体系，因此推测其可能是植物体内SLs内源激素含量变化所导致的。有研究发现在水稻d10突变体中用GR24能恢复其增加分枝的表型，但SLs没有产生可测量的量，所以该结果的影响因素可能涉及对SLs的感知。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种植物分枝调节剂的应用，其特征在于，将植物分枝调节剂应用于对植物分枝抑制的机理研究；
所述植物分枝调节剂通过调控CmSMXL6的表达量上升，从而对植物分枝进行调节；所述CmSMXL6 的基因序列如 SEQ ID NO.6 所示；所述植物分枝调节剂为浓度 9-11μM 的GR24；
所述植物为菊花。
2. 如权利要求 1所述的植物分枝调节剂的应用，其特征在于，
所述植物分枝调节剂为浓度 9-11μM 的 GR24，每 3d 喷施植物叶片1次，总处理时间≤8d。
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