CN110760522B

CN110760522B - Ak209基因及编码蛋白与抗逆增产的应用

Info

Publication number: CN110760522B
Application number: CN201910913680.9A
Authority: CN
Inventors: 孔德艳; 刘灶长; 陈守俊; 周立国; 罗利军
Original assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Current assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2039-09-25
Also published as: CN110760522A

Abstract

本发明涉及水稻抗逆增产相关基因AK209及其编码蛋白与应用及获取方法，AK209基因序列为如下之一：如SEQ ID NO:1中所示DNA序列，或与SEQ ID NO:1至少90％同源DNA序列；或与功能相对于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。或如SEQ ID NO:2中所示DNA序列；或与SEQ ID NO:2至少90％同源的DNA序列；与功能相对于SEQ ID NO:2所示序列的亚片段。AK209编码一个MYB转录因子，受脱水、PEG、高盐、ABA、H₂O₂的诱导表达，超表达AK209基因可提高水稻苗期抵抗渗透及高盐、抗氧化的能力，本发明的水稻基因对逆境产生明显响应。同时超表达AK209基因可以增加水稻的产量。因而本基因可应用于植物的抗逆增产育种，在提高植物抗逆性的同时增加产量。

Description

AK209基因及编码蛋白与抗逆增产的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及一种新的水稻抗逆相关基因AK209及其编码蛋白与应用，本发明还提供了一种获取AK209基因的方法，利用此基因可培育抗旱能力增强且产量增加的转基因植物。

背景技术

植物的生长受到众多环境因素的影响，其中一些不利的非生物胁迫(包括干旱、盐害、低温、高温等)对作物的产量造成了极大的影响，因此，利用基因工程技术，将一些抗逆增产相关基因转入到优良作物品种中，培育既高产又抗逆且优质的农作物新品种是应对水资源短缺、保障粮食安全的有效途径之一。深入发掘并研究植物节水抗旱基因，是解析植物抗旱机制的基础工作，为培育节水抗旱作物提供理论依据和基因资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的水稻抗逆增产相关基因AK209，可响应逆境胁迫，且增加产量。

本发明的另一目的是提供利用水稻基因AK209培育抗逆增产的转基因植物的方法。

本发明从水稻中分离克隆的一段完整编码区段的DNA片段，对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明，它属于一个MYB家族转录因子，命名为AK209。

本发明分离和应用一种包含AK209基因的DNA片段，该基因能响应脱水、PEG、高盐、ABA、H₂O₂，发生表达变化。

本发明所述AK209基因DNA序列为序列表SEQ ID NO:1所示，或者与SEQ ID NO:1同源度达90％的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。

本发明所述AK209基因DNA序列还可为序列表SEQ ID NO:2所示，或者与SEQ IDNO:2同源度达90％的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。

一种抗逆性水稻，其包含有上述AK209基因编码的蛋白。

所述蛋白的氨基酸序列还包含下列之一：

(a)所述氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:3所示；

(b)所述氨基酸序列为SEQ ID NO:3序列的同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体或诱导突变体。

AK209基因编码的蛋白还包含上述的AK209基因在高或低的严谨条件下杂交的编码DNA。

本发明获得AK209基因的方法如下：(1)、采用已克隆的AK209基因为探针，从cDNA文库和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。(2)、采用PCR(polymerase chainreaction)技术，从基因组，mRNA和cDNA中扩增得到AK209基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含AK209基因序列，将AK209基因序列与引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得抗逆增产的转基因植株。

AK209基因在构建到表达载体上时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导启动子。

AK209基因在构建到表达载体上时，可以使用增强子AK209基因需要与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。

本发明的优选实施方案是，还提供了包含AK209基因的重组载体。携带AK209基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。

包含本发明中的AK209基因的表达载体的转化宿主是包括水稻在内的多种植物，培育抗旱增产的植物品种。

本发明还提供一种AK209基因在水稻抗逆增产的应用，水稻抗逆性的应用中的AK209基因克隆自水稻第4染色体的抗旱QTL区段，在脱水、PEG、高盐、ABA、H₂O₂处理下的基因可响应逆境胁迫及外源激素的表达。其中，超表达该基因的转基因水稻表现出显著增强的抵抗干旱胁迫且增产的能力。

本发明的技术效果是，水稻基因对逆境产生明显响应，同时能增加产量，可应用于植物抗逆及增产育种。

附图说明

图1为本发明的AK209基因在苗期脱水、PEG、高盐、ABA、H₂O₂处理下的表达水平。

图2为本发明的AK209基因的超表达转基因水稻的苗期甘露醇、NaCl处理分析。

图3为本发明的AK209基因超表达转基因水稻的成株期干旱胁迫处理。

图4为本发明的AK209增强水稻苗期抗氧化能力的对照图。

图5为过表达AK209增加水稻与野生型在正常生长条件下的产量对照图。

图6为本发明中的过表达AK209增加水稻在干旱胁迫下的产量对照图

具体实施方式

下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

水稻AK209基因的克隆

1.幼苗培育

将旱稻品种IRAT109置于30℃萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。

2.RNA提取与第一链cDNA合成

RNA的提取：所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1mL TRNzol-A⁺试剂的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加0.2mL氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min；后在4℃，12000rpm离心10min后，上清液移至新的2mL EP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100μL RNase-free ddH₂O溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

反转录之前需用DNaseI消化所提取样品，反应体系如下：

试剂名称	使用量(μL)
		RNA	5(总量约1μg)
10×DNaseI Buffer	1
		DNaseI(5U/μL)	0.2
DEPC H<sub>2</sub>O	Up to 10μL

37℃反应15min后，加入0.25μl 0.1M EDTA(保证终浓度>2mM)，70℃温育10min终止反应，短暂离心后置于冰上备用。

第一链cDNA的合成参照Promega反转录系统A3500操作手册，具体步骤如下：

(1)DNaseI消化过的样品中依次加入下列各试剂配制20μL的反应体系：

(2)将上反应体系于42℃温育15min；

(3)然后95℃加热5min，使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合；

(4)4℃或冰上放置5min。

制备好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃备用。

3.基因的克隆

从水稻第4染色体的抗旱QTL区段内定位到候选基因LOC_Os04g49450，对水稻基因组及全长基因数据库进行BLAST搜索，获得其对应的全长cDNA。根据预测信息设计上下游引物F1:5’-ATGGCGCGTTTTCAGGAAACCAAGG-3’和R1:5’-TTATAAGCACAGCCTCGTCATCTCT-3’，从cDNA中直接克隆获得了AK209基因，回收，连接到pEASY-Blunt Simple载体上，用M13F或M13R作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI3730测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行测序，测序结果同SEQ ID NO:2比对确认，SEQ ID NO:2为构建超表达载体所用序列。其中SEQ ID NO:1为其DNA序列，SEQ ID NO:2为该基因的CDS序列，CDS翻译即得该基因的氨基酸序列SEQ ID NO:3。

实施例2

水稻基因AK209在逆境胁迫及激素处理下的表达分析

1.逆境胁迫及激素处理

选取饱满的日本晴种子，蒸馏水清洗，3％NaClO消毒10min后清洗干净，30℃催芽，种子露白后转放到发芽盒内水培生长，三叶期后施加营养液(国际水稻所标准营养液)。在28℃，16h/8h的光照培养室中培养，至四叶期时进行各种逆境和激素处理：脱水、15％PEG6000、150mM NaCl、10％H₂O₂和100μM脱落酸(ABA)。在处理前、处理后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h对处理样品取样。所有处理和取样过程都是在持续光照的条件下进行。

2.RNA提取与第一链cDNA合成

同实施例1。

3.定量PCR分析

基因表达的定量分析使用Takara公司的

Premix Ex Taq^TM(Perfect RealTime)试剂盒和Bio-Rad CFX96定量PCR仪进行。根据AK209全长cDNA序列设计定量引物。以水稻持家基因actin(GenBank accession No.AY212324)为参照基因，根据其cDNA序列设计引物。所用基因定量前引物为F2:5’-ATGGACATGATGGACGAAGC-3’。

基因定量后引物R2:5’-GCCTATGTGCTCTTGGATGC-3’，Actin F:5’-CTTCCTCATGCCATCCTGC-3’，Actin R:5’-GCAAGCTTCTCCTTGATGTCC-3’。20μL反应体系的配制：

试剂名称	使用量(μL)
		SYBR Premix Ex Taq<sup>TM</sup>(2x)	10
Prime F(2μM)	2
		Prime R(2μM)	2
cDNA	0.5
		ddH<sub>2</sub>O	5.5

反应条件为：95℃30s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，并增设DissociationStage。设定在每个循环中60℃31s时收集数据，其它具体操作按仪器使用说明书进行。计算目的基因与参照基因的平均CT值以及△CT值，利用2^-ΔΔCT法进行结果分析，最后将数据导入GraphPad Prism5.0做出目的基因的相对表达量柱状图。

定量分析结果显示，如图1所示，该基因能够受到脱水、PEG、高盐、H₂O₂、ABA的诱导表达，因而该基因在逆境应答反应中可能起着重要的作用。

实施例3

水稻基因AK209超量表达转化水稻

1.利用GATEWAY重组克隆技术构建含AK209基因的超量表达载体：

以实施例1中已获得含有旱稻IRAT109的AK209基因的pEASY-BluntSimple载体为模板，用前引物F3:5’-AAAAAGCAGGCTATGGCGCGTTTTCAGGAAACCAAGG-3’，后引物R3:5’-AGAAAGCTGGGT TTATAAGCACAGCCTCGTCATCTCT-3’进行第一轮PCR扩增。再利用通用引物attB1adapter:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’，attB2adapter:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’进行第二轮PCR扩增，扩增产物经回收纯化后，通过BP反应，将扩增产物片断克隆到入门载体pDONR207，筛选阳性克隆，通过LR反应，将目的基因重组克隆到GATEWAY超表达载体pCB4004(该载体是在pCB2004基础上，将除草剂抗性基因替换为潮霉素抗性基因改造而来，命名为pCB4004)。具体过程如下：

(1)第一轮PCR扩增

20μl反应体系：

各反应成分	用量(μL)
		ddH<sub>2</sub>O	13.8
10×buffer	2
		dNTPs	1
Prime F(10μM)	1
		Prime R(10μM)	1
质粒	1
		Taq	0.2

扩增程序：

(2)第二轮PCR扩增

取上述PCR产物10uL作为模板，加入到下面PCR配置的40uL反应体系。

紧接着严格按照下面的循环来进行PCR扩增：

然后设置下一步的PCR程序。

最后取5ul电泳检测PCR质量。

(3)PCR产物的回收

采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化回收。

(4)BP重组反应

BP反应的目的在于将含有attB接头的PCR产物重组到含有attP的供体载体上，以产生入门克隆。重组反应可在室温配制混匀，0.5mL的离心管中进行。反应体系如：

25℃温浴16h左右，随后将BP反应液转化大肠杆菌感受态细胞。重组大肠杆菌需在含庆大霉素平板上生长。接着挑取单菌落以进行PCR验证，最后抽提质粒。

(5)LR重组反应

重组反应可在室温配制，0.5mL的离心管中进行。反应体系如下：

25℃温浴16h左右，然后将反应液转化大肠杆菌感受态细胞。转化完成的大肠杆菌液涂布在含有卡那霉素的平板上生长。接着挑取单菌落，进行PCR验证，然后送测序，测序结果与该基因cDNA序列比对以确认序列正确与否，最后提取质粒，即可转化农杆菌EHA105。

2.农杆菌转化

根癌农杆菌(EHA105)感受态细胞的制备：

根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD600＝0.5时，4℃离心收集菌体，用500μL、0.1mol/L冰浴CaCl₂重悬，冰浴30min后离心，去上清，用100μL，0.1mol/L冰CaC1₂重悬后，于4℃保存。

农杆菌转化(冻融法)：

(1)向感受态农杆菌(100μL)中加入5μL植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，冰水浴30min后，于液氮中速冻冷激2min；

(2)取出，加入400～800μL YEP培养液(含卡那霉素，Kan)；28℃，200r/min振荡培养3-5h；

(3)室温离心(5000r/min，5min)，保留100μL上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含Kan)上，28℃倒置培养2天直至长出合适大小的菌落。

(4)挑取单克隆进行PCR检测，得到阳性菌株。

3.愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20min，再用75％的乙醇消毒1min，然后用1.5％有效浓度的次氯酸钠溶液振荡消毒20min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。

愈伤诱导培养基：采用表1的诱导培养基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

4.继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。

继代培养基：采用表1的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2mL2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

5.农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌挑，取阳性单菌落，在1mL含抗生素的农杆菌培养液中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50mL含抗生素的农杆菌培养液中，28℃培养至OD600＝0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30min至OD600＝0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5d。

悬浮培养液：采用表1的悬浮培养液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成100mL溶液，调pH至5.4，分成两瓶(每瓶50mL)，高温高压灭菌。使用之前加入1mL 50％的葡萄糖和100μL AS(100mM)。

共培养培养基：采用表1的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.0mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20mL 50％的葡萄糖和1mL AS(100mM)。

6.筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。

筛选培养基：采用表2的筛选培养基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1mL Hn和1mL Cn(100ppm)。

7.分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽(4-6周)。

分化培养基：采用表2的分化培养基，加入2.0mg/L 6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/LNAA、0.2mg/L IAA、1.0g水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

8.生根培养：待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16h/8h光暗培养，诱导生根。

生根培养基：采用表2的生根培养基，加入30g蔗糖，配成1L溶液，调pH值至5.8，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

9.转化植株培养：待根系发达后，打开试管口，加入无菌水炼苗2-3d后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。

表1基本培养基成分1

表2基本培养基成分2

实施例4转基因水稻的苗期胁迫处理

水稻苗生长条件参照实施例2。

4.1过表达AK209增强水稻苗期干旱胁迫的抗性。

已获得AK209过表达植株(AK209-4和AK209-17)，苗期20％PEG6000胁迫处理可以看出2个过表达株系抗旱明显好于野生型植株(图2A)。解除PEG处理让其正常生长10天，2个过表达株系存活率分别为71％和61％，而野生型植株仅为23％(图2B)。

4.2过表达AK209增强水稻苗期耐盐性。

已获得AK209过表达植株，苗期150mM NaCl胁迫处理3天可见野生型对照植株(WT)已经萎蔫，而过表达株系生长良好。解除NaCl胁迫后正常生长3天，对照植株枯死，过表达株系则有部分植株存活(图3)。说明过表达AK209一定程度上增强了水稻的耐盐性。

4.3过表达AK209增强水稻苗期抗氧化能力。

已获得AK209过表达植株，苗期30％H₂O₂胁迫处理3天可见野生型对照(WT)植株已经萎蔫，而过表达株系生长良好。说明过表AK209也赋予了水稻一定的抗氧化能力(图4)。

实施例5过表达AK209增加水稻在正常生长条件下的产量。

将AK209的2个过表达株系AK209-4、AK209-17以及野生型对照日本晴(WT)种在大田，待种子成熟后，对各植株的株高、单穗粒数、单穗产量、一次枝梗、二次枝梗以及单株产量进行统计。同时将过表达株系AK209-4和AK209-17以及野生型对照日本晴分别种3个小区，每个小区15行，每行6株。长3.62m，宽1.1m，为3.982m²，0.005973亩。待种子成熟后，对每个小区测产。从考种数据来看，过表达株系AK209-4和AK209-17在株高、单穗粒数、单穗产量、一次枝梗、二次枝梗以及单株产量都高于野生型对照(图5A)。同时小区测产结果来看，2个过表达株系AK209-4和AK209-17分别较野生型对照增产15.06％及21.39％(图5B)。

实施例6

过表达AK209增加水稻在干旱胁迫下的产量。

将AK209的2个过表达株系AK209-4、AK209-17以及野生型对照日本晴(WT)分别种在转基因水田以及转基因抗旱鉴定大棚。种在转基因水田的材料全生育期都是有水的生长条件，而种在转基因抗旱鉴定大棚的材料前期正常有水生长，幼穗分化时干旱胁迫处理，干旱胁迫2周左右，复水生长。待种子成熟后，分别对水旱田种植材料考种。从考种结果来看，种在转基因水田的2个过表达株系AK209-4、AK209-17单株产量较对照分别增加15.2％及17.9％(图6A)；而种在抗旱鉴定大棚过表达株系AK209-4、AK209-17单株产量较对照分别增加41.7％及38.9％(图6B)。可见过表达AK209增加水稻在干旱胁迫下的产量。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易的掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。

序列表

<110> 上海市农业生物基因中心

<120> AK209基因及编码蛋白与抗逆增产的应用

<130> AK209

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2825

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atttcccctt cctgccttgc ctcctcgtct ccttctctgc tgctctccaa gctcttcctg 60

cttccatcag gttgtctcga gaaagattgg agtttttggt ggtttgggtt gtgcggttct 120

tgcttttgtt ggcgcaagcg catggctggt tctgggacat agtgagctga gatagagttc 180

ttgtgttcgg tggagtttgg ctttggtgaa tcttcgattc aagtctggag atggcgcgtt 240

ttcaggtaat gaatccttct atcagtctat ctggtggcaa attttgttct ttggagtcca 300

cttttcatgg cagaaagatt ggattttttt cccccaataa gatgccacag taataaatct 360

tttgttggaa aaagggagca aagcaagcag ctgctattct catgttgctg aaattgactt 420

ctccatctct cttttgtagg aaaccaaggc gaggaatgat caaggacctg ttgctgatca 480

tgttgggcac caaaacctca tggaaaacct cacagatcct ctggattcca gtggcatgga 540

catgatggac gaagcgcgaa ttcctaaggt aaatcctcct ccttgcaaat cacagcaaaa 600

gggggcaaat ttcgtgcagt taagatcttg taacaccaag ctcacgctgt gggtcttgcc 660

ttgcaggcgc ggaagccata cacgataacg aagcaaaggg agaaatggac cgaggacgaa 720

cataagctgt tcttggaagc cctgcagctc catggccgag cctggcgacg catccaaggt 780

actaatttta ccgctgcaag aagctgcaac ggtgaagcac agtttctggt ttggtaagaa 840

ttttactgac aaaggatacc tcgctccggt tgcagagcac ataggcacca agactgccgt 900

gcagatcagg agccacgcac agaagttctt ctccaaggtc tcacagcctt ctcgtgcaca 960

aaaaattccc taaatgactt gaaaaacctc catggattgt gttgcttgca aggtgatgta 1020

agttgctcaa tcatggagag caggctgctt tgcaatccat gctgccacac tcgagaccat 1080

gtttcctgac cgttatctgc tttgcactcc ggctgcaggt catcaaagaa tcatctgggg 1140

acaattgcaa cagcttgggt gctgcatcat caattcagat tcccccgccg cggccgaagc 1200

gtaagcctgt tcatccgtac ccacgcaatc tagggagcac agccagcaag aacgtccctg 1260

cactgaaaca gctagagaag cctcagctgc aggtgcagtc tctctacgac caggacaatg 1320

ggtcgccgac gtcagtgtta acagtaccac agatacgggc tgatacactg ggaagtgaga 1380

gtggtgggtc gccaacctcg acgattgata ttgaagagag atgtcctaca ccaagcatag 1440

caactgctga gttagctatg gagttgcctc ctacaaatga cgaggtatat tcttaggaga 1500

caaaatatag tatcctctgc aaggcatatg ttctttatat cgtgcaggaa tatataagct 1560

atttgctcaa gtcaataatt cttcaccttg tcagcatggt ctttaatttt atatatgttg 1620

gaacttgaaa ttctggttat gccttgatgt atccttgcac aacatgatat atagttggtg 1680

ccttctaaat cctgaatcct gatagtaaat atgcatttca ggaggtcaag ggcaatggcg 1740

atcatgaaga agttacatgt gacagatcag gagttccagt ccttaggcta tttggcaaga 1800

gggttatggt gaatgattta catcagatgt cagcccctga tgccgggaac ctgcaaactg 1860

tggcagacat ggaagtggac gcttcagctg agacaccaac tagtggaact gggaaattct 1920

cttcccatgg tgcagcagaa gcaaatacat ggaacccatg gctgactaac acacagcagt 1980

ttctgtatta tcttcctaac ggacaaattt tctccgtgca ttctgctctc ccatgcttca 2040

cctaccataa tgagggtgtt acttgcaccc agttttcaaa cccacaggtg gtagcctcag 2100

atcaacagca tcaacaccaa acttctgaag ctgtagatta caagggtata cagagggaag 2160

gatcttggac ggagtcaaat acatcctcaa gcagtgtgcc tgaaacagca actcataatt 2220

cagagactac agaatcatat agaaacggaa acagaaacga agatgaaatg gtaccttctc 2280

cagattcaag aaaatgtgtg agcccaggtt ccaactgcag gcgaggcttt gtgccgtaca 2340

agagatgtgt tgctgatagt gaggcgctgc tgaagtcaca ggcgcctcag gaggaggcag 2400

acggagagat gacgaggctg tgcttataaa tttttggagc ctcgtagatc actgcaacta 2460

tagatgcttg ctactaatat tttgttcaca gatgagtagg aactgatgta ctgcaggagg 2520

ggctgctttc ctgttacaag aggcagattg aaaccgcgtt agtactccac aaaacaggga 2580

gtggccgtgg ttcttgtctg gccatgtaca gttcaaatat tctatgtttc cattttcctc 2640

gtcgtgtgtt tgtaatttcg ctcccattgc gggagcgttc agaggtcaat ggctgtcatg 2700

caatgacaag tattttgata gagttgtaga agggttgtac tgatgtaaat tatacagtaa 2760

cttattatct gtaagacaat aacaggcgag ctaaagaaaa caacgttgga aagctttgtt 2820

cagta 2825

<210> 2

<211> 1392

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atggcgcgtt ttcaggaaac caaggcgagg aatgatcaag gacctgttgc tgatcatgtt 60

gggcaccaaa acctcatgga aaacctcaca gatcctctgg attccagtgg catggacatg 120

atggacgaag cgcgaattcc taaggcgcgg aagccataca cgataacgaa gcaaagggag 180

aaatggaccg aggacgaaca taagctgttc ttggaagccc tgcagctcca tggccgagcc 240

tggcgacgca tccaagagca cataggcacc aagactgccg tgcagatcag gagccacgca 300

cagaagttct tctccaaggt catcaaagaa tcatctgggg acaattgcaa cagcttgggt 360

gctgcatcat caattcagat tcccccgccg cggccgaagc gtaagcctgt tcatccgtac 420

ccacgcaatc tagggagcac agccagcaag aacgtccctg cactgaaaca gctagagaag 480

cctcagctgc aggtgcagtc tctctacgac caggacaatg ggtcgccgac gtcagtgtta 540

acagtaccac agatacgggc tgatacactg ggaagtgaga gtggtgggtc gccaacctcg 600

acgattgata ttgaagagag atgtcctaca ccaagcatag caactgctga gttagctatg 660

gagttgcctc ctacaaatga cgaggaggtc aagggcaatg gcgatcatga agaagttaca 720

tgtgacagat caggagttcc agtccttagg ctatttggca agagggttat ggtgaatgat 780

ttacatcaga tgtcagcccc tgatgccggg aacctgcaaa ctgtggcaga catggaagtg 840

gacgcttcag ctgagacacc aactagtgga actgggaaat tctcttccca tggtgcagca 900

gaagcaaata catggaaccc atggctgact aacacacagc agtttctgta ttatcttcct 960

aacggacaaa ttttctccgt gcattctgct ctcccatgct tcacctacca taatgagggt 1020

gttacttgca cccagttttc aaacccacag gtggtagcct cagatcaaca gcatcaacac 1080

caaacttctg aagctgtaga ttacaagggt atacagaggg aaggatcttg gacggagtca 1140

aatacatcct caagcagtgt gcctgaaaca gcaactcata attcagagac tacagaatca 1200

tatagaaacg gaaacagaaa cgaagatgaa atggtacctt ctccagattc aagaaaatgt 1260

gtgagcccag gttccaactg caggcgaggc tttgtgccgt acaagagatg tgttgctgat 1320

agtgaggcgc tgctgaagtc acaggcgcct caggaggagg cagacggaga gatgacgagg 1380

ctgtgcttat aa 1392

<210> 3

<211> 463

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 3

Met Ala Arg Phe Gln Glu Thr Lys Ala Arg Asn Asp Gln Gly Pro Val

1 5 10 15

Ala Asp His Val Gly His Gln Asn Leu Met Glu Asn Leu Thr Asp Pro

20 25 30

Leu Asp Ser Ser Gly Met Asp Met Met Asp Glu Ala Arg Ile Pro Lys

35 40 45

Ala Arg Lys Pro Tyr Thr Ile Thr Lys Gln Arg Glu Lys Trp Thr Glu

50 55 60

Asp Glu His Lys Leu Phe Leu Glu Ala Leu Gln Leu His Gly Arg Ala

65 70 75 80

Trp Arg Arg Ile Gln Glu His Ile Gly Thr Lys Thr Ala Val Gln Ile

85 90 95

Arg Ser His Ala Gln Lys Phe Phe Ser Lys Val Ile Lys Glu Ser Ser

100 105 110

Gly Asp Asn Cys Asn Ser Leu Gly Ala Ala Ser Ser Ile Gln Ile Pro

115 120 125

Pro Pro Arg Pro Lys Arg Lys Pro Val His Pro Tyr Pro Arg Asn Leu

130 135 140

Gly Ser Thr Ala Ser Lys Asn Val Pro Ala Leu Lys Gln Leu Glu Lys

145 150 155 160

Pro Gln Leu Gln Val Gln Ser Leu Tyr Asp Gln Asp Asn Gly Ser Pro

165 170 175

Thr Ser Val Leu Thr Val Pro Gln Ile Arg Ala Asp Thr Leu Gly Ser

180 185 190

Glu Ser Gly Gly Ser Pro Thr Ser Thr Ile Asp Ile Glu Glu Arg Cys

195 200 205

Pro Thr Pro Ser Ile Ala Thr Ala Glu Leu Ala Met Glu Leu Pro Pro

210 215 220

Thr Asn Asp Glu Glu Val Lys Gly Asn Gly Asp His Glu Glu Val Thr

225 230 235 240

Cys Asp Arg Ser Gly Val Pro Val Leu Arg Leu Phe Gly Lys Arg Val

245 250 255

Met Val Asn Asp Leu His Gln Met Ser Ala Pro Asp Ala Gly Asn Leu

260 265 270

Gln Thr Val Ala Asp Met Glu Val Asp Ala Ser Ala Glu Thr Pro Thr

275 280 285

Ser Gly Thr Gly Lys Phe Ser Ser His Gly Ala Ala Glu Ala Asn Thr

290 295 300

Trp Asn Pro Trp Leu Thr Asn Thr Gln Gln Phe Leu Tyr Tyr Leu Pro

305 310 315 320

Asn Gly Gln Ile Phe Ser Val His Ser Ala Leu Pro Cys Phe Thr Tyr

325 330 335

His Asn Glu Gly Val Thr Cys Thr Gln Phe Ser Asn Pro Gln Val Val

340 345 350

Ala Ser Asp Gln Gln His Gln His Gln Thr Ser Glu Ala Val Asp Tyr

355 360 365

Lys Gly Ile Gln Arg Glu Gly Ser Trp Thr Glu Ser Asn Thr Ser Ser

370 375 380

Ser Ser Val Pro Glu Thr Ala Thr His Asn Ser Glu Thr Thr Glu Ser

385 390 395 400

Tyr Arg Asn Gly Asn Arg Asn Glu Asp Glu Met Val Pro Ser Pro Asp

405 410 415

Ser Arg Lys Cys Val Ser Pro Gly Ser Asn Cys Arg Arg Gly Phe Val

420 425 430

Pro Tyr Lys Arg Cys Val Ala Asp Ser Glu Ala Leu Leu Lys Ser Gln

435 440 445

Ala Pro Gln Glu Glu Ala Asp Gly Glu Met Thr Arg Leu Cys Leu

450 455 460

Claims

1.一种AK209基因在水稻抗逆性的应用，其特征在于，所述AK209基因序列如SEQ IDNO:1中所示的DNA序列或SEQ ID NO:2中所示的DNA序列的其中一种，所述水稻抗逆性的应用的AK209基因克隆自水稻第4染色体的抗旱QTL区段，在脱水、PEG、高盐、H2O2、ABA处理下的基因可响应逆境胁迫及外源激素的超表达，超表达AK209基因的转基因水稻表现出显著增强的抵抗干旱胁迫能力，同时增加了产量。

2.根据权利要求1所述的AK209基因在水稻抗逆性的应用，其特征在于，所述AK209基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。