CN103014017A - 水稻抗逆性相关OsSRP14基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从水稻DNA片断中分离克隆与水稻抗逆性相关的OsSRP14基因，该基因为信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP）。OsSRP14基因受PEG、高盐、低温、高温以及ABA诱导表达，超表达OsSRP14可提高水稻苗期抵抗渗透胁迫的能力，与水稻抗逆性相关。本发明的水稻基因对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。

Description

水稻抗逆性相关 OsSRP14 基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及一种新的水稻抗逆相关基因OsSRP14及其编码蛋白与应用，利用此基因可培育抗旱能力增强的转基因植物。

背景技术

植物的生长受到众多环境因素的影响，其中一些不利的非生物胁迫（包括干旱、盐害、低温、高温等）对作物的产量造成了极大的影响，因此，利用基因工程技术，将一些抗逆相关基因转入到优良作物品种中，培育既高产又抗逆且优质的农作物新品种是应对水资源短缺、保障粮食安全的有效途径之一。深入发掘并研究植物节水抗旱基因，是解析植物抗旱机制的基础工作，为培育节水抗旱作物提供理论依据和基因资源。

信号识别颗粒（SRP）是真核生物细胞质中的一个11S的核糖体蛋白复合物，包括6个蛋白质和一个小的7S RNA，其中7S RNA为颗粒提供了结构框架，帮助蛋白质组装。SRP能够识别刚从游离核糖体上合成的信号肽并与之结合，暂时终止新生肽的合成；与此同时将信号肽-核糖体复合体带到另一个与其识别的粗面内质网膜上的SRP受体SR上，从而使外输蛋白的合成达到定位的目的。SRP和SR之间的相互作用是真核生物翻译时的关键步骤。SR是一种G蛋白，位于内质网膜上，包括亚基SRα和SRβ。它通过与SRP初期多肽核糖体复合物和细胞质膜的相互作用，来调节膜整合蛋白到易位子的靶向定位。

本发明OsSRP14基因克隆自水稻第4染色体的抗旱QTL区段。在干旱、盐、高温、低温、外源ABA处理下的基因表达谱分析表明，该基因可响应逆境胁迫表达。而且，超表达该基因的转基因水稻表现出显著增强的抵抗渗透胁迫的能力。本发明对于培育抗逆性增强的植物新品种具有重要的意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的水稻抗逆相关基因OsSRP14，可响应逆境胁迫。

本发明的另一目的是提供利用水稻基因OsSRP14培育抗逆能力增强的转基因植物的方法。

本发明从水稻中分离克隆的一段完整编码区段的DNA片段，对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明，它属于一个信号识别颗粒，因此命名为OsSRP14。

本发明分离和应用一种包含OsSRP14基因的DNA片段，该基因能响应高温、低温、盐、外源ABA和PEG胁迫处理，发生表达变化。

本发明所述OsSRP14基因DNA序列为下列之一：

如序列表SEQ ID NO:1所示；

与SEQ ID NO:1同源度达90%的DNA序列；

功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。

本发明所述OsSRP14基因DNA序列还可为下列之一：

如SEQ ID NO:2所示；

与SEQ ID NO:2同源度达90%的DNA序列。

一种包含权利要求1或2所述的OsSRP14基因编码的蛋白。

本发明的优选方案是，所述蛋白的氨基酸序列为下列之一：

如序列表SEQ ID NO:4所示；

如SEQ ID NO:4序列的同源序列、或保守性变异体、或等位变异体、或天然突变体，或诱导突变体。

本发明的优选方案是，所述蛋白是在高或低的严谨条件下， 通过所述OsSRP14基因的DNA杂交编码完成的。

本发明的优选方案是，还提供一种包含OsSRP14基因的重组载体，其中，构建所述重组载体所选用的载体为可以引导外源基因在植物中表达的载体。

本发明的另一优选方案是，构建所述重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。

本发明的优选方案是，还提供一种包含OsSRP14基因的转化体，其中，所述转化体的宿主为植物，所述植物为水稻。

本发明的提供的技术方案是一种包含OsSRP14基因在提高水稻抗逆性中的应用。

采用已克隆的OsSRP14基因为探针，从cDNA文库和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。也可以采用PCR（polymerase chain reaction）技术，从基因组，mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsSRP14基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsSRP14基因序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得抗逆能力提高的转基因植株。本发明的基因在构建到表达载体上时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导启动子。

本发明的基因在构建到表达载体上时，可以使用增强子，但是其必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。

包含OsSRP14基因的重组载体，携带本发明OsSRP14基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。

本发明的技术优点是：包含本发明OsSRP14基因的表达载体的转化宿主是包括水稻在内的多种植物，培育抗旱、抗旱的植物品种。

本发明的水稻基因对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。

附图说明

图1为本发明的OsSRP14基因在各组织器官的表达；

图2为本发明的OsSRP14基因在苗期冷、热、盐、PEG和外源ABA处理下的表达水平；

图3为本发明的OsSRP14基因超表达载体转化水稻植株的Southern blot检测；

图4为本发明的OsSRP14基因超表达载体转化水稻植株的表达水平检测；

图5为本发明的OsSRP14基因的超表达转基因水稻的苗期甘露醇处理分析。

具体实施方式

下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例 1

水稻OsSRP14基因的克隆

1．幼苗培育

将水稻置于30℃萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。

2．RNA提取与第一链cDNA合成

RNA的提取：所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1mL TRNzol-A⁺试剂（天根生化科技有限公司）的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加0.2mL氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min；后于4℃，12000rpm离心10min后，上清液移至新的2mL EP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100µL RNase-free ddH₂O溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

反转录之前需用DNaseI消化所提取样品，反应体系如下：

试剂名称	使用量（µL）
		RNA	5（总量约1µg）
10×DNaseI Buffer	1
		DNaseI（5U/µL）	0.2
DEPC H2O	Up to 10 µL

37℃反应15min后，加入0.25µl 0.1M EDTA（保证终浓度>2mM），70℃温育10 min终止反应，短暂离心后置于冰上备用。

第一链cDNA的合成参照 Promega 反转录系统A3500操作手册，具体步骤如下：

DNaseI消化过的样品中依次加入下列各试剂配制20µL 的反应体系：

试剂名称	使用量（µL）
		MgCl2（25mM）	4
Reverse 10× Buffer	2
		dNTP Mix（10mM）	2
RNasin® Inhibitor（40U/µL）	0.5
		AMV Reverse Transcriptase（25U/µL）	0.6
Oligo(dT)15 Primer（500µg/mL）	1

（2）将上反应体系于42℃温育 15 min；

（3）然后95℃加热5min，使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合；

（4）4℃或冰上放置5 min。

制备好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃备用。

3．基因的克隆

从水稻第4染色体的抗旱QTL区段内定位到候选基因LOC_Os04g53220，对水稻基因组及全长基因数据库进行BLAST搜索，获得其对应的全长cDNA（AK071587）。根据预测信息设计上下游引物Gf1:5’- GAAGGCGACGAAGACGAGG-3’和Gr1:5’-GAGTAAAATGGAGGATAATGTCTTGAC-3’，从cDNA中直接克隆获得了OsSRP14基因，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用T7或SP6作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye, Perkin-Elmer, USA)的方法，在ABI 3730测序仪(Perkin-Elmer, USA)上进行测序，测序结果同SEQ ID NO:2比对确认，SEQ ID NO:2为构建超表达载体所用序列。其中SEQ ID NO:1为其DNA序列，SEQ ID NO:3为该基因的CDS序列，CDS翻译即得该基因的氨基酸序列SEQ ID NO:4。

实施例 2

水稻基因OsSRP14在各组织器官的表达分析

1. 选取材料

苗期：选取饱满的IRAT109种子（国外引进的旱稻品种，上海市农业生物基因中心种质资源库收集保存），蒸馏水清洗，3% NaClO消毒10 min后清洗干净，30℃催芽，种子露白后转放到发芽盒内水培生长，三叶期后施加营养液（国际水稻所标准营养液）。在28℃，16h/8h的光照培养室中培养，至四叶期时取新叶及根部位的材料进行分析；

成株期：IRAT109种植于水田，孕穗期取植株的剑叶、叶鞘和穗进行分析。

2. RNA提取与第一链cDNA合成

同实施例1。

3.定量PCR分析

基因表达的定量分析使用Takara公司的SYBR^® Premix Ex Taq ^TM（Perfect Real Time）试剂盒和美国ABI PRISM^® 7000定量PCR仪进行。根据OsSRP14全长cDNA序列设计定量引物。以水稻持家基因actin（GenBank accession No. AY212324）为参照基因，根据其cDNA序列设计引物。所用基因定量前引物为Gf2:5’- TCCGTTTCTGAGCGAGTTGA-3’，基因定量后引物Gr2:5’- AGCGTGCATATGGGCTTTAA -3’，Actin F:5’- CTTCCTCATGCCATCCTGC-3’，Actin R:5’- GCAAGCTTCTCCTTGATGTCC-3’。20 µL反应体系的配制：

反应条件为：95℃ 30s，然后在95℃ 5s，60℃ 31s，循环40次，并增设Dissociation Stage。设定在每个循环中60℃ 31s时收集数据，其它具体操作按仪器使用说明书进行。计算目的基因与参照基因的平均CT值以及△CT值，利用2^{- ΔΔ CT}法进行结果分析，最后将数据导入GraphPad Prism5.0做出目的基因的相对表达量柱状图。

定量分析结果显示（图1），该基因在各组织器官中都有表达，幼叶、幼穗、叶鞘以及根中有较高的表达量，其中根中表达最高。

实施例 3

水稻基因OsSRP14在逆境胁迫下的表达分析

1. 逆境胁迫处理

选取饱满的IRAT109种子，蒸馏水清洗，3% NaClO消毒10 min后清洗干净，30℃催芽，种子露白后转放到发芽盒内水培生长，三叶期后施加营养液（国际水稻所标准营养液）。在28℃，16h/8h的光照培养室中培养，至四叶期时进行各种逆境和激素处理：20% PEG6000、200mM NaCl、4℃、42℃和100μM脱落酸(ABA)。分别在胁迫前、胁迫后3h、6h、12h、24h对逆境处理材料进行取样。在处理前、处理后0.5h、3h、6h、12h、24h对ABA处理样品取样。所有处理和取样过程都是在持续光照的条件下进行。

2. RNA提取与第一链cDNA合成

同实施例1。

3.定量PCR分析

同实施例1。

定量分析结果显示（图2）：OsSRP14对PEG以及ABA处理较敏感，处理后短时间内被诱导表达，表达量明显上升；对冷处理以及热处理呈现缓慢响应的特点；而高盐处理则抑制了该基因的表达。具体表现为：冷处理6h该基因即被诱导表达，并在12h达到最高，为处理前的2.1倍，并一直维持较高的水平（2-a）热处理3h时该基因被少量诱导表达，其表达量随处理时间延长而上升，在处理24h达到最高，为处理前的11.3倍（图2-b）；高盐处理则可呢抑制了该基因的表达，处理12h达到最低水平，为处理前的0.24倍，处理24h几乎恢复到处理前水平（2-c）；PEG模拟干旱处理3h该基因被急剧诱导表达，为处理前的5.2倍，其表达量随处理时间延长而逐渐下降（图2-d）；ABA处理3h即被迅速诱导表达，在处理6h时达到最高水平，为处理前的5.2倍，并一直维持较高的水平（图2-e）。上述结果表明，该基因能够受到低温、高温、PEG以及ABA的诱导表达，因而该基因在逆境应答反应中可能起着重要的作用。

实施例 4

水稻基因OsSRP14超量表达转化水稻

1．利用GATEWAY重组克隆技术构建含OsSRP14基因的超量表达载体：

以实施例3中已获得含有旱稻IRAT109的OsSRP14基因的pGEMT-Easy载体为模板，用前引物Gf3:5’-AAAAAGCAGGCTATGGTGGTGCTGCAAC-3’，后引物Gr3:5’-AGAAAGCTGGGTTTACGACTTGGACCCTG-3’进行第一轮PCR扩增。再利用通用引物attB1 adapter: 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’，attB2 adapter: 5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’进行第二轮PCR扩增，扩增产物经回收纯化后，通过BP反应，将扩增产物片断克隆到入门载体pDONR207， 筛选阳性克隆，通过LR反应，将目的基因重组克隆到GATEWAY超表达载体pCB4004（该载体是在中国科技大学向成斌研究员赠送的pCB2004基础上，将BASTA抗性基因（除草剂抗性基因）替换为潮霉素抗性基因改造而来，命名为pCB4004）。具体过程如下：

（1） 第一轮PCR扩增

20μl反应体系：

各反应成分	用量（μL）
		ddH2O	13.8
10×buffer	2
		dNTPs	1
Prime F（10µM）	1
		Prime R（10µM）	1
质粒	1
		Taq	0.2

扩增程序：

Step Time Temperature Cycles

Initial Denaturation 2min 98℃ 1X

Denaturation 15s 98℃

Annealing 30s 60 ℃ 10X

Extension 1 min/kb 72℃

（2） 第二轮PCR扩增

取上述PCR产物10uL作为模板，加入到下面PCR配置的40uL反应体系。

各反应成分	用量（μL）
		ddH2O	19.5
10× buffer	4
		dNTPs	2
Prime F（10µM）	2
		Prime R（10µM）	2
PCR产物	10
		Taq	0.5

紧接着严格按照下面的循环来进行PCR扩增：

Step Time Temperature Cycles

Initial Denaturation 1min 98℃ 1X

Denaturation 15s 98℃

Annealing 30s 45 ℃ 5X

Extension 1 min/kb 72℃

然后设置下一步的PCR程序。

Step Time Temperature Cycles

Denaturation 15s 98℃

Annealing 30s 55℃ 25X

Extension 1 min/kb 72℃

最后取5ul电泳检测PCR质量。

（3） PCR产物的回收

采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）进行纯化回收。

（4） BP重组反应

BP反应的目的在于将含有attB接头的PCR产物重组到含有attP的供体载体上，以产生入门克隆。重组反应可在室温配制混匀，0.5mL的离心管中进行。反应体系如：

Components Sample

attB-PCR product（>10ng） 3µL

pDONR207 vector (150 ng/µL) 1µL

5×BP Clonase Clonase enzyme mix 1µL

25℃温浴16h左右，随后将BP反应液转化大肠杆菌感受态细胞。重组大肠杆菌需在含庆大霉素平板上生长。接着挑取单菌落以进行PCR验证，最后抽提质粒。

（5） LR重组反应

重组反应可在室温配制，0.5mL的离心管中进行。反应体系如下：

Components Sample

Entry clone（50-150ng） 3 µL

Destination vector（150 ng/µL） 1 µL

5×LR Clonase enzyme mix 1 µL

25℃温浴16h左右，然后将反应液转化大肠杆菌感受态细胞。转化完成的大肠杆菌液涂布在含有卡那霉素的平板上生长。接着挑取单菌落，进行PCR验证，然后送测序，测序结果与该基因cDNA序列比对以确认序列正确与否，最后提取质粒，即可转化农杆菌EHA105。

2. 农杆菌转化

根癌农杆菌（EHA105）感受态细胞的制备：

根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD600=0.5时，4℃离心收集菌体，用500µL、0.1mol/L冰浴CaCl₂重悬，冰浴30 min后离心，去上清，用100µL，0.1 mol/L冰CaC1₂重悬后，于4℃保存。

农杆菌转化（冻融法）：

（1）向感受态农杆菌（100µL）中加入5µL植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，冰水浴30 min后，于液氮中速冻冷激2 min；

（2）取出，加入400~800µL YEP培养液(含卡那霉素，Kan)；28℃，200 r/min振荡培养3-5 h；

（3）室温离心（5000 r/min，5min），保留100µL上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含Kan)上，28℃倒置培养2 天直至长出合适大小的菌落。

（4）挑取单克隆进行PCR检测，得到阳性菌株。

3．愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20min，再用75%的乙醇消毒1min，然后用次氯酸钠（1.5%有效浓度）溶液振荡消毒20 min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。

愈伤诱导培养基：采用表1的诱导培养基，加入0.3 g脯氨酸、0.6 g水解酪蛋白酶、30 g蔗糖和2.5 mL 2,4-D (浓度1 mg/mL)，配成1 L溶液，调pH至5.9，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。

4. 继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。

继代培养基：采用表1的继代培养基，加入0.5 g脯氨酸、0.6 g水解酪蛋白酶、30 g蔗糖和2 mL2,4-D （浓度1 mg/mL），配成1 L溶液，调pH至5.9，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。

5. 农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌挑，取阳性单菌落，在1 mL农杆菌培养液（含抗生素）中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50 mL农杆菌培养液（含抗生素）中，28℃培养至OD600=0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30 min至OD600=0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20 min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5 d。

悬浮培养液：采用表1的悬浮培养液，加入0.08 g水解酪蛋白酶、2 g蔗糖和0.2 mL 2,4-D（浓度1 mg/mL），配成100 mL溶液，调pH至5.4，分成两瓶 （每瓶50 mL），高温高压灭菌。使用之前加入1 mL 50%的葡萄糖和100 μL AS（100 mM）。

共培养培养基：采用表1的共培养培养基，加入0.8 g水解酪蛋白酶、20 g蔗糖和3.0 mL 2,4-D （浓度1 mg/mL），配成1 L溶液，调pH至5.6，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20 mL 50%的葡萄糖和1 mL AS（100 mM）。

6．筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。

筛选培养基：采用表2的筛选培养基，加入0.6 g水解酪蛋白酶、30 g蔗糖和2.5 mL 2,4-D （浓度1 mg/mL），配成1 L溶液，调pH至6.0，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1 mL Hn和1 mL Cn（100 ppm）。

7．分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16 h/8 h光暗培养诱导分化芽（4-6周）。

分化培养基：采用表2的分化培养基，加入2.0 mg/L 6-BA、2.0 mg/L KT、0.2 mg/L NAA、0.2 mg/L IAA、1.0 g水解酪蛋白酶和30 g蔗糖，配成1 L溶液，调pH至6.0，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。

8．生根培养：待芽长至2 cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16 h/8 h光暗培养，诱导生根。

生根培养基：采用表2的生根培养基，加入30 g蔗糖，配成1L溶液，调pH值至5.8，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。

9．转化植株培养：待根系发达后，打开试管口，加入无菌水炼苗2-3d后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。

表1 基本培养基成分1

表2 基本培养基成分2

10. 超量表达植株的阳性检测（采用GE healthcare公司的Southern blot试剂盒）

（1）基因组DNA提取（大样法）：液氮浸泡叶片，研磨成细粉，装入10mL离心管中，加4 mL 56℃预热的1.5×CTAB混匀；快速置于56℃的水浴30min，中间颠倒数次；加入氯仿/异戊醇（24:1）4 mL，轻摇30min；4000rpm离心20min，吸取上清3mL至新离心管中（10 mL），加300uL 10%的CTAB（56℃水浴预热），以及3.3 mL的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次；4000rpm离心20min，吸取上清2.7 mL至新离心管中（10 mL），加5.4mL 1%CTAB（56℃预热），轻摇沉淀DNA，4000rpm离心20min，弃上清，加入2mL含1uL RNA酶的1M NaCl溶液，56℃水浴过夜溶解，加入2倍体积预冷(-20℃)的无水乙醇沉淀DNA，4000rpm离心5min，弃上清，75%乙醇清洗沉淀，晾干，加100 uL灭菌水溶解DNA。

（2）基因组DNA酶切、电泳和凝胶预处理：

在2mL的离心管中加入以下组分：

DNA	20µL
		HindⅢ （TAKARA）	5µL
10×M buffer (TAKARA)	30µL
		ddH2O	Up to 300μL

混匀后37℃酶切过夜。酶切好的DNA样品在1%的琼脂糖凝胶中，低压（30V）电泳过夜。电泳结束后，将凝胶置于瓷盘中，切除加样孔及不含样品的多余部分，依次用下列溶液处理凝胶：0.25 mol/L的HCl脱嘌呤处理10min，蒸馏水漂洗三次后，加入变性液（1.5M NaCl，0.5M NaOH），振荡变性30min。蒸馏水漂洗三次，加入中和液（1.5M NaCl，0.5M Trizma base）中和30min，蒸馏水漂洗三次。

（3）转膜

在瓷盘中加入适量转膜缓冲液20×SSC，将大小合适的滤纸用20×SSC浸透，并铺在玻璃板上搭成盐桥。将胶反面朝上置于滤纸上。胶周围用封口膜压边。

根据胶大小裁好硝酸纤维素膜，做好标记，正面向下，紧帖于胶上，防止气泡的产生。在膜上铺放浸过20×SSC，与膜同样大小的3层滤纸。然后铺放吸水纸，在吸水纸后压一块玻璃板，板上加1Kg左右的重物。转膜过夜。其间多次更换浸湿的吸水纸。转膜结束后，置于80℃中烘2h。

（4）探针制备

使用潮霉素基因引物（Hyg F:5’ -CGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3’，Hyg R:5’ -TTGGCGACCTCGTATTGG-3’）扩增获得512bp的片段，并回收。将cross-linker按2:8的比例稀释成工作液。使用前，将回收DNA用试剂盒中附带的蒸馏水稀释至10ng/uL，取10ul在沸水浴中变性5min，立即放入冰上冷却5min。依次加入10uL反应液，2uL标记试剂，并轻微混匀。再加入10uL cross-linker工作液，轻微混匀。离心机短暂离心，将液体收集至管底。37℃中反应30min。探针可以立即使用，或置于冰上2h内使用。

（5）杂交和检测

将杂交膜放入含30~40mL预杂交液的杂交管中，55℃预杂交30min，加入制备好的探针，混匀，杂交过夜。弃杂交液，加入55℃预热的洗液I，55℃洗脱10min。重复一次。加入洗液II，常温下漂洗10min。重复一次。将膜转移到干净的封口膜上，将CDP-STAR均匀地滴到杂交膜上，上面用封口膜封好，去除多余的气泡和CDP-STAR。暗室中将杂交膜及底片放入暗盒中，依据所用的DNA浓度，曝光6~12h。黑暗中依次将底片放入显影液，水，定影液中，即可见DNA谱带。显影时间以目的谱带清晰，而背景信号刚要出现时为宜。结果显示（图3），除去2个假阳性植株，仅有5个单拷贝植株，1个两拷贝植株，4个三拷贝植株，1个四拷贝植株。另外，还出现了1个9拷贝植株。同时也说明，各转基因苗来自于不同的独立转化过程。

11. 超量表达阳性植株中目的基因的表达水平检测

RNA提取及定量PCR方法见实施例1。

提取转基因T₀代植物叶片RNA，采用定量PCR法检测了OsSRP14超量表达植株中目的基因的表达水平（图4）。在检测的15株转基因植株中，有5株表达量超过5倍，没有出现超过10倍的植株。

实施例 5

转基因水稻的苗期甘露醇处理

将超量表达转基因家系种子去壳消毒（75%酒精处理1 min，1.5%NaClO处理20 min，无菌水清洗5次），在含有50mg/L潮霉素的1/2 MS培养基上发芽，野生型对照晚一天播于不含潮霉素的1/2 MS 培养基上。待发芽2～3天后挑选发芽好且长势一致的种子，分别转移到含有0，150 mmol/L甘露醇的1/2 MS培养基上，在光照培养室生长7～10天后观察表型，并测量植株的株高以及鲜重。处理过程中观察表型并拍照。

实验结果可以看出（图5），无甘露醇处理的正常生长条件下，转基因植株与野生型植株没有明显的差异；在渗透胁迫后，野生型植株生长明显受到抑制，转基因植株的生长也受到一定程度的抑制，但长势明显优于野生型植株（图5-a）。胁迫前，野生型植株和转基因植株的鲜重没有差异，胁迫后3个转基因株系的植株鲜重与野生型植株的鲜重达极显著差异，3个转基因株系分别为0.053g、0.066g、0.060g，而野生型植株为0.036g（图5-b）；胁迫前，野生型植株和转基因植株在株高上没有差异，胁迫后转基因植株与野生型植株株高差异达极显著，3个转基因株系分别为6.13cm、7.05cm、9.29cm，而野生型植株为2.43cm（图5-c）；胁迫前，野生型植株和转基因植株在根长上没有差异，胁迫后株系S1和S2与野生型植株差异达极显著，分别为6.18cm、4.88cm，而野生型植株为3.55cm（图5-d）。该结果表明超表达OsSRP14提高了水稻苗期对高渗胁迫的抗性。

综上所述，尽管已引证一些具体实例对对本发明作了详细的说明，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围，做各种变化或修正是显然的。

序列表

<110> 上海市农业生物基因中心

<120> 水稻抗逆性相关的OsSRP14基因及其编码蛋白与应用

<130> OsSRP14

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4371

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

cgttggatcc ctcgtgctcc gcaatctcag ccgtccgttt ccccctatag tcccccttac 60

ctccccttct acagttctac gaagtacgat ccaaacacca gcggcgaagg cgacgaagac 120

gagggcaaaa acaccagaag gggaaaactt ttgctctccc ggcgatctcg agatctctca 180

agatggtaat cccccatcca atttctctct acttttcctc ggatttgcgc cgcactcccg 240

atcgatgtct tcgacgcggt taactgcgat ggatttgcgc gagatcggat cctatggtct 300

agaatttcga gtcgattagg cttttttttg ggtggtgttt tgcgttgggt gatttcagat 360

tggaagtaga acggggggac gaggattctg agaagaatct actggtcttt gtcgtactga 420

atgctctcga tttcctcctg ttttgatcgc gtctgtgtgg tttggtctgg tcaggtggtg 480

ctgcaaccag atccgtttct gagcgagttg acgagcatgt acgagcggag cacggagaag 540

ggatctgtct gggtcaccat gaagcgatgt gagtgcgcgc tttcatctgg caatctggtt 600

tgtgatttgg gtggctgaag aactgatgct tgagttgatg ggggttgttt gatatgtgca 660

gcatcgatga agtgccaggc aaggttgaag aagatggcgg cgaagggaga ggcagtggag 720

taccggtgcc tcgtccgtgc caccgatggc aagaagaaca tctgcaccgc ggtacagtga 780

ctgtcctatt gtcctttgct gtgctgattt tgaattatta ttttgcttat ggttgttagt 840

tttgtgcata atggttaccg attatctggt attcgatgct aattatgcca ccaggcggta 900

agtgaggaat gtgaatatga cattaggcgc ttttggtatt gcactaaaac ctctcggata 960

tgaaatttcg gtactgagcc agtttatttg gtattcaagt cagcaaggta tattgtttta 1020

agagatagat aaaagtatgg aactgtagaa gtgctgcaat aagtatgatc caaactgtga 1080

actgtatata tagtgaacat atattgtaga ttggtctatg tagaagatat acagtacgtt 1140

ggtttcttgc ttaagcttct cacaagcatc ctttcgcggt aacatgtgta ggcactcgtg 1200

aagcatgatc ataaacagcg aggtaccgta gaatcagatg cttactcata ggacatctta 1260

actcgcatcc tattgaagta gaatgtgtaa cataatcata agttggaaca gactatacta 1320

tcacatgctt agttgtagca tggtaaattg ataataaaca tgaatgaact ttgttcaata 1380

gacaaactag ccaagaaaac gtttagtgcc attcatggtg ttaatattgc atgtttgcct 1440

gccctacact accgcagtct cattttcatc ctatgctaag ataactctca agttggtgta 1500

gatattgagt atgaaactca tttgtgtgct cttgccaagt tttgattgca ttaagtagtg 1560

aggtttctca ttaattgcac catcttgcat tttctgaaag cgtcatcaag ttgtttgagc 1620

ttaaatttat atggtgaaag tattgtttct aatgataaga ctgtagtatc gatgggcatc 1680

cactggccac tttttcccat gtgattaatc tttaccacca aacagttggg tcgataatct 1740

ttttccacaa gagtaagaac gccatgataa gttcagagtc ccaagatcta tgttctgaac 1800

agtttatttt ctcctctacc ctatatgtgg tgaaaattca catggtgatg tgaggtattc 1860

catatgaagg ctaaaaagtt ggtgattata tctcccatgc tgttcatgta gatacagaat 1920

aatagctggt ttggaaccat gtgtgtccat atctatttgt ccctgctaaa ttacatttgt 1980

caaagctcgc ccaatggagc atttatttgc ccctgctatt gcaataatgc ctcctagggg 2040

tcgatagtgc aattacgagc tgaggtaaac tactatattt acttagatgt tagtgatact 2100

atgttttttt ccttcaatac tatttatagg acagtcattt gcaatacttt tttttttgta 2160

attttgatga aaactggata tctgagttga ctaattacat gttcgtagtt ttgatgaaat 2220

aatggatatt tgaactgatt aatgatggat ttattcatct ttctgaagcc ataaacatta 2280

gccatactta tttgagatgc gtaaattatt ctcctgtcac ttccttagct ttttgggcta 2340

cccaataagt ctaacttaaa aagctcgcca tgtctttcag ctctctgcaa aggagtacct 2400

gaagttccaa gcttcatatg ccacagttct taaagcccat atgcacgctt tgaagaagag 2460

ggagaggaaa gacaagaaga aggctgcaga ggttgagaag ataccagaga aggcaccgaa 2520

gaagcagaag aaagcaccgt cttcaaagaa atctgcaggg tccaagtcgt aagttactga 2580

aagaatttgc taagcccttt tttggccaca ggcctgagta agatgggtgt agtcaagaca 2640

ttatcctcca ttttactctt attcatgtct gcgagatgaa gcatgtgaat acctttatag 2700

agctgtgccg tcgacattag caatttttga agcagctttg gttgtctaga tgtaagccgc 2760

cctggaattt tctatttcta tcatagaaag gcatctctta aactgtgcct gatctgatcg 2820

tcaagttagt gcaactttca attgacagaa ttacgtctgg aacatgaagt tatgcaacta 2880

agactgcaga aggaaattgc agaactgtta tctggatgtc tgtgttcctt caattttgtt 2940

tttctggttg gggagaaaaa gtgtgaaggt atgtctgtgt cacgattccc acatgcaagt 3000

ggtgatcaga atataagcag attccatgtt taggttggtg cataagcaaa cggcgtacta 3060

ctatgggcct atttggtaga gcttcaactc tggattttag ctctaggagt tgggtctgga 3120

gtggagttgt agagctgcct gaacctagct ctatctctga gattttcacc cttctatttt 3180

aagtggagct gaggtgccaa acaggcccta tctctcagca attgctgcat caacatggag 3240

cattggaggg ccgtatgccc gtatcctgtg tatgggcaca gcattgtcgg ttcctagcta 3300

tttgttctgc catcccccgg tcccaactga ttctcgtatc ggtccagaca agtccaaaag 3360

ctccaagctc cagtttttac accatttcgt ttttctttaa cacggttaga atttataaac 3420

catatcatgt ggtggtattt ttgtccagag attcacctca gaagtggcga atttttatcg 3480

taccaattgc agagacgaat ctttgctgag taggaggcag caaccactat gagcagccgt 3540

caccatccaa ccggacaaaa tccatcaaaa aataacccaa agaaatcaaa acaaaagcga 3600

gcacccaccg atgatcactc actgatctct catcaccaaa cgcctccgac ctcgctcgcg 3660

tcgcgcgccg cgcacccatc cccccggcct cgccaccacc cactcccgat cgcccccgtc 3720

gccacccacc ccctcagaaa tctcatcttt tccgcctcct ctcgccaacc aaacccgcga 3780

aacccccaca aacgacggtg gtgaaagaag atgagagggc tactcgcgtg cgccacgctc 3840

gcccgccgcg ccgccggcgc gacgtcgacg gcgcggcggc acctggcggg cgcggccgag 3900

gcggcggagg cggagctgaa gaagacggcg ctgtacgact tccacgtcgc gcacggcggg 3960

aagatggtgc cgttcgccgg gtggagcatg cccatccagt acaaggacac catcatggac 4020

tccaccctca actgccgcgc caacggcagc ctcttcgacg tctcccacat gtgcggcctc 4080

agcctccacg gccgccaggc catccccttc ctcgagtccc tcgtcgtcgc cgacgtcgcg 4140

gcgctcaagg acggcaccgg gacgctcacc gtcttcacca acgaccgcgg cggcgccatc 4200

gacgactccg tcgttaccaa ggtcaccgac cagcacatct acctcgtcgt caacgccggg 4260

tgcagggaca aggatctcgc ccacattggg gagcacatgg aggccttcaa caagaagggc 4320

ggcgacgtca agtggcacgt ccacgatgag cgctcgcttc ttgcattgca g 4371

<210> 2

<211> 778

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<220>

<221> primer_bind

<222> (29)..(47)

<223> GAAGGCGACGAAGACGAGG

<220>

<221> primer_bind

<222> (126)..(145)

<223> TCCGTTTCTGAGCGAGTTGA

<220>

<221> primer_bind

<222> (362)..(381)

<223> AGCGTGCATATGGGCTTTAA

<220>

<221> primer_bind

<222> (563)..(590)

<223> GAGTAAAATGGAGGATAATGTCTTGAC

<400> 2

gacgaagtac gatccaaaca ccagcggcga aggcgacgaa gacgagggca aaaacaccag 60

aaggggaaaa cttttgctct cccggcgatc tcgagatctc tcaagatggt ggtgctgcaa 120

ccagatccgt ttctgagcga gttgacgagc atgtacgagc ggagcacgga gaagggatct 180

gtctgggtca ccatgaagcg atcatcgatg aagtgccagg caaggttgaa gaagatggcg 240

gcgaagggag aggcagtgga gtaccggtgc ctcgtccgtg ccaccgatgg caagaagaac 300

atctgcaccg cgctctctgc aaaggagtac ctgaagttcc aagcttcata tgcctcagtt 360

cttaaagccc atatgcacgc tttgaagaag agggagagga aagacaagaa gaaggctgca 420

gaggttgaga agataccaga gaaggcaccg aagaagcaga agaaagcacc gtcttcaaag 480

aaatctgcag ggtccaagtc gtaagttact gaaagaattt gctaagccct tttttggcca 540

caggcctgag taagatgggt gtagtcaaga cattatcctc cattttactc ttattcatgt 600

ctgcgagatg aagcatgtga atacctttat agagctgtgc cgtcgacatt agcaattttt 660

gaagcagctt tggttgtcta gatgtaagcc gccctggaat tttctatttc tatcatagaa 720

aggcatctct taaactgtgc ctgatctgat cgtcaagtta gtgcaacttt caattgac 778

<210> 3

<211> 399

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 3

atggtggtgc tgcaaccaga tccgtttctg agcgagttga cgagcatgta cgagcggagc 60

acggagaagg gatctgtctg ggtcaccatg aagcgatcat cgatgaagtg ccaggcaagg 120

ttgaagaaga tggcggcgaa gggagaggca gtggagtacc ggtgcctcgt ccgtgccacc 180

gatggcaaga agaacatctg caccgcgctc tctgcaaagg agtacctgaa gttccaagct 240

tcatatgcct cagttcttaa agcccatatg cacgctttga agaagaggga gaggaaagac 300

aagaagaagg ctgcagaggt tgagaagata ccagagaagg caccgaagaa gcagaagaaa 360

gcaccgtctt caaagaaatc tgcagggtcc aagtcgtaa 399

<210> 4

<211> 132

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 4

Met Val Val Leu Gln Pro Asp Pro Phe Leu Ser Glu Leu Thr Ser Met

1 5 10 15

Tyr Glu Arg Ser Thr Glu Lys Gly Ser Val Trp Val Thr Met Lys Arg

20 25 30

Ser Ser Met Lys Cys Gln Ala Arg Leu Lys Lys Met Ala Ala Lys Gly

35 40 45

Glu Ala Val Glu Tyr Arg Cys Leu Val Arg Ala Thr Asp Gly Lys Lys

50 55 60

Asn Ile Cys Thr Ala Leu Ser Ala Lys Glu Tyr Leu Lys Phe Gln Ala

65 70 75 80

Ser Tyr Ala Ser Val Leu Lys Ala His Met His Ala Leu Lys Lys Arg

85 90 95

Glu Arg Lys Asp Lys Lys Lys Ala Ala Glu Val Glu Lys Ile Pro Glu

100 105 110

Lys Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys Ala Pro Ser Ser Lys Lys Ser Ala

115 120 125

Gly Ser Lys Ser

130

Claims (9)

1.一种与水稻抗逆性相关的OsSRP14基因，其特征在于，所述基因具有下列之一核苷酸序列：

如SEQ ID NO:1中所示的DNA序列；

如与SEQ ID NO:1至少90%同源的DNA序列；

如功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。

2.根据权利要求1所述的OsSRP14基因，其特征在于，所述基因具有下列之一DNA序列之一：

如SEQ ID NO:2中所示的DNA序列；

如与所述SEQ ID NO:2同源性达90%的DNA序列。

3.一种包含权利要求1或2所述的OsSRP14基因编码的蛋白。

4.根据权利要求3所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为下列之一：

如序列表SEQ ID NO:4所示；

如SEQ ID NO:4序列的同源序列、或保守性变异体、或等位变异体、或天然突变体，或诱导突变体。

5.根据权利要求3所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白是在高或低的严谨条件下， 通过权利要求1或2所述的OsSRP14基因的DNA杂交编码完成的。

6.一种包含权利要求1或2所述OsSRP14基因的重组载体，其特征在于，构建所述重组载体所选用的载体为可以引导外源基因在植物中表达的载体。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，构建所述重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。

8.一种包含权利要求1或2所述OsSRP14基因的转化体，其特征在于，所述转化体的宿主为植物，所述植物为水稻。

9.一种包含权利要求1或2所述OsSRP14基因在提高水稻抗逆性中的应用。

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