一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
全球干旱、半干旱地区约占土地总面积的36%,占耕地面积的43%。我国的干旱、半干旱地区主要分布在华北、西北、内蒙古和青藏高原等地区,其面积约占全国土地面积的二分之一。随着人口增加、社会经济发展及自然气候条件变化,水资源短缺形势日益加剧,严重影响农业生产。干旱胁迫常常影响植物生长发育,造成作物严重减产。干旱对农作物造成的损失在所有的非生物胁迫中占首位,仅次于生物胁迫病虫害造成的损失。为了解决这些难题,对作物抗旱机制的研究在国际上备受关注,抗旱性已成为评价作物品种的重要指标之一。开展作物抗旱机制的研究,提高作物的抗旱性是解决水资源短缺、实现农业节水、保障农业可持续发展的重要选择。作物抗旱机制的研究可揭示植物适应干旱环境的生命本质,是最终实现人为操纵植物生命活动的基础,因此,也是生命科学领域中的一个重大的科学问题。开展作物抗旱机制的研究可提高我国生命科学的基础研究水平、增强我国科技竞争力。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的植物抗逆性相关蛋白,名称为TCTP类似蛋白(translationallycontrolled tumor family protein similar to translationally controlled tumorprotein,简写为TCTP),其来源于水稻,是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质:
1)序列表中的SEQ ID №:1;
2)将序列表中SEQ ID №:1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。
其中,序列表中的序列1由168个氨基酸残基组成。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述植物抗逆性相关蛋白编码基因(TCTP)及其启动子也属于本发明的保护范围。
上述植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因,可具有下述核苷酸序列之一:
1)序列表中SEQ ID №:2的DNA序列;
2)编码序列表中SEQ ID №:1蛋白质序列的多核苷酸;
3)与序列表中SEQ ID №:2的DNA序列具有90%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列;
4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC),0.1%SDS的溶液中,在65℃下杂交并洗膜。
其中,序列表中的SEQ ID №:1由970个脱氧核苷酸组成,自5′端第113位至619位脱氧核苷酸为编码序列。
本发明所提供的植物抗逆性相关蛋白的基因组基因,可具有下述核苷酸序列之一:
1)序列表中SEQ ID №:3的核苷酸序列;
2)编码序列表中SEQ ID No:1蛋白质序列的DNA;
3)与序列表中SEQ ID №:3的DNA序列具有90%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列;
4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
其中,序列表中序列3由4245个脱氧核苷酸组成,含有5个外显子和4个内含子。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
逆境胁迫实验证明本发明的植物抗逆性相关蛋白的编码基因转入水稻中,可增强水稻的抗逆性,特别是增强对盐、寒和旱的抗性。
附图说明
图1为TCTP类似蛋白编码基因的结构简图
图2为TCTP过量表达载体TCTP-pHOS的结构简图
图3为30%PEG6000模拟干旱胁迫后转TCTP-pHOS水稻植株和对照(中花十一)复水后照片
图4A为寒冷胁迫后中花十一水稻品种(对照)的照片
图4B为寒冷胁迫后转TCTP-pHOS水稻植株的照片
图5A为盐胁迫后中花十一水稻品种(对照)的照片
图5B为盐胁迫后转TCTP-pHOS水稻植株的照片
具体实施方式
实施例中的方法如无特别说明,均为常规方法。
实施例1、水稻抗逆相关蛋白及其编码基因的获得及其功能验证
一、水稻抗逆相关蛋白及其编码基因的获得
通过酵母双杂交技术,筛选得到水稻抗逆相关蛋白TCTP。酵母双杂交系统(CLONGTECH公司)是研究蛋白质间相互作用的一种分子生物学方法,它是基于转录因子可被分为独立的区,即DNA-结合域和转录活化域,而实现人工模拟转录的自然过程。采用的诱饵蛋白是DREB转录因子,即干旱应答元件结合蛋白质,它能特异结合启动子中含有DRE/CRT顺式元件,激活许多逆境诱导基因的表达,增强植物对逆境的忍耐力。通过酵母双杂交筛选与DREB转录因子相互作用的蛋白,推测这些蛋白可能会与DREB转录因子一样,与抗逆相关。通过实验,筛选得到了TCTP类似蛋白(translationally controlled tumor family protein similar totranslationally controlled tumor protein)。TCTP基因位于水稻第11号染色体上。TCTP基因全长4245bp其中启动子区域1990bp,基因2255bp。TCTP基因含有5个外显子和4个内含子。外显子分别为143bp、71bp、130bp、157bp和469bp。外显子1包括mRNA 5’端非翻译区和编码蛋氨酸起始密码(翻译起始点),48个氨基酸的密码子,外显子2由编码TCTP蛋白24个氨基酸的核苷酸组成。外显子3包括编码TCTP蛋白的43个氨基酸的核苷酸顺序构成。外显子4包括编码成熟TCTP蛋白的52个氨基酸的核苷酸顺序构成。外显子5包括终止密码子及3’端非编码区。在3’非编码区有2个poly A信号。内含子分别为312bp、687、79bp和191bp。其结构简图见图1。
经测序表明该蛋白具有序列表中序列1的氨基酸序列,其cDNA基因具有序列表中序列2的核苷酸序列。
扩增TCTP类似蛋白的编码基因TCTP的eDNA基因的特异引物TCTP-F:5′-CACCCTCTCTCTCCGTCCGTCCGCGCC -3′和TCTP-R:5′-CAATACAAAGGTTGCTTCTAAAG-3′,在TCTP-F引物的5′端附加了一个“CACC”接头,作为TOPO clone的接头。以水稻中花十一(湖南亚华种业)的cDNA作为模板,用PCR方法(Invitrogen公司)扩增出TCTP的cDNA基因片段;其中,扩增体系为:10×pfu buffer(含有Mg2+)5ul,10mM dNTPs 1ul,10uM引物TCTP-F 1ul,10uM引物TCTP-R 1ul,水稻cDNA5ul,pfu DNA聚合酶2ul,加水至50ul。扩增程序为:95℃预变性5分钟;95℃20秒,58℃30秒,72℃1分钟30个循环;72℃延伸7分钟。扩增得到974bp片段,将其连接到pENTRTR/D-TOPO载体(Invitrogen公司)得到重组载体,经测序表明该扩增片段具有序列表中序列2的核苷酸序列,该扩增片段即为TCTP的cDNA基因。自序列表中序列2的5′端113-619位为TCTP的cDNA基因的编码序列,编码序列表中序列1的氨基酸序列。将该重组载体命名为PENTR/D-TCTP。
二、TCTP基因功能验证
1、过量表达载体的构建
通过pENTR/D-TOPO载体上LR反应位点attL1和attL2,经过LR反应(Invitrogen公司)将重组载体pENTR/D-TCTP中的TCTP的cDNA基因片段重组到过量表达载体pHOS(Invitrogen公司)上,转化大肠杆菌,进行酶切和菌落PCR鉴定,将鉴定正确的含有TCTP基因的质粒命名为TCTP-pHOS(结构简图如图2所示)。
2、转TCTP-pHOS水稻的获得及其抗逆性过表达检测
将TCTP-pHOS通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA 4404(TIANGEN公司)的介导转入中花十一号水稻中,用50mg/L Hygmycin筛选,然后对表现Hygmycin抗性的植株,用PCR方法检测hpt基因,实验结果呈阳性,证明基因已经整合到水稻基因组中,为筛选得到的转TCTP-pHOS的水稻,即T0代转基因植株。播种T0代转基因植株所结的种子(T1代),用50mg/L Hygmycin筛选,然后对表现Hygmycin抗性的植株,用PCR方法检测hpt基因,结果表明100粒发芽种子中筛选到93株转TCTP-PHOS阳性幼苗,对该阳性幼苗分别进行了抗旱、抗寒、抗盐方面的实验。
(1)抗旱实验
用30%PEG6000来模拟干旱的环境。将T0代转基因植株所结的种子(T1代),直接放在含筛选剂Hygmycin 50mg/L的水中筛选十天。转基因种子因携带hpt基因而可以抗Hygmycin。挑选抗性幼苗转到水中培养,3天后进行抗旱试验。野生型水稻中花十一用水发种子,生长至13天的幼苗,作为此次实验的对照。将筛选得到的T1代转TCTP-pHOS水稻和中花十一(对照)用30%PEG6000溶液处理。胁迫4天后,中花十一严重脱水变干,而转TCTP-pHOS水稻植株只是部分叶片卷曲。4天后复水,即将被处理幼苗根部的PEG洗净后转到水中培养3天。中花十一复水后不能恢复,死亡。转TCTP-pHOS水稻植株复水后立即恢复,结果如图3所示(图左为对照,图右为转基因植株)。转基因抗旱植株转入营养土中进行正常培养。
(2)抗寒实验
将T0代转基因植株所结的种子(T1代),直接放在含筛选剂Hygmycin 50mg/L的水中筛选十天。挑选抗性幼苗转到水中培养,一周后进行抗寒试验。野生型水稻中花十一于同期用水发种子,作为此次实验的对照。将中花十一品种(对照)和筛选得到的T1代转TCTP-pHOS水稻移至4度冷库中培养。两周后对照植株死亡,转TCTP-pHOS水稻植株所受的影响很小。结果如图4A和图4B所示(图4A为对照植株,图4B为转TCTP-pHOS水稻植株)
(3)抗盐实验
将T0代转基因植株所结的种子(T1代),放入含筛选剂Hygmycin 50mg/L的水中筛选十天。挑选抗性幼苗转到水中培养,一周后进行抗盐试验。野生型水稻中花十一于同期用水发种子,作为此次实验的对照。将中花十一品种(对照)和筛选得到的T1代转TCTP-pHOS水稻幼苗放入100mM NaCl溶液中培养,经过一个月的处理,转TCTP-pHOS水稻相对对照植株(中花十一)明显生长状况好。结果见图5A和图5B(图5A为对照植株,图5B为转基因植株)。
以上实验,证明此TCTP基因具有提高植物抗旱、抗寒、抗盐等能力的生物功能,可以增强植物对逆境的忍耐力。
序列表
<160>3
<210>1
<211>168
<212>PRT
<213>稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)
<400>1
Met Leu Val Tyr Gln Asp Leu Leu Thr Gly Asp Glu Leu Leu Ser Asp
1 5 10 15
Ser Phe Pro Tyr Arg Glu Ile Glu Asn Gly Ile Leu Trp Glu Val Asp
20 25 30
Gly Lys Trp Val Val Gln Gly Ala Ile Asp Val Asp Ile Gly Ala Asn
35 40 45
Pro Ser Ala Glu Gly Gly Gly Asp Asp Glu Gly Val Asp Asp Gln Ala
50 55 60
Val Lys Val Val Asp Ile Val Asp Thr Phe Arg Leu Gln Glu Gln Pro
65 70 75 80
Pro Phe Asp Lys Lys Gln Phe Val Thr Phe Met Lys Arg Tyr Ile Lys
85 90 95
Asn Leu Ser Ala Lys Leu Asp Ala Glu Lys Gln Glu Glu Phe Lys Lys
100 105 110
Asn Ile Glu Gly Ala Thr Lys Tyr Leu Leu Gly Lys Leu Lys Asp Leu
115 120 125
Gln Phe Phe Val Gly Glu Ser Met His Asp Asp Gly Gly Leu Val Phe
130 135 140
Ala Tyr Tyr Lys Asp Gly Ala Thr Asp Pro Thr Phe Leu Tyr Phe Ser
145 150 155 160
His Gly Leu Lys Glu Val Lys Cys
165
<210>2
<211>970
<212>DNA
<213>稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)
<400>2
ctctctctcc gtccgtccgc gccgctactc ccccctcgcc gagagagctc tagggtttcc 60
gctgccgaat ttttttttta attcgggggg agagatttga agaggcggca ccatgttggt 120
ctaccaggat ctgcttaccg gtgacgagct cctgtcggat tcgttcccct acagagagat 180
cgagaacggc atcctctggg aagtcgatgg caagtgggtc gttcaaggag ctattgatgt 240
ggacattggt gccaacccat ctgctgaggg tggtggtgat gatgagggtg ttgatgacca 300
agctgtgaag gtggtcgaca ttgtggacac cttccgtctt caggagcaac ctccttttga 360
caagaagcag tttgtgacct tcatgaagcg ctacatcaag aacctctccg ccaagctgga 420
tgcggaaaag caagaggaat tcaagaagaa cattgagggt gccaccaagt acttgcttgg 480
aaagctcaag gaccttcagt tctttgttgg tgagagcatg catgatgatg gcggcttggt 540
gtttgcctac tacaaggacg gagccaccga cccaaccttc ctttacttct ctcatgggct 600
gaaggaggtc aagtgctgag cggttccttc tgctcgacac tgatgtttta tctatgcagt 660
ccgccgtatt tttggtctag tctatggttg tcagttgact cgatatggtc taatgttggt 720
gtcggaaaca actatcgttt gcttgttatg gatgttgaga tgagtccttt taaaaaaacc 780
tccggattat tggattcatg agctccttaa atgtttggaa cgatattaat ttgctttgtg 840
atggctggag aaagataatg atgaaattgt tgtgctagct atgttgctta cacttaaaac 900
atacctttgg tgtgttctgt cagactgatg cccaaaaaaa aaaaaacctt tagaagcaac 960
ctttgtattg 970
<210>3
<211>4245
<212>DNA
<213>稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)
<400>3
ggtacgggca cggagttttg cccgctaact ctagtaggta gggtttgggc gggcaatgtc 60
gggcatcggg tcgggcatgg ttttgctcta cccgtgcccg acccgatcca ttgccatccc 120
taccctcttc ctcctatctc gccggtgcgg tgacggggag gggaccttgc cggttcccct 180
cggccactcc cttccccttc ctcacggcaa cgggacactg tcgattcccc tcgcccgctc 240
cctccccatt actccacggc aacggggagg ggatccaccg gcagcgccgc ttcccctcgg 300
ccactccctc acccatcctc caccagctcc accggcggcg ctctccctct cggcacagag 360
tcggcggccc tccgcccctt ctcgccttct tcccgcgcca gatcaggcgg gtggaggagt 420
cggtggcggt ggcttcctcc gccccctctc gccttccttc cgccacagat cgggcggcgg 480
tggcggccgc ggctggattc ggtggcggag aacggattcg gcggcagtgg cggcggctcc 540
ttccaccctc gcctccctcc ctcggcagaa acgacagcgg tggcgagcgg cggcggcgta 600
gctcggcaag ccacgactgg cggccactcc atgccccctc ctcgtcagat ctggccatgg 660
gagacggtgg cggctgcggc aaactccgct cgatttttgg tcaatttgtt ttttttaatc 720
tccgtttgct gttcttctat tcttgtattt gggatcaaac ttgattaaaa ctttgtgtgt 780
tatttgctgc ggactctgga tgatttgttg tgtgttcgga cttatgatgt tgtggacaaa 840
aataggtgaa gacggacgaa acacctcacg gaatccttgt gttatttgat gcggaccctg 900
gatgattttt ttatgaacat tatggactgt ttttaatcgg acagattcgg ttttttttcg 960
ccctttcttt ttaccatgtc gcatataatc ggattccatt tttttgcccg attcttttgt 1020
cgcctatttt ttcacggacg gatgacggaa acactcgtaa ttttgtaagt ggtagagatt 1080
ttttcctttt ttacataaga cggaaactct tttttcgcac tcctttttaa tcgaccagaa 1140
ttttttttgc actttttttg gatcttggtt ttttttggca cagacgacgg atttttttaa 1200
tcggacagaa ataatttttc gcgttatttt ttcctttttt acggaagaca gaaacccttt 1260
ttttgccttt ttttaatcgg acagaaattt ttcgcacttt cttttgtcgc ttgttttttc 1320
gtacaaaaat cttttttttg gcactctttt ttgaagtcgg aaaccgtttt tcgcaccttt 1380
ttttttctgg gaatcggaca gaaaatattt ttcgcacttt tttttggaaa tttttcttaa 1440
ctttttaagt agcagagata gagatatatg cacgtgttct cctggtgatg ctaaccgaat 1500
aggacccgga ttttctagat cggacagttt tggtttttct tttctttttc cgcacttctt 1560
tttcgcccgg ttttttatcg gacaaacctg atttttttcg ttcggttttt ttgatgaacg 1620
atggaagcac ctctttttta agtagtagag gtagagattc atgatccttt aacactgaat 1680
gatggcgaaa gcggacaagt ccaaacgatt ccgtgccgcc cccgctgacc tcccttcggc 1740
cgccacaaac gcatctgagc cgtccgcctc cgaatatccg tccccaatat cccgatcgga 1800
cggcaggcaa tcaaccacgt actcctcccg gcttctcccc cactcaaaag cccaaaccgg 1860
cacaaatcgg agatctgggc cgtccatcgg taatattccc acggcatcag ccagatcgga 1920
cggccagaat cgcggcccag atatttcggc ccgcttataa ataccggctg gtcgcctcca 1980
cctcaaaccc tctctctccg tccgtccgcg ccgctactcc cccctcgccg agagagctct 2040
agggtttccg ctgccgaatt ttttttttaa ttcgggggga gagatttgaa gaggcggcac 2100
catgttggtc taccaggatc tgcttaccgg tgcgtgaatt gatcataatt ttctctggtt 2160
tttttcgggg gtaattttgt tgtttttgga gtcggggatg tggggatttt gggaattgga 2220
ggtggcgcgg ttagatctgg gcgttttccg tgtttgaatc ggatgatcta accgagaatt 2280
attactggta ggaggttgtg gtttctgatt gttttttttt ttatcgaatc gtcagatctg 2340
cttgtgtgtg gggatcgagt ttgaactcgt gggggattat gtgttgtgtg tttgctgatg 2400
cgattggttt gactgaaatc tgatttgttt gatttggatg tgttgcaggt gacgagctcc 2460
tgtcggattc gttcccctac agagagatcg agaacggcat cctctgggaa gtcgatggca 2520
aggtatgtcg ctttctgttt agtaggcgga ttcaccagct gtatgctttt gctagctttt 2580
gattgatctg ttgccgtcct cgattagatt cagtgtaaca tggttatgtg aaattcgatc 2640
attccgtttg gtgaacactt cgatctttag tggatatgtc attgcatgtt aaattattca 2700
ctgcttgctt ggcacaacat atttgtgcag agttagctta attatgagcc ttttgggcat 2760
ttcgtaaaaa aagatgaagt gcttgtctat gcttctgagg ctttaaatat catgcatact 2820
cgtggatgct gtgctacgtg gcttttgacc ttattaattg ttgcaatgca tgaggattag 2880
aaagatttgc gttgaggatt ctaggttgat tgatatttcc aatgtatcga tttatttagt 2940
tgtatcaatg aaacatgttt ttcaaatcag agatcattat aatatgttcc taaccagtga 3000
aacaatcttg ctttcgtttt gagtattaat ttgatgtttg ctttcctttc aaatttcaat 3060
accaatggat gttttgatca actgcatata tgaattattg caacagaatg cagctgtgga 3120
tatcttttga gataaccacg attttgtcta ttaccttgtg aagatgtcat ttgattctgt 3180
ttggttactt atattatgtt gtatccttgc agtgggtcgt tcaaggagct attgatgtgg 3240
acattggtgc caacccatct gctgagggtg gtggtgatga tgagggtgtt gatgaccaag 3300
ctgtgaaggt ggtcgacatt gtggacacct tccgtcttca ggttgctctc acttccatta 3360
ccttggctct tgtatatgat actatctgca ctttattttt gtgcttaaat tccatgtgtg 3420
tttggcagga gcaacctcct tttgacaaga agcagtttgt gaccttcatg aagcgctaca 3480
tcaagaacct ctccgccaag ctggatgcgg aaaagcaaga ggaattcaag aagaacattg 3540
agggtgccac caagtacttg cttggaaagc tcaaggacct tcagttgtaa gttcactaat 3600
tgcttgccac aggtccagga aatagtaaca tatgtgatgc catgaacatg tctcaccatt 3660
agtgcctaca aattccagtt taaatgattt gctatgttct atcacattaa attcttgaag 3720
caataagact tgtattcaaa cctgcttctt atgctgtctc ttatgatctg tttcagcttt 3780
gttggtgaga gcatgcatga tgatggcggc ttggtgtttg cctactacaa ggacggagcc 3840
accgacccaa ccttccttta cttctctcat gggctgaagg aggtcaagtg ctgagcggtt 3900
ccttctgctc gacactgatg ttttatctat gcagtccgcc gtatttttgg tctagtctat 3960
ggttgtcagt tgactcgata tggtctaatg ttggtgtcgg aaacaactat cgtttgcttg 4020
ttatggatgt tgagatgagt ccttttaaaa aaacctccgg attattggat tcatgagctc 4080
cttaaatgtt tggaacgata ttaatttgct ttgtgatggc tggagaaaga taatgatgaa 4140
attgttgtgc tagctatgtt gcttacactt aaaacatacc tttggtgtgt tctgtcagac 4200
tgatgcccaa aaaaaaaaaa acctttagaa gcaacctttg tattg 4245