CN101050462A

CN101050462A - 来源于拟南芥的缺磷诱导基因及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN101050462A
Application number: CN 200710065082
Authority: CN
Inventors: 赵婷; 凌宏清
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2007-04-02
Filing date: 2007-04-02
Publication date: 2007-10-10
Anticipated expiration: 2027-04-02
Also published as: CN101050462B

Abstract

本发明公开了一个来源于拟南芥的缺磷诱导基因及其编码蛋白与应用。其目的是提供一个拟南芥的缺磷诱导基因及其编码蛋白与其在提高植物吸磷能力中的应用。该基因的cDNA是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物吸磷能力功能的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的基因及其编码蛋白将在植物，特别是油菜、棉花、小麦、玉米、水稻和番茄等经济作物的品种改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

来源于拟南芥的缺磷诱导基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一个来源于拟南芥的缺磷诱导基因及其编码蛋白与其在提高植物吸磷能力中的应用。

背景技术

磷是植物生长所必需的大量营养元素之一，它不仅是植物细胞中ATP、核苷酸和磷脂的重要组成成份，而且在能量转移、蛋白激活和碳氮代谢中起到非常重要的调节作用。但是，由于磷在土壤中极易被固定，因此土壤中磷的浓度非常低，大约为2-10μM，扩散到根表面的磷更低，很难被植物利用，因而磷成为限制农作物生长发育和产量形成的最主要缺素之一。实践中通过大量施磷肥来满足植物生长需要，但会引起局部水资源污染，造成水的富营养化和增加农产品成本。因此，鉴定和分离磷高效吸收利用相关基因，研究其生物学功能，利用生物技术和遗传学的方法，改良农作物耐低磷能力和提高磷的吸收利用效率，对培育资源节约型的磷高效农作物新品种，有着重要的理论意义和经济价值。

发明内容

本发明的目的是提供一个来源于拟南芥的缺磷诱导基因。

本发明所提供的缺磷诱导基因，名称为AtAPL1(Acid phosphatase-like gene 1)，来源于拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其cDNA是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物吸磷能力功能的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：2由840个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-837位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

其基因组基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列；

2)与序列表中SEQ ID NO：3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物吸磷能力功能的核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID NO：3由1459个碱基组成，自5′端第44-190位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第191-314位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第315-436位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第437-508位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5′端第509-710位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5′端第711-887位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5′端第888-1256位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端第1-43位碱基为该基因组基因的5’非编码区(UTR)，自5′端第1257-1459位碱基为该基因组基因的3’非编码区。

所述缺磷诱导基因AtAPL1的启动子，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列；

2)与序列表中SEQ ID NO：4限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有启动所述缺磷诱导基因转录功能的核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID NO：4由1232个碱基组成。

本发明缺磷诱导基因的编码蛋白(AtAPL1)，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物吸磷能力功能的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1由279个氨基酸残基组成。

所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

含有本发明基因和启动子的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增本发明基因和启动子中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种提高植物吸磷能力的方法。

本发明所提供的提高植物吸磷能力的方法，是将所述缺磷诱导基因AtAPL1或与AtAPL1具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，植物吸磷能力获得提高。

在上述提高植物吸磷能力的方法中，所述缺磷诱导基因AtAPL1既可为AtAPL1的cDNA序列，也可为AtAPL1的基因组基因序列；与AtAPL1具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列，是将AtAPL1的cDNA或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

所述缺磷诱导基因AtAPL1或其同源序列可通过含有AtAPL1或其同源序列的植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pJIT163-hGFP、pCAMBIA系列载体、PER8、PX6、pBI系列载体、pBin系列载体或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

使用AtAPL1或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子；所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，玉米Ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号：NM_118848.2，GI：30687489)和NapinA(GenBank号：M64633.1，GI：349405)启动子；所述诱导型启动子可为受ABA、乙烯或化学等诱导的启动子；上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

其中，以pJIT163-hGFP为出发载体，构建的含有AtAPL1的植物表达载体为pBINPLUS::AtAPL1。

携带有本发明缺磷诱导基因AtAPL1或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

此外，通过将转化有本发明缺磷诱导基因AtAPL1或与AtAPL1具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。

本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于拟南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、蓖麻、马铃薯或烟草等双子叶植物，也可来源于玉米、水稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。

本发明提供了一个来源于拟南芥的缺磷诱导基因AtAPL1及其编码蛋白。转基因实验证明，AtAPL1过表达株系的含磷量极显著高于野生型植株，AtAPL1过表达后增加了转基因植株对磷的吸收，从而可改善植株的磷营养状况，使得植株的株高、荚数和粒数与野生型植株相比均得到明显增加。此外，由于过表达AtAPL1可增加植物的吸磷能力，因而在同样的土壤肥力条件下，AtAPL1转基因植物可以少施肥料，减少土壤污染，节约自然资源。本发明的基因及其编码蛋白将在植物，特别是油菜、棉花、小麦、水稻和番茄等粮食和经济作物的品种改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1A为拟南芥在缺少N、P、K、Mg、Fe不同营养元素胁迫处理3天后AtAPL1基因在根和叶中表达水平的RT-PCR检测结果

图1B为拟南芥在2.5mM磷和0mM磷条件下AtAPL1基因在不同时间段根和叶中表达水平的RT-PCR检测结果

图1C为拟南芥在不同磷浓度下处理3天后AtAPL1基因在根和叶中的表达水平的RT-PCR检测结果

图2为含有缺磷诱导基因AtAPL1的启动子及GUS基因的重组载体P_AtAPL1::GUS的结构示意图

图3为转P_AtAPL1::GUS拟南芥在正常和缺磷条件下培养的植株的GUS染色结果

图4为转P_AtAPL1::GUS拟南芥在缺磷条件下培养的植株各个组织的GUS染色结果

图5为缺磷诱导基因AtAPL1过表达载体pBINPLUS::AtAPL1的结构示意图

图6为5个成熟期AtAPL1过表达拟南芥株系与野生型植株地上部含磷量的统计结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

实施例1、缺磷诱导基因AtAPL1的获得

在ATS培养基(配方：5mM KNO₃，2mM MgSO₄，2mM Ca(NO₃)₂，2.5mM KH₂PO₄，70μMH₃BO₃，14μM MnCl₂，1μM ZnSO₄，0.5μM CuSO₄，10μM NaCl，0.2μM Na₂MoO₄，40μM FeSO₄，43mM蔗糖，4.7mM MES，8g/1000mL琼脂，pH调成6.0)上播种拟南芥野生型Columbia，4℃春化3天后，在21℃，16h光照/8h黑暗的光照培养间生长7天，然后分成两组，分别转移至正常ATS培养基和缺磷的ATS培养基中处理3天，最后提取在两种生长条件下的植株的根系RNA进行拟南芥ATH1基因组芯片杂交(拟南芥芯片从Affymetrix公司购买，芯片杂交由上海晶泰生物技术有限公司完成)。对芯片杂交数据进行分析，其中一个基因(位点：At1g17710)在缺磷诱导时的表达强度比在正常供磷条件下增加142倍。然后，对该基因序列进行BLASTX分析，分析结果显示该基因与番茄、水稻和拟南芥中编码酸性磷酸酶的基因在氨基酸水平上的的同源性分别高达75％、62％和59％。因此，将该基因命名为类酸性磷酸酶基因AtAPL1(Acid phosphatase-likegene 1)。该基因位于拟南芥第一染色体，其基因组基因具有序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列，由1459个碱基组成，自5′端第44-190位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第191-314位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第315-436位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第437-508位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5′端第509-710位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5′端第711-887位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5′端第888-1256位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端第1-43位碱基为该基因组基因的5’非编码区(UTR)，自5′端第1257-1459位碱基为该基因组基因的3’非编码区。该基因的cDNA具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列，由840个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-837位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，蛋白分子量大小约为31.6kD。

实施例2、AtAPL1专一受缺磷诱导表达的检测

一、不同缺素处理

为检测在拟南芥根和叶中AtAPL1基因的转录启动是否只受磷调控，对野生拟南芥幼苗分别进行缺氮、磷、钾、镁、铁处理(缺P、Mg和Fe处理方法：在ATS培养基中分别不加KH₂PO₄，MgSO₄和FeSO₄；缺N处理方法：用5mM KCl和2mM CaCl₂取代ATS培养基中的5mM KNO₃和2mM Ca(NO₃)₂，以补偿培养基中Ca²⁺的浓度；缺K处理方法：用2.5mM NH₄NO₃和2.5mM NaH₂PO₄取代ATS培养基中的5mM KNO₃和2.5mM KH₂PO₄，以补偿培养基中的N和P离子浓度)，具体方法为：首先，将野生型拟南芥种子用1％的NaClO消毒15分钟，然后用灭菌的蒸馏水清洗4次，再用1g/1000mL的琼脂悬浮后，播种在磷含量在2.5mM的ATS正常培养基上。4℃春化3天后，转移至16小时光照/8小时黑暗、22-24℃的培养间，培养皿垂直放置，当拟南芥在正常加磷的ATS培养基中生长7天后，再将其转移至上述分别缺N，P，K，Mg和Fe处理的ATS培养基和正常ATS培养基(对照，CK)中继续生长3天，然后收集叶片和根系，在液氮中速冻，用Trizol试剂提取总RNA，用RT-PCR法分析AtAPL1基因的表达水平，以AtACT2为量参，其中，PCR扩增AtAPL1的引物序列为F(上游引物)：5′-GCTTCTCCCAACAATGCC-3′和R(下游引物)：5′-TTCTCCTCTCCTTCCTCTGAT-3′；PCR扩增AtACT2的引物序列为F1(上游引物)：5′-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3′和R1(下游引物)：5′-CTCGGCCTTGGAGATCCACATC-3′。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1A所示，在缺氮、缺磷、缺钾、缺镁和缺铁胁迫处理植株中，只有在缺磷条件下可检测到AtAPL1基因的转录，证明AtAPL1基因在拟南芥根和叶中的转录受磷专一调控。

二、不同时间段处理

把在正常ATS培养基生长7天的拟南芥幼苗分别转移至正常ATS培养基和不加磷的ATS培养基生长不同时间(0小时(对照，ck)，6小时，12小时，1天，3天和5天)，在不同时间点取样(叶片和根系)，然后把在缺磷ATS培养基生长5天的幼苗重新转移至正常加磷的ATS培养基上继续生长1天和3天。在每个时间点取在正常ATS培养基和缺磷ATS培养基上生长幼苗的叶片和根系，在液氮中速冻，用Trizol试剂提取总RNA，用与步骤一相同的RT-PCR方法进行AtAPL1基因的表达谱分析。分析结果如图1B所示(“+”含磷，“-”不含磷)，缺磷后12小时AtAPL1即开始在叶片中上调表达，而在根中缺磷1天后AtAPL1上调表达，到缺磷5天后AtAPL1在根和叶中表达量达最大。当把在缺磷培养基中生长5天后的植株重新转移至磷充足的ATS培养基中，AtAPL1基因表达关闭，进一步证明AtAPL1基因的转录受磷专一调控。

三、不同磷浓度处理

为检测培养基中的磷浓度对AtAPL1基因表达丰度的影响，将野生型拟南芥的种子播种在正常加磷的ATS培养基中生长7天后，将幼苗转移至磷含量分别为0，0.05，0.1，0.25，1.0，2.5和10mM的ATS培养基中继续生长3天，然后收集叶片和根系，在液氮中速冻，用Trizol试剂提取总RNA，用与步骤一相同的RT-PCR方法进行AtAPL1基因的表达谱分析。分析结果如图1C所示，在根中，AtAPL1基因只在不加磷的ATS培养基中生长的植株中强烈表达；在叶片中，未加磷时表达量最大，随磷浓度的增加，AtAPL1基因的转录丰度下降，到正常供磷1mM或过量供磷10mM时还能检测到AtAPL1的转录产物。

实施例3、AtAPL1基因原位表达模式分析

用Promoter-GUS转基因的方法进行AtAPL1基因的原位表达模式分析，具体方法包括以下步骤：

一、AtAPL1基因启动子的分离

根据拟南芥的基因组序列，设计扩增AtAPL1基因启动子的特异引物F2(上游引物)：5′- GAATTCCTTACCTCAAGAAGAGTGTCG-3′(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)和R2(下游引物)：5′- GTCGACTCTATCAGATACAATG-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Sal I识别位点)，然后提取Columbia生态型拟南芥的基因组DNA并以此为模板，在引物F2和R2的引导下，PCR扩增AtAPL1基因的启动子片段并在序列的两端分别添加限制性内切酶EcoR I和Sal I识别位点，PCR扩增体系为：DNA 2μl(约10ng)，10×ExTaq缓冲液2.5μl，dNTPs(2.5mM)2.0μl，引物F2(10μM)0.5μl，引物R2(10μM)0.5μl，ExTaq(5u/μl，购自TaKaRa公司)0.2μl，H₂O 17.3μl。PCR扩增程序为：先94℃预变性5分钟；然后94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1.5分钟，共35个循环；最后72℃延伸5分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增得到大小约位1232bp的DNA片段，与预期结果相符，回收并纯化该目的片段，将其连接到pMD18-T(购自Takara公司)载体中，得到携带AtAPL1基因启动子的重组载体，对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确的AtAPL1基因启动子片段，具有序列表中SEQ ID NO：4的核苷酸序列，由1232个碱基组成，将该启动子命名为P_AtAPL1。

二、含有P_AtAPL1和GUS基因的载体P_AtAPL1::GUS的构建及其转基因植株的获得

1、含有P_AtAPL1和GUS基因的载体P_AtAPL1::GUS的构建

用限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切步骤一获得携带AtAPL1基因启动子的重组载体，回收纯化得到1232bp的启动子片段，再将其与经同样酶双酶切的载体pCAMBIA1381(CAMBIA，Canberra，Australia)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，经EcoR I和Sal I双酶切鉴定和菌落PCR鉴定，得到插入序列及位置均正确的携带AtAPL1基因启动子的重组载体，将其命名为P_AtAPL1::GUS，该载体的结构示意图如图2所示(Promoter表示P_AtAPL1)。

2、P_AtAPL1::GUS转基因植株的获得

将P_AtAPL1::GUS转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，用扩增启动子的引物F2和R2进行菌落PCR鉴定，经扩增得到大小为1232bp DNA片段的为阳性克隆，对阳性克隆进行大量培养，通过蘸花浸染法转化拟南芥，当代收获的为T₀代转基因种子。将T₀代转基因种子在含有50mg/L抗生素Hygromycin和150mg/LTimenten的MS培养基上进行筛选，得到T₁代转基因阳性植株，成熟后得到T₁代种子。再将T₁代种子播种在含有50mg/L抗生素Hygromycin的MS培养基上进行筛选，转基因阳性植株成熟后得到T₂代种子。最后，将T₂代种子播种在含有50mg/L抗生素Hygromycin的MS培养基上，全部为绿苗的株系为P_AtAPL1::GUS转基因纯合系，其所获得的种子为T₃代。

三、P_AtAPL1启动GUS基因表达

选步骤二获得的5个T₃代P_AtAPL1::GUS转基因纯合系，将种子播种在ATS培养基上使其发芽，生长7天后，将幼苗分别移到正常ATS培养基(对照)或缺磷的ATS培养基(不含KH₂PO₄的ATS培养基)中继续生长3天，然后取整株进行GUS染色，用70％的乙醇脱绿后，进行镜检观察并照相。检测结果如图3所示，正常供磷条件下整株检测不到GUS活性，而在缺磷条件下，叶片、表皮毛和根系都能检测到很强的GUS活性，特别是在开花期的根、茎、叶、花和幼嫩的荚果全部检测到很强的GUS活性(见图4)，在花器官中，花萼、花丝、部分花粉粒和柱头被染色。

实施例4、检测过表达AtAPL1对植物的影响

用下述转基因试验检测过表达AtAPL1对植物的影响，具体过程包括以下步骤：

一、AtAPL1基因的全长CDS的获得

以缺磷处理的拟南芥根系的cDNA为模板，在引物F3(上游引物)：5′- GGATCCATGGCTAAGAATAACAAC-3′(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)和R3(下游引物)：5′- CCCGGGTCACTTGACCAAATTTAAAG-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Sma I识别位点)的引导下，PCR扩增两端分别添加限制性内切酶BamH I和Sma I识别位点的AtAPL1基因的全长cDNA片段，其中，PCR扩增体系为：cDNA 2μl(约10ng)，10x ExTaq缓冲液2.5μl，dNTPs(2.5mM)2.0μl，引物F3(10μM)0.5μl，引物R3(10μM)0.5μl，ExTaq(5u/μl)0.2μl，H₂O 17.3μl。PCR扩增程序为：先94℃预变性3分钟；然后94℃50秒，52℃50秒，72℃1分钟，共35个循环；最后72℃延伸5分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增得到大小约852bp的DNA片段，与预期结果相符，回收并纯化该目的片段，将其连接到pMD18-T(购自Takara公司)载体中，对该重组载体进行测序，测序结果表明获得了序列正确的AtAPL1基因全长CDS，具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列，将该携带有AtAPL1基因全长CDS的重组载体命名为pMD18-AtAPL1。

二、利用35S强启动子构建过表达载体

用限制性内切酶BamH I和Sma I对步骤一获得的携带有AtAPL1基因全长CDS的重组载体pMD18-AtAPL1进行双酶切，回收并纯化852bp的AtAPL1基因全长CDS片段(带2个酶切位点)，将其与经相同酶双酶切切去hGFP的载体pJIT163-hGFP(Liu etaL.Molecular and functional characterization of sulfiredoxin homologs fromhigher plants.Cell Research(2006)16：287-296)连接，转化大肠杆菌，酶切和菌落PCR鉴定正确的质粒用Xho I和Kpn I双酶切，得到带有目的片段的中间载体片段，再与Sal I(与Xho I是同尾酶)和Kpn I双酶切的pBINPLUS连接，将连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，经BamH I和Sma I双酶切鉴定和菌落PCR鉴定，得到插入序列及位置均正确的携带AtAPL1基因全长CDS的重组载体，将其命名为pBINPLUS::AtAPL1，该载体的结构示意图如图5所示。

三、AtAPL1转基因株系生育性状及含磷量的统计

将pBINPLUS::AtAPL1转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，用扩增全长CDS的引物F3和R3进行菌落PCR鉴定，经扩增得到大小为852bp(带2个酶切位点)DNA片段的为阳性克隆，对阳性克隆进行大量培养，通过蘸花浸染法转化拟南芥，经3代筛选获得5个AtAPL1基因过表达转基因纯合系(OE22-8、OE28-12、OE34-2、OE8-7和OE25-1)，当植株接近成熟时，调查这5个AtAPL1过表达株系与野生型植株的生育性状(株高、单株荚数和单荚粒数)，每个株系统计10-20株，平行测3次，其中3个过表达株系OE28-12、OE34-2和OE25-1的株高与野生型植株的差异达到显著水平，而且这3个过表达株系的单株荚数显著高于野生型植株(Col)，所有过表达株系的单荚粒数(单株所有荚的平均粒数)极显著高于野生型植株(见表1，**表示过表达株系与野生型之间的差异达1％的极显著水平，*表示过表达株系与野生型之间的差异达5％的显著水平)。测定上述AtAPL1过表达株系和野生型植株的含磷量，结果如图6所示(**表示过表达株系与野生型之间的差异达1％的极显著水平，*表示过表达株系与野生型之间的差异达5％的显著水平)，其中4个AtAPL1过表达株系的含磷量极显著高于野生型植株，说明基因AtAPL1过表达后增加了转基因植株对磷的吸收，从而改善了植株的磷营养状况，使得植株的株高、荚数和粒数也得到明显增加。

表1 5个AtAPL1基因过表达转基因纯合系的株高、单株荚数和单荚粒数的统计结果

过表达株系	株高(cm)	单株荚数	单荚粒数
过表达株系	株高(cm)	单株荚数	单荚粒数	ColOE 22-8OE 28-12OE 34-2OE 8-7OE 25-1	23.8±3.624.0±1.026.7±2.2^26.5±2.1^24.8±1.026.6±2.5^*	45.2±12.133.4±3.361.0±19.7^75.6±13.4^52.2±8.573.0±25.0^*	38.2±3.948.4±1.5^46.3±2.7^47.7±3.0^46.2±1.3^45.8±3.0^**

序列表

<160>4

<210>1

<211>279

<212>PRT

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

Met Ala Lys Asn Asn Asn Ile Val Ile Val Phe Asp Phe Asp Lys Thr

1 5 10 15

Ile Ile Asp Val Asp Ser Asp Asn Trp Val Val Asp Glu Leu Gly Phe

20 25 30

Thr Asp Leu Phe Asn Gln Leu Leu Pro Thr Met Pro Trp Asn Ser Leu

35 40 45

Met Asn Arg Met Met Lys Glu Leu His Asp His Gly Lys Thr Ile Glu

50 55 60

Glu Ile Lys Gln Val Leu Arg Arg Ile Pro Ile His Pro Arg Val Ile

65 70 75 80

Pro Ala Ile Lys Ser Ala His Ala Leu Gly Cys Glu Leu Arg Ile Val

85 90 95

Ser Asp Ala Asn Thr Leu Phe Ile Glu Thr Ile Ile Glu His Leu Gly

100 105 110

Ile Gly Glu Phe Phe Ser Glu Ile Asn Thr Asn Pro Gly Leu Val Asp

115 120 125

Glu Gln Gly Arg Leu Ile Val Ser Pro Tyr His Asp Phe Thr Lys Ser

130 135 140

Ser His Gly Cys Ser Arg Cys Pro Pro Asn Met Cys Lys Gly Leu Ile

145 150 155 160

Ile Asp Arg Ile Gln Ala Ser Leu Thr Lys Glu Gly Lys Thr Ser Lys

165 170 175

Met Ile Tyr Leu Gly Asp Gly Ala Gly Asp Tyr Cys Pro Ser Leu Gly

180 185 190

Leu Lys Ala Glu Asp Tyr Met Met Pro Arg Lys Asn Phe Pro Val Trp

195 200 205

Asp Leu Ile Ser Gln Asn Pro Met Leu Val Lys Ala Thr Val Arg Asp

210 215 220

Trp Thr Asp Gly Glu Asp Met Glu Arg Ile Leu Met Glu Ile Ile Asn

225 230 235 240

Glu Ile Met Ser Ser Glu Glu Gly Glu Glu Asn Asp Lys Met Leu Ser

245 250 255

Ser Glu Asn Cys Lys Ile Ser Val Gly Ile Val His Glu Pro Ile Gln

260 265 270

Val Pro Leu Asn Leu Val Lys

275

<210>2

<211>840

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

atggctaaga ataacaacat cgtgatcgtc ttcgattttg acaagacaat catcgatgta 60

gacagcgata attgggtcgt ggatgaactt ggtttcactg atttgttcaa ccagcttctc 120

ccaacaatgc cttggaactc tctcatgaat cggatgatga aggagcttca tgatcatggt 180

aaaaccattg aagaaatcaa acaagtcctt aggagaatcc caattcatcc acgtgtcatc 240

ccagccatca aatctgctca tgctttaggg tgcgagctga gaatagtgag cgacgcaaac 300

acgttgttca tcgaaacaat cattgaacat ctcgggattg gtgagttttt ctccgagatt 360

aacacaaatc caggacttgt agatgaacaa ggaagattaa tagtctctcc ttaccatgac 420

ttcaccaaat cttctcatgg ttgctctcgt tgccctccta acatgtgcaa gggtttaata 480

atcgatagga ttcaagcttc tctaacgaaa gaagggaaga cgagcaagat gatctatctt 540

ggagatggtg ctggtgatta ctgtcccagt cttggactca aagctgaaga ttacatgatg 600

ccaaggaaga atttcccggt ttgggatttg attagtcaaa atcccatgtt ggttaaggct 66a

accgttagag attggaccga tggagaagat atggagagga tactaatgga aataatcaac 720

gaaattatgt catcagagga aggagaggag aatgacaaga tgttgagctc tgaaaactgc 780

aagatatctg ttgggattgt tcatgaacct attcaagttc ctttaaattt ggtcaagtga 840

<210>3

<211>1459

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

gaaatcgata aaacagtacc tataaaacat tgtatctgat agaatggcta agaataacaa 60

catcgtgatc gtcttcgatt ttgacaagac aatcatcgat gtagacagcg ataattgggt 120

cgtggatgaa cttggtttca ctgatttgtt caaccagctt ctcccaacaa tgccttggaa 180

ctctctcatg gtttgttttg ttcatccatc tctaactctt ctctgtttcg gtttctctag 240

ggctttgtta cgttggtcta tatatgttca tcagtcataa cactaaatcc ttatttggtt 300

ttatttcaaa acagaatcgg atgatgaagg agcttcatga tcatggtaaa accattgaag 360

aaatcaaaca agtccttagg agaatcccaa ttcatccacg tgtcatccca gccatcaaat 420

ctgctcatgc tttagggtaa aaatccatgt taaattcctc attcttcgtt tgataacacg 480

gtactgaatc atacgacata atatttaggt gcgagctgag aatagtgagc gacgcaaaca 540

cgttgttcat cgaaacaatc attgaacatc tcgggattgg tgagtttttc tccgagatta 600

acacaaatcc aggacttgta gatgaacaag gaagattaat agtctctcct taccatgact 660

tcaccaaatc ttctcatggt tgctctcgtt gccctcctaa catgtgcaag gtactgcagt 720

tacactaatc tcatattgat tgattagttc aaaagataag atttgtcatt actattttca 780

gggattttgg gaaacttttt ggtgtaaaat atattatctt tgattctgtt atgagtcaat 840

atggacctat ctgtgtgcta aattaatact aaattttgtt tatacagggt ttaataatcg 900

ataggattca agcttctcta acgaaagaag ggaagacgag caagatgatc tatcttggag 960

atggtgctgg tgattactgt cccagtcttg gactcaaagc tgaagattac atgatgccaa 1020

ggaagaattt cccggtttgg gatttgatta gtcaaaatcc catgttggtt aaggctaccg 1080

ttagagattg gaccgatgga gaagatatgg agaggatact aatggaaata atcaacgaaa 1140

ttatgtcatc agaggaagga gaggagaatg acaagatgtt gagctctgaa aactgcaaga 1200

tatctgttgg gattgttcat gaacctattc aagttccttt aaatttggtc aagtgattga 1260

tgaaaacaag aaattgaaga tttttgtttt gtattcgaga tattcttcat gcaattatgt 1320

aagatgtcta aagatgaatg gttcatgcac gttaagtgat ttcttttttt tgtatacgta 1380

attaagggat ctccttcgga ggagcgtcta gctaccacgg aagcttaatg ggctcatttt 1440

tcgtatcact tctttaatt 1459

<210>4

<211>1232

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>4

cttacctcaa gaagagtgtc gagggcaaca ttaatattac gtaacttaat ttgatttctg 60

ctaagaaaaa tgaaatgttt gccaattgag gtagtggatg cagtgaaatg tagttttttc 120

gtggtgccac aagatttaca actagatata aaatattatg ttccttgttc tatatcacaa 180

tctaaagaca cgaggaagag aaataaaaga agcttgtttt gatgcgtctc ttctgataat 240

gtctgataga agtatattat tttatagata gaggattaca cacacacaca cacatttgtt 300

ttgttgtcat gctaagactt gtttggttag aatactttta attgttattg aagaaatcaa 360

atacagatga atattgaaag atgtggctac caaatgaaaa gatgatgtga tccttaaccc 420

ctagaatatt ctttctgctt acaattgtga tttgtcactc aatattcctt ccaagttgca 480

accttattcc ttcctagtgc cttctgatgc aattcccata tatttcgata aatttcatgt 540

ttttaagttt aaatccaatc gagtatgaat gttgtggttt ttacaattaa ctttatcgat 600

caaatgtgtg acataaagca actatcccat gcacatttat ttatttttca tcccatgata 660

aatcaaaact tattcatacg ataaacacca atatattcat tttgcatttt ttactttttt 720

tgggttgcgt attaaaagaa aaataaacct ttttgggtaa cggattttat tttcctttaa 780

taaaaatgaa aataatgacg aaaacgcata aataggtgga atattctttt tttttatctt 840

attccattcc ggtgtcttct caaatctcaa ctgcctaaat cccactaaat aaaactttta 900

acaagccaaa ctaaataata cccacaaaat aaaccaaaga gtcatcaaca ccgttggatc 960

agtataccta gtcaatgttt gacacataaa cgtcatcaga tctaacggtt caaaagatac 1020

gaatcatatc agattaggat tcttaattat ctatcttacc ttgcgtttga cggtaagtaa 1080

tattccaatg gcatcttcct cgaaagatcc ctattcgtct ctagcctttt caccttctct 1140

cactcgtata tatatcacat tcttcttctc caaattccat aatcatacag aaatcgataa 1200

aacagtacct ataaaacatt gtatctgata ga 1232

Claims

1、来源于拟南芥的缺磷诱导基因，其cDNA是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

2、根据权利要求1所述的基因，其特征在于：其基因组基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列；

3、权利要求1或2所述基因编码的蛋白，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

4、权利要求1或2所述基因的启动子，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列；

5、含有权利要求1或2所述基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌。

6、含有权利要求4所述启动子的表达载体、转基因细胞系及宿主菌。

7、一种提高植物吸磷能力的方法，是将权利要求1或2所述缺磷诱导基因或与该基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，植物吸磷能力获得提高。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述缺磷诱导基因或与该基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列通过含有该基因或与该基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体为pJIT163-hGFP、p3301、PER8、PX6、pBI系列载体、pBin系列载体、pCAMBIA系列载体、pUC系列载体或pBluescript系列载体。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体为pBINPLUS::AtAPL1。

10、根据权利要求7-9任一项所述方法，其特征在于：所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。