CN1302110C

CN1302110C - 水稻Osfad8编码序列及其应用

Info

Publication number: CN1302110C
Application number: CNB2005100270815A
Authority: CN
Inventors: 明凤; 王敬文; 沈大稜
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2005-06-23
Filing date: 2005-06-23
Publication date: 2007-02-28
Anticipated expiration: 2025-06-23
Also published as: CN1724668A

Abstract

本发明属分子生物学、基因工程技术领域，具体提供了一种在水稻中表达的ω-3脂肪酸脱氢酶(fad8)的编码序列及其在提高植物18碳三烯酸(α-亚麻酸)含量的应用。本发明涉及包含上述基因的重组表达载体。还涉及所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物。本发明将所说基因在植物中表达，所获得的转基因植物α-亚麻酸的含量显著增高。

Description

水稻Osfad8编码序列及其应用

技术领域

本发明属分子生物学、生理学以及基因工程等技术领域，具体涉及一种在水稻中表达的ω-3脂肪酸脱氢酶(水稻ω-3脂肪酸脱氢酶，ω-3 fatty acid desaturase，Osfad8)的克隆，拷贝数分析，基因表达模式分析，转基因载体的构建，植物转化，转基因植株的获得以及相应的生理生化特性的鉴定。

背景技术

低温是影响植物生长、发育及其地理分布的重要环境限制因素之一。大多数热带和亚热带植物由于缺乏对低温的适应能力，当环境温度低于10℃时就会受到伤害，严重影响植物的正常生长、发育甚至造成死亡。在降温过程中，植物膜系统是最先受到伤害的部位。由此，膜组分与抗冷性的关系成为人们的关注焦点。当前在生物膜的研究方面，分子生物学手段越来越受到人们的关注，ω-3脂肪酸脱氢酶是当前研究的热点之一。它是一种形成三烯脂肪酸的脱氢酶，存在于内质网膜与质膜，分别由fad3，fad7和fad8三种基因编码。三烯脂肪酸在内质网及质体中的含量不仅受在膜中从头合成的影响而且在这些膜之间还可以相互转化。Kodama等(1994)将从拟南芥上分离的叶绿体-3脂肪酸脱氢酶基因AtFAD7转移到烟草(Nicotiana tabacum)中，使烟草中三烯脂肪酸成分增加，该转基因烟草抗寒性明显提高。Shimad等(2000)把烟草的ω-3脂肪酸脱氢酶基因NtFAD3转入水稻中同样也发现转基因水稻幼苗的叶片及根中的18:3(α-亚麻酸)增加，并表现出轻微的耐冷性增强。此外，ω-3脂肪酸脱氢酶的产物之一α-亚麻酸属ω-3不饱和脂肪酸，具有抗血栓、抗血凝、调节血液粘稠度、降低血液中甘油三酯和胆固醇含量的作用，是降血压、降血脂药物和保健品的重要原料。

本发明研究了一种从水稻中克隆催化生成α-亚麻酸的ω-3脂肪酸脱氢酶(Osfad8)，转入烟草后提高α-亚麻酸含量的技术。应用该技术不仅可提高α-亚麻酸在植物中的含量，预期可以使植物在较低的温度下正常生长，可扩大亚热带植物(如水稻)等的栽培范围。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本发明申请中提及的水稻Osfad8序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的水稻基因Osfad8(SEQ ID NO.1)，该基因是一个ω-3脂肪酸脱氢酶基因。

本发明的第二目的是提供这种水稻蛋白OsFAD8编码序列在利用转基因技术提高植物α-亚麻酸含量的应用。

本发明一方面从水稻分离出了一种DNA分子，其核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示。它是一种ω-3脂肪酸脱氢酶基因，该基因的长度为1239bp。

本发明另一方面得到了一种蛋白质分子，它编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽，它由413个氨基酸残基组成，分子量47011.13道尔顿，pI为8.61。

本发明还提供了一种检测Osfad8 mRNA表达模式的方法，其步骤如下：

(1)将水稻幼苗在25℃，20℃和15℃下分别处理2天，提取水稻的总RNA(Trizol，市售)。

(2)利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA，然后根据Osfad8的开放读框的第1-25，1239-1218的特异序列设计引物，进行PCR。

本发明还提供了一种利用转基因技术将编码具有水稻OsFAD8酶活性的核苷酸序列转化入烟草以提高α-亚麻酸含量的方法，其步骤如下：

(1)将编码具有水稻OsFAD8基因的开放读框可操作的连接于植物表达载体，形成含有水稻Osfad8基因的植物表达载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在25±2℃条件下，暗培养2天；

(3)通过筛选，PCR鉴定，获得水稻OsFAD8基因的转化细胞并再生转基因植株。含有水稻OsFAD8基因的转基因植株的三烯脂肪酸有较大程度的提高。

本发明还提供了一种用于检测样品中水稻ω-3脂肪酸脱氢酶拷贝数的方法，它包括用SEQ ID NO.1所示序列与样品杂交，然后检测探针是否发生了结合，该样品是水稻基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸序列。

本发明还提供了用于鉴定转基因烟草的核酸分子，它包含SEQ ID NO.1所示的DNA分子中246-263个连续的核苷酸和1069-1086个连续核苷酸的反向互补序列。

本发明还提供了一种用于检测样品中是否存在水稻ω-3脂肪酸脱氢酶核苷酸序列的方法，它包括用前述核酸子与样品进行PCR反应，然后检测是否扩增出目的片段；样品为转基因烟草基因组DNA。

本发明还提供了一种测定转基因烟草中脂肪酸含量的方法，其步骤如下：

(1)在样品中加入1ml 2.5％(v/v)H₂SO₄/Methanol，置于80℃90min，然后加1.5ml0.9％NaCl和1ml己烷，混匀后，低速离心，取有机相1μl进行气相色谱测定。

(2)气相色谱测定程序：150℃3min，以15℃/min的速度升温至210℃，210℃保持12min。

在本发明中，术语“水稻Osfad8基因的开放读框”指编码完整的水稻OsFAD8蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-1239位的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1中第1-1239位的核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中第1-1239位的核苷酸序列同源性低至约85％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其他植物细胞。

此外，还可用Southern印迹法技术分析水稻OsFAD8基因在细胞中存在的数量。

本发明的水稻OsFAD8蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后将各次扩增出的片断按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组方法来大批量地获得该序列。这通常是将其克隆入载体，在转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离到有关序列。

表1为本发明的水稻OsFAD8与玉米Zea mays FAD8的核苷酸序列(GenBank AccessionNo.D63953)的同源比较(FASTA)表。

表2为本发明的水稻OsFAD8与玉米Zea mays FAD8的氨基酸序列(GenBank AccessionNo.D63953.1)的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。

表3为转基因烟草的脂肪酸含量：WT为野生型烟草；EV为转空载体的烟草；T1，T2，T3为正向转入外源Osfad8的烟草植株，每一样品平行测定2-3次。

附图说明

图1为水稻Osfad8基因的Southern blot鉴定：lane1 DraI酶切，lane2 HindIII酶切。

图2为RT-PCR鉴定Osfad8的表达模式：A，RT-PCR结果；B，RT-PCR的相对定量分析：lane1：25℃，lane2：20℃，1ane3 15℃。

图3为转基因植株的PCR鉴定：EV为转空载体的烟草；T1，T2，T3为正向转入外源Osfad8的烟草植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor Labortary Press，1989)中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

水稻Osfad8基因的克隆

1.将室温(25℃)生长的水稻幼苗低温(20℃或者15℃)处理2天后立即置于液氮中冷冻保存，应该注意到本实验所选取的材料与选用的水稻品种没有必然的联系。

2.DNA的提取

取部分组织，用研钵研碎，加入盛有预热的裂解液的50ml离心管，65℃保温40min，离心。上清中加入RNaseA(0.5μg/ml)，65℃消化RNA 1h；以等体积的酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽一次蛋白，以乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤两遍，最后用TE溶液溶解DNA。用0.8％琼脂糖凝胶检测DNA的质量。

3.全长基因的克隆

根据水稻基因组中假定的ω-3脂肪酸脱氢酶的序列，设计引物，采用RT-PCR方法从水稻cDNA中扩增出一条1.2kb左右的条带。将PCR产物回收，连接到T-载体上，用SP6和T7做为通用引物进行测序。将测序结果提交至NCBI非冗余数据库，BLAST结果表明该序列和其他物种中相应的脂肪酸脱氢酶序列高度保守。

实施例2

水稻Osfad8基因的序列信息与同源性分析

本发明新的水稻Osfad8基因的长度为1239bp，详细序列见SEQ ID NO.1。该基因编码的多肽由413个氨基酸残基组成，分子量47011.13道尔顿，pI为8.61。详细序列见SEQID NO.2。

将水稻Osfad8全长基因的编码区序列及其编码的蛋白质序列用BLAST程序再Non-redundant GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GeneBank CDS translations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检测，结果发现它与玉米Zea mays FAD8存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它与玉米Zea mays FAD8基因的mRNA编码序列(GeneBank AccessionNo.D63953.1)有一定的同源性(见表1)，在氨基酸水平上，它与玉米Zea mays FAD8蛋白的氨基酸残基有85％的相似性(见表2)。由上可见，该Osfad8基因与玉米Zea mays FAD8基因存在较高的同源性。

实施例3

水稻Osfad8基因的拷贝数分析

以CTAB方法大量抽提水稻基因组DNA，取10μg DNA分别用DraI和HindIII酶切，以0.8％琼脂糖凝胶进行片段分离，将DNA转到Hybond-N+尼龙膜上，固定；以水稻Osfad8基因为探针进行Southern杂交，鉴定它在水稻中的拷贝数，结果表明，Osfad8基因为低拷贝。

实施例4

水稻Osfad8表达模式分析

用RT-PCR的方法检测不同温度处理后，水稻幼苗(二叶期)分别置于25℃，20℃，15℃ 2天，然后提叶片和根的总RNA，反转录，然后根据Osfad8的开放读框的第1-25，1239-1218的特异序列设计引物，进行PCR。电泳之后，用相对定量软件(天程公司)进行分析。结果表明，室温下，Osfad8几乎不表达，随着温度降低至20℃和15℃，Osfad8 mRNA的积累量显著增高，为25℃时的4-5倍，且它只在叶片中表达，根中不表达。Osfad8基因的表达模式和Gibson(1994)等人报道的拟南芥Ntfad8以及Berberich(1998)等人报道的玉米Zmfad8的表达模式一致，再次证明Osfad8为水稻中的ω-3脂肪酸脱氢酶。

实施例5

水稻Osfad8基因在烟草细胞中进行真核表达及转基因植株的表型鉴定

含目的基因(水稻Osfad8基因)表达载体的构建

根据水稻Osfad8基因全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反向引物上分别引入限制性内切酶识别位点(视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将水稻Osfad8基因正向克隆到双元表达载体pBI121中，在保证阅读框架的前提下，将其转入农杆菌中。利用叶圆盘法技术转化模式植物烟草。

利用叶盘法转化烟草

1、用灭菌牙签挑取YEB选择培养基上的阳性克隆，接种于2mlYEB液体(利福平40mg/L，链霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L)，28℃ 200rpm振荡培养24-36h；

2、室温下4000g离心10min；

3、弃上清，菌体用1/2MS液体培养基重悬，稀释到原体积的5-20倍，使OD₆₀₀＝0.5左右；

4、取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去其叶主脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；

5、将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；

6、将侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48h；

7、将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+cef250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天见愈伤组织形成；

8、约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基上(1/2MS+NAA(0.5mg/L+Kan50mg/L+cef250mg/L)；

9、待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，温室中培养。

对转基因植株进行分子鉴定

以CTAB方法小量抽提部分转基因植株的基因组DNA，以转pBI121空载体的烟草作为对照，根据水稻Osfad8基因的特异序列设计引物，进行PCR检测(部分结果)。结果表明约有80％的烟草携带有外源水稻Osfad8基因。

转基因植株进行表型鉴定

总共得到约120棵转基因植株，其中有三棵转基因烟草的α-亚麻酸的含量比野生型和转空载型分别提高了约41％和17％，而相应的OsFAD8(ω-3脂肪酸脱氢酶)的底物十八碳二烯酸的含量则相对下降，此外，十八碳和十六碳三烯酸的总含量也增高了约22％左右。推测外源fad8基因在宿主烟草中实现了超量表达，增加了烟草中的α-亚麻酸的含量。试验结果表明，实施例1中得到的水稻Osfad8基因为有功能的基因，可以用于利用转基因技术改良水稻脂肪酸含量的研究和产业化中。

表1

水稻Osfad8基因核苷酸序列与玉米Zea mays FAD8基因核苷酸序列的同源性比较

gi|2446995|dbj|D63953.1|Zea mays FAD8 mRNA for fatty acid desaturase，partial cds

Length＝1494

Score＝351 bits(177)，Expect＝3e-93

Identities＝351/409(85％)

Strand＝Plus/Plus

Query：190 ttcgacccgggcgcggcgcccccgtttggtctggccgacatccgcgccgctatccccaag 249

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Sbjct：122 ttcgacccgggggcgccgccgccgttcgggctggcggagatccgcgcggccatccccaag 181

Query：250 cactgttgggtgaaggacccctggcgatccatggggtacgtgctgcgcgacgtggtggtg 309

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Sbjct：182 cactgctgggtcaaggacccctggcgctccatggcctacgtgctgcgcgacgtcgtcgtc 241

Query：310 gtgttcgccctcgctgccgccgccgcgcgcctccacagctgcctcgcctggccgctctac 369

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Sbjct：242 gtcctggggctcgccgcggccgccgcgcgcctcgacagctggctcgtctggccgctctac 301

Query：370 tgggcggcgcagggaaccatgttctgggcgctcttcgtcctcggccacgactgcgggcac 429

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Sbjct：302 tgggccgcgcagggcaccatgttctgggcgctcttcgtcctcggccacgactgtggacac 361

Query：430 gggagcttctccaacaactcgaggctcaacagcgtgatgggccacatactccactcctcc 489

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Sbjct：362 gggagcttctcgaacaaccccaagctgaacagcgtggtcggacacatactccattcctcc 421

Query：490 atcctcgtaccctaccatggctggaggattagccacaggacgcatcatcagaaccatggc 549

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Sbjct：422 attcttgtcccgtaccacggatggaggattagccacaggacgcaccatcaaaaccacggc 481

Query：550 catgtcgacaaggatgagtcctggcatcccctccccgagcggctgtaca 598

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Sbjct：482 cacgttgagaaggacgagtcctggcacccgctaccagagaggctgtaca 530

Score＝165 bits(83)，Expect＝4e-37

Identities＝173/203(85％)

Strand＝Plus/Plus

Query：889 tacttgcaccatcacggccacaacgacaagctgccctggtaccgtggcaaggaatggagc 948

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Sbjct：821 tacttgcaccatcatggccatgaagacaagcttccctggtaccgtggacaggaatggagt 880

Query：949 tatttgcggggaggactgacgacagtggacagggactatgggtggatcaacaacatccac 1008

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Sbjct：881 tatctgcgtggaggactgacgacgctcgaccgggactatggactgattaacaatatccac 940

Query：1009 cacgacatcgggacacatgtcattcaccatcttttcccccaaatcccgcattaccatcta 1068

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Sbjct：941 catgacattggaactcatgtcatccatcaccttttccctcaaatcccgcattaccatctc 1000

Query：1069 attgaggcgacggaagcagcaaa 1091

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Sbjct：1001 attgaggcgaccgaggcagcaaa 1023

Query为水稻Osfad8基因核苷酸序列

Sbjct为Zea mays FAD8基因核苷酸序列(GeneBank AccessionNo.D63953.1)

表2

水稻Osfad8基因编码的蛋白质序列与Zea mays FAD8蛋白的氨基酸序列的同源性比较

gi|7433278|pir||T01696 omega-3 fatty acid desaturase(EC 1.14.99-)FAD8-maize

(fragment)

gi|2447000|dbj|BAA22442.1|fatty acid desaturase[Zea mays]

gi|2446996|dbj|BAA22440.1|fatty acid desaturase[Zea mays]

Length＝398

Score＝615 bits(1587)，Expect＝e-175

Identities＝282/385(73％)，Positives＝312/385(81％)，Gaps＝9/385(2％)

Query：35 LRVAAPTSRVATVXXXXXXX---------XXXXXXXXXFDPGAAPPFGLADIRAAIPKHC 85

LRV+APT + V FDPGA PPFGLA+IRAAIPKHC

Sbjct：3 LRVSAPTRLTSAVEEDKRSSPLGEGDEHVAASGAAGGEFDPGAPPPFGLAEIRAAIPKHC 62

Query：86 WVKDPWRSMGYXXXXXXXXXXXXXXXXXXHSCLAWPLYWAAQGTMFWALFVLGHDCGHGS 145

WVKDPWRSM Y S L WPLYWAAQGTMFWALFVLGHDCGHGS

Sbjct：63 WVKDPWRSMAYVLRDVVVVLGLAAAAARLDSWLVWPLYWAAQGTMFWALFVLGHDCGHGS 122

Query：146 FSNNSRLNSVMGHILHSSILVPYHGWRISHRTHHQNHGHVDKDESWHPLPERLYRSLNRA 205

FSNN +LNSV+GHILHSSILVPYHGWRISHRTHHQNHGHV+KDESWHPLPERLY+SL+

Sbjct：123 FSNNPKLNSVVGHILHSSILVPYHGWRISHRTHHQNHGHVEKDESWHPLPERLYKSLDFM 182

Query：206 TRMLRFSIPFPMLAYPFYLWSRSPGKSGSHFHPSSDLFQPNERNDVLTSTACWVAMAALL 265

TR LRF++PFP+LA+P YL++RSPGKSGSHF+PSSDLFQPNE+ D++TSTA W+AM +L

Sbjct：183 TRKLRFTMPFPLLAFPLYLFARSPGKSGSHFNPSSDLFQPNEKKDIITSTASWLAMVGVL 242

Query：266 AGLTFLMGPLLMLNLYFVPYWIFVMWLDFVTYLHHHGHNDKLPWYRGKEWSYLRGGLTTV 325

AGLTFLMGP+ ML LY VPY++FV WLD VTYLHHHGH DKLPWYRG+EWSYLRGGLTT+

Sbjct：243 AGLTFLMGPVAMLKLYGVPYFVFVAWLDMVTYLHHHGHEDKLPWYRGQEWSYLRGGLTTL 302

Query：326 DRDYGWINNIHHDIGTHVIHHLFPQIPHYHLIEATEAAKGVMGKYYREPDKSGPFPLHLF 385

DRDYG INNIHHDIGTHVIHHLFPQIPHYHLIEATEAAK V+GKYY+EP KSGP P HLF

Sbjct：303 DRDYGLINNIHHDIGTHVIHHLFPQIPHYHLIEATEAAKPVLGKYYKEPKKSGPLPWHLF 362

Query：386 GALSRSLKRDHYVSDTGDVVYYQTD 410

G L++SLK+DHYVSDTGDVVYYQTD

Sbjct：363 GVLAQSLKQDHYVSDTGDVVYYQTD 387

Query为水稻Osfad8基因核苷酸序列

Sbjct为玉米Zea mays FAD8基因核苷酸序列(GeneBank AccessionNo.D63953.1)

表3

不饱和脂肪酸含量(mol％±SD)(n＝2 or 3)
不饱和脂肪酸含量(mol％±SD)(n＝2 or 3)						16:3％	16:0％	18:3％	18:2％	18:0％	16:3+18:3％
WTEVT1T2T3	10.2±0.810.4±0.49.3±0.310.2±0.512.3±0.6	31.0±0.226.1±0.121.6±0.223.6±0.524.9±0.4	39.7±0.447.0±0.357.2±0.553.5±0.653.53±0.7	8.5±0.049.2±0.26.2±0.15.3±0.40.00±0.0	10.7±0.27.3±0.15.7±0.27.5±0.39.4±0.2	16:3％	16:0％	18:3％	18:2％	18:0％	16:3+18:3％	49.9±0.457.4±0.166.5±0.263.7±0.565.7±0.3

序列表

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1239bp

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：核酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

1 ATGGCCCGGCTGCTACTCTCCGGCGTCGCGCCGCTCCCCCTCCTCCCCTGCCGCCGTCGC

61 GCCATTGCATTTGCGCTCCCACTTGGGAATGTCCGCCTCCGCCTCCGTGTGGCCGCACCC

121 ACCAGCCGCGTGGCCACCGTGGAGGAGGACGACAATGAAAATAATGCTCCTCCTCCTCCT

181 TGTGAGGACTTCGACCCGGGCGCGGCGCCCCCGTTTGGTCTGGCCGACATCCGCGCCGCT

241 ATCCCCAAGCACTGTTGGGTGAAGGACCCCTGGCGATCCATGGGGTACGTGCTGCGCGAC

301 GTGGTGGTGGTGTTCGCCCTCGCTGCCGCCGCCGCGCGCCTCCACAGCTGCCTCGCCTGG

361 CCGCTCTACTGGGCGGCGCAGGGAACCATGTTCTGGGCGCTCTTCGTCCTCGGCCACGAC

421 TGCGGGCACGGGAGCTTCTCCAACAACTCGAGGCTCAACAGCGTGATGGGCCACATACTC

481 CACTCCTCCATCCTCGTACCCTACCATGGCTGGAGGATTAGCCACAGGACGCATCATCAG

541 AACCATGGCCATGTCGACAAGGATGAGTCCTGGCATCCCCTCCCCGAGCGGCTGTACAGG

601 AGCCTTAACAGAGCCACCCGGATGCTCCGCTTCTCCATACCCTTCCCCATGCTCGCCTAC

661 CCATTCTACCTGTGGTCTCGGAGCCCAGGAAAGTCTGGTTCGCATTTCCATCCCAGCAGC

721 GACCTGTTCCAGCCCAACGAAAGGAACGATGTGCTGACATCCACAGCATGCTGGGTGGCC

781 ATGGCTGCCCTCCTCGCAGGCCTCACCTTCCTCATGGGACCCCTCCTCATGCTCAACCTC

841 TACTTTGTCCCTTACTGGATTTTTGTTATGTGGCTGGACTTCGTCACCTACTTGCACCAT

901 CACGGCCACAACGACAAGCTGCCCTGGTACCGTGGCAAGGAATGGAGCTATTTGCGGGGA

961 GGACTGACGACAGTGGACAGGGACTATGGGTGGATCAACAACATCCACCACGACATCGGG

1021 ACACATGTCATTCACCATCTTTTCCCCCAAATCCCGCATTACCATCTAATTGAGGCGACG

1081 GAAGCAGCAAAGGGTGTGATGGGGAAATACTACAGGGAGCCGGACAAGTCTGGGCCTTTT

1141 CCCTTACACCTGTTTGGAGCGCTGTCCCGGAGCTTGAAACGCGACCACTATGTCAGCGAC

1201 ACCGGAGATGTGGTCTACTACCAGACCGACCCTGCTAAC

(2)SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：413氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

1 MARLLLSGVA PLPLLPCRRR AIAFALPLGN VRLRLRVAAP TSRVATVEED

51 DNENNAPPPP CEDFDPGAAP PFGLADIRAA IPKHCWVKDP WRSMGYVLRD

101 VVVVFALAAA AARLHSCLAW PLYWAAQGTM FWALFVLGHD CGHGSFSNNS

151 RLNSVMGHIL HSSILVPYHG WRISHRTHHQ NHGHVDKDES WHPLPERLYR

201 SLNRATRMLR FSIPFPMLAY PFYLWSRSPG KSGSHFHPSS DLFQPNERND

251 VLTSTACWVA MAALLAGLTF LMGPLLMLNL YFVPYWIFVM WLDFVTYLHH

301 HGHNDKLPWY RGKEWSYLRG GLTTVDRDYG WINNIHHDIG THVIHHLFPQ

351 IPHYHLIEAT EAAKGVMGKY YREPDKSGPF PLHLFGALSR SLKRDHYVSD

401 TGDVVYYQTD PAN

Claims

1.一种从水稻分离出的DNA分子，其特征在于，是一个ω-3脂肪酸脱氢酶基因，长度为1239bp，它具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，其编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。

3.一种将如权利要求1所述的编码具有水稻ω-3脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列转入烟草以提高α-亚麻酸含量的方法，具体操作步骤为：

(1)将编码具有水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因的开放读框可操作的连接于植物表达载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含有表达载体的农杆菌与真核宿主细胞共培养；

(3)通过筛选，PCR鉴定，获得转化细胞并最终再生转基因植株，转基因植物的三烯脂肪酸含量增加。

4.一种用于检测样品中水稻ω-3脂肪酸脱氢酶拷贝数的方法，其特征在于它包括用SEQ ID NO.1所示序列与样品杂交，然后检测探针是否发生了结合，该样品是水稻基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸序列。

5.用于鉴定转基因烟草的核酸分子，其特征在于，它包含SEQ ID NO.1所示的DNA分子中246-263个连续的核苷酸和1069-1086个连续核苷酸的反向互补序列。

6.一种用于检测样品中是否存在水稻ω-3脂肪酸脱氢酶核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用权利要求5所述核苷酸序列与样品进行PCR反应，然后检测是否扩增出目的片段；样品为转基因烟草基因组DNA。