CN1202254C - 水稻抗白叶枯病基因Xa26（t） - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及一种DNA片断的分离克隆和应用。所述的DNA片断能够赋予植物抵抗由白叶枯病原菌引起的病害。将该片段与其内源调节序列直接转入植物体，或者将该片段和合适的调节序列连接后转入植物体，转基因植物可以产生抗病基因介导的对多种病原菌的防卫反应。将该DNA片段和其它基因的DNA片段重组有可能使植物产生更强和更广的抗病性。

Description

水稻抗白叶枯病基因Xa26(t)

                          技术领域

本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及一种DNA片断的分离克隆和应用。所述的DNA片断能够赋予植物抵抗由白叶枯病菌引起的病害。将该片段与其内源调节序列直接转入植物体，或者将该片段和合适的调节序列连接后转入植物体，转基因植物可以产生Xa26(t)介导的对多种病原菌的防卫反应。

                          背景技术

植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、霉菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生防卫反应，杀死病原物或阻止其生长。

虽然植物缺乏像动物一样的循环系统和抗体，也缺乏特化的防卫细胞，但它有一套区别于脊椎动物免疫系统的抗病防卫体系。在这一体系中，植物的每一个细胞都有对病原物的侵染产生组成型抗性(constitutive resistance)和诱导型抗性(induced resistance)的能力。组成型抗性又称为被动抗病性，主要靠形态和组织结构产生的机械障碍(主要指能够抗穿刺和阻止病原物的移动物质，如角质层、木栓质、蜡质、木质素、硅和二价阳离子等)以及抗病原物的化学因子(如酚类化合物、生物碱等，但不包括病原物侵染后发生防卫反应产生的活性因子)来降低病原物对宿主的损害(王金生，1999，分子植物病理学，中国农业出版社)。组成型抗性相对较弱。诱导抗性又称为主动抗性，是在植物和病原微生物长期相互作用中产生的，指寄主植物被病原物侵染后，产生或激活的抗病特性。植物对病原物的这种主动抗病形式由植物的抗病基因介导，其可见的标志是过敏反应，抗性很强。许多植物抗病基因已经被遗传定位。

植物和病原菌的互作分为亲和性互作和非亲和性互作两种。前者是指病原物侵染寄主植物并引起发病；后者是指病原物遇上抗病寄主和非寄主植物时病害一般不会发生。植物的主动抗病反应主要是针对非亲和性病原菌产生。这种反应一般具有病原小种特异性。Flor(1956，Adv.Genet.8：29-54)根据对亚麻(Linumusitatissmum)锈病(Melampsora lini)的研究提出基因对基因学说解释植物主动抗病反应。该学说认为，当植物携带的抗病基因的产物能够识别病原菌无毒基因(avirulent gene)产物时，植物表现出抗病。针对寄主的每一个抗病基因，在病原菌方面或迟或早都会发现一个毒性基因(virulent gene)。毒性基因只能克服其对应的抗病基因，而产生致病效应。这一遗传假说为深刻理解植物宿主一病原物的相互作用提供了理论基础，并进一步引导了研究者们对病原物无毒基因和植物抗病基因的克隆。研究者们对抗病基因的深入研究进一步证明了基因对基因学说的合理性，并从分子水平上对这一学说作出了解释：植物对病原物的防卫反应起始于对病原物特殊信号分子—激发子(elicitor)的识别(激发子是病原物无毒基因直接或间接产物)；抗病基因编码这些信号分子的受体，受体和激发子的结合启动宿主对病原物产生抗性，抑制病原物的生长(Staskawicz等，1995，Science 268：661-667)。

植物中已有多个抗病基因被克隆。在已被克隆的植物抗病基因中，大多数基因都编码信号分子识别蛋白。这类抗病基因介导的抗病反应可以用基因对基因学说解释(Baker等，1997，Science 276：726-733)。根据基因产物的结构，一般可将采用基因对基因学说原理介导抗病反应的抗病基因分为5类(Jones，2000，In：Dickinson M and Beynon J.Molecular Plant Pathology，Annual Plant Reviews，Vol 4.108-143；Dangl和Jones，2001，Nature 411：826-833)(表1)。

表1部分已克隆的采用基因对基因学说原理介导抗病反应的植物抗病基因

类

      基因     宿主      病原菌          蛋白质结构    参考文献^a

群

1     Rps2     拟南芥    Pseudomonas     CC-NBS-LRR    Bent等，1994

                         syringae

      Rps4     拟南芥    P.Syringae      CC-NBS-LRR    Gassmann等，1999

      RPS5     拟南芥    P.syringae      CC-NBS-LRR    Warren等，1998

      Rpp8     拟南芥    P.Parasitica    CC-NBS-LRR    McDowell等，1998

      Rpp13    拟南芥    P.parasitica    CC-NBS-LRR    Bittner-Eddy，2000

      Rpm1     拟南芥    P.maculicola    CC-NBS-LRR    Grant等，1996

      HRT      拟南芥    TCV             CC-NBS-LRR    Cooley等，2000

      Prf      番茄      P.syringae      CC-NBS-LRR    Salmeron等，1996

      Mi       番茄      Meloidogyne，   CC-NBS-LRR    Milligan等，1998

                         Macrosiphum

      I₂      番茄      Fusarium.       CC-NBS-LRR    Simons等，1998

                         Oxysporum

      Xa1      水稻      Xanthomonas     CC-NBS-LRR    Yoshimura等，1998

                         oryzae

     Pita        水稻      Magnaporthe          CC-NBS-LRR     Bryan等，2000

                           grisea

     Pi-b        水稻      M.grisea             CC-NBS-LRR     Wang等，1998，

     Dm3         莴苣      Bremia lactucae      CC-NBS-LRR     Myers等，1998

     Mla1        大麦      Bluseria graminis    CC-NBS-LRR     Zhou等，2001

     Mla6        大麦      B.graminis           CC-NBS-LRR     Halterman等，2001

     Rp1-D       玉米      Puccinia.Sorghi      CC-NBS-LRR     Collins等，1999

     Rpp5        拟南芥    P.parasitica         TIR-NBS-LRR    Parker等，1997

     Rpp1        拟南芥    P.parasitica         TIR-NBS-LRR    Botella等，1998

     N           烟草      TMV                  TIR-NBS-LRR    Whitham等，1994

     L⁶         亚麻      Melampsora lini      TIR-NBS-LRR    Lawrence等，1995

     M           亚麻      M.lini               TIR-NBS-LRR    Eliss等，1995

     N           亚麻      M.lini               TIR-NBS-LRR    Dodd等，2001

2    Cf9         番茄      Cladosporium         LRR-TM         Jones等，1994

                           Fulvum

     Cf2         番茄      C.fulvum             LRR-TM         Dixon等，1996

     Cf4         番茄      C.fulvum             LRR-TM         Thomas等，1997

     Cf5         番茄      C.fulvum             LRR-TM         Dixon等，1998

     HS1^pro-1    甜菜      Heterodera           LRR-TM         Cai等，1997

                           Schachtii

3    Pto         番茄      P.syringae           蛋白激酶       Martin等，1993

     PBS1        拟南芥    P.syringae           蛋白激酶       Swiderski和Innes，2001

4    Xa21        水稻      X.oryzae             LRR-TM-蛋白    Song等，1995

                                                激酶

5    RPW8        拟南芥    E.Cichoracearum      CC-NBS         Xiao等，2001

^a参考文献目录：

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Bitter Eddy P D et al.Plant J，2000，21：177-188

Botella M A et al.Plant Cell，1998，10：1847-1860

Bryan G T et al.Plant Cell，2000，12：2033-2045

Cai D et al.Science，1997，275：832-834

Collins N et al.Plant Cell，1999，11：1365-1376

Cooly M B et al.Plant Cell，2000，663-676

Dixon M S et al.Cell，1996，84：451-459

Dixon M S et al.Plant Gell，1998，10：1915-1925.

Dodds P N et al.Plant J，2001，27：439-452

Ellis J G et al.Proc Nat Acad Sci USA，1995，92：4185-4188

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Grant M Ret al.Science，1995，269：843-846

Halterman D et al.Plant J，2001，25：335-348

Jones D A et al.Science，1994，266：789-793

Lawrence G J et al.Plant Cell，1995，7：1195-1206

Martin G B et al.Science，1993，262：1432-1436

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Milligan S B et al.Plant Cell，1998，10：1307-1319

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Swiderski M R and Innes R W.Plant J，2001，26：101-112

Thomas C M et al.Plant Cell，1997，9：2209-2224

Wang Z X et al.Plant J，1999，19：55-64

Warren R F et al.Plant Cell，1998，10：1439-1452

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Xiao S et al.Science，2001，291：118-120

Yoshimura S et al.Proc Natl Acad Sci，1998，95：1663-1668

Zhou F et al.Plant Cell，2001，13：337-350

第一类抗病基因编码具有NBS-LRR(nucleotide binding site-leucine richrepeat)结构域的蛋白质，它是已被克隆的抗病基因中最大的一群(表1)。这类抗病基因可被进一步分为两个亚群(Richter和Ronald，2000，Plant Mol.Bio.42：195-204)。一个亚群其抗病基因编码的蛋白氨基端是CC(Coiled-coil)结构域，拟南芥中的RPS2和RPM1以及番茄中的Mi基因属于这一亚群。另一亚群含有TIR结构域(homology to the cytoplasmic domains of the Toll receptor ofDrosophila melanogaster and the IL-1 receptor of birds and mammals)，如烟草中的N基因、拟南芥中的Rpp5和亚麻中的L基因。该类基因编码的蛋白一般存在于细胞质内，抗病基因编码蛋白和激发子的相互作用也发生在细胞内；其NBS结构域比较保守，LRR结构域不很规则，相互之间同源性较差(Baker等，1997，Science 276：726-733；Kobe和Deisenhofer，1994，Trend Biochem.Sci.19：415-421)。

第二类抗病基因编码胞外LRR结构域(表1)。这类抗病基因编码的LRR结构域比第一类抗病基因编码的LRR规则。LRR存在于细胞外，通过跨膜结构域(TM)将其锚定于细胞膜上。在这类抗病基因介导的抗病反应中很可能激发子和胞外的LRR结合，由TM将信号传递入胞内。该类蛋白质的胞内结构域很小，较保守，可能涉及到和细胞内的信号传递体的相互作用(Jones等，1994，Science 266：789-793；Dixon等，1998，Plant Cell 10：1915-1925；Thomas等，1997，Plant Cell 9：2209-2224)。

第三类抗病基因编码蛋白激酶(表1)。如番茄的Pto基因(Martin等，1993，Science 262：1432-2436；美国专利第5,648,599)编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶。这个蛋白质是一种典型的信号传递蛋白质。从结构分析该蛋白似乎缺乏受体的功能。但目前已证明该蛋白能直接和由病原菌avrPto编码的蛋白结合，亦能和植物体内其它的蛋白—很可能是与信号传递相关的蛋白相互作用。Pto蛋白发挥作用时需要Prf基因编码的LZ(leucine zipper)-NBS-LRR类蛋白质的协助(Scofield等，1996，Science 274：2063-2065；Tang等，1996，Science274：2060-2063)。另一个抗病基因一PBS1也属于这一类群。PBS1也编码一种蛋白激酶，但和Pto不属于一类。它发挥作用同样需要一类NBS-LRR蛋白质-RPS5的协助。

第四类抗病基因编码受体激酶(表1)。从水稻中分离克隆的抗白叶枯病基因Xa21属于此类。Xa21蛋白由LRR、TM和蛋白激酶三部分结构域组成。一般认为LRR位于胞外，激酶部分在胞内(Song等，1995，Science 270：1772-1804)。到目前为止，Xa21蛋白是唯一发现具有抗病活性的受体激酶。从结构上分析，这个蛋白具有典型的信号识别和传递功能。

第五类抗病基因编码产物仅包含截短的CC-NBS结构(表1)。拟南芥的RPW8基因属于此类(Xiao等，2001，Science 291：118-120)。目前，研究者们还不知道该基因编码的蛋白质如何完成对病原菌的识别。

水稻白叶枯病是一种非常严重的病害，由稻黄单孢杆菌中的致病变种Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)侵染引起。这种病害在亚洲、欧洲、非洲、南美、美国和澳大利亚都有发生；而以日本、印度和中国发生比较严重。我国主要发生在华东、华中、华南稻区，在西北、西南、华北和东北部分稻区也有分布。自叶枯病在潮湿和低洼地区发病比较频繁，一般籼稻重于粳稻，双季晚稻重于双季早稻，单季中稻重于单季晚稻(过崇俭，1995，中国农作物病虫害，中国农业出版社，14-24)。受侵染的水稻一般减产20-30％，严重时能够达到50％(Ou，1985，Rice disease，2nd edition.)。白叶枯病造成米质松脆，发芽率降低。如果在分蘖期出现凋萎型白叶枯，则造成稻株的大量枯死，损失会更大。

控制白叶枯病害流行的最好的方法改良水稻品种的抗性。转基因技术为品种改良提供了高效技术途径。但利用这一途径的前体是必须具有优良基因克隆。目前已被鉴定的抗白叶枯病基因有20多个，但国际国内已报道被分离克隆的抗白叶枯病基因只有两个：Xa21(Song等，1995，Science 270：1804-1806，美国专利号：5,859,339)和Xa1(Yoshimura等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：1663-1668)。Xa21基因抗谱广，但它只具有成株期抗性。Xa1基因虽然具有全生育期抗性，但它的抗谱窄。另外，Xa21基因的知识产权不属于我国，使利用这个基因克隆改良水稻品种的抗性受到限制。籼稻品种明恢63是我国水稻生产中种植面积最大、使用时间最长的杂交水稻的恢复系。由明恢63配制的杂交水稻的主要优势是产量高和适应性强。这些杂交水稻适应性强的一个重要方面是它们具有较好的抗白叶枯病性能。明恢63携带至少两个抗白叶枯病基因(Chen等，2002，Phytopathology 92：750-754)。明恢63携带的抗病基因在我国的水稻品种改良中具有很好的应用前景。

克隆抗病基因是对水稻抗病机理研究的前提，揭示水稻抗白叶枯病的机理可以更好的控制和减低Xoo对水稻的危害。同时，对克隆的抗病基因的修饰和改造，可以人为控制和增加植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。

                           发明内容

本发明的目的是分离克隆水稻品种明恢63中携带的一个抗白叶枯病基因和包含调控这个基因的启动子的DNA片段，利用这个基因改良其它水稻品种或其它植物抵御病害的能力。

本发明涉及分离和应用一种包含Xa26(t)基因的DNA片段，该片段赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害产生特异性的抗病反应。这一发明适用于所有对该病原菌敏感的植物。这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。该DNA序列编码一种受体蛋白激酶，它包含细胞外的LRR结构域和细胞内的蛋白质激酶结构域，其氨基酸序列如(图11)所示。本发明所示的DNA片段的表达具有组织特异性。

所分离克隆的Xa26(t)抗病基因编码受体蛋白激酶。这种蛋白质包含两个主要结构域：由26个LRR组成的胞外结构域和胞内的蛋白激酶结构域。已被克隆的水稻抗白叶枯病基因Xa21也编码受体蛋白激酶。但Xa21蛋白的胞外结构域由23个LRR组成。另外，Xa26(t)基因和Xa21基因编码的蛋白激酶结构域也存在序列上的差异。Xa26(t)基因中编码LRR或蛋白激酶结构域的核酸片段可能具有独立的功能。将Xa26(t)基因中编码胞内或胞外结构域的片段与其它核酸片段重组，可构成嵌合基因或蛋白质，使之具有新的功能。对Xa26(t)基因进行修饰或改造，可改变或增加基因的某种功能。例如，将该基因的胞外结构域替换为Xa21基因的胞外结构域，可能会改变基因的抗谱；对该基因的胞外结构域进行定点突变，可能会改变基因的抗性和抗谱等。

本发明同样包括将Xa26(t)抗病基因的主要结构部分有效连接上合适的调节序列所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。如这种基因可以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何环境条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动子。这样，环境的改变，发育时期的不同都可以改变该基因的表达，同样，也可以将该基因的表达限定在某一个组织内，使由该基因诱导的抗病反应得到人为的控制。其中环境条件包含病原菌的攻击、厌氧条件、和光等，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。

本发明中，Xa26(t)基因的内源启动子也可以控制该基因的表达。该启动子同样也可以控制嵌合基因或其它基因的表达。因此将该基因的启动子和任何其它基因连接、特别是与抗病基因连接，同样会改变植物的抗性，包括抗真菌和细菌的抗性的等。本发明的Xa26(t)基因的启动子是一种组织特异性的启动子。我们检测到它在叶、根中表达，没有检测到它在花期茎和穗中的表达。

在cDNA和基因组文库中，可以采用已经克隆的Xa26(t)基因为探针，筛选到本发明的基因或同源基因。同样，可以在基因组中、mRNA和cDNA中，采用PCR技术，扩增到本发明中的核苷酸序列中任何感兴趣的一段或与其同源的一段。例如，所扩增的序列用于蛋白质的表达、用作探针筛选文库、测序或其它目的等。采用以上技术，可以分离到包含Xa26(t)基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物。

本发明为增强植物对细菌性病害的抗性提供了一种新的方法。这些方法包括将该片段转入感病植物或者将Xa26(t)结构基因和可调控的启动子连接或将Xa26(t)的重组基因转入植物，拓宽和增强植物对病原菌的抗性。另一方面，本发明涉及到重组表达载体，所述载体赋予植物在侵染点对细菌性病原体所致病害的防卫反应。所述重组表达构件包含分离的DNA片段，其赋予植物对细菌性病原体的抗性，其中，所述DNA片段基本上相当于SEQ ID NO：1中所述的核酸序列或其功能等同的亚片段。

将克隆的抗病基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植株中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的连锁基因组序列。抗病基因的克隆是克服传统育种不能在植物种间转移抗病基因的问题前提。

本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其它的植株。

在本发明的实施例部分，我们阐述了Xa26(t)基因的分离过程和该基因的特点，分离的Xa26(t)基因能够和适当的载体连接，转入植物体中，使该植物体带有一定的抗性(图1)。

序列表、附图及其说明

序列表SEQ ID No：1.包括Xa26(t)基因和Xa26(t)基因启动子的DNA序列。

图1.是本发明的水稻抗白叶枯病基因Xa26(t)的分离克隆和应用流程图。

图2.是本发明的水稻抗白叶枯病基因Xa26(t)在第11染色体分子标记遗传连锁图上的位置。

图3.用DNA杂交技术分析Xa26(t)基因区段的BAC克隆之间的重叠关系。将提取的BAC质粒(33P4、65H1、3H8、5B14、31B6、65A17、39F18、26G20、57B2和38G13)用Hind III完全酶切，电泳后转移至尼龙膜。然后用经Hind III酶切消化、放射性同位素P³²标记的BAC克隆3H8、39F18和57B2分别与尼龙膜杂交，根据杂交带型的重叠情况确定BAC克隆之间的重叠关系。

图4.覆盖Xa26(t)基因区段的物理图谱。短横线代表不同BAC克隆。竖虚线表示某一BAC克隆包含的分子标记经过DNA杂交验证。分子标记之间的阿拉伯数字表示在F₂感病群体中某一分子标记与Xa26(t)基因之间存在重组的单株数目。Xa26(t)基因被定位在BAC克隆3H8上。

图5.对BAC克隆3H8进行测序分析后，获得两条长DNA序列。一条长36.4kb，另一条长30.4kb。长36.4kb的序列中包含3个编码LRR-蛋白激酶类蛋白质的基因，分别被命名为RKa、RKb和RKc。垂直虚线示来源于3H8的分子标记3H8-RKa、3/7A-8、2/15B-29、3H8-RKb、M196-1、3/7A-80和3/7A-10在3H8或3个基因(RKa、RKb和RKc)上的相对位置。用这些分子标记分析重组自交系群体中在Xa26(t)基因区段发生重组的5个家系(表型为抗病，但与Xa26(t)共分离的分子标记R1506和Xa26(t)基因两侧的分子标记RM224和RM144位点处是感病亲本的基因型)，发现3H8-RKa、3/7A-8和2/15B-29在这5个家系中检测出不规则(A)的杂交带型(既非抗病亲本的带型，也非感病亲本的带型)，而3H8-RKb、M196-1、3/7A-80和3/7A-10在这5个家系中检测到抗病亲本的杂交带型(R)。根据这些结果和图3中的结果，可以确定RKb就是Xa26(t)基因。

图6.示3个转基因T₁家系(RKb17、RKb18和RKb22)的不同单株对白叶枯病菌生理小种PXO61的抗性(叶片病斑长度)发生分离。IR24和牡丹江8号(MDJ8)是对照感病品种，明恢63(MH63)是对照抗病品种。MDJ 8/MH63是两个亲本的杂交(F₁)后代。

图7.采用RKb基因的特异性引物，通过PCR扩增检测3个T₁转基因家系(RKb17、RKb18和RKb22)中的各个单株。带有RKb基因的阳性转基因单株和抗病水稻品种明恢63(MH63)呈现出很强的带，而阴性单株和感病品种牡丹江8号(MDJ 8)因只带有与RKb同源的序列，故呈现出弱带或无带。

图8.用RT-PCR方法分析明恢63接种白叶枯病菌和对照(假接种)处理中Xa26(t)基因的表达水平。用RKb2R和RKb/3’race-2引物扩增明恢63的总DNA和明恢63 RNA的反转录产物(cDNA)获得大小不同的片段。

图9.Xa26(t)基因内含子的剪切位点。

图10.Xa26(t)基因的结构。

图11.Xa26(t)基因编码的受体激酶类膜蛋白质的结构，其中包括两个主要的结构域：LRR和激酶(kinase)。在Kinase结构域序列中用下划线标注的氨基酸残基是蛋白激酶的保守结构域。

图12.Xa26(t)基因在不同组织内的表达分析。1、分蘖期的根；2、苗期的叶鞘；3、苗期叶；4、分蘖期的叶；5、抽穗期的茎；6、灌浆期穗。

                        具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明。根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例一：水稻品种明恢63中的抗白叶枯病基因的遗传定位

本发明采用两个遗传作图群体定位水稻品种明恢63中的抗白叶枯病基因。其中一个群体是由感病亲本珍汕97和抗病亲本明恢63杂交配制的F₂群体，该群体包含2533个F₂单株。另一个群体是由珍汕97和明恢63杂交配制的重组自交系群体，包含241个家系。对F₂群体进行白叶枯病菌接种鉴定，确定了477株极端感病单株，由它们组成感病群体。我们在前期工作中已经鉴定出明恢63的一个抗白叶枯病基因位于水稻第11染色体的两个分子标记RM224和RM144之间(Chen等，2002，Phytopathology 92：750-754)。因此，可以用这两个分子标记筛选F₂极端感病单株组成的群体，寻找和发现抗病基因和分子标记间的重组事件。分子标记和抗病基因之间发生的重组事件越多，两者的遗传距离越远。二者之间的交换率采用最大似然法来估计(Allard，1956，Hilgardia 24：235-278)，其中交换率c＝(N₁+N₂/2)/N，N为所测定的感病单株总数，N₁为感病群体中呈现纯合抗病带型的个体数，N₂是呈现杂合带型的个体数。标准差为Vc＝c(1-c)/2N。

用RM224标记在感病群体内检测出两个重组单株，用RM144标记在感病群体中检测出20个重组单株。这一结果进一步确认这两个分子标记之间存在一个抗白叶枯病基因。进一步用这两个标记之间的其它分子标记分析它们和抗病基因间的重组事件，将这个抗病基因定位于分子标记RM224和Y6855RA之间。这两个分子标记距抗病基因的遗传距离分别为0.21和2.1cM(centiMorgan)(图2)。另外，这个抗病基因与分子标记R1506共分离(图2)。根据这个抗病基因的染色体位置和携带这个基因的水稻品种明恢63的抗谱，我们认为该基因可能是一个抗白叶枯病新基因，命名为Xa26(t)。

实施例二：建立覆盖Xa26(t)基因区段的物理图谱

Xa26(t)基因区段的物理图谱的构建采用本实验室构建的明恢63 BAC文库。该文库由26,000个克隆组成，平均插入片段150kb，覆盖水稻基因组9倍(Peng等，1998，Acta Botanica Sinica 40：1108-1114)。首先采用和Xa26(t)基因紧密连锁的分子标记筛选BAC文库。分子标记R1506属于单拷贝探针，用该探针从文库中筛选到3个重叠的BAC克隆，分别是33P4，65H1和3H8。分子标记S12886位于基因的另一侧，用该标记筛选到另外3个重叠BAC克隆，分别为26G20、57B2和39F18。另外，用与S12886共分离的分子标记Y6855RA鉴定出3个BAC克隆，分别是31B6、65A17和7M24。从保存的文库中将筛选到的BAC克隆取出，扩大培养，采用标准碱裂解法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press)分离提取BAC质粒。将所得BAC质粒用Hind III完全酶切、电泳、转移至尼龙膜；然后用Hind III完全酶切的BAC克隆作探针与载有BAC质粒的尼龙膜杂交，根据电泳位置相同的杂交带的有无和多少确立不同BAC克隆之间的重叠关系。两个BAC克隆分享相同的杂交带越多，则重叠区段越长，图3显示了跨越基因区段的10个BAC克隆之间的重叠情况。最后，从中确立了6个冗余最少的BAC克隆，建立了覆盖Xa26(t)基因区段的重叠群(图4)。

为确定BAC克隆插入片段的大小，采用NotI对BAC克隆进行酶切，1％琼脂糖脉冲场电泳分离酶切片段，并和已知大小的DNA片段的迁移率做比较，计算出插入片段的大小。电泳条件如下：电泳缓冲液为0.5×TBE，转换时间(switchtime)1-12秒，角度为120度，电压6V/cm，温度14℃，电泳时间16小时。通过脉冲电泳分析，确定了跨越Xa26(t)基因区段的重叠群长约500kb。

分子标记R1506和Xa26(t)基因间在F₂代感病单株组成的群体内没有检测出重组单株，但在重组自交系中找到5个重组单株。进一步以明恢63的BAC克隆3H8的亚克隆为探针，分析F₂感病群体中所发生的重组事件。BAC克隆3H8的亚克隆3/7A-10和3/7A-80在这个感病群体内检测到14个重组单株，3H8的另一个亚克隆M196-1和抗病基因共分离。综合上述各方面的信息，我们将Xa26(t)基被定位在一个BAC克隆-3H8上(图4)。

实施例三：测序分析包含Xa26(t)基因的BAC克隆和Xa26(t)候选基因的分离克隆

1.BAC克隆3H8的Shotgun文库的构建

采用超声波法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory Press)构建Shotgun文库。用超声波处理明恢63BAC克隆3H8的环形质粒，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离出1.5-2.5kb的DNA片段，纯化后用T₄-DNA聚合酶补平末端，与SmaI酶切的去磷酸化的pUC18载体平端连接，电转化大肠杆菌DH10B，进行蓝白斑筛选。提取阳性克隆质粒，并与空pUC18质粒进行电泳比较，剔除假阳性克隆及小片段克隆，或用BamHI和EcoRI双酶切，检测插入片段大小。

2.随机亚克隆片段的测序

采用M13-R和M13-F引物、美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big DyeKit)、以双脱氧核苷酸末端终止法分别从每个亚克隆的两端测序。测序仪为PerkinElmer公司的ABI377 Sequencer。

3.原始序列的拼接

使用Sequencher 4.1软件(美国Gene Codes Corporation)拼接序列。用Sequencher 4.1软件自动去除末端测序较差的序列和pUC18载体序列；用Sequencher 4.1软件没有去除干净的序列则用手工删除。BAC载体pBeloBAC11的碎片序列和污染的细菌DNA序列则通过和BAC序列进行比较或BLAST分析的方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)加以去除。用Sequencher 4.1软件对两条序列进行拼接的参数是：重叠序列长度(Mini Overlap)大于20bp(base pair)，重叠序列的一致性(Mini Match)大于85％。每一个碱基的确定都要参照重叠在该位点的多个Shotgun片段序列。对于由一个Shotgun片段序列所覆盖的区域要再次测序验证，以确保碱基的准确性。而由一个亚克隆覆盖的断口处，则对该克隆进行长序列胶测序或用primer walking的方法，填补缺口。

4.BAC克隆的序列分析

首先用Blastn和Blastx方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)分析所得序列。然后采用GenScan( http：//genes.mit.edu/GENSCAN.html)和Fgenesh(http：//www.softberry.com/)软件分析预测基因结构，分析结果进一步用Blastp方法(Altschul等，1997，NucleicAcids Res.25：3389-3402)进行确证。两条或多条核苷酸或氨基酸序列的比较分析使用BLAST 2 sequence方法(Tatiana等，1999，FEMS Microbiol Lett.174：247-250)和ClustalW方法(http：//www.ebi.ac.uk)。

对BAC克隆3H8测序和序列拼接形成两个大的序列片段，一个片段长36.4kb，另一个片段长30.4kb，二者之间有一个小于1kb的间隙(图5)。序列分析发现在36.4kb的片段上有3个区段编码LRR-蛋白激酶类蛋白，并与水稻抗白叶枯病基因Xa21编码的产物有不同程度的同源性，它们被分别称之为RKa、RKb和RKc(图5)。用GenScan、Fgenesh和Blastx分析表明，RKa、RKb和RKc是3个完整的基因。RKa和RKb的转录方向相同，而RKc的转录方向相反。

5.Xa26(t)候选基因的确定

采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)方法分析(具体操作方法见实施例四)，检测到RKa和RKb基因的表达，没有检测到RKc基因的表达。

用与Xa26(t)共分离的分子标记R1506和Xa26(t)基因两侧的分子标记RM224和RM144检测重组自交系群体，发现5个重组家系(R85，R96，R102，R117和R240)。这5个家系在上述3个分子标记位点处是感病亲本的基因型，而表型则是抗病。用BAC克隆3H8的亚克隆3/7A-8、2/15B-29、M196-1、3/7A-80、3/7A-10以  3H8的PCR产物3Hg-RKa和3Hg-RKb作探针检测这5个家系，发现3H8-RKa、3/7A-8和2/15B-29在这5个家系中检测出不规则(A)的杂交带型(既非抗病亲本的带型，也非感病亲本的带型)，而3H8-RKb、M196-1、3/7A-80和3/7A-10在这5个家系中检测到抗病亲本的杂交带型(R)(图5)。3H8-RKa、3/7A-8和2/15B-29是RKa基因的片段；3H8-RKb和M196-1是RKb基因的片段；3/7A-80是RKc基因的片段，但RKc基因不表达，且3/7A-80与Xa26(t)之间检测到14个重组交换单株(图4)。综合上述各方面的信息，初步确定基因RKb就是Xa26(t)基因(图5)。

6.分离克隆Xa26(t)候选基因和遗传转化鉴定候选基因的功能

用DraI限制性内切从BAC克隆3H8上获得6.6kb包含RKa基因的编码区、启动子以及加尾序列的片段和7.5kb包含RKb基因的编码区、启动子以及加尾序列的片段。将这两个片段分别连接到SmaI酶切的pCAMBIA1301遗传转化载体上。通过农杆菌介导得遗传转化，将携带RKa和RKb的片段分别导入感病水稻品种牡丹江8号，获得转化了包含RKa的DNA片段的转基因植株120株，转化了包含RKb片段的转基因植株40株。对转基因植株接种白叶枯病菌生理小种PXO61，所有转化了包含Rka基因片段的转基因植株都感病，在转化了包含RKb基因片段的转基因植株的T₀代和T₁代植株中都发现抗病单株(表2和图6)。采用遗传转化载体所携带的报告基因Gus的引物和RKb基因的特异性引物扩增检测(图7)部分转基因T1代单株，发现转基因植株的抗性和RKb基因共分离(表2、图6和图7)。这说明转基因单株的抗性是由RKb提供的，从而确定RKb基因就是Xa26(t)基因。

表2.转基因植株和对照水稻品种对水稻白叶枯病菌生理小种PXO61的抗性以及转基因T1代单株的抗性与RKb基因、Gus基因共分离分析

水稻材料    单株  病斑长度(cm)    RKb基因    Gus基因

转基因受体水稻品种(感病)

牡丹江8号

(MDJ8)               16.2           无

转基因T1代家系

Rb11         1       0.5            有

             2       18.3           无

        3     14.0    无

        4     0.4     有

        5     1.4     有

        6     16.3    无

        7     16.7    无

        8     4.8     有

        9     0.6     有

        10    21.0    无

        11    16.2    无

        12    10.9    无

        13    1.0     有

        14    13.2    无

        15    0.6     有

Rb16    1     17.6    无    无

        2     1.6     有    有

Rb17    1     16.9    无

        2     0.2     有

        3     16.2    无

        4     12.5    无

        5     0.6     有

Rb18    1     0.7     有    有

        2     18.2    无    无

        3     0.2     有    有

        4     0.6     有    有

Rb22    1     16.7    无    无

        2     0.6     有    有

        3     0.2     有    有

        4     1.3     有    有

        5     1.0     有    有

        6     0.7     有    有

        7     18.1    无    无

        8     2.0     有    有

        9     1.2     有    有

        10    1.4     有    有

实施例四：Xa26(t)基因结构分析

1.总RNA的抽提

总RNA的抽提采用TRIzol Reagent(美国Invitrogen公司)。操作方法按公司提供的试剂盒说明书进行。

2.RT-PCR分析

将接种白叶枯病菌生理小种PXO61的明恢63叶片和未接种白叶枯病菌的明恢63叶片用于RT-PCR分析。RT-PCR以两步法进行(Zhou等，2002，Science inChina 45：449-467)。首先，将用于反转录的总RNA用无RNA酶活性的DNA酶I处理，去除总RNA中可能污染的DNA；将总RNA在65℃处理10分钟，灭活DNA酶I；将RNA在72℃变性5分钟，然后加入Oligo-dT15、dNTP、反转录酶等，在42℃反转录90分钟。第二步，取1微升反转录产物作PCR扩增。PCR扩增引物为：

对于RKa基因：RKaL和RKaR，RKa2L和RKa22R(表3)

对于RKb基因：RKbL和RKbR，RKb2R和RKb/3’race-2(表3)

对于RKc基因：RKcL和RKcR(表3)

表3.用于PCR、RT-PCR和RACE分析的引物

引物名称              引物序列(5’-3’)

RKaL                  CTGGCTCTGTCCCATCAAAT

RKaR                  GCTGAAAGCAAAAGCTCCAA

RKa2L                 CTGCATGGTCAGATACCAAAAG

RKa22R                TACGGGATCATGCTACTCGA

RKbL                  GGCTTGCAAACTTTGGACAT

RKbR                  GCTTCCCTTGTTCTGAGTGC

RKb2R                 CAGTCCACCACATGGACAAG

RKb/3’race-2         TGGTCAAATACCGGAAGGAG

RKbL/3’race-1        CCATCCCAAACTACTTGGCTA

adaptor               CTGATCTAGAGGTACCGGATCC

Oligo-dT17-adaptor    CTGATCTAGAGGTACCGGATCC(T)17

RKcL                  TGTTTCGAGTGGCATACAGC

RKcR                  ATGAGCCGAGCAATGATACC

Race                  ATCAACCGGCA

RKb/5’-race-A1       GCGTGTCCATACCTCCAAGT

RKb/5’-race-A2    CCAATCTTGATGCCATCTCC

RKb/5’-race-S1    CGTAGAACTGGGAGGCTGAA

RKb/5’-race-S2    CCGCCCCAGTTAAGTTATTG

3.基因末端序列分析

采用大连TaKaRa公司的5’Full RACE Core Set试剂盒和3’RACE Core Set试剂盒，通过5’-RACE(rapid amplification of cDNA end)和3’-RACE分析方法，确定Xa26(t)基因的5’和3’末端序列。

进行3’-RACE的反转录和做RT-PCR的反转录条件一样，只是用Oligo-dT17-adaptor代替Oligo-dT15。反转录完成后，进行两轮扩增。第一轮扩增引物是RKbL/3’race-1和adaptor；第二轮扩增引物是RKb/3’race-2和adaptor。然后通过电泳回收目标大小的片段，用pGEM-T Vector System I试剂盒(美国Promega Corporation)对回收片段进行克隆。最后对克隆进行测序分析。

采用Superscript^TM II反转录酶(美国Life Technologies公司)进行5’-RACE的反转录反应；用于反转录的特异性引物Race(表3)的磷酸化采用T4polynucleotide kinase(美国MBI Fermentas公司)，反应按试剂说明书进行。磷酸化后的引物用10mol/L NH₄AC-乙醇沉淀，纯化。以后的操作按TaKaRa公司提供的试剂盒说明书进行。进行5’-RACE第一轮扩增的引物是RKb/5’-race-A1和Kb/5’-race-S1；第二轮扩增引物是RKb/5’-race-A2和RKb/5’-race-S2。

4.基因内含子的确定

采用GenScan(http：//genes.mit.edu/GENSCAN.html)软件对包含Xa26(t)基因区段的基因组DNA的分析发现在编码激酶结构域的区段存在一个内含子，采用跨越该区段的引物RKb2R和RKb/3’race-2扩增基因组DNA和RNA反转录产物，RT-PCR产物比从基因组中扩增出的产物小(图8)，这说明该区段确实存在一个内含子。将RT-PCR产物克隆、测序、与基因组DNA比较，确定内含子长105bp以及该内含子的剪切位点(图9)。采用Xa26(t)基因区段的其它引物进行RT-PCR、5’RACE和3’RACE分析，没有再发现其它内含子的存在。

5.基因结构分析

Xa26(t)基因的5’端位于基因起始密码子上游48bp(序列表SEQ ID NO：1所示序列的1494bp)处，3’端位于终止密码子下游166bp(序列表SEQ ID NO：1所示序列的5124bp)处。该基因由两个外显子和一个内含子组成(图10)。内含子靠近基因的3’端，长105bp，位于编码蛋白激酶的结构域内(序列表SEQID NO：1所示序列的4477-4581bp)。Xa26(t)基因的全长编码序列是3312bp，被插入的内含子分为两段，分别长2935bp(序列表SEQ ID NO：1所示序列的1542-4476 bp)和377bp(序列表SEQ ID NO：1所示序列的4582-4958bp)。对水稻抗白叶枯病近等基因系IRBB3中与明恢63的Xa26(t)基因区段同源的片段进行测序分析，发现IRBB3中携带有与Xa26(t)序列完全相同的基因。实施例五：Xa26(t)基因的产物和特征

根据Xa26(t)基因的结构特征和对该基因表达序列的分析，以及结合BLAST分析，可以确定这个基因编码一种受体激酶类膜蛋白质(图11)。这个膜蛋白质的胞外的结构域由26个LRR组成，其保守结构特征为L/I/VXXL/MXXLXXL/I/VXL/VXXNXL/FXGXI/L/VPXX(其中X代表任意氨基酸残基)。该保守结构特征与已知的LRR-蛋白激酶类蛋白质的LRR结构基本相同(Torii和Clark，2000，In：Keris M，Walker J C and Callow J A.Plant ProteinKinases，Advances in Botanical Research.Academics Press)。与上述LRR的保守结构特征相比，在Xa26(t)基因编码的26个LRR中，第1个LRR不完整，第6、11和17个LRR中间多一个氨基酸残基，第8和第15个LRR分别在末端多出一个和两个氨基酸残基。

Xa26(t)基因编码的膜蛋白质的细胞内结构域是一个类似于蛋白激酶结构，它具有蛋白激酶的保守的结构域(图11)。

实施例六：Xa26(t)基因在叶片组织中呈组成型表达模式，但具有不同组织表达特异性

Xa26(t)基因在没有接种的叶片中和接种的叶片都表达，接种之后没有发现明显地表达增强，这说明该基因不受病原菌侵染的诱导(图8)。但Xa26(t)基因在不同组织中表达有差异(图12)。该基因在苗期的叶片中表达最强，在分蘖期的叶片中表达略差，在成株期的的叶片中能检测到Xa26(t)基因的表达(图8)。另外，在分蘖期的根和和苗期的叶鞘中也都检测到Xa26(t)基因的表达。但在花期茎和灌浆期穗中未检测到Xa26(t)基因的表达(图12)。

术语定义

本说明书、权利要求书和其它有关该专利申请文字材料中使用的术语的定义如下：

术语“植物”包括整个植株、植物的组织(如叶、茎、根等)、植物种子、细胞和其后代。本文中的植物主要是指可以用于转化的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物。

“抗病基因”是指编码能够在植物细胞或植物组织中激发防卫反应的多肽的基因。抗病的植物表现出较短或很短的菌斑，感病的植物菌斑很长。

“防卫反应”是由寄主(如植物)产生的特异性、抵抗侵染因子或病原体存在的防卫反应。

“功能等同的亚片段”是指分离的DNA片段的一部分或亚序列，其中无论这些片段或亚序列是否编码活性蛋白质，都保留改变基因表达或产生一定表型的能力。如所述片段可用于嵌合基因的设计或反义抑制等。

“基因”是指表达特定蛋白的DNA片段，包括所述编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。“天然基因”是指同自然界中发现的一样具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指非天然基因的任何基因，包括在自然界中未发现在一起的调节序列和编码序列组成的基因。因此，嵌合基因可以包括得自不同来源的调节序列和编码序列，或得自同一来源、但排列方式不同于天然形式的调节序列和编码序列。“内源基因”是指在生物体的基因组中于天然位置的天然基因。“外源基因”是指不是在所述寄主生物体中发现的、而是通过基因转移被引入所述寄主生物体中的基因。外源基因可以包括插入非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已经通过转化程序被引入基因组中的基因。

“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调节序列”是指位于编码序列上游(5’非编码序列)、之中或下游(3’非编码序列)影响所连接的编码序列转录、RNA加工、稳定性或翻译的核苷酸序列。这种序列可以是天然的或是非天然的。调节序列可以包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。

“病原体”是指其侵染到活植物组织的细胞周围或细胞中激发病害反应的生物或侵染性因子。

“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。启动子序列包括邻近的上游元件和更远的上游元件，后者通常被称作“增强子”。因为增强子是刺激启动子活性的DNA序列，可以是所述启动子的固有元件，或是插入的以提高启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可以全部衍生自天然基因，或可以由衍生自自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包括合成的DNA区段。本领域技术人员会理解，不同的启动子可能指导基因在不同组织或不同细胞类型中表达，或指导基因在不同发育阶段表达，或对不同环境条件应答而指导基因表达。引起基因在大多数时间、大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。另外，由于在大多数情况下尚未完全确定调节序列的实际边界，因此某些变异的DNA片段可以具有相同的启动子活性。

“内含子”是基因中不编码蛋白质序列的间插序列。虽然这种序列被转录成RNA，但随后被剪切去掉。该术语也用于被切下的RNA序列。“外显子”是基因中被转录且存在于成熟的信使RNA中的序列，但不必是编码最终基因产物的序列的一部分。

“3’非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。通常，聚腺苷酸化信号的特征在于影响聚腺苷酸序列段添加至mRNA前体3’端。Ingelbrech等，1989，Plant Cell 1：671-680例举了不同3’非编码序列的应用。

本文中的“表达”是指功能性终产物的产生。基因的表达或过量表达涉及该基因的转录和所述mRNA翻译成前体蛋白或成熟蛋白。

“转化”是指将核酸片段转移到寄主生物体的基因组中，并形成稳定的遗传。带有所述转化核酸片段的寄主生物体被称为“转基因”生物。水稻、玉米和其它单子叶植物的优选细胞转化方法是应用加速粒子或“基因枪”转化技术(Klein等，1987，Nature 327：70-73；美国专利第4,945,050号)，或采用合适的含所述转基因的Ti质粒的农杆菌介导的方法(Ishida等，1996，Nature Biotech.14：745-750)。

“表达构件”是指所分离的DNA片段单独使用，或与载体和其它的亚片段结合使用所形成的新的DNA片段。如果使用载体，载体的选择决定于将来转化寄主植物的方法。“表达构件”和“重组表达构件”在本文中通用。

“PCR”或“聚合酶链式反应”是用于合成大量特定DNA区段的技术，由一系列重复的循环组成(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT)。通常由连续的三个步骤构成一个循环：将双链DNA于高温(如95℃)下变性，将两种与靶区段的3’边界互补的引物于低温(如55℃)下退火然后在中温(如72℃)下延伸。

                              SEQUENCE LISTING

<110>华中农业大学

<120>水稻抗白叶枯病基因Xa26(t)

<130>

<140>02139212.9

<141>2002-10-28

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>6000

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>5′UTR

<222>(1494)..(1541)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(1494)..(5124)

<223>

<220>

<221>3′UTR

<222>(4959)..(5124)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(4582)..(4958)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(1542)..(4476)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(4477)..(4581)

<223>

<400>1

aaaaatggcc atgggtccac acgcagtgag atgaatgcta gatctcacga gaaaaaagaa     60

atacatctca ggggttgtga tgtactggat aatttgctcg tcatattaac cattagctta    120

ctctagttga tgtgggcatg gatggagccg gcagccggcg atcctattta acctgcttaa    180

ctacacaatc gttgctggga gacggcaaaa atgcgcgctt ttggagctca aaatggttag    240

ataatcaaac gccgcaactg attgctccag atattttcat ggtctctaaa agaaaaaaca    300

gaaccgtgca agatgccatt ttagaaaaca actggatccg agatattgac atctcccgta    360

tcactgaggc atatcaactc caacagtatg tccacctttg gagaatgatc agagacatga    420

ggccgctcaa cgaaagctac gatagaatcc gatggaatat cacagcaaat ggacagtact    480

ttgcaaaatc ggccaatcgg ctacagttcc ttttggctgc gaaatccgtc ttctaccagt    540

caatttggaa ggcctgggcg cctccgaagt gcaaattctt ctcctggttg gtcactcaaa    600

acagagtatg cacggcagac agactggaaa aaagaggatg gcaaaaccaa aagacttgcc    660

cactctgcta catcgtcgat gagtcggcct tacatctcct ggccaaatgc agactcacaa    720

agaggatatg gacggaaatt caaagatgga ccgggactga cctccaaatg gacaattggg    780

aaaattgtca ctcggtcgaa caatggtgga ccctcgtagc ggagtcccca agcaccccac    840

gcaagcctct caggactcta gtgattctaa tctcatggga aatctggtgc aaacgaaacg    900

caagaatatt ctgcaacaat gcgtctgcgc cgtcctcaat tctagcaaaa atcaaggagg    960

aaggaagagc atgggtcaaa gcagaggctg caaccttgca agagtttgga atcttgggag   1020

atatcgccta attcctgctt tttttttcct tttcttttgc gggttattct tgtttaccgt   1080

cttttttgtc taaccctgta tatgtatatg gctcgttata attttttcta ttaatatata   1140

caaggcaaag ctattgtctt tccttaaaaa aaaaactaca caatcgttgc tgttctaacc   1200

accaaatcaa caaaagagta aggccgttgc cgtcagtgag tgtatggctg atgacggagc   1260

gacacagcta tcatatctag cgtgtcgtgc acaccgcgat ctgctgaata tatattttgt   1320

gatgtcttta ttttccagcg tttacctagt agtgctgtca aatatttatg accggaagga   1380

gtatcattta agtttctttc gctttctgag agcaacagtc aaggtcgtcc tacatgtcga   1440

taaagcaaac tagcactact gtgctaaata aagctcaact tgatcgtcac tgtgaagtat    1500

gatgcatact cttgctgcca atgcatcaca cacaaccaga c atg gct ctt gtt cga    1556

                                              Met Ala Leu Val Arg

                                              1               5

ttg cca gta tgg att ttc gtt gcg gcg ttg ttg atc gct tcg tcc agt      1604

Leu Pro Val Trp Ile Phe Val Ala Ala Leu Leu Ile Ala Ser Ser Ser

                10                  15                  20

act gtg cct tgt gct tcc tct cta ggt ccg atc gcc agc aag agt aac      1652

Thr Val Pro Cys Ala Ser Ser Leu Gly Pro Ile Ala Ser Lys Ser Asn

            25                  30                  35

agc agc gac acc gac ctc gct gca ttg ctg gcc ttc aaa gcc cag ctc      1700

Ser Ser Asp Thr Asp Leu Ala Ala Leu Leu Ala Phe Lys Ala Gln Leu

        40                  45                  50

tcc gat cct aac aac atc ctt gcc ggc aat tgg acc acc gga acg ccg      1748

Ser Asp Pro Asn Asn Ile Leu Ala Gly Asn Trp Thr Thr Gly Thr Pro

    55                  60                  65

ttc tgc cgg tgg gtg ggt gtc tcg tgc agc agc cac cgc cgc cgc cgg      1796

Phe Cys Arg Trp Val Gly Val Ser Cys Ser Ser His Arg Arg Arg Arg

70                  75                  80                  85

cag cgc gtc acc gcc ctg gaa ctg cca aac gtt cct ctc caa gga gag      1844

Gln Arg Val Thr Ala Leu Glu Leu Pro Asn Val Pro Leu Gln Gly Glu

                90                  95                  100

ctc agc tct cac ctt ggt aac att tct ttt ctc ttc atc ctc aac ctc      1892

Leu Ser Ser His Leu Gly Asn Ile Ser Phe Leu Phe Ile Leu Asn Leu

            105                 110                 115

acc aac acc ggc ctc act ggc tcg gtg ccc aac aaa ata gga agg ctg      1940

Thr Asn Thr Gly Leu Thr Gly Ser Val Pro Asn Lys Ile Gly Atg Leu

        120                 125                 130

cgt cgc ctc gag ctc ctt gat ctc ggc cac aat gcc atg tca ggt ggc      1988

Arg Arg Leu Glu Leu Leu Asp Leu Gly His Asn Ala Met Ser Gly Gly

    135                 140                 145

atc cct gca gcc ata ggg aac ctc acg agg ctt cag cta ctt aat cta      2036

Ile Pro Ala Ala Ile Gly Asn Leu Thr Arg Leu Gln Leu Leu Asn Leu

150                 155                 160                 165

cag ttt aac cag cta tac ggt cca atc cca gca gag ctg cag ggg ttg      2084

Gln Phe Asn Gln Leu Tyr Gly Pro Ile Pro Ala Glu Leu Gln Gly Leu

                170                 175                 180

cac agt ctt ggc agc atg aat ctc cgt cac aat tac ctc act gga tcg      2132

His Ser Leu Gly Ser Met Asn Leu Arg His Asn Tyr Leu Thr Gly Ser

            185                 190                 195

att ccg gac gat ctg ttc aac aac acg cct ttg cta act tat ctc aac      2180

Ile Pro Asp Asp Leu Phe Asn Asn Thr Pro Leu Leu Thr Tyr Leu Asn

        200                 205                 210

gtt ggt aac aat agc ctg tca gga ctg ata ccg ggt tgc atc ggt tcc      2228

Val Gly Asn Asn Ser Leu Ser Gly Leu Ile Pro Gly Cys Ile Gly Ser

    215                 220                 225

ttg cca atc ctc caa cac ctt aac ttt cag gcc aat aac tta act ggg      2276

Leu Pro Ile Leu Gln His Leu Asn Phe Gln Ala Asn Asn Leu Thr Gly

230                 235                 240                 245

gcg gtg cca cca gcc atc ttc aac atg tct aaa tta agt acc att tct      2324

Ala Val Pro Pro Ala Ile Phe Asn Met Ser Lys Leu Ser Thr Ile Ser

                250                 255                 260

ctt ata tcg aat ggt tta act ggc cct atc cct ggt aat aca agt ttc      2372

Leu Ile Ser Asn Gly Leu Thr Gly Pro Ile Pro Gly Asn Thr Ser Phe

            265                 270                 275

agc ctc cca gtt cta cga tgg ttc gcc atc agt aaa aac aat ttc ttt      2420

Ser Leu Pro Val Leu Arg Trp Phe Ala Ile Ser Lys Asn Asn Phe Phe

        280                 285                 290

ggt cag att cca ctg ggg ctc gca gcg tgt cca tac ctc caa gtt att      2468

Gly Gln Ile Pro Leu Gly Leu Ala Ala Cys Pro Tyr Leu Gln Val Ile

    295                 300                 305

gcc atg cct tat aat tta ttc gag ggt gtt ttg cca cca tgg ctg ggc      2516

Ala Met Pro Tyr Asn Leu Phe Glu Gly Val Leu Pro Pro Trp Leu Gly

310                 315                 320                 325

agg ttg acc aat ctt gat gcc atc tcc ttg ggt ggg aat aac ttt gat      2564

Arg Leu Thr Asn Leu Asp Ala Ile Ser Leu Gly Gly Asn Asn Phe Asp

                330                 335                 340

gct ggc ccc atc cct act gaa ctt agc aac ctc acc atg ctg aca gtc      2612

Ala Gly Pro Ile Pro Thr Glu Leu Ser Asn Leu Thr Met Leu Thr Val

            345                 350                 355

tta gat ttg acg acg tgc aac cta aca gga aac atc cct gca gat att      2660

Leu Asp Leu Thr Thr Cys Asn Leu Thr Gly Asn Ile Pro Ala Asp Ile

        360                 365                 370

ggg cac cta ggc caa ctt tca tgg ttg cat ctt gcg atg aat caa cta      2708

Gly His Leu Gly Gln Leu Ser Trp Leu His Leu Ala Met Asn Gln Leu

    375                 380                 385

aca gga cct att cct gct tct ctt ggc aac ctt tca tcg ttg gca atc      2756

Thr Gly Pro Ile Pro Ala Ser Leu Gly Asn Leu Ser Ser Leu Ala Ile

390                 395                 400                 405

ctg cta ctg aaa gga aac ttg ctg gat gga tca tta cca tcg aca gtt      2804

Leu Leu Leu Lys Gly Asn Leu Leu Asp Gly Ser Leu Pro Ser Thr Val

                410                 415                 420

gat agc atg aac tca cta acg gca gtt gat gtt act gaa aac aat cta      2852

Asp Ser Met Asn Ser Leu Thr Ala Val Asp Val Thr Glu Asn Asn Leu

            425                 430                 435

cac ggg gat ctc aac ttc ctt tct act gtt tcc aat tgt agg aag ctt      2900

His Gly Asp Leu Asn Phe Leu Ser Thr Val Ser Asn Cys Arg Lys Leu

        440                 445                 450

tct acc ctc caa atg gac ctg aat tat atc acc gga atc ctc cca gac      2948

Ser Thr Leu Gln Met Asp Leu Asn Tyr Ile Thr Gly Ile Leu Pro Asp

    455                 460                 465

tat gtt ggg aac ctg tcg tca cag ctg aaa tgg ttc acg tta tct aac      2996

Tyr Val Gly Asn Leu Ser Ser Gln Leu Lys Trp Phe Thr Leu Ser Asn

470                 475                 480                 485

aac aag tta act ggc acg ctt cca gct acc att tca aat tta act gct      3044

Ash Lys Leu Thr Gly Thr Leu Pro Ala Thr Ile Ser Asn Leu Thr Ala

                490                 495                 500

ctt gag gtg ata gat ctt tca cat aac caa ctg cgc aat gca att cca      3092

Leu Glu Val Ile Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Arg Asn Ala Ile Pro

            505                 510                 515

gaa tca atc atg acg att gag aat ctc caa tgg ctt gac cta agt gga      3140

Glu Ser Ile Met Thr Ile Glu Asn Leu Gln Trp Leu Asp Leu Ser Gly

        520                 525                 530

aat agc ttg tct ggc ttc atc cca tcg aat act gca ctt cta agg aac      3188

Asn Ser Leu Ser Gly Phe Ile Pro Ser Asn Thr Ala Leu Leu Arg Asn

    535                 540                 545

att gta aaa ctg ttc ctt gaa agc aac gaa att tct ggc tcc ata cca      3236

Ile Val Lys Leu Phe Leu Glu Ser Asn Glu Ile Ser Gly Ser Ile Pro

550                 555                 560                 565

aag gac atg agg aac ctc act aat cta gag cac ctt cta ttg tct gat      3284

Lys Asp Met Arg Asn Leu Thr Asn Leu Glu His Leu Leu Leu Ser Asp

                570                 575                 580

aac aaa tta acg tca act ata cca cca agc tta ttt cat ctt gat aaa      3332

Asn Lys Leu Thr Ser Thr Ile Pro Pro Ser Leu Phe His Leu Asp Lys

            585                 590                 595

atc gtc agg cta gat ctt tct cga aac ttc ttg agt ggt gca ctg ccg      3380

Ile Val Arg Leu Asp Leu Ser Arg Asn Phe Leu Ser Gly Ala Leu Pro

        600                 605                 610

gtt gat gta ggg tat ttg aag caa att acc atc atg gat ctc tct gac      3428

Val Asp Val Gly Tyr Leu Lys Gln Ile Thr Ile Met Asp Leu Ser Asp

    615                 620                 625

aac cac ttt tct ggt aga atc cca tat tcg ata gga caa ctt cag atg      3476

Asn His Phe Ser Gly Arg Ile Pro Tyr Ser Ile Gly Gln Leu Gln Met

630                 635                 640                 645

tta aca cac ctg aat cta tca gct aac gga ttc tat gat tct gtt cca      3524

Leu Thr His Leu Asn Leu Ser Ala Asn Gly Phe Tyr Asp Ser Val Pro

                650                 655                 660

gac tct ttt ggt aat tta act ggc ttg caa act ttg gac ata tcc cat      3572

Asp Ser Phe Gly Asn Leu Thr Gly Leu Gln Thr Leu Asp Ile Ser His

            665                 670                 675

aac agt att tct ggt acc atc cca aac tac ttg gct aat ttt acg acc      3620

Asn Ser Ile Ser Gly Thr Ile Pro Asn Tyr Leu Ala Asn Phe Thr Thr

        680                 685                 690

ctt gtt agc ttg aac cta tct ttc aac aaa cta cat ggt caa ata ccg      3668

Leu Val Ser Leu Asn Leu Ser Phe Asn Lys Leu His Gly Gln Ile Pro

    695                 700                 705

gaa gga ggt gtc ttt gca aac atc act tta caa tac ttg gaa gga aac      3716

Glu Gly Gly Val Phe Ala Asn Ile Thr Leu Gln Tyr Leu Glu Gly Asn

710                 715                 720                 725

tca ggg cta tgt ggt gct gcc cgt tta gga ttc cca cca tgc caa acc      3764

Ser Gly Leu Cys Gly Ala Ala Arg Leu Gly Phe Pro Pro Cys Gln Thr

                730                 735                 740

acc tcc ccc aac aga aat aat ggt cac atg cta aaa tat ttg cta cct      3812

Thr Ser Pro Asn Arg Asn Asn Gly His Met Leu Lys Tyr Leu Leu Pro

            745                 750                 755

act ata atc ata gta gtt gga att gta gct tgt tgc ctg tat gta gtg      3860

Thr Ile Ile Ile Val Val Gly Ile Val Ala Cys Cys Leu Tyr Val Val

        760                 765                 770

att aga aag aaa gct aac cat caa aat act tct gct ggt aag gct gac      3908

Ile Arg Lys Lys Ala Asn His Gln Asn Thr Ser Ala Gly Lys Ala Asp

    775                 780                 785

ctt atc agc cat caa ttg ctc tcc tat cat gag ctt ctt cgt gca acc      3956

Leu Ile Ser His Gln Leu Leu Ser Tyr His Glu Leu Leu Arg Ala Thr

790                 795                 800                 805

gat gat ttc agc gat gat agc atg ttg ggc ttc gga agc ttt gga aaa      4004

Asp Asp Phe Ser Asp Asp Ser Met Leu Gly Phe Gly Ser Phe Gly Lys

                810                 815                 820

gtt ttt agg gga cga ttg agc aac ggt atg gtg gtt gcc ata aaa gtt      4052

Val Phe Arg Gly Arg Leu Ser Asn Gly Met Val Val Ala Ile Lys Val

            825                 830                 835

ata cac cag cat ctg gaa cat gcc atg aga agc ttt gac acc gag tgt      4100

Ile His Gln His Leu Glu His Ala Met Arg Ser Phe Asp Thr Glu Cys

        840                 845                 850

cgt gtg ctc cga atg gct cga cat cgc aac ctg ata aag att ctg aac      4148

Arg Val Leu Arg Met Ala Arg His Arg Asn Leu Ile Lys Ile Leu Asn

    855                 860                 865

act tgt tcc aac ctg gac ttc aga gca ctg gta ctt cag tac atg ccc      4196

Thr Cys Ser Asn Leu Asp Phe Arg Ala Leu Val Leu Gln Tyr Met Pro

870                 875                 880                 885

aag ggt agc tta gaa gca ctc ctg cac tca gaa caa ggg aag caa tta      4244

Lys Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu His Ser Glu Gln Gly Lys Gln Leu

                890                 895                 900

ggc ttt ctc gag agg ttg gat att atg cta gat gtg tca atg gca atg      4292

Gly Phe Leu Glu Arg Leu Asp Ile Met Leu Asp Val Ser Met Ala Met

            905                 910                 915

gaa tac ctg cat cat gag cac tat gag gtg gtc tta cac tgc gat ttg      4340

Glu Tyr Leu His His Glu His Tyr Glu Val Val Leu His Cys Asp Leu

        920                 925                 930

aag cct agc aac gta cta ttt gac gat gat atg acg gca cat gtg gca      4388

Lys Pro Ser Asn Val Leu Phe Asp Asp Asp Met Thr Ala His Val Ala

    935                 940                 945

gac ttt ggt att gca agg ttg ttg tta ggt gat gac aac tcc atg atc      4436

Asp Phe Gly Ile Ala Arg Leu Leu Leu Gly Asp Asp Asn Ser Met Ile

950                 955                 960                 965

tca gct agc atg cca gga aca gtt ggg tac atg gca cca g gtacttaata     4486

Ser Ala Ser Met Pro Gly Thr Val Gly Tyr Met Ala Pro

                970                 975

gtttttcttg tctttctcaa actttgcccg atcttttatt attattgagt agatagggtg    4546

caactaattt ttggtgtcta atttttcttg agcag ag  tat ggg act cta gga       4598

                                       Glu Tyr Gly Thr Leu Gly

                                           980

aaa gca tca cgg aag agt gat gtg ttc agt tac ggc atc atg ctg ctt      4646

Lys Ala Ser Arg Lys Ser Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ile Met Leu Leu

985                 990                 995                 1000

gaa gtg ttc act gcg  aag aga ccc aca gat  gct atg ttt gtg gga        4691

Glu Val Phe Thr Ala  Lys Arg Pro Thr Asp  Ala Met Phe Val Gly

                1005                 1010                 1015

gaa ctg aac atc agg  cag tgg gtt caa cag  gcg ttt cct gca gag        4736

Glu Leu Asn Ile Arg  Gln Trp Val Gln Gln  Ala Phe Pro Ala Glu

                1020                 1025                 1030

ctt gtc cat gtg gtg  gac tgc caa ctt cta  cag gat ggc tct tct        4781

Leu Val His Val Val  Asp Cys Gln Leu Leu  Gln Asp Gly Ser Ser

                1035                 1040                 1045

tct tct tca agt aac  atg cat gac ttc ctt  gtg cca gtg ttc gag        4826

Ser Ser Ser Ser Asn  Met His Asp Phe Leu  Val Pro Val Phe Glu

                1050                 1055                 1060

ctg ggc ttg ctc tgt  tcg gct gac tcc ccc  gag caa agg atg gcg        4871

Leu Gly Leu Leu Cys  Ser Ala Asp Ser Pro  Glu Gln Arg Met Ala

                1065                 1070                 1075

atg agc gat gtg gtc  ttg aca ctg aac aag  att aga aag gac tat        4916

Met Ser Asp Val Val  Leu Thr Leu Asn Lys  Ile Arg Lys Asp Tyr

                1080                 1085                 1090

gtc aaa ttg atg gca  acc aca gtg agc gtt  gtg cag cag tga            4958

Val Lys Leu Met Ala  Thr Thr Val Ser Val  Val Gln Gln

                1095                 1100

ttcatcgctc tctcgtggta tatgagcgaa tgaaatatat atatcctttg catccatttc    5018

ttctgtatta ggaatagcat cagtgtatac ccagtgatca attacccttt gcttctatgt    5078

gtttacggtt gaattgaata tatctatggt gcttcaggtt ctgcaacaat ttatagttgg    5138

tgtaaaaatg tgattgaaaa tgggagtaga tgatgtgctg cttatatttt cttatttctg    5198

gctgaaacaa aaaaaaaaaa gagggaatat tctgacctga aaaaggaatg tggtttgcat    5258

gtaaacatta atttgggcct ttgtcgtggg cttcactggt agcttgacat gcttcatacc    5318

ccatgggtac attaaggcct gtttgaacac tggaatattt tgcgctggta gaggtggaca    5378

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gcaataaatt tgagaaacgg tcattaatca aacctcacac acgtcattaa tgcataataa    5498

tggaggtaat ttactaatga atcatccaag atttgctctt gtgactctat ataaacagct    5558

gcaaaatgaa gctaggggcc aggtagtagc cagcatatgc agtagcttcc ttgtcaaaag    5618

gatctcctct catctcatct catcatggcg caaattctca gcaagaaggc tgcagcagtg    5678

ttcttcttca catctcttat ggtgatggcc accgtaaatt tctcatccgg tcatactaca    5738

caaggtatac atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat    5798

atatatatat atatatacac ctctcgattg aatttctcca tcacatccaa atgcaaaaac    5858

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atatatagcc tgacaagtat atatgcattt tacattttct gtatgaacta tttcggctct    5978

ctgtaaaagt cggggtcatt aa                                             6000

Claims (4)

1、Xa26(t)基因介导的赋予植物对白叶枯病菌抗性的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO：1中第1494-5124位所示的DNA序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。

2、合适启动子连接的权利要求1所述的DNA序列。

3、权利要求2所述的DNA序列，它是SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

4、权利要求1-3任一项所述的DNA序列在增加水稻对白叶枯病抗性中的应用。

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