CN1854154A - 一种稻瘟病抗性相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稻瘟病抗性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的稻瘟病抗性相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：3；2)将序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与稻瘟病抗性相关的蛋白质。将该稻瘟病抗性相关蛋白编码基因导入水稻，筛选得到过量表达所述稻瘟病抗性相关蛋白的水稻植株，即可得到稻瘟病抗性增强的植株。本发明的稻瘟病抗性相关蛋白将其编码基因在水稻抗稻瘟病育种工作中具有良好的应用前景。

Description

一种稻瘟病抗性相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种稻瘟病抗性相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，在我国农业和国民经济中也占据重要地位。因此提高水稻的产量和品质具有重要意义。病害侵袭是造成水稻减产和品质下降的主要原因之一，培育具有优良抗病性的水稻品种将有助于减轻病害引起的损失。水稻病害主要包括细菌性，真菌性和病毒性三种，关于水稻-病原菌相互作用机理的研究在近年来取得显著进展，克隆了一批特异性的抗病基因以及防卫基因，如抗水稻白叶枯病的Xa21和Xa26等。

稻瘟病(rice blast disease)是水稻主要的真菌性病害，由真菌Magnaporthegrisea引起，许多研究工作致力于克隆抗稻瘟病的相关基因。目前已经从水稻中分离了一些稻瘟病抗性基因，如Pib和Pi-ta等。

发明内容

本发明的目的是提供一种稻瘟病抗性相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的稻瘟病抗性相关蛋白，名称为OsBRR1(Oryza sativa blastresistance related protein1)，来源于水稻(Oryza sativa L.)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：3；

2)将序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与稻瘟病抗性相关的蛋白质。

序列表中的序列3由1001个氨基酸残基组成，自氨基端第316位至579位氨基酸残基为富含亮氨酸重复(leucine-rich repeat，LRR)的结构域，自氨基端第678位至957位氨基酸残基为蛋白激酶(protein kinase)结构域。因此推断该蛋白为富含亮氨酸重复的类受体激酶(leucine-rich repeat containingreceptor-like kinase，LRR-RLK)。已发现植物中编码该类蛋白的基因与个体发育及防御反应等密切相关。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

OsBRR1的编码基因(OsBRR1)也属于本发明的保护范围。

OsBRR1的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的序列1由3006个碱基组成，其编码序列为自5′端第1位至3006位碱基。

OsBRR1的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的序列2由3420个碱基组成，其开放阅读框架为自5′端起第1位-3420位碱基，该基因含有2个外显子(自序列2的5′端起第1位-2565位碱基，自序列2的5′端起第2980位-3420位碱基)，1个内含子(自序列2的5′端起第2566位-2979位碱基)。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有OsBRR1基因的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增OsBRR1基因中任一片段的引物也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种利用上述稻瘟病抗性相关蛋白编码基因增强水稻稻瘟病抗性的方法。

本发明所提供的增强水稻稻瘟病抗性的方法，是将上述稻瘟病抗性相关蛋白编码基因导入水稻，筛选得到过量表达所述稻瘟病抗性相关蛋白的水稻植株即为稻瘟病抗性增强的植株。

可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的稻瘟病抗性相关蛋白编码基因导入水稻。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(GUS基因、GFP和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(庆大霉素，卡那霉素等)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期进行特定PCR分子标记筛选。含有本发明的OsBRR1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化水稻细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

RNAi和过量表达结果的分析表明，OsBRR1基因的表达量和水稻的稻瘟病抗性水平密切相关。本发明的稻瘟病抗性相关蛋白将其编码基因在水稻抗稻瘟病育种工作中具有良好的应用前景。

附图说明

图1A为pCADS1341的T-DNA区结构示意图

图1B为pCUbi1390的T-DNA区结构示意图

图2A为T0代OsBRR1-RNAi水稻植株的Southern检测

图2B为T0代OsBRR1-RNAi水稻植株的Northern检测

图3为T1代OsBRR1-RNAi水稻植株的RT-PCR和研54-04抗性检测

图4为T0代OsBRR1过量表达水稻植株的RT-PCR和97-27-2抗性检测

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

T0表示由水稻的愈伤组织得到的转基因植株，T1表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株。

实施例1、获得OsBRR1编码基因

根据水稻基因组和cDNA测序结果预测OsBRR1基因及其开放阅读框，利用引物5’-CGG GGTACCGCCTCATCCATGGCACTGG-3’和5’-CGC GGATCCAGGACACCAGCACAGTCCA-3’从水稻cDNA中扩增获得OSBRR1的cDNA基因。其中，使用TRIZOL一步法提取粳稻品种日本晴的叶片总RNA，取2μg总RNA采用SuperScriptTMfirst-strand synthesis system来制备cDNA。整个操作均按照试剂盒推荐的条件进行。将得到的PCR扩增产物连入pGEM-T Easy(购自promega公司)载体，得到含有该PCR扩增产物的重组载体，进行测序，结果表明该PCR扩增产物大小为3006个碱基，具有序列表中序列1的DNA序列，编码具有序列表中SEQ ID №：3氨基酸残基序列的蛋白质OsBRR1。

利用引物5’-CGG GGTACCGAAACTCGGACACCCACTC-3’和5’-CGC GGATCCAGGACACCAGCACAGTCCA从日本晴基因组DNA中扩增获得OsBRR1的基因组基因。将得到的PCR扩增产物连入pGEM-T Easy载体，得到含有该PCR扩增产物的重组载体，进行测序，结果表明该PCR扩增产物大小为由3420个碱基，具有序列表中序列2的DNA序列，编码具有序列表中SEQ ID №：3氨基酸残基序列的蛋白质OsBRR1。OsBRR1的基因组基因的开放阅读框架为自5′端起第1位-3420位碱基，该基因含有2个外显子(自序列2的5′端起第1位-2565位碱基，自序列2的5′端起第2980位-3420位碱基)，1个内含子(自序列2的5′端起第2566位-2979位碱基)。

上述PCR扩增OSBRR1的cDNA基因及其基因组基因的条件为先94℃ 5min；接着94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 3min 8个循环；94℃ 1min，62℃ 1min，72℃ 3min 22个循环；最后72℃ 7min。

实施例2、OsBRR1的功能验证

1、构建RNAi和过量表达载体及其转化植株

使用TRIZOL一步法提取水稻日本晴叶片总RNA，取2μg总RNA采用SuperScriptTMfirst-strand synthesis system来制备cDNA。整个操作均按照试剂盒推荐的条件进行。

以日本晴的cDNA为模板，用引物5’-CGCTCTAGAGCTCGGTGTCACCATCAATAGGAG-3’和5’-CGCGGATCCATGGCGTTGAAGTAGGCGAAC-3’按照常规方法进行PCR扩增，扩增条件为先94℃ 5min；接着94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 2min 8个循环；94℃ 1min，62℃ 1min，72℃ 2min 22个循环；最后72℃ 7min。得到的PCR扩增产物大小为452bp。将该452bp的DNA片段以反向重复的方式插入RNAi载体pCADS1341。pCADS1341的T-DNA区结构如图1A所示，植物选择标记为潮霉素(HYG)抗性(R)，RNAi系统由CaMV 35S启动子驱动。pCADS1341按如下方法构建：使用EcoRI/PstI酶切pFGC5941(GenBank注册号：AY310901，构建方法见参考文献McGinnis K etal.Transgene-induced RNA interference as a tool for plant functionalgenomics.Methods Enzymol，2005，392：1-24)，电泳分离大小约为3.5kb的RNA干涉载体功能片段，插入pCAMBIA1300((CAMBIA购买))的EcoRI/PstI位点，即得到载体pCADS1341。

将PCR扩增得到的长度为452bp的DNA片段以反向重复的方式插入pCADS1341的具体方法为：先将该片段用SacI/NcoI酶切，插入到pCADS1341的SacI/NcoI克隆位点，得到中间载体后，再将经BamHI/XbaI酶切的该长度为452bp的片段插入到该中间载体的BamHI/XbaI克隆位点，即得到该片段反向重复插入pCADS1341的RNAi表达载体。每一步连接产物转入E.coli JM109感受态细胞中，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定，挑选有插入片段的克隆测序鉴定，得到含有反向重复插入上述452bp DNA片段的RNAi表达载体pCADS1341-OsBRR1。

用引物5’-CGGGGTACCGAAACTCGGACACCCACTC-3’和5’-CGCGGATCCAGGACACCAGCACAGTCCA-3’从日本晴基因组DNA中按照常规方法PCR扩增OsBRR1全长基因，载体pCUbi1390和OsBRR1全长基因均经限制性内切酶KpnI和BaHI酶切后，用T4 DNA连接酶连接后，转入E.coli JM109感受态细胞中，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定，挑选有插入片段的克隆测序鉴定，得到含有OsBRR1全长基因的过量表达载体pCUbi1390-OsBRR1。其中，pCUbi1390的T-DNA区结构如图1B所示，植物选择标记为潮霉素(HYG)抗性(R)，过量表达系统由玉米ubiquitin启动子驱动。载体pCUbi1390按照如下方法构建：利用引物5’-GCCC AAGCTTCTAGTGCAGTGCAGCGTGAC-3’和5’-GCAA CTGCAGGTACCTAGTGCAGAAGTAACACCA-3’从pMCG161(GenBank注册号：

AY572837，构建方法见参考文献McGinnis K et al.Transgene-induced RNAinterference as a tool for plant functional genomics.Methods Enzymol，2005，392：1-24)扩增获得玉米ubiquitin启动子，并将其插入到pCAMBIA1390(从CAMBIA购买)的HindIII/PstI克隆位点，即得到过量表达载体pCUbi1390。

将pCADS1341-OsBRR1和pCUbi1390-OsBRR1分别转化农杆菌GV3101，质粒PCR及酶切鉴定后，将阳性菌株转化按常规植物组织培养方法制备的日本晴的生长状态良好、颗粒状愈伤组织，按照常规方法培养，得到再生植株。提取再生植株的基因组DNA，以5’-AAGTTCGACAGCGTCTCCGAC-3’和5’-TCTACACAGCCATCGGTCCAG-3’为正向和反向引物PCR扩增潮霉素抗性基因进行PCR鉴定，得到20株转pCADS1341-OsBRR1植株，为T0代OsBRR1-RNAi水稻植株；102株转pCUbi1390-OsBRR1植株，为T0代OsBRR1过量表达水稻植株。按照上述方法得到转空载体pCADS1341或pCUbi1390的对照植株。

2、在OsBRR1-RNAi水稻植株中验证OsBRR1的功能

取8株(1-8号植株)T0代OsBRR1-RNAi水稻植株按照常规方法进行Southern和Northern检测。其中，Southern检测中，水稻叶片样品的基因组DNA用EcoRI酶切后进行Southern杂交，探针为以pCADS1341-OsBRR1为模板，用引物5’-AAGTTCGACAGCGTCTCCGAC-3’和5’-TCTACACAGCCATCGGTCCAG-3’PCR扩增得到的潮霉素抗性基因片段；Northern检测中，Northern杂交的探针为以T0代OsBRR1-RNAi日本晴水稻植株的叶片cDNA为模板，用引物5，-TCGCACCTCCAGTCACTCAAC-3’和5’-CGATTCCGGAAGAGGTTCAGC-3’PCR扩增得到的OsBRR1的cDNA片段。Southern检测的结果表明1号样品中T-DNA为单拷贝插入，RNAi的效率也是最高的，因此选择该样品进行T1代分析(图2A，1-8为植株编号，箭头示电泳方向)。Northern检测结果表明1，3，8号植株中的OsBRR1基因表达量与未转基因的日本晴相比明显降低(图2B)。图2B中，1，3，4，5，8为植株编号，CK1为野生型日本晴植株，CK2为按照常规方法获得的转pCADS1341空载体的日本晴植株，箭头示电泳方向。

使用日本晴具有一定抗性的稻瘟菌菌株研54-04对OsBRR1-RNAi水稻植株中的1号T1代苗期植株进行了喷雾接种，结果表明1号的T1代OsBRR1-RNAi水稻植株对研54-04的抗性与转pCADS1341空载体的对照植株相比明显下降(表1)。

其中，叶瘟分级参照国际水稻研究所(international rice research institute，IRRI)制定的标准。R1-R4视为抗病，S5-S6视为感病，从R1到S6抗性依次减弱。

      表1 T1代OsBRR1-RNAi植株对稻瘟菌研54-04的抗性分析

水稻对稻瘟病的抗性分级标准	T1代OsBRR1-RNAi植株		转pCADS1341空载体对照
					数目	百分比	数目	百分比
	R1	5	5.6	2					14.3

R2R3R4S5S6植株总数

21191431090

23.321.115.634.40.0

6231014

42.914.321.47.10.0

对OsBRR1-RNAi水稻植株中，8株1号的T1代水稻植株进行了RT-PCR和研54-04抗性分析，结果表明OsBRR1基因表达量的下降和水稻对研54-04抗性的下降呈正相关性(图3)。其中，水稻actin基因的表达量作为内对照。PCR扩增actin基因cDNA片段所用引物为5’-GACCTTGCTGGGCGTGATCTC-3’和5’-GATGGGCCAGACTCGTCGTAC-3’。扩增OsBRR1基因cDNA片段所用引物为5’-TCTCGGCGGAGATACAGACGC-3’和5’-GTGGGTCGGCGATCTTCGTGA-3’。

3、在OsBRR1过量表达水稻植株中验证OsBRR1的功能

使用日本晴敏感的稻瘟菌菌株97-27-2对苗期的T0代OsBRR1过量表达水稻植株进行了喷雾接种，结果表明T0代OsBRR1过量表达水稻植株对97-27-2的抗性与转pCADS1341空载体的对照植株相比，有不同程度的提高(表2)。其中，叶瘟分级参照国际水稻研究所(international rice research institute，IRRI)制定的标准。R1-R4视为抗病，S5-S6视为感病，从R1到S6抗性依次减弱。

选取12株T0代过量表达植株进行了RT-PCR分析，其中8株OsBRR1的表达量有不同程度的提高，对这8株水稻的97-27-2抗性分析结果表明OsBRR1基因表达量的提高和水稻对97-27-2抗性的增强呈正相关性(图4)。其中，RT-PCR所用引物与1号OsBRR1-RNAi水稻的T1代植株的RT-PCR检测相同。图4中，CK为转pCUbi1390空载体的对照植株，1-8为T0代OsBRR1过量表达植株。

表2 T0代OsBRR1过量表达植株对稻瘟菌97-27-2的抗性分析

水稻对稻瘟病的抗性分级标准	T0代过量表达植株		转pCUbi1390空载体对照
					数目	百分比	数目	百分比
	R1R2R3R4S5S6植株总数	31121710302102	30.411.816.79.829.42.0	20008313					15.40.00.00.061.523.1

上述RNAi和过量表达结果的分析表明，OsBRR1基因的表达量和水稻的稻瘟病抗性水平密切相关。

                               序列表

<160>3

<210>1

<211>3006

<212>DNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400>1

atggccgccg ccgccgccac ctccaccctt ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcgcc      60

accgccaccc atggcgccgc ggccgacaca gtctcgtccc ccgcctcccc tgaagcggcc     120

gcactcctca acctctccgc cgcgctcggt gatccctcgg gctacctctc cacgcactgg     180

acgcacgaca ccgcgttctg ctcgtggccg cgcctctcct gcgacgccga cggctcccgc     240

gtcctctcgc tcgacctctc cggcctcaac ctctccggcc cgatccccgc cgcggcgctc     300

tcctccctct cgcacctcca gtcactcaac ctctccaaca acatcctcaa ctccaccttc     360

ccggagggcc tcatcgccag cctcaagaac cttcgcgttc tcgatttcta caacaacaac     420

ctcaccggcg ctctcccggc cgcgctcccc aacctcacca accttgttca cctccacctc     480

ggcggcaatt tcttcttcgg cagcatcccc aggtcgtacg ggcagtggag ccggatcaag     540

tacctggctc tctccggcaa tgagctcacc ggggagatac cgccggagct cggcaacctg     600

acgacgctca gggaactgta cctcggctac ttcaacagct tcaccggcgg gataccgccg     660

gagctcggga ggctgaagga gctcgtgcgg ctcgacatgg cgaactgcgg gatctccggt     720

gtggtcccgc cggaggtggc gaacctgacg tcgctcgaca ctctgtttct tcagatcaac     780

gctctctccg ggcggctgcc gccggagatt ggcgcaatgg gggcgctgaa atcgctcgac     840

ctgtcgaaca acctgttcgt cggggagatc cccgcgagct tcgcgtcgct caagaacctg     900

acgctgctga acctcttccg gaatcgcctc gccggcgaga ttcccgagtt tgtcggcgac     960

ctgccgaacc tcgaggtgct gcagctgtgg gagaacaact tcaccggtgg agtgccggct    1020

cagctcggcg tggcagccac caggctgagg atcgtcgatg tgagcacgaa caggctaacc    1080

ggcgttctac caacagagct ctgcgccggc aagcggctgg agacgttcat tgcgctgggg    1140

aactcactgt tcggcagcat tcccgacggg ctcgccgggt gcccgtcgtt gacgaggctt    1200

cgtcttggag agaattatct gaacgggacg ataccggcga agatgtttac attgcagaac    1260

ctgacgcaga tcgagctgca cgataatttg ctctccggcg agctccggct ggacgccggc    1320

gtggtgtcac catcaatagg agagctgagc ttgtataaca atcggttgtc cggtccggtg    1380

ccggtgggga tcggtggtct cgtcgggctg cagaagttgc tggtcgccgg gaaccggttg    1440

tccggcgaac tccctcgtga gattgggaag ctgcaacagc tttcaaaggc ggacttatct    1500

gggaacctga tctccgggga gatacctccg gcgatcgccg gatgccggct gctcaccttc    1560

ctcgacctct ctggcaacag gctctccggc agaatcccgc cggcgctcgc cgggctacga    1620

atcctcaact atctcaatct gtcccacaac gcgctcgacg gggagattcc acctgctatc    1680

gccggaatgc agagcctaac agccgtcgac ttctccgaca acaatctctc cggcgaggtc    1740

ccggcgaccg gccagttcgc ctacttcaac gccacgtcgt tcgccggtaa cccaggcctc    1800

tgcggcgcct tcctctcccc gtgccgctcc cacggcgtcg ccacgacgtc gaccttcggc    1860

tccctctcgt cggcgtcgaa gctgctcctc gtgctcggcc tcctcgcgct gtccatcgtg    1920

ttcgccggcg cggcggtgct gaaggcgcgg tcgctgaagc ggtccgccga ggcgcgcgcg    1980

tggcggctca cggcgttcca gcgcctcgac ttcgccgtgg acgacgtgct ggactgcctc    2040

aaggaggaga acgtgatcgg caagggcggg tcagggatcg tgtacaaggg cgcgatgccc    2100

ggcggcgcgg tggtggccgt gaagcggctc ccggccatgg ggcgctccgg cgcggcgcac    2160

gacgactacg gcttctcggc ggagatacag acgctggggc gcatccggca ccgacacatc    2220

gtgcgcctgc tcgggttcgc cgccaaccgg gagacgaacc tgctggtgta cgagtacatg    2280

ccgaacggca gcctcggcga ggtgctccac ggcaagaagg gcggccacct gcagtgggcg    2340

acgcggtaca agatcgccgt ggaggccgcc aagggcctct gctacctgca ccacgactgc    2400

tcgccgccga tcctgcaccg cgacgtcaag tccaacaaca tcctcctcga cgccgagttc    2460

gaggcgcacg tcgccgactt cggcctcgcc aagttcctcc gcggcaatgc cggtggctcc    2520

gagtgcatgt ccgcgatcgc cggctcctac ggctacattg ctcccgagta cgcctacacg    2580

ctcaaggtgg acgagaagag cgacgtgtac agcttcgggg tagtgctact ggagctcatc    2640

gctgggcgga agccggtggg agagttcggc gacggcgtgg acatcgtgca ctgggtgcgg    2700

atggtgaccg ggtcgagcaa ggagggcgtc acgaagatcg ccgacccacg gctctcgacg    2760

gtgcccctcc acgagctgac gcacgtcttc tacgtcgcca tgctgtgcgt cgccgagcag    2820

agcgtcgagc ggccgacgat gcgggaggtc gtgcagatct tgaccgacct gcccggtacg    2880

gcggcggcga cggccatgga cgcgccgtcg cacgggtcgg ggaaagagca agaccggagc    2940

gcggagatgc agcagcagga cgggtcacgc gagtccccgc cacagcagga tctccttagc    3000

atctag                                                               3006

<210>2

<211>3420

<212>DNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400>2

atggccgccg ccgccgccac ctccaccctt ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcgcc      60

accgccaccc atggcgccgc ggccgacaca gtctcgtccc ccgcctcccc tgaagcggcc     120

gcactcctca acctctccgc cgcgctcggt gatccctcgg gctacctctc cacgcactgg     180

acgcacgaca ccgcgttctg ctcgtggccg cgcctctcct gcgacgccga cggctcccgc     240

gtcctctcgc tcgacctctc cggcctcaac ctctccggcc cgatccccgc cgcggcgctc     300

tcctccctct cgcacctcca gtcactcaac ctctccaaca acatcctcaa ctccaccttc     360

ccggagggcc tcatcgccag cctcaagaac cttcgcgttc tcgatttcta caacaacaac     420

ctcaccggcg ctctcccggc cgcgctcccc aacctcacca accttgttca cctccacctc     480

ggcggcaatt tcttcttcgg cagcatcccc aggtcgtacg ggcagtggag ccggatcaag     540

tacctggctc tctccggcaa tgagctcacc ggggagatac cgccggagct cggcaacctg     600

acgacgctca gggaactgta cctcggctac ttcaacagct tcaccggcgg gataccgccg     660

gagctcggga ggctgaagga gctcgtgcgg ctcgacatgg cgaactgcgg gatctccggt     720

gtggtcccgc cggaggtggc gaacctgacg tcgctcgaca ctctgtttct tcagatcaac     780

gctctctccg ggcggctgcc gccggagatt ggcgcaatgg gggcgctgaa atcgctcgac     840

ctgtcgaaca acctgttcgt cggggagatc cccgcgagct tcgcgtcgct caagaacctg     900

acgctgctga acctcttccg gaatcgcctc gccggcgaga ttcccgagtt tgtcggcgac     960

ctgccgaacc tcgaggtgct gcagctgtgg gagaacaact tcaccggtgg agtgccggct    1020

cagctcggcg tggcagccac caggctgagg atcgtcgatg tgagcacgaa caggctaacc    1080

ggcgttctac caacagagct ctgcgccggc aagcggctgg agacgttcat tgcgctgggg    1140

aactcactgt tcggcagcat tcccgacggg ctcgccgggt gcccgtcgtt gacgaggctt    1200

cgtcttggag agaattatct gaacgggacg ataccggcga agatgtttac attgcagaac    1260

ctgacgcaga tcgagctgca cgataatttg ctctccggcg agctccggct ggacgccggc    1320

gtggtgtcac catcaatagg agagctgagc ttgtataaca atcggttgtc cggtccggtg    1380

ccggtgggga tcggtggtct cgtcgggctg cagaagttgc tggtcgccgg gaaccggttg    1440

tccggcgaac tccctcgtga gattgggaag ctgcaacagc tttcaaaggc ggacttatct    1500

gggaacctga tctccgggga gatacctccg gcgatcgccg gatgccggct gctcaccttc    1560

ctcgacctct ctggcaacag gctctccggc agaatcccgc cggcgctcgc cgggctacga    1620

atcctcaact atctcaatct gtcccacaac gcgctcgacg gggagattcc acctgctatc    1680

gccggaatgc agagcctaac agccgtcgac ttctccgaca acaatctctc cggcgaggtc    1740

ccggcgaccg gccagttcgc ctacttcaac gccacgtcgt tcgccggtaa cccaggcctc    1800

tgcggcgcct tcctctcccc gtgccgctcc cacggcgtcg ccacgacgtc gaccttcggc    1860

tccctctcgt cggcgtcgaa gctgctcctc gtgctcggcc tcctcgcgct gtccatcgtg    1920

ttcgccggcg cggcggtgct gaaggcgcgg tcgctgaagc ggtccgccga ggcgcgcgcg    1980

tggcggctca cggcgttcca gcgcctcgac ttcgccgtgg acgacgtgct ggactgcctc    2040

aaggaggaga acgtgatcgg caagggcggg tcagggatcg tgtacaaggg cgcgatgccc    2100

ggcggcgcgg tggtggccgt gaagcggctc ccggccatgg ggcgctccgg cgcggcgcac    2160

gacgactacg gcttctcggc ggagatacag acgctggggc gcatccggca ccgacacatc    2220

gtgcgcctgc tcgggttcgc cgccaaccgg gagacgaacc tgctggtgta cgagtacatg    2280

ccgaacggca gcctcggcga ggtgctccac ggcaagaagg gcggccacct gcagtgggcg    2340

acgcggtaca agatcgccgt ggaggccgcc aagggcctct gctacctgca ccacgactgc    2400

tcgccgccga tcctgcaccg cgacgtcaag tccaacaaca tcctcctcga cgccgagttc    2460

gaggcgcacg tcgccgactt cggcctcgcc aagttcctcc gcggcaatgc cggtggctcc    2520

gagtgcatgt ccgcgatcgc cggctcctac ggctacattg ctcccggtat gtatgagtgt    2580

accccctctg ccccctacaa attttcagct cattctgttg actgtacccg gttgctacta    2640

gtactactat ccaccatcat ttccagtgtt gaaaaaatca tgcatcacaa agtgcagaaa    2700

aggcccaaaa ttgctagtac tagtcctgtc ctgctcatgg caaatgttac aatggggcct    2760

tcatattttt caaactcact atcacattga aatttggaag aaaatggttg gttttggtat    2820

gctctgattt gttttttact gtgcccccac actatcgagt tgtacatatg ctggatgttg    2880

tgcctctcgt cactttgtcg ttttaatgaa tcatcattgg gaattgatgg cctgcgatct    2940

tatgtggtct gagctgtgtg tttgccctgt gcatccgcag agtacgccta cacgctcaag    3000

gtggacgaga agagcgacgt gtacagcttc ggggtagtgc tactggagct catcgctggg    3060

cggaagccgg tgggagagtt cggcgacggc gtggacatcg tgcactgggt gcggatggtg    3120

accgggtcga gcaaggaggg cgtcacgaag atcgccgacc cacggctctc gacggtgccc    3180

ctccacgagc tgacgcacgt cttctacgtc gccatgctgt gcgtcgccga gcagagcgtc    3240

gagcggccga cgatgcggga ggtcgtgcag atcttgaccg acctgcccgg tacggcggcg    3300

gcgacggcca tggacgcgcc gtcgcacggg tcggggaaag agcaagaccg gagcgcggag    3360

atgcagcagc aggacgggtc acgcgagtcc ccgccacagc aggatctcct tagcatctag    3420

<210>3

<211>1001

<212>PRT

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400>3

Met Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ser Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Ala Thr Ala Thr His Gly Ala Ala Ala Asp Thr Val Ser

            20                  25                  30

Ser Pro Ala Ser Pro Glu Ala Ala Ala Leu Leu Asn Leu Ser Ala Ala

        35                  40                  45

Leu Gly Asp Pro Ser Gly Tyr Leu Ser Thr His Trp Thr His Asp Thr

    50                  55                  60

Ala Phe Cys Ser Trp Pro Arg Leu Ser Cys Asp Ala Asp Gly Ser Arg

65                  70                  75                  80

Val Leu Ser Leu Asp Leu Ser Gly Leu Asn Leu Ser Gly Pro Ile Pro

                85                  90                  95

Ala Ala Ala Leu Ser Ser Leu Ser His Leu Gln Ser Leu Asn Leu Ser

            100                 105                 110

Asn Asn Ile Leu Asn Ser Thr Phe Pro Glu Gly Leu Ile Ala Ser Leu

        115                 120                 125

Lys Asn Leu Arg Val Leu Asp Phe Tyr Asn Asn Asn Leu Thr Gly Ala

    130                 135                 140

Leu Pro Ala Ala Leu Pro Asn Leu Thr Asn Leu Val His Leu His Leu

145                 150                 155                 160

Gly Gly Asn Phe Phe Phe Gly Ser Ile Pro Arg Ser Tyr Gly Gln Trp

                165                 170                 175

Ser Arg Ile Lys Tyr Leu Ala Leu Ser Gly Asn Glu Leu Thr Gly Glu

            180                 185                 190

Ile Pro Pro Glu Leu Gly Asn Leu Thr Thr Leu Arg Glu Leu Tyr Leu

        195                 200                 205

Gly Tyr Phe Asn Ser Phe Thr Gly Gly Ile Pro Pro Glu Leu Gly Arg

    210                 215                 220

Leu Lys Glu Leu Val Arg Leu Asp Met Ala Asn Cys Gly Ile Ser Gly

225                 230                 235                 240

Val Val Pro Pro Glu Val Ala Asn Leu Thr Ser Leu Asp Thr Leu Phe

                245                 250                 255

Leu Gln Ile Asn Ala Leu Ser Gly Arg Leu Pro Pro Glu Ile Gly Ala

            260                 265                 270

Met Gly Ala Leu Lys Ser Leu Asp Leu Ser Asn Asn Leu Phe Val Gly

        275                 280                 285

Glu Ile Pro Ala Ser Phe Ala Ser Leu Lys Asn Leu Thr Leu Leu Asn

    290                 295                 300

Leu Phe Arg Asn Arg Leu Ala Gly Glu Ile Pro Glu Phe Val Gly Asp

305                 310                 315                 320

Leu Pro Asn Leu Glu Val Leu Gln Leu Trp Glu Asn Asn Phe Thr Gly

                325                 330                 335

Gly Val Pro Ala Gln Leu Gly Val Ala Ala Thr Arg Leu Arg Ile Val

            340                 345                 350

Asp Val Ser Thr Asn Arg Leu Thr Gly Val Leu Pro Thr Glu Leu Cys

        355                 360                 365

Ala Gly Lys Arg Leu Glu Thr Phe Ile Ala Leu Gly Asn Ser Leu Phe

    370                 375                 380

Gly Ser Ile Pro Asp Gly Leu Ala Gly Cys Pro Ser Leu Thr Arg Leu

385                 390                 395                 400

Arg Leu Gly Glu Asn Tyr Leu Asn Gly Thr Ile Pro Ala Lys Met Phe

                405                 410                 415

Thr Leu Gln Asn Leu Thr Gln Ile Glu Leu His Asp Asn Leu Leu Ser

                420              425                430

Gly Glu Leu Arg Leu Asp Ala Gly Val Val Ser Pro Ser Ile Gly Glu

        435                 440                 445

Leu Ser Leu Tyr Asn Asn Arg Leu Ser Gly Pro Val Pro Val Gly Ile

    450                 455                 460

Gly Gly Leu Val Gly Leu Gln Lys Leu Leu Val Ala Gly Asn Arg Leu

465                 470                 475                 480

Ser Gly Glu Leu Pro Arg Glu Ile Gly Lys Leu Gln Gln Leu Ser Lys

                485                 490                 495

Ala Asp Leu Ser Gly Asn Leu Ile Ser Gly Glu Ile Pro Pro Ala Ile

            500                 505                 510

Ala Gly Cys Arg Leu Leu Thr Phe Leu Asp Leu Ser Gly Asn Arg Leu

        515                 520                 525

Ser Gly Arg Ile Pro Pro Ala Leu Ala Gly Leu Arg Ile Leu Asn Tyr

    530                 535                 540

Leu Asn Leu Ser His Asn Ala Leu Asp Gly Glu Ile Pro Pro Ala Ile

545                 550                 555                 560

Ala Gly Met Gln Ser Leu Thr Ala Val Asp Phe Ser Asp Asn Asn Leu

                565                 570                 575

Ser Gly Glu Val Pro Ala Thr Gly Gln Phe Ala Tyr Phe Asn Ala Thr

            580                 585                 590

Ser Phe Ala Gly Asn Pro Gly Leu Cys Gly Ala Phe Leu Ser Pro Cys

        595                 600                 605

Arg Ser His Gly Val Ala Thr Thr Ser Thr Phe Gly Ser Leu Ser Ser

    610                 615                 620

Ala Ser Lys Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Leu Ala Leu Ser Ile Val

625                 630                 635                 640

Phe Ala Gly Ala Ala Val Leu Lys Ala Arg Ser Leu Lys Arg Ser Ala

                645                 650                 655

Glu Ala Arg Ala Trp Arg Leu Thr Ala Phe Gln Arg Leu Asp Phe Ala

           660                  665                 670

Val Asp Asp Val Leu Asp Cys Leu Lys Glu Glu Asn Val Ile Gly Lys

        675                 680                 685

Gly Gly Ser Gly Ile Val Tyr Lys Gly Ala Met Pro Gly Gly Ala Val

    690                 695                 700

Val Ala Val Lys Arg Leu Pro Ala Met Gly Arg Ser Gly Ala Ala His

705                 710                 715                 720

Asp Asp Tyr Gly Phe Ser Ala Glu Ile Gln Thr Leu Gly Arg Ile Arg

                725                 730                 735

His Arg His Ile Val Arg Leu Leu Gly Phe Ala Ala Asn Arg Glu Thr

            740                 745                 750

Asn Leu Leu Val Tyr Glu Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu Gly Glu Val

        755                 760                 765

Leu His Gly Lys Lys Gly Gly His Leu Gln Trp Ala Thr Arg Tyr Lys

    770                 775                 780

Ile Ala Val Glu Ala Ala Lys Gly Leu Cys Tyr Leu His His Asp Cys

785                 790                 795                 800

Ser Pro Pro Ile Leu His Arg Asp Val Lys Ser Asn Asn Ile Leu Leu

                805                 810                 815

Asp Ala Glu Phe Glu Ala His Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Lys Phe

            820                 825                 830

Leu Arg Gly Asn Ala Gly Gly Ser Glu Cys Met Ser Ala Ile Ala Gly

        835                 840                 845

Ser Tyr Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Thr Leu Lys Val Asp

    850                 855                 860

Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Leu Glu Leu Ile

865                 870                 875                 880

Ala Gly Arg Lys Pro Val Gly Glu Phe Gly Asp Gly Val Asp Ile Val

                885                 890                 895

His Trp Val Arg Met Val Thr Gly Ser Ser Lys Glu Gly Val Thr Lys

            900                 905                 910

Ile Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Val Pro Leu His Glu Leu Thr His

        915                 920                 925

Val Phe Tyr Val Ala Met Leu Cys Val Ala Glu Gln Ser Val Glu Arg

    930                 935                 940

Pro Thr Met Arg Glu Val Val Gln Ile Leu Thr Asp Leu Pro Gly Thr

945                 950                 955                 960

Ala Ala Ala Thr Ala Met Asp Ala Pro Ser His Gly Ser Gly Lys Glu

                965                 970                 975

Gln Asp Arg Ser Ala Glu Met Gln Gln Gln Asp Gly Ser Arg Glu Ser

            980                 985                 990

Pro Pro Gln Gln Asp Leu Leu Ser Ile

        995                 1000

Claims (9)

1、稻瘟病抗性相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：3；

2)将序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与稻瘟病抗性相关的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述稻瘟病抗性相关蛋白具有序列表中序列3的氨基酸残基序列。

3、根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述序列表中的序列3中，自氨基端第316位至579位氨基酸残基为富含亮氨酸重复的结构域，自氨基端第678位至957位氨基酸残基为蛋白激酶结构域。

4、权利要求1、2或3所述稻瘟病抗性相关蛋白的编码基因。

5、根据权利要求4所述的基因，其特征在于：所述稻瘟病抗性相关蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

6、根据权利要求4所述的基因，其特征在于：所述稻瘟病抗性相关蛋白的基因组基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

7、含有权利要求4、5或6所述稻瘟病抗性相关蛋白编码基因的表达载体，细胞系和宿主菌。

8、扩增权利要求4、5或6所述稻瘟病抗性相关蛋白编码基因中任一片段的引物。

9、一种增强水稻稻瘟病抗性的方法，是将权利要求4、5或6所述稻瘟病抗性相关蛋白编码基因导入水稻，筛选得到过量表达所述稻瘟病抗性相关蛋白的水稻植株即为稻瘟病抗性增强的植株。

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