CN109721647A - 一种诱导水稻免疫反应的稻瘟菌分泌蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种诱导水稻免疫反应的稻瘟菌分泌蛋白及其应用，属于农业生物技术领域。该稻瘟菌分泌蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQID NO:2。稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7能够诱导水稻免疫反应，显著提高水稻对稻瘟菌的抗性。MoCDIP7作为蛋白分子，容易降解，对环境友好，不易产生污染，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

Description

一种诱导水稻免疫反应的稻瘟菌分泌蛋白及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种诱导水稻免疫反应的稻瘟菌分泌蛋白及其应用。

背景技术

稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度减产，严重时甚至绝收。目前对稻瘟病病害的防治主要采取化学防治和选育抗病品种。但是化学防治往往存在着环境污染的弊端，抗病品种则容易因稻瘟菌生理小种改变而丧失抗性。近年来，通过诱导植物免疫反应、提高植物抗病性受到关注。一些病原分泌蛋白作为诱导植物抗性的有效成分，已获得应用。因此从病原菌中寻找出具有免疫诱导活性的产物己成为国内外科学家关注的热点。

许多真菌分泌的效应蛋白具有诱导植物细胞死亡的能力(Chen et al., 2013;Fang et al., 2016; Anderson et al., 2017)。如，利用农杆菌真空渗透法，Fang等(2016年)从活体营养真菌Ustilaginoidea virens中鉴定了13种诱导细胞死亡分泌蛋白；Handerson等(2017年)从坏死真菌病原体根瘤菌中鉴定出包括木聚糖酶和含有抑制剂I9结构域的诱导细胞死亡的分泌蛋白。在稻瘟病菌中，有几种效应蛋白，如MoHrip1 (Chen etal., 2013), MoHrip2 (Chen et al., 2014)，MSP1 (Wang et al., 2016), MoNLP1、MoNLP2、MoNLP4 (Fang et al, 2017)和MoSM1 (Hong et al., 2017)，也被鉴定为具有诱导细胞死亡的活性。

细胞坏死是植物与病原菌互作中一个关键的过程(Kanneganti et al. 2006)。目前已知不少能够诱导细胞坏死的病原菌分泌蛋白能诱发植物免疫反应，其中有一些具有PAMPs功能，如一些细胞毒素NLPs具有一个可被十字花科植物识别的模块，该模块含有20个氨基酸的(nlp20) (Böhm et al., 2014)。nlp20模块被拟南芥的LRR受体蛋白RLP23结合,产生由模式识别受体诱导的免疫反应(PTI) (Albert et al., 2015)。大豆疫霉菌糖苷水解酶12蛋白和Rhynchosporium commune 诱导细胞死亡蛋白1 (RcCDI1)也被确认为是PAMPs (Ma et al., 2015; Franco-Orozcoet al., 2017). 研究还表明，稻瘟菌效应蛋白MoHrip1、MoHrip2和MSP1能诱导水稻的防卫反应(Chen et al., 2012; Chen et al.,2014; Wang et al., 2016)。

MoCDIP7是从稻瘟菌中鉴定到的一种分泌蛋白。通过体外表达、纯化MoCDIP7，喷施于水稻植株，能够诱导水稻产生免疫反应，提高水稻对稻瘟病菌的抗性。因此，该蛋白可以作为植物免疫增强剂或诱导剂，应用于生物农药配置。

发明内容

本发明目的在于针对目前水稻稻瘟菌缺乏有效生物防治药物，提供一种诱导水稻免疫反应的稻瘟菌分泌蛋白及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)菌株70-15 (Dean et al. 2005）和Guy11(Chen et al. 2007)为本实验室保存。

通过对受稻瘟菌侵染的水稻叶片做转录组分析，确定了多个在水稻中表达的编码分泌蛋白的效应蛋白，利用瞬时表达分析，确定其中一个稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7能诱导细胞坏死；进一步通过体外表达、纯化MoCDIP7，喷施于水稻秧苗植株，能够诱导水稻产生免疫反应，提高水稻对稻瘟病菌的抗性。

稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

一种重组表达载体，其含有上述稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7的编码基因。

上述重组载体为在pMAL-c2载体的BamHI位点插入稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7的编码基因，使MoCDIP7分泌蛋白与麦芽糖标签(MBP)同框融合表达。

一种重组蛋白，利用重组表达载体表达、纯化获得的重组MoCDIP7蛋白或MoCDIP7与麦芽糖标签融合的重组MBP-MoCDIP7蛋白。

上述稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7或重组蛋白在诱导水稻免疫反应中的应用。

上述稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7或重组蛋白在提高水稻稻瘟病抗性中的应用。

本发明的优点为：

稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7能够显著提高水稻对稻瘟菌的抗性。MoCDIP7作为蛋白分子，容易降解，对环境友好，不易产生污染，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

附图说明

图1 为SDS-PAGE检测利用大肠杆菌BL21表达、纯化的MBP-MoCDIP7融合蛋白图。M:Marker；1: 诱导前的BL21细菌溶液；2: IPTG诱导后的BL21细菌溶液；3: 纯化的重组MBP-MoCDIP7蛋白样品。

图2 MBP-MoCDIP7诱导水稻幼苗病程相关基因OsCht1的表达情况。buffer: 缓冲液喷洒水稻幼苗，作为阴性对照1；MBP：以麦芽糖标签表达物(2 μM) 喷洒水稻幼苗，作为阴性对照2；MBP-MoCDIP7：重组的MBP-MoCDIP7 (2 μM)喷洒水稻幼苗。

图3 MBP-MoCDIP7诱导水稻幼苗病程相关基因OsCht3的表达情况。buffer: 缓冲液喷洒水稻幼苗，作为阴性对照1；MBP：以麦芽糖标签表达物(2 μM) 喷洒水稻幼苗，作为阴性对照2；MBP-MoCDIP7：重组的MBP-MoCDIP7 (2 μM)喷洒水稻幼苗。

图4 MBP-MoCDIP7诱导水稻幼苗病程相关基因OsPR1b的表达情况。buffer: 缓冲液喷洒水稻幼苗，作为阴性对照1；MBP：以麦芽糖标签表达物(2 μM) 喷洒水稻幼苗，作为阴性对照2；MBP-MoCDIP7：重组的MBP-MoCDIP7 (2 μM)喷洒水稻幼苗。

图5 MBP-MoCDIP7诱导水稻幼苗病程相关基因OsNac4的表达情况。buffer: 缓冲液喷洒水稻幼苗，作为阴性对照1；MBP：以麦芽糖标签表达物(2 μM) 喷洒水稻幼苗，作为阴性对照2；MBP-MoCDIP7：重组的MBP-MoCDIP7 (2 μM)喷洒水稻幼苗。

图6为重组MBP-MoCDIP7 (2 μM)预处理的水稻秧苗提高对水稻稻瘟病抗性表现图。A: 接种稻瘟菌Guy11后第5天的发病表型；B: 接种稻瘟菌Guy11后第5天的病斑相对面积；buffer: 缓冲液预处理的材料，作为阴性对照；MBP-MoCDIP7: 重组MBP-MoCDIP7 (2 μM)预处理的材料。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1: 稻瘟病效应蛋白MoCDIP7编码基因的克隆

（1）稻瘟病效应蛋白MoCDIP7的分析:

通过前期对受稻瘟菌侵染的水稻叶片做转录组分析，确定了多个在水稻中表达的编码分泌蛋白的效应蛋白，利用瞬时表达分析，确定MoCDIP7能诱导细胞坏死。信号肽剪切后的MoCDIP7成熟蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO: 2所示，信号肽剪切后的MoCDIP7氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

（2）设计引物:

根据信号肽剪切后的MoCDIP7编码基因的序列设计引物，引物对碱基序列如下所示:

F1: 5′-ATGGATCCATGCACCCTCCCAAGCCG-3′；

R1: 5′-ATGGATCCCTACAAGAAAGCAACGG-3′

利用上述引物对Fl和R1，以70-15分离的稻瘟病基因DNA作为模板，进行常规PCR扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

扩增反应体系如下:

2 x Reaction Mix: 12.5 μL

引物 Fl (10 μΜ): 1 μL

引物 Rl (10μΜ): 1 μL

Golden DNA Polymerase: 0.2 μL

DNA 模板(20-50 ng/μL): 1 μL

ddH₂O: 补足至 25 μL。

PCR温度循环条件如下: 94℃ 5分钟；94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 30秒，35个循环；72℃ 7分钟；10℃保存。

结果：PCR产物经回收测序，序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例2: MBP-MoCDIP7重组蛋白表达和纯化

（1）表达载体构建

利用BamHI酶切实施例1获得的PCR扩增片段，插入融合蛋白N末端含有麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein, MBP)的pMAL-c2x载体(New England Biolabs, Ipswich,USA)，转化到大肠杆菌BL21中，挑取阳性克隆，摇菌并提取质粒，酶切并测序验证。

（2）诱导表达

将（1）中验证正确的重组表达菌株过夜活化，同时载体pMAL-c2x作为对照。分别取l mL过夜培养液加入到含有氨苄青霉素(终浓度100 μg/ml)的100 mL LB液体培养基中(1%接种量), 37 ℃，200 r/min振荡培养2~3 h。加入诱导剂IPTG (终浓度为0.5 mM), 16 ℃，220r/min 继续振荡培养过夜，诱导表达目的蛋白。高速离心，收集菌体加入缓冲液。 经超声破碎菌体后，4℃高速离心，收集上请，得到重组蛋白液。取20 µL上清液，加入 5 µL 5 × SDS上样缓冲液（变性）重悬菌体，沸水浴中加热10 min，13000 r/min离心10 min，取上清进行SDS-PAGE检测，考马斯亮兰R250染色，观察表达情况。经过SDS-PAGE 检测，麦芽糖的融合表达蛋白 MBP-MoCDIP7获得了表达。

(3）重组蛋白的纯化

利用直链淀粉树脂(New England Biolabs)对MBP-MoCDIP7重组蛋白进行纯化，经SDS-PAGE电泳和考马斯亮兰染色检测，成功获得了MBP-MoCDIP7重组蛋白，见图1。

实施例3: MBP-MoCDIP7重组蛋白诱导水稻对稻瘟病菌的防卫反应

（1）MBP-MoCDIP7重组蛋白诱导水稻产生免疫反应

取重组MBP-MoCDIP7蛋白液(2 μM)喷在播种后三周的水稻幼苗上，同时以纯化蛋白所用的缓冲液(buffer) (20 mM pH7.4 Tris-HCl，10 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM DTT，10 mM麦芽糖)及麦芽糖标签表达物(MBP) (2 μM)为对照处理水稻幼苗。分别于喷施0 h，24 h，48h和72 h后取水稻叶片。

用“RNAprep pure植物总RNA提取”试剂盒(TIANGEN公司)提取水稻叶片总 RNA，试验步骤如下：

a、将100 mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μL RL，涡旋剧烈震荡混匀，在56 ℃孵育1-3 min。

b、将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000 rpm离心5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

c、缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇(通常为225 μL)，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000 rpm离心60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

d、向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白液RW1，12,000 rpm离心60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

e、DNaseI 工作液的配制：取10 μL DNaseI 储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μL RDD溶液，轻柔混匀。

f、向吸附柱CR3中央加入80 μL的DNase I工作液，室温放置15 min。

g、向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白液RW1，12,000 rpm离心60s，倒掉收集管 中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

h、向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW (使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2 min，12,000 rpm离心60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

i、重复步骤h。

j、12,000 rpm离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

k、将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μL RNase-Free ddH₂O，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min，得到RNA 溶液，测RNA浓度，调成相同浓度。-70 ℃中保存。

第一链cDNA的合成，以提取的经完整性和纯度检测合格的总RNA为模板，采用“Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit”试剂盒(Thermo公司)进行cDNA第一条链反转录合成。

具体步骤如下：

a、将试剂盒中各组分混匀并稍微离心，离心后置于冰上。在置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，按照顺序加入下面的反应物：模板RNA 1 μg，oligo (dT) 18 引物1 μL，无核酸酶的高纯水至总体积为12 μL。

b、如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，将模板和引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65 °C孵育5 min，冰上冷却，离心，再置于冰上冷却。

c、将下列组分按照顺序加入：5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLock™ RNA酶抑制剂(20 u/μL) 1 μL，10 mM dNTP Mix 2 μL，RevertAid™M-MuLV逆转录酶(200 u/μL) 1 μL，总体为20 μL。

d、轻轻混匀，离心。

e、42°C孵育60 min。

f、70°C加热5 min终止反应。反应产物可直接用于PCR反应或者在-20°C保存少于一周的时间。如想延长保存时间，使用-70°C保存。

以反转录获得的cDNA为模板，OsActin基因为内参, 利用实时荧光定量PCR 分析4个病程相关基因OsCht1，OsCht3，OsNac4和OsPR1b的表达水平。5个基因的引物分别为：

Actin-F: 5’-CTCAACCCCAAGGCTAACAG-3’，

Actin-R: 5’-CCTTCATAGATTGGCACGGT-3’；

Cht1-F: 5’-GCACTGATAACCACTGATCGG-3’，

Cht1-R: 5’-TGTGGGCATTACTGATGATTG-3’；

Cht3-F: 5’-GCGATAACCTGGATTGCTACAA-3’，

Cht3-R: 5’-GTATTTTATTCGTCTGCTC-3’；

Nac4-F: 5’-TCCTGCCACCATTCTGAGATG-3’，

Nac4-R: 5’-TTGCAGAATCATGCTTGCC-3’；

PR1b-F: 5’-ACGGGCGTACGTACTGGCTA-3’，

PR1b-R: 5’-CTCGGTATGGACCGTGAAG-3’。

实时荧光定量PCR体系为20 μL：包括2.0 μL DNA模板，SYBR Premix ExTaq TM (2×) 10 μL，正、反向引物(10 μM)各0.4 μL，ROX Reference Dye II (50×) 0.4 μL，和6.8μL ddH₂O。每个样品设置3个重复。PCR扩增程序为：95 ℃预变性30 s； 95 ℃ 3 s，60 ℃30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反应结束后，确认Real Time PCR的扩增曲线和熔解曲线，制作标准曲线，计算各基因的相对表达量。观察抗性相关基因的表达情况。

结果：荧光定量PCR结果见图2、图3、图4、图5。结果表明MBP-MoCDIP7处理水稻叶片后，诱导提高了病程相关基因的表达，说明MoCDIP7诱导了水稻的免疫反应。

实施例4 MBP-MoCDIP7诱导水稻增强对稻瘟菌的抗性

以MBP-MoCDIP7蛋白液(2 μM)喷在三周龄的水稻幼苗上。24 h后，用稻瘟病菌菌株Guy11接种水稻。以纯化蛋白所用的缓冲液(buffer) (20 mM pH7.4 Tris-HCl，10 mMNaCl，1 mM EDTA，1 mM DTT，10 mM麦芽糖) 喷在三周龄的水稻幼苗上为对照组。

稻瘟菌的接种方法为：以0.025 % 的Tween20缓冲液洗脱稻瘟菌孢子，均匀喷洒在水稻幼苗上，25 ℃，>95%相对湿度条件下培养。5天后观察发病表型，并取样扫描，分析比较植株叶片发病面积，见图6。

图6结果表明：以缓冲液对照(buffer)和MBP-MoCDIP7溶液预处理的水稻幼苗，均有发病，但MBP-MoCDIP7溶液处理的水稻材料发病症状轻微，而对照材料则感病严重。说明重组MBP-MoCDIP7蛋白溶液诱导水稻增强对稻瘟菌的抗性。

以上实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 闽江学院、福建省农业科学院生物技术研究所

<120> 一种诱导水稻免疫反应的稻瘟菌分泌蛋白及其应用

<130> 14

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

His Pro Pro Lys Pro Ser Ser Thr Leu Thr Ser Val Ala Thr Leu Thr

1 5 10 15

Thr Thr Phe Thr Pro Pro Thr Val Thr Pro Pro Ala Val Ser Ser Thr

20 25 30

Glu Asp Cys Asp Asp Glu Ser Ser Thr Val Ala Pro Thr Thr Ser Ser

35 40 45

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Val Lys Met Thr Thr Ser Thr Thr

50 55 60

Ser Lys Thr Leu Ile Val Thr Val Thr Ser Cys Ala Pro Thr Val Thr

65 70 75 80

Ser Cys Pro Gly Lys Pro His Val Thr Thr Thr Val Ile Val Glu Thr

85 90 95

Thr Val Cys Pro Val Asp Glu Thr Thr Pro Thr Ser Lys Pro Pro Val

100 105 110

Gly Lys Pro Thr Thr Ser Thr Pro Tyr Pro Thr Gly Thr Lys Thr Ser

115 120 125

Gln Lys Pro Pro Val Gly Thr Gly Val Pro Pro Thr Gln Gln Pro Pro

130 135 140

Val Lys Pro Pro Val Gly Thr Gly Thr Gly Leu Pro Pro Thr Pro Pro

145 150 155 160

Lys Pro Thr Thr Thr Pro Pro Pro Val Thr Ala Gly Ala Ala Lys Met

165 170 175

Ala Ser Gly Phe Ser Ala Val Val Ala Phe Ile Gly Ala Val Ala Phe

180 185 190

Leu

<210> 2

<211> 582

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caccctccca agccgtccag cactctcacc tcggttgcca ccttgactac gacctttact 60

cctccgacgg tcacccctcc ggccgtcagc tccaccgagg actgcgacga cgagtctagc 120

accgtcgccc ccaccaccag cagcagcagc agcagcagca gcagctctgt caagatgacc 180

acttcgacca cctccaagac cctcatcgta accgtcacca gctgcgctcc caccgtcacc 240

agctgcccgg gcaagcctca cgtcaccacc accgtcatcg tcgagaccac cgtctgcccc 300

gtcgacgaga ccaccccgac ctccaagccc cccgtcggaa agcccaccac ctcgactccc 360

taccccaccg gcaccaagac cagccagaag cccccggtcg gcactggcgt tcctcctacc 420

cagcagcctc ccgtcaagcc tcctgtcggc accggcaccg gtcttccccc cacccctccc 480

aagcctacca ccacccctcc tccggtcacc gccggtgccg ccaagatggc ctcgggcttc 540

tcggcagtcg tggctttcat tggcgccgtt gctttcttgt ag 582

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> F1

<400> 3

atggatccat gcaccctccc aagccg 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> R1

<400> 4

atggatccct acaagaaagc aacgg 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Actin-F

<400> 5

ctcaacccca aggctaacag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Actin-R

<400> 6

ccttcataga ttggcacggt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Cht1-F

<400> 7

gcactgataa ccactgatcg g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Cht1-R

<400> 8

tgtgggcatt actgatgatt g 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Cht3-F

<400> 9

gcgataacct ggattgctac aa 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Cht3-R

<400> 10

gtattttatt cgtctgctc 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Nac4-F

<400> 11

tcctgccacc attctgagat g 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Nac4-R

<400> 12

ttgcagaatc atgcttgcc 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> PR1b-F

<400> 13

acgggcgtac gtactggcta 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> PR1b-R

<400> 14

ctcggtatgg accgtgaag 19

Claims (7)

1.一种稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

2.如权利要求1所述的一种稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7的编码基因，其特征在于，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，其含有权利要求1所述稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7的编码基因。

4.根据权利要求3所述的一种重组表达载体，其特征在于，所述重组载体为在pMAL-c2x载体的BamHI位点插入稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7的编码基因，使MoCDIP7分泌蛋白与麦芽糖标签(MBP)同框融合表达。

5.一种重组蛋白，其特征在于，利用权利要求3和4所述重组表达载体表达、纯化获得的重组MoCDIP7蛋白或MoCDIP7与麦芽糖标签融合的重组MBP-MoCDIP7蛋白。

6.如权利要求1所述的稻瘟菌分泌蛋白MoCDIP7在诱导水稻稻瘟菌免疫反应和/或在提高水稻稻瘟菌抗病性中的应用。

7.如权利要求5所述的重组蛋白在诱导水稻稻瘟菌免疫反应和/或在提高水稻稻瘟菌抗病性中的应用。