CN110938118B

CN110938118B - 致病疫霉菌分泌的植物免疫激活蛋白pc2及其应用

Info

Publication number: CN110938118B
Application number: CN201911298598.6A
Authority: CN
Inventors: 董莎萌; 王帅帅; 邢荣康; 王源超; 郑小波
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: CN110938118A

Abstract

本发明公开了一种致病疫霉菌分泌的植物免疫激活蛋白PC2及其应用，该植物免疫激活蛋白PC2具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。本发明研究发现PC2能够被植物免疫系统识别产生免疫反应，为提高植物抗性提供了新的途径。最小片段PC2^138‑198能够诱导植物防卫反应，有望合成有功能的肽段，为生物农药合成提供新的材料。本发明可以运用在定向改造新型有益共生菌、作物育种抗病性改良方面和生物农药等方面，有望提高植物对疫病的抗病性，从而达到增产减药的目的，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

Description

致病疫霉菌分泌的植物免疫激活蛋白PC2及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，具体涉及致病疫霉分泌的一种激发植物免疫活性的蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

疫霉菌是一类重要的植物病原菌，其引起的疫病经常在作物上造成严重的危害。其中由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病是农业生产中的一种毁灭性病害，造成大量农作物损失[1,2]。19世纪中期，晚疫病在欧洲种植区爆发，连续两年受灾而导致马铃薯绝产，致使几十万人死亡，一百五十万人移居，史称爱尔兰饥馑。目前，晚疫病每年在全球范围内仍造成近百亿美元的农作物损失，依然是威胁人类粮食安全的重大隐患之一[3]。推进马铃薯主粮化是保障我国粮食安全的国家战略，然而晚疫病在我国大部分马铃薯产区均危害严重，是制约我国马铃薯产量的最重要因素之一。

效应子是致病疫霉菌向植物细胞输送的一类分泌蛋白，具有调节寄主生理和免疫反应的重要功能，是解析病害发生机制和植物抗病性状的关键[4]。在病原菌侵染植物过程中，植物会利用细胞表面的模式识别受体(Pattern Recognition Receptors,PRRs)识别病原菌分泌的效应子，触发植物的基础免疫反应[5]。这些能够激活植物免疫反应的因子通常被称为植物免疫激发子 (Plant Immunity Inducer，PII)，其中很重要的一类是植物免疫激活蛋白。目前，鉴定病原菌分泌的新型植物免疫诱抗蛋白是国内外研究人员关注的焦点。

本发明鉴定到一个新的致病疫霉Small Cysteine Rich(SCR)类效应蛋白PC2，在卵菌中普遍存在，可以被植物识别从而激发植物免疫反应。鉴定致病疫霉分泌的新型植物免疫激活蛋白，研究其与植物互作机理，为开发激活植物免疫的蛋白组生物农药提供有效的蛋白资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种致病疫霉分泌的SCR类效应分子PC2，其具有激活植物免疫的活性。

本发明的另一目的在于提供该致病疫霉SCR类分子PC2的编码基因。

本发明的又一目的在于提供上述植物免疫激活蛋白PC2诱导植物免疫活性的最短片段 PC2^138-198。

本发明的又一目的在于提供上述蛋白和基因在激活植物免疫反应方面的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种致病疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PC2，是如下(a)或(b)：

(a)具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且与激活植物免疫反应功能相关的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

编码上述植物免疫激活蛋白PC2的基因；该基因能够诱导植物抗性，该基因为如下(1) 或(2)：

(1)具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)与SEQ ID NO.1至少具有50％以上的同源性的核苷酸序列；优选为与SEQ IDNO.1 至少具有70％以上的同源性的核苷酸序列；优选为与SEQ ID NO.1至少具有80％以上的同源性的核苷酸序列；进一步优选为与SEQ ID NO.1至少具有85％以上的同源性的核苷酸序列；更进一步优选为与SEQ ID NO.1至少具有90％以上的同源性的核苷酸序列；最优选为与SEQ ID NO.1至少具有95％以上的同源性的核苷酸序列。

含有PR1信号肽的植物免疫激活蛋白PC2的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。利用本发明的基因编码的氨基酸序列，设计和人工添加PR1信号肽以替换PC2自身信号肽序列，以有利于其在植物中的表达。

上述植物免疫激活蛋白PC2具有诱导植物免疫活性的最短片段PC2^138-198，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

含有上述基因或上述肽段PC2^138-198的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。所述的重组载体为重组表达载体或过表达载体；所述的重组表达载体是将所述的基因插入植物表达载体pICH31160的BsaI酶切位点得到的[6]；所述的过表达载体为将所述的基因转入pTOR载体得到的。

上述的重组表达载体是将所述的基因插入到含有BsaI酶切位点、人工添加PR1信号肽以替换基因自身信号肽序列(有利于基因在植物中的表达)的植物表达载体pICH31160中得到的。该植物表达载体具体为将基因PC2插入到pICH31160::GFP酶切位点BsaI中得到的载体 pICH31160::PC2。

上述的包括所述PC2基因在致病疫霉菌中的过表达载体，为pTOR载体。利用该表达载体在致病疫霉菌中过表达PC2，获得PC2过表达菌株，以有利于在植物-病原物互作中的应用。

诱导植物抗性反应的检测是将上述的重组表达载体导入宿主细胞所得。

上述的植物免疫激活蛋白PC2、上述的肽段PC2^138-198、上述的基因、上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在诱导植物防卫反应及提高植物抗病性中的应用。

一种诱导植物抗性反应的方法，在植物中瞬时表达上述的蛋白PC2。

本发明的有益效果：

PC2能够被植物免疫系统识别产生免疫反应，为提高植物抗性提供了新的途径。最小片段 PC2^138-198能够诱导植物防卫反应，有望合成有功能的肽段，为生物农药合成提供新的材料。本发明可以运用在定向改造新型有益共生菌、作物育种抗病性改良方面和生物农药等方面，有望提高植物对疫病的抗病性，从而达到增产减药的目的，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为植物表达载体pICH31160::PC2模式图；

图2为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达PC2后诱导的烟草叶片过敏反应检测；

图3为利用植物表达载体在茄科植物注射表达PC2后诱导植物叶片坏死反应检测；

图4为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达PC2后诱导烟草叶片活性氧的产生；

图5为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达PC2后诱导植物防卫相关基因的表达；

图6为PC2蛋白在卵菌中的进化树分析；

图7为PC2及其同源基因编码蛋白序列比对分析；

图8为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达PC2及其同源蛋白后诱导的烟草叶片过敏反应检测；

图9为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达PC2及其同源蛋白后诱导烟草叶片活性氧的产生；

图10为检测证实PC2及其同源基因正常表达的SDS-PAGE检测图，所用抗体为anti-HA；

图11为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达筛选获得PC2诱导坏死反应的最短片段 PC2^138-198；

图12为致病疫霉PC2过表达转化子侵染植物致病力减弱；

图13为致病疫霉PC2过表达转化子诱导强烈的防卫相关基因上调表达。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明实施例所涉及引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

参考文献：

1.Haverkort AJ,Boonekamp P M,Hutten R,et al.Societal costs of lateblight in potato and prospects of durable resistance through cisgenicmodification[J].Potato Research,2008,51(1): 47-57.

2.Fry W E,Birch P R,Judelson H S,et al.Five Reasons to ConsiderPhytophthora infestans a Reemerging Pathogen.[J].Phytopathology,2015,105(7):966.

3.Vleeshouwers,V.G.,et al.,Understanding and exploiting late blightresistance in the age of effectors.Annu Rev Phytopathol,2011.49:p.507-31.

4.Kamoun,S.,A catalogue of the effector secretome of plant pathogenicoomycetes.Annu Rev Phytopathol,2006.44:p.41-60.

5.Jones J D G&L,D.J.The plant immune system.Nature,2006.444(7117):323-329.

6.van Demmel E.J.M.,Nausch H.,Mikschofsky H.,et al.High-LevelTransient Expression of ER-Targeted Human Interleukin 6in Nicotianabenthamiana.PloS one,2012.7(11):e48938.

实施例1：编码基因的克隆

(1)总RNA提取：以致病疫霉菌丝体为实验材料，总RNA的抽提采用Omega公司RNA提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。

(2)反转录生成第一链：取0.7μg RNA作模板，根据Takara公司PrimeScript反转录试剂盒使用说明进行cDNA合成。取适量的反转录产物用于随后的基因克隆PCR。

(3)以cDNA为PCR模板，扩增PC2基因的成熟序列：

PCR引物扩增序列：

上游引物：SEQ ID NO.5

(5’-TCACACTACAAAGTGCACCAC-3’)

下游引物：SEQ ID NO.6

(5’-CTAGGCGCTTCCGTCCTCTCC-3’)

50μL反应体系：5×buffer 10μL，2.5mM dNTPs 4μL,TakaraPrimerSTARTaq酶0.5μL,模板 cDNA1μL，加水至50μL；PCR扩增程序为98℃预变性3min，98℃变性15s，58℃退火15s， 72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min；利用琼脂糖凝胶进行电泳分离，溴化乙锭(EB)染色照相，记录结果，并切胶回收PCR产物。用Agarose Gel DNAPurification Kit(TaKaRa)对电泳条带进行回收(该PCR产物条带即为植物免疫激活蛋白PC2基因，送南京金斯瑞公司测序，序列如SEQID NO.1所示，其所编码的植物免疫激活蛋白PC2氨基酸序列如SEQID NO.2所示)。切胶回收的PCR产物根据CloneExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme) 按照说明操作连接到BsaI酶切的pICH31160::GFP载体上得到含有pICH31160::PC2的连接产物。其中载体pICH31160::GFP载体为PVX改造载体，含有BsaI酶切位点。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂LB(含卡纳50μg/mL)平板，37℃培养16h后菌落PCR验证挑取两个阳性克隆按照质粒提取试剂盒操作(Takara)提取质粒，送南京金斯瑞公司测序，序列如SEQID NO.3。测序正确的质粒电击转化到农杆菌GV3101中，涂LB(含卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)平板，28℃培养48h后菌落PCR验证挑取正确克隆进行后续实验。

结果显示，获得植物表达载体pICH31160::PC2阳性转化子，其模式图如图1所示。

实施例2：烟草中瞬时表达PC2及其同源蛋白后诱导防卫反应的产生

(1)农杆菌培养

分别从平板上挑取含有相关载体的农杆菌GV3101单菌落，接种到2mL LB液体培养基中(含卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)于恒温摇床上28℃，200rpm培养过夜至OD600为2.0。将过夜培养的GV3101农杆菌液5000g离心3min收集菌体。用缓冲液(组分：10 mM2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid，10mM MgCl₂，200μMacetosyringone pH5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗2次后，用缓冲液稀释菌液，最终浓度各为0.5。

(2)烟草叶片瞬时表达PC2

配好的农杆菌用1mL去掉针头的注射器注射到烟草叶片中，注射后烟草于温室(21-23℃、 16h光照/8h黑暗)培养。

(3)坏死反应的检测

农杆菌注射表达4-5天后，观察烟草叶片的坏死情况，待出现明显表型后，采集叶片进行拍照。烟草叶片放置于紫外成像仪(Tanon 5200Multi)中，在UV光365nm波长下曝光处理，采集照片并使用着色软件TanonImage进行处理。荧光颜色若为黄绿色，证明叶片出现坏死反应，荧光越强，坏死程度越强；荧光颜色若为红色，证明叶片无坏死现象。

(4)诱导活性氧的检测

农杆菌注射表达2.5天后，摘取叶片进行DAB染色，观察活性氧的积累。DAB染色：称取250mg DAB粉末(Diaminobenzidine)研磨后溶解于250mL灭菌超纯水中，调节pH值至3.8。将待检测植物叶片浸没于新鲜配制的DAB染液中，26℃黑暗静置6～8h。染色完后的叶片浸泡于96％乙醇中煮沸脱色10min，然后将叶片浸泡于乙醇中，25℃，4h后观察拍照。

(5)诱导防卫相关基因上调表达的检测

农杆菌注射烟草叶片后，收取不同时间点的样品，提取RNA并反转录生成cDNA，取适量的反转录产物用于随后的实时定量PCR反应。

实时定量PCR反应：

NbPR1定量前引物：SEQ ID NO.7

(5’-GGCGAAAACCTAGCTGAGGGA-3’)

NbPR1定量后引物：SEQ ID NO.8

(5’-ACGCCAAACCACCTGAGTATA-3’)

NbRbohB定量前引物：SEQ ID NO.9

(5’-TCACAAGAGCTCAGGCGTTT-3’)

NbRbohB定量后引物：SEQ ID NO.10

(5’-TCATCGAACCGCTTCTCGAC-3’)

PCR反应体系包含cDNA5uL，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNase H Plus)10uL，前后引物各0.4uL，ROX Reference Dye II 0.4uL,水13.8uL。反应程序：I:95度30秒，II:95度5秒， 60度34秒，步骤II应40个循环。溶解曲线分析程序是：95度15秒,60度1分钟，95度15秒。

(6)PC2蛋白累积量检测

收集注射两天后的烟草叶片进行蛋白累积量的检测。将收集的烟草叶片液氮速冻后研磨加入蛋白提取液：GTEN缓冲液(10％glycerol(v/v),25mM Tris pH 7.5,1mM EDTA,150mM NaCl)，使用时加入终浓度为10mM的DTT，0.15％的NP-40(碧云天)(v/v)和1％的蛋白酶抑制子Cocktail(v/v)。提取液使用量为0.5g/500μL。12000rpm转速离心，收集上清液80μL加入20μL 5Ⅹ蛋白上样缓冲液混合均匀后沸水浴7min。取10μL样品在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，120V电泳1.5h。反应结束后将蛋白样品转到PVDF膜上，用5％PBST牛奶孵育封膜。加入1:5000稀释的HA一抗(Abmart)孵育3h后用PBST洗膜5min三次，随后加入1:10000稀释的鼠抗(LI-COR,irdye 800,926-32210)孵育30min后用PBST洗膜5min三次，扫膜成像。

结果：烟草叶片上瞬时表达PC2及其后，能够诱导植物防卫反应的产生，例如PC2诱导坏死反应的产生(如图2)、活性氧积累(如图4)、防卫相关基因上调表达(如图5)，PC2同源蛋白诱导产生的坏死反应(如图8)及活性氧积累(如图9)等。Western检测证实PC2及其同源蛋白能够正常表达(如图10)。

实施例3：茄科植物中瞬时表达PC2后诱导坏死反应的产生

(1)农杆菌培养

分别从平板上挑取含有相关载体的农杆菌GV3101单菌落，接种到2mL LB液体培养基中(含卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)于恒温摇床上28℃，200rpm培养过夜至OD600为2.0。将过夜培养的GV3101农杆菌液5000g离心3min收集菌体。用缓冲液(组分：10 mM2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid，10mM MgCl₂，200μMacetosyringone pH＝5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗2次后，用缓冲液稀释菌液，最终浓度各为1.0。

(2)烟草叶片瞬时表达PC2

(3)坏死反应的检测

农杆菌瞬时表达7-10后，观察叶片的的坏死情况，待出现明显表型后，采集叶片，用相机拍照并保存。

结果：PC2能够诱导茄科植物番茄、茄子、马铃薯等的免疫反应，结果如图3所示。

实施例4：PC2蛋白在卵菌中的进化树分析及同源蛋白序列比对

(1)提取PC2蛋白在卵菌中的同源蛋白

利用NCBI数据库及软件SeqHunter提取PC2蛋白在卵菌中的同源蛋白序列。

(2)PC2同源蛋白序列比对及进化树分析

利用生物学软件BioEdit(版本号7.2.5)进行核酸序列及氨基酸序列的比对；MEGA7用于基因和蛋白序列的比对以及进化树的构建。

结果：PC2蛋白在卵菌中具有高度的保守性，进化树分析和序列比对如图6和7所示。

实施例5：PC2^138-198诱导植物免疫

(1)PC2^138-198的克隆

以PC2全长为PCR模板，扩增序列：

PCR引物扩增序列：

上游引物：SEQ ID NO.11

(5’-ACGTCCAGTGGAGAGGTGG-3’)

下游引物：SEQ ID NO.12

(5’-CTAGCAGATACCGAAGTTGTCGTA-3’)

50μL反应体系：5×buffer 10μL，2.5mM dNTPs 4μL，TakaraPrimerSTARTaq酶0.5μL，模板cDNA1μL，加水至50μL；PCR扩增程序为98℃预变性3min，98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min；利用琼脂糖凝胶进行电泳分离，溴化乙锭(EB)染色照相，记录结果，并切胶回收PCR产物。用Agarose Gel DNAPurificationKit(TaKaRa)对电泳条带进行回收。切胶回收的PCR产物根据CloneExpress II One StepCloning Kit(Vazyme)按照说明操作连接到BsaI酶切的pICH31160::GFP载体上得到pICH31160::PC2^138-198质粒，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂含有相应抗生素的LB平板(卡纳50μg/mL)，37℃培养16h后菌落PCR验证挑取两个阳性克隆按照质粒提取试剂盒操作(Takara)提取质粒，送南京金斯瑞公司测序，其编码的肽段序列如SEQID NO.4所示。测序正确的质粒电击转化到农杆菌GV3101中，涂含相应抗生素LB平板(卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)，28℃培养48h后菌落PCR验证挑取正确克隆进行后续实验。

(2)农杆菌培养

分别从平板上挑取含有相关载体的农杆菌GV3101单菌落，接种到2mL LB液体培养基中(含有卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)于恒温摇床上28℃，200rpm培养过夜至OD600为2.0。将过夜培养的GV3101农杆菌液5000g离心3min收集菌体。用缓冲液(组分：10 mM2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid，10mM MgCl₂，200μMacetosyringone pH5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗2次后，用缓冲液稀释菌液，最终浓度各为0.5。

(3)烟草叶片瞬时表达PC2^138-198

(4)细胞坏死检测

结果：PC2中包含61个氨基酸的片段(138-198)诱导植物免疫反应，结果如图11所示。

实施例6：致病疫霉PC2过表达转化子能够诱导植物防卫反应

(1)筛选获得致病疫霉PC2过表达菌株

利用PEG介导的原生质体转化技术，将质粒pTOR-PC2转入到致病疫霉菌中。利用定量 PCR技术筛选获得阳性转化子T8、T14、T29。

(2)致病疫霉PC2过表达菌株侵染烟草和马铃薯

将生长状态良好的烟草和马铃薯叶片放到接种盘中保湿，接种致病疫霉野生型菌株和PC2 过表达菌株。接种5-6天后统计病斑大小并记录。

(3)致病疫霉PC2过表达菌株诱导植物的抗病性

选取接种烟草叶片后0、12、24、36、48小时时间点植物材料用于RNA提取与定量PCR反应。

NbPR1定量前引物：SEQ ID NO.7

(5’-GGCGAAAACCTAGCTGAGGGA-3’)

NbPR1定量后引物：SEQ ID NO.8

(5’-ACGCCAAACCACCTGAGTATA-3’)

结果：致病疫霉PC2过表达转化子侵染烟草、马铃薯能力减弱(图12)，且在侵染过程中能够诱导防卫相关基因NbPR1的上调表达(图13)。

PC2基因全长核苷酸序列：SEQ ID NO.1

ATGCACTCGTCTCTTCTCGTCGCTCTTGCGTTGCTGGCGTCTCCCGCCATGGCCTCAC ACTACAAAGTGCACCACCACCACCACATGAAGTTTCGTGAAGTGACAGTCATCGCGGA CAACGCTACGTGCCCCAATGGCGGCGACGTGTTGCTGTGTCAGAGCGCGTCATACGC GTGCCAGGACGACGGAACGGGCGCTCAGAAGTGTCTCGAGCGCGACGACTCGTTCC TGGACTCAGTGGATAGCAGCACTGCGATGCCTTGGATGCAGTGCAGCCAATCAAACGC GTCGCTGCCTTCCAAATGCCTCTTCGACTTCCAGTGCATCTGCATGGACTACGCCAAC GTGGACTGCTACTGCTCACCGCCCGATGCCTGGCGCACGGGTCGCGCTACAGCTGAC AACTGCACCACGTCCAGTGGAGAGGTGGGATCGTGTGATGAGGGCAAGTACTGCCGC ACCAAGGGCTCGTACCAGGAGTGCGCTTCAGCCCCGTATCTGCCGAGCAGCACGTCGCTCTATAGCGACTGCTCGGACGACGGTGTGTGCGACTCAGGTCTCACATGTGATGACT ACGACAACTTCGGTATCTGCGTTGAGGACGACGGAGAGGACGGAAGCGCCTAG

PC2基因编码全长蛋白序列：SEQ ID NO.2

MHSSLLVALALLASPAMASHYKVHHHHHMKFREVTVIADNATCPNGGDVLLCQSASYACQ DDGTGAQKCLERDDSFLDSVDSSTAMPWMQCSQSNASLPSKCLFDFQCICMDYANVDCY CSPPDAWRTGRATADNCTTSSGEVGSCDEGKYCRTKGSYQECASAPYLPSSTSLYSDCS DDGVCDSGLTCDDYDNFGICVEDDGEDGSA*

PC2植物表达核苷酸序列：SEQ ID NO.3

ATGGGATTTGTTCTCTTTTCACAATTGCCTTCATTTCTTCTTGTCTCTACACTTCTCTTATT CCTAGTAATATCCCACTCTTGCCGTGCCAGGTCATCACACTACAAAGTGCACCACCACC ACCACATGAAGTTTCGTGAAGTGACAGTCATCGCGGACAACGCTACGTGCCCCAATGG CGGCGACGTGTTGCTGTGTCAGAGCGCGTCATACGCGTGCCAGGACGACGGAACGG GCGCTCAGAAGTGTCTCGAGCGCGACGACTCGTTCCTGGACTCAGTGGATAGCAGCACTGCGATGCCTTGGATGCAGTGCAGCCAATCAAACGCGTCGCTGCCTTCCAAATGCCT CTTCGACTTCCAGTGCATCTGCATGGACTACGCCAACGTGGACTGCTACTGCTCACCG CCCGATGCCTGGCGCACGGGTCGCGCTACAGCTGACAACTGCACCACGTCCAGTGGA GAGGTGGGATCGTGTGATGAGGGCAAGTACTGCCGCACCAAGGGCTCGTACCAGGAG TGCGCTTCAGCCCCGTATCTGCCGAGCAGCACGTCGCTCTATAGCGACTGCTCGGACG ACGGTGTGTGCGACTCAGGTCTCACATGTGATGACTACGACAACTTCGGTATCTGCGTTGAGGACGACGGAGAGGACGGAAGCGCCTAG

PC2^138-198氨基酸序列：SEQ ID NO.4

TSSGEVGSCDEGKYCRTKGSYQECASAPYLPSSTSLYSDCSDDGVCDSGLTCDDYDNFG IC。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 致病疫霉菌分泌的植物免疫激活蛋白PC2及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 627

<212> DNA

<213> 致病疫霉(Phytophthora infestans)

<400> 1

atgcactcgt ctcttctcgt cgctcttgcg ttgctggcgt ctcccgccat ggcctcacac 60

tacaaagtgc accaccacca ccacatgaag tttcgtgaag tgacagtcat cgcggacaac 120

gctacgtgcc ccaatggcgg cgacgtgttg ctgtgtcaga gcgcgtcata cgcgtgccag 180

gacgacggaa cgggcgctca gaagtgtctc gagcgcgacg actcgttcct ggactcagtg 240

gatagcagca ctgcgatgcc ttggatgcag tgcagccaat caaacgcgtc gctgccttcc 300

aaatgcctct tcgacttcca gtgcatctgc atggactacg ccaacgtgga ctgctactgc 360

tcaccgcccg atgcctggcg cacgggtcgc gctacagctg acaactgcac cacgtccagt 420

ggagaggtgg gatcgtgtga tgagggcaag tactgccgca ccaagggctc gtaccaggag 480

tgcgcttcag ccccgtatct gccgagcagc acgtcgctct atagcgactg ctcggacgac 540

ggtgtgtgcg actcaggtct cacatgtgat gactacgaca acttcggtat ctgcgttgag 600

gacgacggag aggacggaag cgcctag 627

<210> 2

<211> 208

<212> PRT

<213> 致病疫霉(Phytophthora infestans)

<400> 2

Met His Ser Ser Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Ser Pro Ala

1 5 10 15

Met Ala Ser His Tyr Lys Val His His His His His Met Lys Phe Arg

20 25 30

Glu Val Thr Val Ile Ala Asp Asn Ala Thr Cys Pro Asn Gly Gly Asp

35 40 45

Val Leu Leu Cys Gln Ser Ala Ser Tyr Ala Cys Gln Asp Asp Gly Thr

50 55 60

Gly Ala Gln Lys Cys Leu Glu Arg Asp Asp Ser Phe Leu Asp Ser Val

65 70 75 80

Asp Ser Ser Thr Ala Met Pro Trp Met Gln Cys Ser Gln Ser Asn Ala

85 90 95

Ser Leu Pro Ser Lys Cys Leu Phe Asp Phe Gln Cys Ile Cys Met Asp

100 105 110

Tyr Ala Asn Val Asp Cys Tyr Cys Ser Pro Pro Asp Ala Trp Arg Thr

115 120 125

Gly Arg Ala Thr Ala Asp Asn Cys Thr Thr Ser Ser Gly Glu Val Gly

130 135 140

Ser Cys Asp Glu Gly Lys Tyr Cys Arg Thr Lys Gly Ser Tyr Gln Glu

145 150 155 160

Cys Ala Ser Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Ser Thr Ser Leu Tyr Ser Asp

165 170 175

Cys Ser Asp Asp Gly Val Cys Asp Ser Gly Leu Thr Cys Asp Asp Tyr

180 185 190

Asp Asn Phe Gly Ile Cys Val Glu Asp Asp Gly Glu Asp Gly Ser Ala

195 200 205

<210> 3

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggatttg ttctcttttc acaattgcct tcatttcttc ttgtctctac acttctctta 60

ttcctagtaa tatcccactc ttgccgtgcc aggtcatcac actacaaagt gcaccaccac 120

caccacatga agtttcgtga agtgacagtc atcgcggaca acgctacgtg ccccaatggc 180

ggcgacgtgt tgctgtgtca gagcgcgtca tacgcgtgcc aggacgacgg aacgggcgct 240

cagaagtgtc tcgagcgcga cgactcgttc ctggactcag tggatagcag cactgcgatg 300

ccttggatgc agtgcagcca atcaaacgcg tcgctgcctt ccaaatgcct cttcgacttc 360

cagtgcatct gcatggacta cgccaacgtg gactgctact gctcaccgcc cgatgcctgg 420

cgcacgggtc gcgctacagc tgacaactgc accacgtcca gtggagaggt gggatcgtgt 480

gatgagggca agtactgccg caccaagggc tcgtaccagg agtgcgcttc agccccgtat 540

ctgccgagca gcacgtcgct ctatagcgac tgctcggacg acggtgtgtg cgactcaggt 600

ctcacatgtg atgactacga caacttcggt atctgcgttg aggacgacgg agaggacgga 660

agcgcctag 669

<210> 4

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Ser Ser Gly Glu Val Gly Ser Cys Asp Glu Gly Lys Tyr Cys Arg

1 5 10 15

Thr Lys Gly Ser Tyr Gln Glu Cys Ala Ser Ala Pro Tyr Leu Pro Ser

20 25 30

Ser Thr Ser Leu Tyr Ser Asp Cys Ser Asp Asp Gly Val Cys Asp Ser

35 40 45

Gly Leu Thr Cys Asp Asp Tyr Asp Asn Phe Gly Ile Cys

50 55 60

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcacactaca aagtgcacca c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctaggcgctt ccgtcctctc c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcgaaaacc tagctgaggg a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgccaaacc acctgagtat a 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcacaagagc tcaggcgttt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcatcgaacc gcttctcgac 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acgtccagtg gagaggtgg 19

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctagcagata ccgaagttgt cgta 24

Claims

1.含有PR1信号肽的植物免疫激活蛋白PC2的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种能够诱导植物免疫反应的肽段PC2^138-198，其特征在于，该肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3.含有权利要求1中所述基因或权利要求2中所述肽段PC2^138-198的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，其特征在于，所述的重组载体为重组表达载体或过表达载体；所述的重组表达载体是将所述的基因插入植物表达载体pICH31160的BsaI酶切位点得到的；所述的过表达载体为将所述的基因转入pTOR载体得到的。

5.如SEQ ID NO.2所示的植物免疫激活蛋白PC2在诱导植物防卫反应及提高植物抗病性中的应用。

6.如SEQ ID NO.1所示的编码植物免疫激活蛋白PC2的基因，或含有如SEQ ID NO.1所示基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在诱导植物防卫反应及提高植物抗病性中的应用。

7.权利要求1中所述的基因或权利要求2中所述的肽段PC2^138-198在诱导植物防卫反应及提高植物抗病性中的应用。

8.权利要求3或4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在诱导植物防卫反应及提高植物抗病性中的应用。

9.一种诱导植物抗性反应的方法，其特征在于在植物中瞬时表达如SEQ ID NO.2所示的植物免疫激活蛋白PC2。