CN113929755B - 一种葡萄霜霉菌分泌的植物免疫激活蛋白及引物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种葡萄霜霉菌分泌的植物免疫激活蛋白及引物和应用，该植物免疫激活蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该植物免疫激活蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该植物免疫激活蛋白的突变体PvAvh77‑M2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，突变体PvAvh77‑M2的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该植物免疫激活蛋白的突变体PvAvh77‑M2能够诱导葡萄抗病相关基因的表达及防卫物质的积累，抑制葡萄霜霉菌的侵染，减轻霜霉菌对葡萄造成的危害，能够作为预防葡萄霜霉病的生物农药。

Description

一种葡萄霜霉菌分泌的植物免疫激活蛋白及引物和应用
技术领域
本发明涉及一种植物免疫激活蛋白，具体涉及一种葡萄霜霉菌分泌的植物免疫激活蛋白及引物和应用。
背景技术
由葡萄霜霉菌[Plasmopara viticola(Berk.&M.A.Curtis)Berl.&De Toni]引起的葡萄霜霉病(Plasmopara viticola)是限制葡萄产业健康发展的最严重的真菌病害，传统高毒农药防治霜霉病给环境和人类健康带来严重威胁。2015年，农业农村部提出化肥农药零增长计划，因此，生物农药的开发和利用尤为重要。
在植物-病原菌共进化过程中，植物已进化出复杂而功能多样的先天免疫系统以抵御潜在病原菌的入侵。病原菌在侵染早期能够通过分泌毒性因子攻击植物，植物则利用细胞表面的模式识别受体(Pattern Recognition Recepters,PRRs)识别病原菌毒性因子，触发植物产生基础免疫反应。这些可以激发植物免疫反应的因子被称为植物免疫激发子(plant immune inducers)，即植物疫苗，主要包括植物免疫激活蛋白、寡糖、水杨酸(SalicylicAcid,SA)及其类似物、次生代谢物等类型，通过增强植物的生理功能，增加植物对致病因子的抵抗力，进而提高植物的诱导抗性。
植物免疫激活蛋白作为一种新型生物农药，在植物抗病、增产、提高品质等方面效果显著。目前，有关该技术已成功用于生产的实例有美国Eden公司研发的‘Messenger-HarpinEa’，还有以色列Galilee-Green实验室研发的‘HarpinEcc’。2013年，四川海博氏生物科技有限公司引进了Galilee-Green实验室的科研成果并命名为信号施康乐。中国农科院植物保护所从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离出植物免疫激活蛋白PeaT1和Hrip1(Stable isotope labeled mass spectrometry for quantification ofthe relative abundances for expressed proteins induced by PeaT1.Science ChinaLife Sciences,2010,53(12):1410-1417；Purification and characterization of aglycoprotein elicitor from Alternaria tenuissima.World Journal ofMicrobiologyand Biotechnology,2009,25(11):2035-2042)，以此开发出全球第一个能够抗植物病毒病蛋白生物农药‘阿泰灵’并于2014年登记上市。目前，该产品在我国已成功推广使用并受到广大农户好评。因此，鉴定和应用微生物分泌的植物免疫激活蛋白已成为国内外学者研究的热点，可为创制新型生物农药提供丰富的蛋白资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种葡萄霜霉菌分泌的植物免疫激活蛋白及引物和应用，该植物免疫激活蛋白的突变体PvAvh77-M2能够诱导葡萄抗病相关基因的表达及防卫物质的积累，抑制葡萄霜霉菌的侵染，减轻霜霉菌对葡萄造成的危害，能够作为预防葡萄霜霉病的生物农药。
为了达到上述目的，本发明提供了一种葡萄霜霉菌分泌的植物免疫激活蛋白，该植物免疫激活蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一目的是提供所述的植物免疫激活蛋白的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一目的是提供用于扩增所述的编码基因的引物，该引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明的另一目的是提供一种植物免疫激活蛋白的突变体PvAvh77-M2，该突变体PvAvh77-M2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的另一目的是提供所述的突变体PvAvh77-M2的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的另一目的是提供用于扩增所述的编码基因的引物，该引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示或如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示。
本发明的另一目的是提供包含所述的编码基因的重组载体。
优选地，该重组载体为在pCold-TF中插入所述的编码基因得到的重组表达载体。
本发明的另一目的是提供包含所述的编码基因的重组菌。
本发明的另一目的是提供所述的突变体PvAvh77-M2在诱导植物防御反应和提高植物抗病性中的应用。具体地，该突变体PvAvh77-M2能够作为预防或治疗葡萄霜霉病的生物农药。
本发明的葡萄霜霉菌分泌的植物免疫激活蛋白及引物和应用，具有以下优点：
本发明的葡萄霜霉菌分泌的植物免疫激活蛋白PvAvh77，能够引起河岸葡萄和烟草叶片的过敏性细胞死亡，其突变体PvAvh77-M2引起的过敏性细胞死亡更加快速和强烈，利用原核表达系统纯化到含有PvAvh77-M2的重组蛋白，该突变体PvAvh77-M2能够诱导植物免疫反应机制(包括防卫相关物质的产生、防御相关基因的表达等)，有望开发成新型生物农药以应用到农业的绿色可持续生产中。
附图说明
图1为植物免疫激活蛋白PvAvh77诱导河岸葡萄叶片细胞产生过敏性坏死反应。
图2植物免疫激活蛋白PvAvh77及其不同缺失突变可以在本氏烟草和红花烟草叶片诱导过敏性坏死反应。
图3植物免疫激活蛋白PvAvh77及其缺失突变的PvAvh77-M1和PvAvh77-M2引起的叶片过敏性反应强度比较。
图4为纯化的植物免疫激活蛋白PvAvh77-M2依然可以引起烟草叶片过敏性反应。
图5为植物免疫激活蛋白PvAvh77-M2诱导葡萄SA通路基因表达模式分析。
图6植物免疫激活蛋白PvAvh77-M2促进无核白葡萄SA生物合成。
图7为植物免疫激活蛋白PvAvh77-M2诱导感病葡萄增强对葡萄霜霉菌抗性。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1植物免疫激活蛋白PvAvh77的克隆与植物瞬时表达
(1)基因组DNA提取
以采自中国杨凌的西北农林科技大学葡萄种质资源圃的葡萄霜霉菌菌株为材料，将其收集研磨成粉末并加入裂解液(2％CTAB、2％PVP40、1％β-ME、200mM NaCl、0.2mMEDTApH 8.0和50mM Tris pH 8.0)，65℃孵育30min，加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比为24：1)，16000g离心15min，抽提两次，取上清后使用无水乙醇过夜沉淀。沉淀使用70％乙醇洗两遍，吹干后使用50μL TE缓冲液完全溶解，用分光光度计检测DNA含量和质量。
(2)PCR扩增目的基因
以提取的基因组DNA为模板，进行常规PCR扩增PvAvh77编码基因全长及不同长度缺失突变的PCR引物扩增序列，引物见表1。
表1为PvAvh77及其缺失突变编码基因的特异引物
注：F为上游引物；R为下游引物；GGTACC为KpnI限制性内切酶的酶切位点；TCTAGA为XbaI限制性内切酶的酶切位点；PvAvh77+SP为PvAvh77带有完整信号肽(signalpeptide,SP)的基因；PvAvh77为PvAvh77缺失信号肽的基因；PvAvh77-M1至PvAvh77-M10为PvAvh77不同长度缺失突变的基因。
PCR反应体系和PCR反应程序如下表2：
采用说明书(KOD-Plus-Neo,TOYOBO,Japan)推荐的三步法进行PCR反应程序：94℃预变性2min；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸(30s/kb)，反应35个循环；72℃终延伸10min；12℃保存样品。
扩增完毕后，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。切胶回收上述表1中编码基因的PCR产物。使用胶回收试剂盒(Tiangen，DP209)按照试剂盒说明书回收目的条带。
随后，将目的条带连接到KpnI和XbaI限制性内切酶(Thermo)酶切的过表达载体pCAMBIA2300上，转化大肠杆菌感受态Top10，涂布于含卡那霉素50μg/mL固体培养基上，37℃倒置过夜培养，菌落PCR验证阳性克隆并提取质粒送生工生物工程股份有限公司测序。
将测序正确的质粒采用液氮冻融法转化农杆菌GV3101，涂布到LB(含卡那霉素50μg/mL、庆大霉素50μg/mL、利福平50μg/mL)固体培养基上，28℃倒置培养48h，菌落PCR验证阳性克隆后进行后续试验。
(3)农杆菌培养和收集
挑取阳性克隆于5mL液体LB(含卡那霉素50μg/mL、庆大霉素50μg/mL、利福平50μg/mL)培养基中，28℃180rpm摇床培养至OD600＝0.4～0.8。4500rpm，离心3min收集菌体，使用10mM MgCl2重悬菌体。重复4500rpm，离心3min收集菌体。
使用注射缓冲液(10mM MgCl2、10mM MES-pH5.7和200μM乙酰丁香酮)重悬菌体，调整OD600＝0.4注射烟草叶片，调整OD600＝1.0注射葡萄叶片。28℃黑暗静置3h后用于注射。
(4)葡萄叶片瞬时表达PvAvh77及其缺失突变PvAvh77-M2编码基因
使用1mL注射器(无针头)将浓度调整为OD600＝1.0的农杆菌菌液注射到葡萄组培苗叶片背面，注射后的葡萄组培苗置于组培间(22℃、16h光照/8h黑暗)继续培养。
(5)烟草叶片瞬时表达PvAvh77及其缺失突变编码基因
使用1mL注射器(无针头)将浓度调整为OD600＝0.4的农杆菌菌液注射到本氏烟草(Nicotiana benthamiana)和红花烟草(Nicotiana tabacum)叶片背面，注射后的烟草置于人工气候室(20～25℃、16h光照/8h黑暗)继续培养。
(6)Westernblot检测蛋白累计量
收集注射2d后的烟草叶片及葡萄叶片进行Westernblot检测蛋白表达情况。将收集的叶片用PPEB蛋白提取缓冲液(0.1M Tris-HCl、2％SDS、10％丙三醇和0.05Mβ-巯基乙醇)提取，每10min涡旋震荡一次，30min后12000rpm离心15min，上清液即总蛋白提取液。
在上述总蛋白提取液中加入5×SDS loading buffer，沸水浴5min，12000rpm离心5min，吸取上清20μL进行SDS-PAGE凝胶电泳，用半干转膜仪将蛋白样品转移至0.45μm PVDF膜上，用5％的脱脂奶粉室温封闭3h，按1:3000加入Anti-GFP一抗(购自ABclonal)，4℃过夜孵育。用TBST缓冲液(8.8g NaCl、20mL 1M Tris-HCl和500μL Tween 20，定容至1L)洗掉一抗，按1:5000加入二抗HRP GoatAnti-Mouse IgG(H+L)(ABclonal)，室温孵育2h，TBST缓冲液洗掉二抗，每次5min，洗5～6次。将超敏显色液(米鼠生物，MI00607D)加入到PVDF膜上，在超灵敏多功能成像仪(Alliance Q9 Anvanced,UVItec,Britain)上显色。显色完后，用丽春红或考马斯亮蓝染液染色，相机拍照。
检测结果具体如下：
如图1所示，为植物免疫激活蛋白PvAvh77诱导河岸葡萄叶片细胞产生过敏性坏死反应情况(A1为GFP空载体和PvAvh77注射抗病的河岸葡萄V.riparia组培苗叶片8d后引起的细胞坏死反应；A2为台盼蓝染色后观察抗病的河岸葡萄组培苗叶片细胞坏死情况；A3-A4分别为A2中GFP空载体和PvAvh77的细胞坏死情况的放大图；B1为GFP空载体和PvAvh77注射感病的无核白葡萄V.vinifera cv.Thompson Sedless组培苗叶片8d后未出现细胞坏死反应；B2为台盼蓝染色后观察感病的无核白葡萄组培苗叶片细胞坏死情况；B2-B4分别为B2中GFP空载体和PvAvh77的细胞坏死情况的放大图；C为GFP空载体和PvAvh77注射河岸和无核白葡萄8d后进行的离子渗透率检测结果，**表示GFP空载体和PvAvh77之间有极显著性差异(**P＜0.01)；D为Westernblot检测GFP空载体和PvAvh77在河岸和无核白葡萄叶片中的表达情况)，从图中可以看出，PvAvh77能够在河岸葡萄叶片引起过敏性细胞坏死。
如图2所示，为植物免疫激活蛋白PvAvh77及其不同缺失突变可以在本氏烟草和红花烟草叶片诱导过敏性坏死反应情况(A为PvAvh77及其不同缺失突变在本氏烟草叶片引起的细胞坏死情况，图中m/15，m为坏死的叶片数量，叶片总数量为15；B为PvAvh77及其不同缺失突变在本氏烟草叶片引起的细胞坏死，1：GFP empty vector(即在pCAMBIA2300载体骨架基础上插入GFP荧光标签蛋白)，2：INF1(由致病疫霉分泌的具有10KDa的胞外蛋白激发子，能够引起典型的过敏性细胞坏死反应)，3：PvAvh77+SP，4：PvAvh77，5：PvAvh77-M1，6：PvAvh77-M2，7：PvAvh77-M3，8：PvAvh77-M4，9：PvAvh77-M5，10：PvAvh77-M6，11：PvAvh77-M7，12：PvAvh77-M8，13：PvAvh77-M9，14：PvAvh77-M10；C为Westernblot检测图2中B中的1-14蛋白在烟草叶片中的表达情况)，可以看出，在本氏烟草和红花烟草叶片上瞬时表达的PvAvh77、PvAvh77-M1、PvAvh77-M2和PvAvh77-M5均能引起明显的过敏性细胞坏死反应(如图2中的A和B)。Westernblot检测蛋白均可正常表达(如图2中的C)。
如图3所示，为植物免疫激活蛋白PvAvh77及其缺失突变的PvAvh77-M1和PvAvh77-M2引起的叶片过敏性反应强度比较(A为在本氏烟草叶片上注射植物免疫激活蛋白PvAvh77及其缺失突变的PvAvh77-M1和PvAvh77-M2引起烟草叶片细胞坏死速度的观察；B为在本氏烟草叶片上注射植物免疫激活蛋白PvAvh77及其缺失突变的PvAvh77-M1和PvAvh77-M2离子渗透率检测示意图，小写字母表示显著性差异P＜0.05；C1和C2为注射PvAvh77及其缺失突变PvAvh77-M2后6d在河岸葡萄叶片引起细胞坏死强度的观察；D为注射PvAvh77及其缺失突变PvAvh77-M2后6d离子渗透率检测，**表示PvAvh77与PvAvh77-M2之间具有极显著差异，**P＜0.01)。可以看出，与PvAvh77相比，其缺失突变PvAvh77-M2引起的过敏性细胞死亡更加快速和强烈，在瞬时转化60h后即已出现过敏性坏死反应(如图3中的A和B)。在河岸葡萄上过敏性坏死反应与烟草一致，即PvAvh77-M2引起的过敏性坏死反应强于PvAvh77(如图3中的C和D)。
实验例2植物免疫激活蛋白PvAvh77-M2的原核表达和纯化
(1)构建原核表达载体
使用pCold-TF为原核表达载体，由于PvAvh77-M2引起的过敏性坏死反应强于其全长编码序列PvAvh77，因此设计PvAvh77-M2编码基因的特异引物，引物见表3。
表3为PvAvh77-M2编码基因特异引物
反应体系和PCR反应程序如下表4：
采用说明书(KOD-Plus-Neo,TOYOBO,Japan)推荐的两步法进行PCR反应程序：94℃预变性2min；98℃变性10s，68℃退火/延伸(30s/kb)，反应35个循环；72℃终延伸10min；12℃保存样品。
扩增完毕后进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收PvAvh77-M2编码基因的PCR产物，将目的条带连接到BamHI和SalI限制性内切酶(Thermo)酶切的原核表达载体pCold-TF上，转化大肠杆菌感受态Top10，涂布于含氨苄青霉素100μg/mL固体培养基上，37℃倒置过夜培养，菌落PCR验证阳性克隆并提取质粒送生工生物工程股份有限公司测序。
将测序正确的质粒转化大肠杆菌感受态BL-21(DE3)，菌落PCR验证阳性克隆并用于后续试验。
(2)诱导原核蛋白表达
吸取100μL菌液至5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，摇床(37℃，200rpm)中过夜培养，以1:50的比例将活化的菌液加入到新鲜的LB(含100μg/mL氨苄青霉素)中，于37℃继续摇菌至OD600＝0.4～0.6，平均分装至四个50mL离心管中，其中两管加入终浓度为0.1mM的IPTG，分别于16℃和37℃摇床中诱导16h和4h，以未加IPTG的菌液作为对照。
分别吸取诱导菌液于两个2.0EP管中，12000rpm常温离心2min，去除上清，加入200μL细菌裂解液(CWBIO，CW2334)，吹打混匀，于室温静置裂解60min；取一管12000rpm常温离心10min，上清移入新的2.0EP管，即为可溶性蛋白样品，剩余沉淀即为包涵体蛋白样品，未离心的另一管作为总蛋白。未诱导菌液于12000rpm离心2min，加入200μL细菌裂解液，作为未诱导的总蛋白样品。
分别将以上样品加入5×SDS loading buffer，沸水浴5min，SDS-PAGE凝胶电泳。用0.25％考马斯亮蓝(R-250)染色液于摇床上染色30min，脱色后观察是否诱导出原核表达蛋白以及蛋白是否可溶。
结果显示：经过SDS-PAGE凝胶电泳检测，获得一个分子量约96KDa的包含“触发因子(Trigger Factor，TF)”(48KDa)和His标签的融合蛋白(pCold-TF-PvAvh77-M2)。
(3)原核表达蛋白的纯化
37℃大摇菌液600mL，以16℃进行蛋白诱导，4℃，7500rpm离心20min，收集菌体并用PBS缓冲液离心清洗菌体两次，用PBS(含0.1mM蛋白酶抑制剂PMSF)重悬，将样品置于冰和乙醇的混合物中，用触摸式超声波细胞粉碎机(JY92-ⅠⅠDN)进行细胞的超声破碎(参数设置为超声破碎时长为20min，每超声10s，间隔20s)；4℃，7500rpm离心20min，收集上清，用0.45μm无菌滤头过滤，稀释上清(粗提物：Soluble Binding Buffer＝1:1)。按照His标签蛋白纯化试剂盒(CW0894S，购自康为世纪)使用说明，吸取2mL混匀的Ni-Agarose Resin填料加入层析柱中，室温静置约10min，至溶液和凝胶出现明显分层，打开底部出液口，通过重力作用使乙醇流出；向装填好的柱中加入5倍柱体积(即10mL)无菌ddH2O洗去乙醇，再用10倍柱体积(即20mL)Soluble Binding Buffer平衡柱子，平衡结束进行上样；吸取制备好的蛋白样品加入平衡好的柱子中，控制流速为10倍柱体积/h，收集流穿液；上样结束后，使用15倍柱体积(即30mL)的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白；使用Soluble ElutionBuffer洗脱负载在柱子上的蛋白样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白纯度并利用超滤管对蛋白样品进行脱盐处理。
表5蛋白纯化缓冲液配方
如图4所示，为纯化的植物免疫激活蛋白PvAvh77-M2引起烟草叶片过敏性反应的情况(A为纯化原核表达的pCold-TF空载蛋白的SDS-PAGE检测示意图，考马斯亮蓝染色；B为纯化后重组的植物免疫激活蛋白pCold-TF-PvAvh77-M2的SDS-PAGE检测示意图，考马斯亮蓝染色；M：蛋白Marker；1-9：分别为搜集的纯化蛋白的离心管编号)，可以看出，获得纯化后的原核表达蛋白pCold-TF和pCold-TF-PvAvh77-M2(如图4中的A和B)。
实验例3植物免疫激活蛋白在烟草叶片上引起过敏性坏死反应
经测定浓度后的pCold-TF-PvAvh77-M2溶液稀释到10μM和15μM后注射本氏烟草叶片，以相同浓度的pCold-TF为阴性对照，120h后观察叶片致死情况。如图4中D所示，为纯化后pCold-TF及重组的植物免疫激活蛋白pCold-TF-PvAvh77-M2注射烟草叶片引起过敏性坏死反应示意图，发现有轻微致死并且不同浓度致死程度没有明显变化，可能是载体上自带的“触发因子”和His标签蛋白影响了PvAvh77-M2的功能。因此，利用凝血酶将“触发因子”和His标签蛋白切除(如图4中C，为纯化后重组的植物免疫激活蛋白pCold-TF-PvAvh77-M2及其切除载体标签蛋白的PvAvh77-M2的SDS-PAGE检测示意图，考马斯亮蓝染色)。如图4中E所示，为切除载体标签蛋白的PvAvh77-M2引起烟草过敏反应示意图(台盼蓝染色)，用不同浓度的切除标签蛋白的PvAvh77-M2注射烟草叶片发现，100nM～1μM的PvAvh77-M2蛋白浓度不足以触发烟草叶片过敏性坏死反应，而5μM～20μM均可以触发烟草叶片的细胞死亡，并且坏死程度呈现剂量递增的效果。纯化后的原核表达蛋白依然可以引起烟草叶片的过敏性细胞死亡。
实验例4植物免疫激活蛋白PvAvh77-M2可在葡萄上引起防卫反应
(1)PvAvh77-M2诱导SA通路相关基因的表达
将PvAvh77-M2蛋白浓度调整至10μM，均匀喷施到感病葡萄无核白叶片表面，以相同浓度的pCold-TF作为对照，各处理3株，重复3次。诱导后0、12、24、48、72、96、120h取样，进行SA通路相关基因的表达水平检测。采用Omega公司RNA提取试剂盒提取总RNA，使用Nanodrop2000测定RNA含量和质量，并用琼脂糖凝胶电泳进行RNA完整性检测。
反转录生成第一条链：取1μg RNA作模板，参照 One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix kit(TransGen)说明书，对检测合格的RNA进行cDNA合成，定容至20μL。用DEPC水将反转录产物稀释4倍用于实时荧光定量PCR模板。
利用GenScript公司的引物设计网站Real-time PCR(TaqMan)Primer and ProbesDesign Tool进行目的基因的定量引物设计，以在葡萄中高度保守的基因ACTIN作为内参，引物见表3。
表6为抗性相关基因定量特异引物
注：VvACTIN为Vitis vinifera actin 1(act1)gene；VvEDS1为Vitis viniferaenhanced disease susceptibility 1；VvEDS5为Vitis vinifera proteinDETOXIFICATION 46；VvICS1为Vitis vinifera isochorismate synthase 2；VvNPR1为Vitis vinifera BTB/POZ domain and ankyrin repeat-containing protein NPR1；VvPR1为Vitis vinifera basic form ofpathogenesis-related protein 1；VvPR2为Vitis vinifera mRNAforbeta 1-3glucanase。
以 Top Green qPCR SuperMix(AQ131-01)说明书推荐的qPCR体系和条件对目的基因进行表达模式分析。
PCR反应体系(20μL)见如下表7：
反应程序为(三步法)：94℃，30s(预变性)；94℃，5s；58℃，15s；72℃，10s。扩增循环数设置45。溶解曲线程序为：94℃，15s；58℃，1min；94℃，15s。采用2-ΔΔCT方法对数据进行分析。
如图5所示，为植物免疫激活蛋白PvAvh77-M2诱导葡萄SA通路基因表达模式分析，图中A-F分别为SA通路合成和代谢相关基因VvEDS1、VvEDS5、VvICS1、VvNPR1、VvPR1、VvPR2在处理后不同时间点(0h、12h、24h、48h、72h、96h和120h)的相对表达量分析示意图，以VvActin为内参基因，误差棒代表SE，三次生物学重复(Student’s ttest,*P<0.05，**P<0.01)。可以看出，荧光定量PCR结果表明10μM的PvAvh77-M2蛋白处理葡萄叶片后能够诱导SA通路相关基因的显著上调表达。
(2)PvAvh77-M2能够诱导SA的合成
对以上收集的不同时间点的样品进行激素提取：称取新鲜样品100mg置于1.5mL离心管(带有玻璃珠)中，将样品置于液氮并用研磨仪充分研磨，加入1mL提取液(乙酸乙酯)，每隔2h涡旋震荡一次(共5次)，12000rpm低温离心15min，吸取上清至新的1.5mL离心管里，利用氮吹仪蒸干有机溶剂(约45min)，样品蒸干后加入200μL 50％甲醇，2000rpm涡旋震荡10min，12000rpm低温离心15min，用0.22μm的有机滤膜进行过滤，吸取100μL滤液于进样瓶中，用SA标准品(Sigma-Aldrich,USA)制备标准曲线样品，准备上样。使用串联四级杆液质联用仪(Agilent,USA)对激素含量进行检测。
如图6所示，为植物免疫激活蛋白PvAvh77-M2促进无核白葡萄SA生物合成，纯化的pCold-TF和PvAvh77-M2蛋白处理0h、12h、24h、48h、72h、96h和120h后的SA含量测定，误差棒代表SE，三次生物学重复(Student’s t test,*P<0.05，**P<0.01)，可以看出，PvAvh77-M2诱导促进了SA的合成。
实验例5植物免疫激活蛋白PvAvh77-M2增强葡萄对葡萄霜霉菌的抗性
(1)葡萄霜霉菌接种
将纯化后的PvAvh77-M2蛋白溶液稀释到10μM，以pCold-TF和Buffer(PBS缓冲液)作为对照，均匀喷施到无核白葡萄叶片表面，人工气候室中培养24h后采集叶片，用9mm的打孔器打取叶圆片，背面朝上置于铺有两张湿润滤纸的90mm培养皿中。用灭菌的软刷将纯化的葡萄霜霉菌孢子囊刷至适量无菌水，黑暗环境震荡10min，用4层无菌纱布过滤，用血球计数板在光学显微镜下计数，将孢子囊悬浮液调整成5×104个/mL的浓度，用移液器吸取30μL悬浮液滴于叶圆片中间部位。人工气候室中黑暗培养，于接种霜霉菌后72h取样，进行DAB和苯胺蓝染色，并于96h进行生物量统计和拍照记录。
(2)葡萄霜霉菌生物量统计
收集接种后96h的叶盘，置于液氮中速冻，提取基因组DNA，将浓度调整至50μg/L，吸取4μL基因组DNA为模板，通过qRT-PCR进行检测葡萄叶片中的霜霉菌生物量。以葡萄VvACTIN为内参，对葡萄霜霉菌进行定量。
(3)DAB和苯胺蓝染色分析
收集接种后72h的叶盘置于1mg/mL 3,3-二氨基联苯胺(DAB)溶液(Tris-HCl，pH3.8)中，室温下黑暗静置8h，在0.15％三氯乙酸(溶于乙醇：三氯甲烷＝3：1)中固定和脱色3～5d。将样品在饱和的水合氯醛中脱色至半透明，用在0.05％苯胺蓝(溶于0.1M磷酸氢二钾缓冲液，pH 8.0)溶液中静置过夜。将叶盘背面朝上放在载玻片上，用蓝紫光观察菌丝的生长情况，在明场下观察H2O2的存在即红褐色斑点。
如图7所示，为植物免疫激活蛋白PvAvh77-M2诱导感病葡萄增强对葡萄霜霉菌抗性，图中A为对Buffer(PBS缓冲液)、纯化的pCold-TF和PvAvh77-M2蛋白处理的无核白葡萄叶片接种葡萄霜霉菌96h表型观察；B为对Buffer(PBS缓冲液)、纯化的pCold-TF和PvAvh77-M2蛋白处理的无核白葡萄叶片接种葡萄霜霉菌96h的生物量统计图，误差棒代表SE，三次生物学重复，小写字母代表显著性差异(P<0.05)；C为对Buffer(PBS缓冲液)、纯化的pCold-TF和PvAvh77-M2蛋白处理的无核白葡萄叶片接种葡萄霜霉菌72h的电镜观察菌丝生长(苯胺蓝染色)及活性氧(DAB染色)产生情况观察，hy：菌丝(hyphae)，sp：孢囊梗(sporangiophores)，红色箭头表示活性氧产生。与对照相比，使用纯化的PvAvh77-M2蛋白处理葡萄叶片增强了葡萄对葡萄霜霉菌的抗性。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种葡萄霜霉菌分泌的植物免疫激活蛋白及引物和应用
<141> 2023-06-16
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1245
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
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gtgaagacgc tggcaaaacg ctttctccgt ggaagccgtg tcgtacacga cgacttggct 120
aatgaagagc gctctttcca tcctttcttg gtagacatga tagaggaagg tataaaggaa 180
atgtcacacg ctgcagagat tgtggaggag atgccacttg ctggaaaggt tgtggaggag 240
gtgccacatg ctacagaggg tggtcagcaa aagatggata aaggtgcgga ggaggcattc 300
gagaaacatg tagaaccatc tggtcatact gctaccattc aagatacttc tcgtgatata 360
tccacccaag aggtaatcca gctctcaccc catgagtggg agtccgactt gagcaagctt 420
aagccattcg ttgtattaaa caagcaccgg ggccgtatcg aaccagtaaa agatgcattt 480
gcagcattct gcgatgaggg tttaaagccg actaccgaag agacgtcgat tatctggagc 540
atgttgggtt ggaaccttgc acgaaaacct aaaggtaagc accggcaaca tcttatagct 600
caagcgaggc gaggtgtgct cttagatttg cggattgtaa gaatggatga atcgttgtgg 660
aacaagtgga tgcaattgcc gaaaccgctg aggatgctca agctgaacaa tcttctaaat 720
atgcattatc agagatgggt gcacttgttt aacatttttc aacgacgttt gtctgagatc 780
atcggcccgc ctccaaaatt gaaggtcgct catggagaca ctacagacac aagtaaggct 840
cttgctttac acacgcactc aaacatgcag agttcgactc cgtctgagcc actcaacgca 900
gcatcgacat ttaaagttga gcgctttgtc tggggggcta ataggccaaa gcgtactact 960
gacggcaaca ccggcacaat cagtcttcca actaagccaa cgaagacgca taggctgaag 1020
ccgctcatgc cacgtttgac ggaatcgacg acatcaagcg acctacttgt tcccactaaa 1080
agaatgagac ttagctttgg cggtacaaga agtgcttttg ccccgtataa ggaccctaaa 1140
gaaaagttgt tggcaccttc ttccactgct ttgacgcata aagacatcga cttggatctc 1200
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<213> Artificial Sequence
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Arg Val Val His Asp Asp Leu Ala Asn Glu Glu Arg Ser Phe His Pro
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Phe Leu Val Asp Met Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Met Ser His Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Val Pro His Ala Thr Glu Gly Gly Gln Gln Lys Met Asp Lys Gly Ala
85 90 95
Glu Glu Ala Phe Glu Lys His Val Glu Pro Ser Gly His Thr Ala Thr
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Ile Gln Asp Thr Ser Arg Asp Ile Ser Thr Gln Glu Val Ile Gln Leu
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Ser Pro His Glu Trp Glu Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Pro Phe Val
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Ala Ala Phe Cys Asp Glu Gly Leu Lys Pro Thr Thr Glu Glu Thr Ser
165 170 175
Ile Ile Trp Ser Met Leu Gly Trp Asn Leu Ala Arg Lys Pro Lys Gly
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Lys His Arg Gln His Leu Ile Ala Gln Ala Arg Arg Gly Val Leu Leu
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Asp Leu Arg Ile Val Arg Met Asp Glu Ser Leu Trp Asn Lys Trp Met
210 215 220
Gln Leu Pro Lys Pro Leu Arg Met Leu Lys Leu Asn Asn Leu Leu Asn
225 230 235 240
Met His Tyr Gln Arg Trp Val His Leu Phe Asn Ile Phe Gln Arg Arg
245 250 255
Leu Ser Glu Ile Ile Gly Pro Pro Pro Lys Leu Lys Val Ala His Gly
260 265 270
Asp Thr Thr Asp Thr Ser Lys Ala Leu Ala Leu His Thr His Ser Asn
275 280 285
Met Gln Ser Ser Thr Pro Ser Glu Pro Leu Asn Ala Ala Ser Thr Phe
290 295 300
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325 330 335
His Arg Leu Lys Pro Leu Met Pro Arg Leu Thr Glu Ser Thr Thr Ser
340 345 350
Ser Asp Leu Leu Val Pro Thr Lys Arg Met Arg Leu Ser Phe Gly Gly
355 360 365
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cattatcaga gatgggtgca cttgtttaac atttttcaac gacgtttgtc tgagatcatc 660
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Phe Asn Ile Phe Gln Arg Arg Leu Ser Glu Ile Ile Gly Pro Pro Pro
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Lys Leu Lys Val Ala His Gly Asp Thr Thr Asp Thr Ser Lys Ala Leu
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<210> 30
<211> 41
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<213> Artificial Sequence
<400> 30
ctagactgca ggtcgaccaa agctttgtca gtccttttgc c 41

Claims (7)

1.一种植物免疫激活蛋白的突变体PvAvh77-M2，其特征在于，该突变体PvAvh77-M2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的突变体PvAvh77-M2的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.用于扩增如权利要求2所述的编码基因的引物，其特征在于，该引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示或如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示。
4.包含如权利要求2所述的编码基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，该重组载体为在pCold-TF中插入如权利要求2所述的编码基因得到的重组表达载体。
6.包含权利要求2所述的编码基因的重组菌。
7.如权利要求1所述的突变体PvAvh77-M2在提高葡萄抗葡萄霜霉菌中的应用。
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