CN109400688A

CN109400688A - OsHAP2C及其编码基因在调控水稻白叶枯病抗性中的应用

Info

Publication number: CN109400688A
Application number: CN201811472128.2A
Authority: CN
Inventors: 周永力; 曾丹; 石英尧; 陈腾君; 黎志康
Original assignee: Shenzhen Biology Breeding And Innovation Institute Chinese Academy Of Agricultural Sciences; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shenzhen Biology Breeding And Innovation Institute Chinese Academy Of Agricultural Sciences; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2019-03-01
Anticipated expiration: 2038-12-04
Also published as: CN109400688B

Abstract

本发明公开了OsHAP2C及其编码基因在调控水稻白叶枯病抗性中的应用。本发明公开的OsHAP2C为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列3的第240‑448位的蛋白质；A2)将序列表中序列3的第240‑448位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，敲除OsHAP2C基因，植物的抗病性提高；转OsHAP2C基因植物的抗病性显著降低，表明该基因可以用于调控植物的抗病性。

Description

OsHAP2C及其编码基因在调控水稻白叶枯病抗性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，OsHAP2C及其编码基因在调控水稻白叶枯病抗性中的应用。

背景技术

由稻黄单胞水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的白叶枯病是全球稻作栽培中重要的细菌性病害之一，在我国华南和东南亚稻区危害严重。水稻白叶枯病一般可导致水稻减产10％左右，严重时可减产50％-60％。利用抗性基因培育抗病品种是目前防治水稻白叶枯病最经济有效的措施。迄今，国内外已报道42个水稻白叶枯病抗性基因(http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/gene/list)。然而，来源于野生稻的抗病基因难以利用；部分抗性基因仅具有成株期抗性；大多抗性基因的抗谱较窄。在已鉴定的水稻白叶枯病抗性基因中，仅Xa3、Xa4、Xa21和Xa23等基因在生产中得以广泛应用。水稻白叶枯病菌具有复杂的多样性和高度的变异性，生产实践表明携带单一主效基因的抗病品种大面积推广种植后，潜在的毒性小种上升为优势小种或病菌变异出现新的毒性小种，极易导致品种抗性丧失。

利用基因编辑技术敲除负调控水稻抗病性的基因或超表达正调控水稻抗病性的基因，可以提高植株的抗病性。鉴定水稻抗病相关基因，在水稻抗病育种中具有重要的应用价值。异源三聚体血红素激活蛋白(HAP)复合物也称为CCAAT盒因子(CBF)或核因子Y(NF-Y)。HAP复合物由三个亚基组成：HAP2(NF-YA；CBF-B)，HAP3(NF-YB；CBF-A)和HAP5(NF-YC；CBF-C)，在调节植物生长发育和应激反应中具有重要作用。水稻中OsHAP家族有10个HAP2s，11个OsHAP3s和7个OsHAP5s同源基因。目前，尚无OsHAP2s调控水稻抗病反应的报导。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物白叶枯病抗性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用，所述蛋白质来源于水稻，其名称为OsHAP2C：

D1)调控植物抗病性；

D2)制备调控植物抗病性产品；

D3)培育抗病植物；

D4)制备培育抗病植物产品；

D5)培育抗病性降低植物；

D6)制备培育抗病性降低植物产品；

OsHAP2C为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列3的第240-448位的蛋白质；

A2)将序列表中序列3的第240-448位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列3的第240-448位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的OsHAP2C蛋白质，为与序列3的第240-448位所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的OsHAP2C蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的OsHAP2C蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列3的第240-448位所示的OsHAP2C蛋白质。

A3)所述蛋白质具体可为序列表中序列3所示的蛋白质。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与OsHAP2C相关的生物材料的下述任一应用：

D1)调控植物抗病性；

D2)制备调控植物抗病性产品；

D3)培育抗病植物；

D4)制备培育抗病植物产品；

D5)培育抗病性降低植物；

D6)制备培育抗病性降低植物产品；

所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码OsHAP2C的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低OsHAP2C表达量的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

b13)序列表中序列1的所示的DNA分子；

b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码OsHAP2C的cDNA分子或DNA分子；

b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码OsHAP2C的cDNA分子或DNA分子；

B8)所述核酸分子为靶向B1)所述核酸分子的sgRNA。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码OsHAP2C蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的OsHAP2C蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码OsHAP2C蛋白质且具有OsHAP2C蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3的第240-448位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码OsHAP2C蛋白质的核酸分子的表达盒(OsHAP2C基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达OsHAP2C蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动OsHAP2C基因转录的启动子，还可包括终止OsHAP2C基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述OsHAP2C基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为载体pMDC43。

B3)所述重组载体具体可为pMDC43-OsHAP2C。所述pMDC43-OsHAP2C含有序列表中序列2所示的DNA分子，能表达序列表中序列3所示的OsHAP2C与GFP的融合蛋白。

B8)所述sgRNA的靶序列可为序列表中序列1的第253-272位。

B8)所述sgRNA可为序列5所示的RNA。

B9)所述重组载体可为利用crisper/cas9系统制备的可以降低OsHAP2C含量的重组载体。所述重组载体可含有表达B8)所述sgRNA的表达盒。

B9)所述重组载体具体可为pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-OsHAP2C。所述pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-OsHAP2C含有表达B8)所述sgRNA的表达盒。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如根癌农杆菌EHA105。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述应用中，所述抗病可为抗白叶枯病。

本发明还提供了下述任一方法：

X1)培育抗病性增强植物的方法，包括降低受体植物中OsHAP2C的含量，或降低受体植物中OsHAP2C的活性，得到与所述受体植物相比抗病性增强的目的植物；

X2)培育抗病性降低植物的方法，包括使受体植物中表达OsHAP2C，或提高受体植物中OsHAP2C的含量，或提高受体植物中OsHAP2C的活性，得到与所述受体植物相比抗病性降低的目的植物；

X3)提高植物抗病性的方法，包括降低受体植物中OsHAP2C的含量，或降低受体植物中OsHAP2C的活性，得到与所述受体植物相比抗病性增强的目的植物实现植物抗病性的提高；

X4)降低植物抗病性的方法，包括使受体植物中表达OsHAP2C，或提高受体植物中OsHAP2C的含量，或提高受体植物中OsHAP2C的活性，得到与所述受体植物相比抗病性降低的目的植物实现植物抗病性的降低。

上述方法中，X1)和X3)所述方法可通过敲除所述受体植物中OsHAP2C的编码基因实现；

X2)和X4)所述方法可通过向所述受体植物中导入OsHAP2C的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

X1)和X3)中所述受体植物含有OsHAP2C的编码基因。

所述编码基因可为B1)所述核酸分子。

敲除所述受体植物中OsHAP2C的编码基因可利用CRISPR/Cas9方法进行。

利用CRISPR/Cas9方法敲除所述受体植物中OsHAP2C的编码基因可通过将编码靶向所述编码基因的所述sgRNA的表达盒和编码Cas9的表达盒导入所述受体植物中实现。

利用CRISPR/Cas9方法敲除所述受体植物中OsHAP2C的编码基因具体可通过将B9)所述重组载体导入所述受体植物中实现。

利用CRISPR/Cas9方法敲除所述受体植物中OsHAP2C的编码基因所用靶序列可为序列1的第253-272位。

在本发明的一个实施例中，与所述受体植物相比抗病性增强的目的植物为缺失所述受体植物中序列1的第269位的G得到的植物。

在本发明的一个实施例中，与所述受体植物相比抗病性增强的目的植物为缺失所述受体植物中序列1的第270-278位得到的植物。

上述方法中，所述OsHAP2C的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述OsHAP2C的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述OsHAP2C的编码基因可利用含有所述OsHAP2C的编码基因的重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体具体可为所述pMDC43-OsHAP2C。

所述重组表达载体和所述重组载体均可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson andCorey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。

所述目的植物理解为不仅包含OsHAP2C蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述抗病可为抗白叶枯病。

本发明还提供了调控植物抗病性的产品，所述产品含有OsHAP2C或所述生物材料。

所述产品可以OsHAP2C或所述生物材料为其活性成分，也可将OsHAP2C或所述生物材料与其他具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

上文中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)单子叶植物或双子叶植物；

M2)禾本科植物；

M3)水稻。

所述白叶枯病可为白叶枯病菌所致病害。所述白叶枯病菌具体可为水稻白叶枯病菌。所述白叶枯病菌进一步可为水稻黄单胞菌水稻致病变种Xoo菌株KS6-6所致病害。

OsHAP2C或所述生物材料，也属于本发明的保护范围。

本发明通过研究发现，植物接种水稻白叶枯病菌后OsHAP2C基因上调表达，表明该基因可能参与调控植物对白叶枯病的反应，进一步研究发现敲除OsHAP2C基因，植物的抗病性提高；转OsHAP2C基因植物的抗病性显著降低，表明该基因可以用于改良植物的抗病性。本发明对于培育抗病植无具有重要的意义，适合于推广应用。

附图说明

图1为OsHAP2C转基因植株的PCR鉴定结果。

图2为阳性OsHAP2C基因敲除植株的测序峰图。

图3为阳性OsHAP2C转基因植株中OsHAP2C基因在RNA水平上的表达量。

图4为阳性OsHAP2C转基因植株中OsHAP2C基因在蛋白质水平上的表达量。

图5为野生型植株和OsHAP2C转基因植株叶片的病斑长度。

图6为以实时定量PCR分析9804水稻接种Xoo菌株KS6-6后OsHAP2C基因的表达水平。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

水稻品系9804(简称9804水稻)：参考文献：谢学文，于晶，徐建龙，周永力，黎志康.玉米细菌性条斑病非寄主抗性基因Rxo1转化水稻的研究.生物工程学报，2007，23(4)：607-611.；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

Xoo菌株KS6-6，为水稻黄单胞菌水稻致病变种，属于水稻白叶枯病菌：方中达，许志刚，过崇俭，殷尚智，伍尚忠，徐羡明，章琦.中国水稻白叶枯病菌致病型的研究,植物病理学报，1990，20(2)：81-88；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

载体pGWC：BioVector NTCC典型培养物保藏中心。

载体pMDC43:BioVector NTCC典型培养物保藏中心。

pYLsgRNA-OsU6a/LacZ载体(Ma X,Zhang Q,Zhu Q.et al.A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot andDicot Plants,Mol Plant.2015,8(8):1274-84)经华南农业大学刘耀光老师同意后公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体(Ma X,Zhang Q,Zhu Q.et al.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing inMonocot and Dicot Plants,Mol Plant.2015,8(8):1274-84)经华南农业大学刘耀光老师同意后公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

根癌农杆菌EHA105：BioVector NTCC典型培养物保藏中心。

DNA Maker：博迈德生物技术有限公司，货号：MD102。

GFP抗体：北京全式金生物技术有限公司,货号：HT801-01。

实施例1、OsHAP2C可以调控水稻白叶枯病抗性

本实施例提供了一种来源于9804水稻的名称为OsHAP2C的蛋白质，其序列为序列表中序列3的第240-448位，9804水稻中OsHAP2C基因的编码区序列为序列表的序列2，基因组序列为序列表中序列1。

1、重组载体的构建

1)OsHAP2C基因表达载体

提取9804水稻叶片的总RNA，反转录为cDNA。以上述步骤得到cDNA为模板，采用引物attB-F：5′-AAGCAGGCTTTGACTTTATGCAAAGTTTGTTTGCATCTA-3′和引物attB-R：5′-GGGTCTAGAGACTTTAGCGCCCTCTTTCGCACGAC-3′进行PCR扩增，得到扩增产物。通过BP反应，将上述步骤得到的扩增产物导入载体pGWC，得到含有序列表的序列2所示的双链DNA分子的阳性入门克隆质粒pGWC-OsHAP2C(测序验证)。BP反应体系：扩增产物5μL(50-100ng)，载体pGWC 2.0μL(30-50ng)，5×BP Reaction Buffer 2.0μL，BP Enzyme mix 1μL。BP反应条件：25℃温浴1h。取上述步骤得到的阳性入门克隆质粒pGWC-OsHAP2C，与载体pMDC43进行LR反应，得到含有序列表的序列2所示的双链DNA分子的过表达载体pMDC43-OsHAP2C。LR反应体系：入门克隆质粒pGWC-OsHAP2C 1μL(50-100ng)，载体pMDC43 1μL(50-100ng)，LR enzyme mix 0.5μL。LR反应条件：25℃温浴1h。

pMDC43-OsHAP2C含有序列表中序列2所示的DNA分子以及35S启动子，能表达序列表中序列3所示的OsHAP2C与GFP的融合蛋白质，该蛋白质的表达由35S启动子驱动。

2)OsHAP2C基因敲除表达载体

构建利用CRISPR/Cas9方法编辑OsHAP2C基因的重组载体，所用靶序列为TGCTGACCGTATCTTGGACC(即序列表中序列1的第253-272位)；将CRISPR/Cas9方法中靶向靶序列的sgRNA记为sgRNA1；

sgRNA表达盒构建：

以pYLsgRNA-OsU6a/LacZ载体为模板，使用引物U-F(5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’)和U6a-HAP2C-R(5’-CGAGGGATGTACTTCATGGCCGGCAGCCAAGCCAGCA-3’)进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为U6a-HAP2C；以pYLsgRNA-OsU6a/LacZ载体为模板，使用引物gR-HAP2C-F(5’-GCCATGAAGTACATCCCTCG GTTTTAGAGCTAGAAAT’)和g-gR(5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’)进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为sgRNA-HAP2C。采用overlapping PCR方法将U6a-Hap2C和sgRNA-HAP2C连在一起，随后用V-F(5’-GCGCCGTAGTGCTCGTGGAATCGGCAGCAAAGGAC-3’)和V-R(5’-TTTGCTGCCGATTCCCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’)进行PCR扩增加上infusion接头，将得到的序列正确的DNA片段命名为LacZ-U6a-sgRNA-HAP2C，LacZ-U6a-sgRNA-HAP2C即为sgRNA1表达盒。LacZ-U6a-sgRNA-HAP2C的序列为序列表中序列4，序列4的第237-683位为U6a启动子，第687-789位为sgRNA1的编码序列，第81-236位为LacZ alpha的编码序列。LacZ-U6a-sgRNA-HAP2C能编码sgRNA1，sgRNA1的序列为序列表中序列5。

重组载体的构建：

将上述LacZ-U6a-sgRNA-HAP2C与pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体经BsaI酶切得到的载体骨架进行同源重组连接反应，得到HAP2C基因敲除载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-OsHAP2C。

同源重组反应体系：LacZ-U6a-sgRNA-HAP2C(50-100ng)，已被BsaI酶切的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体(50-100ng)，5×In-fusion HD Enzyme Premix 1μL，加ddH₂O补充至5μL。

同源重组反应体程序：50℃孵育15min，反应体系转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，将得到的序列正确的重组载体命名为pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-OsHAP2C，pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-OsHAP2C含有sgRNA1表达盒，能表达sgRNA1和Cas9。

2、转基因水稻的获得

分别利用步骤1得到的重组载体pMDC43-OsHAP2C和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-OsHAP2C制备转基因水稻，并利用分别载体pMDC43和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体制备空载对照植株，具体步骤如下：

a)取9804水稻的成熟种子，机械脱壳，挑取饱满光洁无菌斑的种子进行消毒。

b)将消毒后的种子接种到诱导培养基28℃、暗培养14天左右，选取外观良好，生长力好的愈伤组织。

c)取步骤1构建的重组载体导入根癌农杆菌EHA105，得到重组菌。

d)取上述步骤得到的重组菌，用侵染培养基重悬菌体，得到菌悬液。

e)将完成步骤b)的愈伤组织浸泡于步骤d)制备的菌悬液中，侵染20min。侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后置于共培养培养基上，28℃暗培养50-55h。

f)完成步骤e)后，挑选表面没有明显农杆菌的愈伤组织移至抑菌培养基中，28℃暗培养3-4天。

g)完成步骤f)后，将愈伤组织移至筛选培养基上28℃暗培养培养30天，每10天继代一次。

h)完成步骤g)后，取新鲜潮霉素抗性的愈伤组织，接于预再生培养基中，28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养7天后转入再生培养基上，继续光照培养，直至生长出再生植株，得到T₀代植株。T_O代植株自交，得到T₁代植株。

将利用重组载体pMDC43-OsHAP2C得到的转基因植株记为OsHAP2C转基因植株，将利用载体pMDC43得到的转基因植株记为转基因空载对照植株；

将利用重组载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-OsHAP2C得到的转基因植株记为OsHAP2C基因敲除植株，将利pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体得到的转基因植株记为基因敲除空载对照植株。

遗传转化所用培养基及配方：

诱导培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，2，4-D 2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，去离子水加至1L。

侵染培养基：配制方法参见参考文献：Hiei Y,Ohta S,Komari T,etal.Efficient transformation of rice(Oryza sativa,L.)mediated byAgrobacterium,and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].PlantJournal,1994,6(2):271–282.。将参考文献中乙酰丁香酮的浓度替换为200μM。

共培养培养基：在诱导培养基中加入乙酰丁香酮和葡萄糖，使乙酰丁香酮在培养基中的终浓度为200μM，葡萄糖在培养基中的终浓度为10g/L。

抑菌培养基：在诱导培养基中头孢霉素，使头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/L。

筛选培养基：在诱导培养基中加入潮霉素和头孢霉素，使潮霉素在培养基中的终浓度为65mg/L，头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/L。

预再生培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。

再生培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂6g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。

3、转基因水稻的鉴定

阳性OsHAP2C转基因植株：取上述步骤2获得的OsHAP2C转基因植株的19个株系的T₁代植株，提取植株叶片的DNA，以DNA为模板，采用引物GFP6-F：5’-TGGTCTCTCTTTTCGTTGGG-3’；和GFP6-R：5’-CAGTGGAGAGGGTGAAGGTG-3’进行PCR鉴定。采用重组载体pMDC43-OsHAP2C作为阳性对照，采用9804水稻和转基因空载对照植株的DNA作为阴性对照，转基因植株中扩增得到目的条带的植株为阳性转基因植株，对阳性植株进行收种。

转基因植株的PCR鉴定结果如图1所示。图1中，M为DNA Maker，+为阳性对照，-为阴性对照，泳道1-19依次对应19个不同株系的T₁代植株。结果表明，14个转基因株系的植株均能扩增出与重组载体pMDC43-OsHAP2C中GFP基因一致的特异条带，这14个转基因株系即为阳性OsHAP2C转基因植株。

阳性OsHAP2C基因敲除植株：对OsHAP2C基因敲除植株的T₁代提取DNA，以DNA为模板，采用引物Cas9-OsHAP2C-F:CAGCAAGGGAGGAGGTTTG和Cas9-OsHAP2C-R:CAGAACAAGTTACAAGCATCGT进行PCR扩增，将扩增产物进行测序，测序峰图如图2所示。

结果表示，有2个转基因株系(命名为Cas9-1和Cas9-2)峰图结果为单峰，经过序列比对发现Cas9-1比9804水稻中OsHAP2C基因的靶序列少1个核苷酸—G，即Cas9-1中，OsHAP2C基因缺失了序列表中序列1的第269位的G，Cas9-1其他序列均不变；Cas9-2比9804水稻中OsHAP2C基因的靶序列少了9个核苷酸—ACCCGGCTG，即Cas9-2中，OsHAP2C基因缺失了序列表中序列1的第270-278位，Cas9-2其他序列均不变，表明了这两个植株均为阳性OsHAP2C基因敲除植株，且为纯合基因型植株。

4、转基因水稻在RNA和蛋白质水平上的鉴定

RNA水平上的鉴定：取5个阳性OsHAP2C转基因植株(命名为T6、T7、T8、T9、T10)，采用qRT-PCR检测OsHAP2C基因在RNA水平上的表达情况，所用引物为：F：5′-AGCTGGTGAAAAACCGCAAG-3′和R：5′-GTCCTTGTCACAAGTCTAGC-3′，采用引物Actin-F：5′-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3′和引物Actin-R：5′-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3′检测内参基因(Actin基因)的表达水平。利用转基因空载对照植株和9804水稻作为阴性对照。

图3为阳性OsHAP2C转基因植株中OsHAP2C基因在RNA水平的表达量，9804表示9804水稻。结果显示：与阴性对照相比，阳性OsHAP2C转基因植株T6、T7、T8、和T10植株中OsHAP2C基因显著上调表达。转基因空载对照植株和9804水稻中OsHAP2C基因的表达水平无显著差异。

蛋白质水平上的鉴定：取阳性OsHAP2C转基因植株(T6、T7、T8)和9804水稻，采用Western Blot检测OsHAP2C基因在蛋白质水平上的表达量，所用一抗为GFP抗体。

图4为将GFP抗体作为一抗采用Western Blot检测目的蛋白的表达情况，9804表示9804水稻。从图中可知，阳性OsHAP2C转基因植株T6、T7和T8中OsHAP2C蛋白水平都有不同的表达。转基因空载对照植株和9804水稻中OsHAP2C基因的表达水平无显著差异。

5、转基因水稻的抗水稻白叶枯病表型鉴定

待测植株为：9804水稻(野生型)；阳性OsHAP2C转基因植株(T6和T7的T₁代植株)，转基因空载对照植株；阳性OsHAP2C基因敲除植株Cas9-1和Cas9-2的T₁代植株，基因敲除空载对照植株。

1)将待测植株的种子播于装有淋过土壤杀菌剂的营养土壤的育秧盘中，在温室中培养约25天后移栽至网室中进行种植，单株种植，每种植株种植20株。

2)在步骤1)水稻植株的分蘖盛期，用Xoo菌株KS6-6，采用剪叶法对水稻植株进行人工接种，每株接种5个叶片(菌液浓度为1×10⁹cfu/mL)，每个叶片的接种量均相等。

3)完成步骤2)后14天，测量各植株叶片的病斑长度，每个植株测量3个接种叶片的病斑长度，计算平均值。

结果如图5所示。结果表明，野生型植株的病斑长度为17.4cm，阳性OsHAP2C转基因植株T6和T7植株的病斑长度分别为23.7cm和23.7cm，显著长于野生型的病斑长度；阳性OsHAP2C基因敲除植株Cas9-1和Cas9-2植株的病斑长度分别为11.9cm和15.4cm，显著短于野生型的病斑长度。转基因空载对照植株、基因敲除空载对照植株与野生型的病斑长度均无显著差异。

上述结果表明OsHAP2C基因可以显著增强水稻对白叶枯病的感病性；敲除OsHAP2C基因，能够提高水稻对白叶枯病的抗病性。

实施例2、接种Xoo菌株KS6-6后OsHAP2C基因的表达水平

1、水稻品系9804接种Xoo菌株KS6-6和叶片取样

将9804水稻的种子播于盛有灭菌土壤的育秧盘中，在温室中培养25天后移栽到网室中，单株种植。在水稻植株的分蘖盛期，用Xoo菌株KS6-6，采用剪叶法对水稻植株进行人工接种，每株接种5个叶片。完成人工接种的0、2、4、8、12、24和36h，剪取接种的叶片，迅速放入液氮中速冻，每样品各取三个生物学重复。所有样品液氮速冻后置-70℃保存。

2、实时定量PCR分析

RNA提取：采用TRIZON试剂提取样品总RNA，并对RNA进行纯度分析，用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，具体方法和步骤参照说明书。

反转录：上述得到的RNA进行反转录得到第一链的cDNA，反转录方法和步骤参照反转录试剂盒(北京全式金生物生物技术有限公司，Code no：AT311-03)。

Real Time PCR分析：以上述得到的cDNA为模板，进行Real Time PCR反应，所用引物和内参同实施例1中步骤4。

Real Time PCR的分析使用全式金的TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒(货号：AQ132-23)，应用的Real Time PCR扩增仪为ABI7500，具体方法和步骤参照试TransStart Top Green qPCR SuperMix剂盒说明书及ABI7500操作手册。

分析结果显示溶解曲线均为单峰，扩增产物特异性好，荧光曲线可以很好地反应扩增结果。对结果进行分析，结果如图6所示。结果表明，在接种Xoo菌株KS6-6后，9804水稻叶片中OsHAP2C的表达量随着接种时间的推移而上升，接种2h后表达量显著上升，随后又逐渐下降，在36h后，又达到另一峰值。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所、中国农业科学院深圳生物育种创新研究院

<120> OsHAP2C及其编码基因在调控水稻白叶枯病抗性中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3434

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

aggcagagga gagagagaag gagaggggct ttgcacttgc agaggagaga agcaaggtga 60

gaagtgagga ggcagcaagg gaggaggttt gccggagagg ggacatgctc cctcctcatc 120

tcacaggtat cccctctctc ctcctcctca tccgcttctc tgactcgctt ctccgtagac 180

ttgtaatccg tggcttgttt ctttctcctc cactttgtgg actctgttcc aacgcaagcc 240

gattcttgcc attgctgacc gtatcttgga cccggctggg tttgtggtgg ttttgatttc 300

ttggtggatc tggccggttt cttcgttgtt ggcttggttt ttagttgatg aggcgccgtg 360

atttgtagat gcattcttgg gtggaggtga gggtggttgc aactgcgttg tctctgactc 420

tccgtggtag caacctaaga ccataagacg atgcttgtaa cttgttctgt tgttcagttt 480

gatagttcaa ctatctgttt ctaattgacc atggttgggt gggctgctta gttcctatga 540

attcatcact tttgttagtt cggtttgttt aggtccgtga caagggggca agtgagggga 600

attggatgat tggaacggta ttggatgatt ggaatattgg atccgagtag aacttaatta 660

gtttaaacct tttctgtatt aattacttgt ttgcacacaa attcgcttgg tggagaggta 720

gtaggatcca gatggcatgt cagctgtgaa tttattttag gggttagttg tgagcttctg 780

aattaatatt gctttcttta caaataaatt tacttttcca catgagtatt gagtaatatg 840

attattggga gtggggagaa ccgctggctt tgtgtcacag cgatttggaa ctggctagtg 900

ctgaagtgag ttattgaagg gatttgtctc atcacatagt ttgatagtag taggctagta 960

gcttttacat ctgacatgaa cgatcgaatt tttgaaagga gttaacaagt ttatttataa 1020

cagctctgtg aacattttta gtcatgttct ggcaaataca tggatcaggg caacattcaa 1080

catgtctaga ttgatcagtt ttaagtgaat ctgtctacac aattgataga tatacaagtt 1140

attttcagta acagaatatg gaaaataata ttattcatta atatttcatt tgtccttgcg 1200

attgactgat cttctcctta aaaaactcag acagtagaac tgaaaagcaa gagatgagaa 1260

agcccatgag aagaggcatt aggaaaagag aaaacatatt gttcaattct aaggcaccat 1320

ttggaacacg agaatttcca atttttgtat gatctgaact gcttgtaaaa ttcttgcatt 1380

ctaaataggg cctaatattg caaataccgc tctcctaact agatgtctat tttcttgcat 1440

ctctagcttt catgcaacta aatttaaaac atctacttca ttattcttgc agaaaatggc 1500

acagtaatga ttcagtttgg tcataaaatg cctgactacg agtcatcagc tacccaatca 1560

actagtggat ctcctcgtga agtgtctgga atgagcgaag gaagcctcaa tgagcagaat 1620

gatcaatctg gtttggacta gacacaccat atgcattttt tgtatcagta aataatattg 1680

caatacagca cctccagggt aaaaggaata ttgatggatg caaagtttgt ttgcatctac 1740

actactgaag ttatgtgaca tttcttttct tcttgtacta atgctaggta atcttgatgg 1800

ttacacgaag agtgatgaag gtaagatgat gtcagcttta tctctgggca aatcagaaac 1860

tgtgtatgca cattcggaac ctgaccgtag ccaacccttt gtaagtgtct ttacgtggca 1920

taaatcttgg taacttgaat ttcttcattg gcaagtctgt gagtcaagaa agatgcttta 1980

ccttttcagg gcatatcata tccatatgct gattcgttct atggtggtgc tgtagcgact 2040

tatggcacac atgctattgt aagtgacctt tgtgctatcc aaggtttcct ttattaattc 2100

catttacttt cttgatctgg cagttataaa tggaattcat ccaaactcgg cgaaattcca 2160

atcaaattaa gaatgggatt tcgttttatc tcattctcat ttaccttttt ggttccaaac 2220

ttccagccta atgttcttgt gtgcgcgctt atgtgcttta ggtatattca tgggttgtta 2280

agaatgggat ttcgtttttg tgggataatc tctgactgtt ttgactaaac taagcaaaat 2340

tccaatcatt tttttactgt acaaaggcag tgtgttattc tttatctttt ctcattatca 2400

tcctcctgat gagaatagtt taattttctt gcatatgctc ggcccaatat gtttctattc 2460

aatatcacaa agtcatcctc atctaatatc aataattcaa acagatgcat ccccagattg 2520

tgggcgtgat gtcatcctcc cgagtcccgc taccaataga accagccacc gaagagccta 2580

tttatgtaaa tgcaaagcaa taccatgcga ttctccgaag gagacagctc cgtgcaaagt 2640

tagaggctga aaacaagctg gtgaaaaacc gcaaggtatt tcgtcgctct ttctgactga 2700

agttttatta ggagaaattc ttgagagact agccattggc cctttttgct cagaatgtgc 2760

ggaaaatttc ctctcttcct ttcactttcc cttcatgaat tctagctcac ggtttcacta 2820

aaagcggcat aacgtttata tttgtgttca gccgtacctc catgaatccc ggcatcaaca 2880

cgcgatgaag agagctcggg gaacaggggg gagattcctc aacacaaagc agcagcctga 2940

agcttcagat ggtggcaccc caaggctcgt ctctgcaaac ggcgttgtgt tctcaaagca 3000

cgagcacagc ttgtcgtcca gtgatctcca tcatcgtcgt gcgaaagagg gcgcttgaga 3060

tcctcgccgt ttctgtcatg gcaaatcatc cttggcttat gtgtggtgcc cagcaaaaaa 3120

aaatctgact gaacctgtgt gtaaactgat gggtatgggt gggttttgtg caactgtaac 3180

tagggtgctt gacatctgtg tctgttgttc ctctgcctcc ttagtttgga gacggtgcag 3240

ctgcagctgg taccagtaat ctgatcatgc tagacttgtg acaaggacaa aactagcacc 3300

ccgttatgtt tcctggcttc tgaatttggt ggtcattcag taagcaagca ctcgacgtca 3360

gcgggagggg gttgcttcga ttgatctagt tctttcgcga taaacttatt taattttgaa 3420

caaaggttgg tttc 3434

<210> 2

<211> 630

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

atgcaaagtt tgtttgcatc tacactactg aagttatgtg acatttcttt tcttcttgta 60

ctaatgctag gtaatcttga tggttacacg aagagtgatg aaggtaagat gatgtcagct 120

ttatctctgg gcaaatcaga aactgtgtat gcacattcgg aacctgaccg tagccaaccc 180

tttggcatat catatccata tgctgattcg ttctatggtg gtgctgtagc gacttatggc 240

acacatgcta ttatgcatcc ccagattgtg ggcgtgatgt catcctcccg agtcccgcta 300

ccaatagaac cagccaccga agagcctatt tatgtaaatg caaagcaata ccatgcgatt 360

ctccgaagga gacagctccg tgcaaagtta gaggctgaaa acaagctggt gaaaaaccgc 420

aagccgtacc tccatgaatc ccggcatcaa cacgcgatga agagagctcg gggaacaggg 480

gggagattcc tcaacacaaa gcagcagcct gaagcttcag atggtggcac cccaaggctc 540

gtctctgcaa acggcgttgt gttctcaaag cacgagcaca gcttgtcgtc cagtgatctc 600

catcatcgtc gtgcgaaaga gggcgcttga 630

<210> 3

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50 55 60

Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Ala Asn Phe Lys Thr Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Met

225 230 235 240

Gln Ser Leu Phe Ala Ser Thr Leu Leu Lys Leu Cys Asp Ile Ser Phe

245 250 255

Leu Leu Val Leu Met Leu Gly Asn Leu Asp Gly Tyr Thr Lys Ser Asp

260 265 270

Glu Gly Lys Met Met Ser Ala Leu Ser Leu Gly Lys Ser Glu Thr Val

275 280 285

Tyr Ala His Ser Glu Pro Asp Arg Ser Gln Pro Phe Gly Ile Ser Tyr

290 295 300

Pro Tyr Ala Asp Ser Phe Tyr Gly Gly Ala Val Ala Thr Tyr Gly Thr

305 310 315 320

His Ala Ile Met His Pro Gln Ile Val Gly Val Met Ser Ser Ser Arg

325 330 335

Val Pro Leu Pro Ile Glu Pro Ala Thr Glu Glu Pro Ile Tyr Val Asn

340 345 350

Ala Lys Gln Tyr His Ala Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Arg Ala Lys

355 360 365

Leu Glu Ala Glu Asn Lys Leu Val Lys Asn Arg Lys Pro Tyr Leu His

370 375 380

Glu Ser Arg His Gln His Ala Met Lys Arg Ala Arg Gly Thr Gly Gly

385 390 395 400

Arg Phe Leu Asn Thr Lys Gln Gln Pro Glu Ala Ser Asp Gly Gly Thr

405 410 415

Pro Arg Leu Val Ser Ala Asn Gly Val Val Phe Ser Lys His Glu His

420 425 430

Ser Leu Ser Ser Ser Asp Leu His His Arg Arg Ala Lys Glu Gly Ala

435 440 445

<210> 4

<211> 824

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgccgtagt gctcgtggaa tcggcagcaa aggacgcgtt gacattgtag gactatattg 60

ctctaataaa ggaggcagct atgctggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 120

ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 180

gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggctaaatgt 240

tttttcctgt agttttccca caaccatttt ttaccatccg aatgatagga taggaaaaat 300

atccaagtga acagtattcc tataaaattc ccgtaaaaag cctgcaatcc gaatgagccc 360

tgaagtctga actagccggt cacctgtaca ggctatcgag atgccataca agagacggta 420

gtaggaacta ggaagacgat ggttgattcg tcaggcgaaa tcgtcgtcct gcagtcgcat 480

ctatgggcct ggacggaata ggggaaaaag ttggccggat aggagggaaa ggcccaggtg 540

cttacgtgcg aggtaggcct gggctctcag cacttcgatt cgttggcacc ggggtaggat 600

gcaatagaga gcaacgttta gtaccacctc gcttagctag agcaaactgg actgccttat 660

atgcgcgggt gctggcttgg ctgccgtgct gaccgtatct tggaccgttt tagagctaga 720

aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 780

gctttttttc aagagcttgg agtggatggg gaatcggcag caaa 824

<210> 5

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

ugcugaccgu aucuuggacc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

Claims

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：

D1)调控植物抗病性；

D2)制备调控植物抗病性产品；

D3)培育抗病植物；

D4)制备培育抗病植物产品；

D5)培育抗病性降低植物；

D6)制备培育抗病性降低植物产品；

所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列3的第240-448位的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料的下述任一应用：

D1)调控植物抗病性；

D2)制备调控植物抗病性产品；

D3)培育抗病植物；

D4)制备培育抗病植物产品；

D5)培育抗病性降低植物；

D6)制备培育抗病性降低植物产品；

所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B8)降低权利要求1中所述蛋白质表达量的核酸分子；

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

b13)序列表中序列1的所示的DNA分子；

b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

B8)所述核酸分子为靶向B1)所述核酸分子的sgRNA。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述抗病为抗白叶枯病。

5.下述任一方法：

X1)培育抗病性增强植物的方法，包括降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比抗病性增强的目的植物；

X2)培育抗病性降低植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比抗病性降低的目的植物；

X3)提高植物抗病性的方法，包括降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比抗病性增强的目的植物实现植物抗病性的提高；

X4)降低植物抗病性的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比抗病性降低的目的植物实现植物抗病性的降低。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：X1)和X3)所述方法通过敲除所述受体植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因实现；

X2)和X4)所述方法通过向所述受体植物中导入权利要求1中所述蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述抗病为抗白叶枯病。

8.调控植物抗病性的产品，含有权利要求1中所述蛋白质或权利要求2或3中所述生物材料。

9.根据权利要求1-4中任一所述的应用，或权利要求5-7中任一所述的方法，或权利要求8所述的产品，其特征在于：所述植物为M1)或M2)或M3)：

M1)单子叶植物或双子叶植物；

M2)禾本科植物；

M3)水稻。

10.权利要求1中所述蛋白质或权利要求2或3中所述生物材料。