CN110699363B

CN110699363B - 水稻反转座子基因LOC_Os11g45295及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN110699363B
Application number: CN201911164309.3A
Authority: CN
Inventors: 周永力; 李全林; 史晓荣; 卢家玲
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: CN110699363A

Abstract

本发明公开了水稻反转座子基因LOC_Os11g45295及其编码蛋白与应用。本发明发现水稻反转座子基因LOC_Os11g45295及其编码蛋白在调控植物抗病性中的应用，通过破坏LOC_Os11g45295基因的编码蛋白的生物学功能能够显著提高水稻对白叶枯病的抗性。本发明利用CRISPR/Cas9技术实现了高效的LOC_Os11g45295基因定点敲除，定点敲除水稻接种白叶枯病菌IV、KS‑6‑6和PXO61后，病斑长度显著缩短。本发明提供的LOC_Os11g45295基因的新功能为植物抗病育种提供了新方法，在农业生产上具有十分重要的应用价值。

Description

水稻反转座子基因LOC_Os11g45295及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及水稻反转座子基因LOC_Os11g45295及其编码蛋白与应用。

背景技术

由黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pIV.oryzae)引起的白叶枯病是制约水稻生产的一种重要细菌性病害，对于水稻种植产业危害严重，一般可致水稻减产20％-30％左右，严重可达50％。利用抗性基因培育和种植抗病品种是防治水稻白叶枯病最经济有效的措施。然而，目前已报道的44个水稻白叶枯病抗性基因/位点(http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/gene/list)大部分表现出抗谱较窄或者难以利用的问题，仅Xa3、Xa4、Xa21和Xa23等基因在生产中得以广泛应用。

由于黄单胞杆菌水稻致病变种易于变异，水稻与白叶枯病菌(黄单胞杆菌水稻致病变种)的协同进化导致品种抗性极易丧失。因此，通过鉴定并敲除白叶枯病易感性基因提高水稻品种的抗病性，对培育抗病水稻具有重要的应用价值。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明的一个目的是提供水稻反转座子基因LOC_Os11g45295及其编码蛋白在调控植物抗病性中的应用。

本发明提供了如下A-C中任一种物质在调控植物抗病性中的应用；

A、LOC_Os11g45295蛋白；

B、所述LOC_Os11g45295蛋白的编码核酸；

C、含有所述核酸的表达盒、重组载体或重组微生物。

本发明还提供了如下b1或b2所示的物质在提高植物抗病性或改良植物抗病性中的应用：b1、抑制或降低植物中LOC_Os11g45295蛋白活性或者含量的物质；b2、抑制或降低植物中LOC_Os11g45295蛋白编码核酸表达的物质。

上述应用中，所述LOC_Os11g45295蛋白为如下(a1)-(a4)中任一种：

(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；

(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗病相关的蛋白质；

(a4)与(a1)具有98％以上同一性且与植物抗病性相关的蛋白质。

上述应用中，所述LOC_Os11g45295蛋白编码核酸为如下(b1)-(b3)中任一种：

(b1)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)与(b1)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)任一种限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。

上述如序列1所示的氨基酸序列为水稻LOC_Os11g45295基因的编码蛋白序列，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与本发明公开的水稻LOC_Os11g45295基因的编码蛋白具有相同活性的突变体。

上述如序列2所示的核苷酸序列为水稻LOC_Os11g45295基因的核苷酸序列。本发明所述的水稻LOC_Os11g45295基因可以为任意能够编码上述水稻LOC_Os11g45295基因的编码蛋白的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

上述应用中，所述抗病性为抗白叶枯病。

上述应用中，所述b1或b2所示的物质为LOC_Os11g45295蛋白或LOC_Os11g45295蛋白编码核酸的抑制因子，抑制因子可以为核酸，也可以含有所述核酸的表达盒、载体、重组菌或宿主细胞的形式存在；抑制因子具体如下：

1)干扰RNA；

2)CRISPR/Cas9系统；

所述CRISPR/Cas9系统中，所述sgRNA的靶序列为所述LOC_Os11g45295蛋白的编码核酸中的XXXNGG形式的核苷酸序列，其中，XXX为所述LOC_Os11g45295蛋白的编码核酸中任意19-20bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基。

利用CRISRP/Cas9系统可使水稻LOC_Os11g45295基因中XXXNGG形式的核苷酸序列在NGG上游3-4bp处切割产生DNA双链断裂，从而引入核苷酸序列的插入缺失，进而造成该基因的翻译提前终止或蛋白构象改变，最终破坏该基因的编码蛋白的生物学功能；其中XXXNGG形式的核苷酸序列，其中，XXX为19-20bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基。

优选为，XXX为LOC_Os11g45295蛋白的编码核酸(基因组)中第二外显子中任意19-20bp的核酸序列；在本发明的实施例中，更优选地，所述sgRNA为sgRNA1和/或sgRNA2；所述sgRNA1的靶序列为序列3(水稻LOC_Os11g45295基因的第1390位至第1409位)；所述sgRNA2的靶序列为序列4(水稻LOC_Os11g45295基因的第1509位至第1528位)。

在本发明的实施例中，pYLCRISPR/Cas9系统包括如下任一种重组载体(CRISRP/Cas9基因编辑质粒)：

重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T1含有U6a-LOC_Os11g45295-sgRNA1和cas9编码基因，U6a-LOC_Os11g45295-sgRNA1具有20个核苷酸组成的靶序列区，靶序列区在LOC_Os11g45295基因上对应的靶序列为序列3所示的LOC_Os11g45295-T1；该重组表达载体的具体构建方法见实施例；

重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T2含有U6b-LOC_Os11g45295-sgRNA2和cas9编码基因，U6b-LOC_Os11g45295-sgRNA2具有20个核苷酸组成的靶序列区，靶序列区在LOC_Os11g45295基因上对应的靶序列为序列4所示的LOC_Os11g45295-T2；该重组表达载体的具体构建方法见实施例。

重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295含有U6a-LOC_Os11g45295-sgRNA-1、U6b-LOC_Os11g45295-sgRNA-2和cas9编码基因，U6a-LOC_Os11g45295-sgRNA-1具有20个核苷酸组成的靶序列区，靶序列区在LOC_Os11g45295基因上对应的靶序列为序列3所示的LOC_Os11g45295-T1；U6b-LOC_Os11g45295-sgRNA-2具有20个核苷酸组成的靶序列区，靶序列区在LOC_Os11g45295基因上对应的靶序列为序列4所示的LOC_Os11g45295-T2；该重组表达载体的具体构建方法见实施例。

上述应用中，所述遗传育种为构建抗白叶枯病的转基因植物。

上述抗病性的提高可表现为植物白枯病的病斑长度减少。

本发明另一个目的是提供一种提高植物抗病性的方法，为如下1)-3)中任一种方法，实现提高植物抗病性；

1)包括如下步骤：抑制或降低目的植物中LOC_Os11g45295蛋白活性或者含量；

2)包括如下步骤：抑制或降低目的植物中LOC_Os11g45295蛋白编码核酸表达；

3)包括如下步骤：对目的植物中LOC_Os11g45295蛋白编码核酸进行基因编辑；

本发明还提供了一种制备高抗病性的转基因植物的方法，为如下1)-3)中任一种方法，

1)包括如下步骤：抑制或降低目的植物中LOC_Os11g45295蛋白活性或者含量，得到转基因植物；

2)包括如下步骤：抑制或降低目的植物中LOC_Os11g45295蛋白编码核酸表达，得到转基因植物；

3)包括如下步骤：对目的植物中LOC_Os11g45295蛋白编码核酸进行基因编辑，得到转基因植物；

所述转基因植物中的抗病性高于所述目的植物；

所述目的植物为野生型植物或受体植物。

上述方法还包括如下步骤：从转基因植物或基因编辑后植物中选取LOC_Os11g45295蛋白编码核酸被编辑的植株，为抗病性高的转基因植物。

所述从转基因植物或基因编辑后植物中选取LOC_Os11g45295蛋白编码核酸被编辑的植株的选取方法包括：1)直接扩增含有LOC_Os11g45295蛋白编码核酸抑制因子的载体片段；2)扩增并测序编辑后植株中含有LOC_Os11g45295蛋白编码核酸靶序列的基因组片段。

在本发明的实施例中，扩增并测序编辑后植株中含有LOC_Os11g45295蛋白编码核酸靶序列的基因组片段中采用的扩增引物具体为序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子组成的引物。

上述方法中，所述抗病性为抗白叶枯病。

上述方法中，所述抑制或降低植物中LOC_Os11g45295蛋白活性或者含量，或，抑制或降低植物中LOC_Os11g45295蛋白编码核酸表达是通过对LOC_Os11g45295蛋白编码核酸进行基因编辑实现。

上述方法中，所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现的；

所述CRISPR/Cas9系统中，所述sgRNA的靶序列为所述LOC_Os11g45295蛋白的编码核酸中的XXXNGG形式的核苷酸序列，其中，XXX为所述LOC_Os11g45295蛋白的编码核酸中任意19-20bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基；

上述方法中，基因编辑具体为先构建含有序列3或/和序列4所示的sgRNA靶序列区的CRISRP/Cas9基因编辑质粒，再将该CRISRP/Cas9基因编辑质粒转入植物中，实现基因编辑。其中，CRISRP/Cas9基因编辑质粒为II型CRISPR系统。在本发明的实施例中，pYLCRISPR/Cas9系统包括如下任一种重组载体(pYLCRISRP/Cas9基因编辑质粒)：重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T1、重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T2或重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295。

本发明还有一个目的是提供一种特异sgRNA或含有所述sgRNA编码基因的表达盒、载体、宿主细胞、工程菌或转基因植物细胞系。

本发明提供的特异sgRNA为sgRNA1和/或sgRNA2；

所述sgRNA1的靶序列为序列3；所述sgRNA2的靶序列为序列4。

在本发明中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，优选为白叶枯病菌的寄主植物，包括但不限于水稻。

本发明实验证明，利用上述sgRNA进行CRISRP/Cas9介导的基因编辑能够高效获得LOC_Os11g45295基因突变的水稻植株，并且在如序列2所示序列的第1390位至第1409位或/和第1509位至第1528位发生插入或缺失均会导致水稻LOC_Os11g45295基因的编码蛋白的生物学功能被破坏，使得水稻表现出白叶枯病抗性水平提高的性状，进而有效提高基于LOC_Os11g45295基因突变的抗病植物的选育效率。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明发现水稻反转座子基因LOC_Os11g45295及其编码蛋白参与调控水稻对白叶枯病菌的免疫响应，通过破坏LOC_Os11g45295基因的编码蛋白的生物学功能能够显著提高水稻的白叶枯病菌抗性。经实验验证：分别对LOC_Os11g45295定点敲除水稻接种白叶枯病菌IV、KS-6-6和PXO61，接种白叶枯病菌IV叶片病斑长度缩短63.1％，接种白叶枯病菌KS-6-6叶片病斑长度缩短41.4％，接种白叶枯病菌PXO61叶片病斑长度缩短35％，证明通过突变LOC_Os11g45295基因的核苷酸序列制备水稻白叶枯抗病材料，在农业生产上具有十分重要的应用价值。

(2)本发明利用CRISRP/Cas9技术进行基因组靶向修饰LOC_Os11g45295基因，实现了高效的LOC_Os11g45295的定点敲除。本发明发现水稻LOC_Os11g45295基因中以第1390位至第1409位或/和第1509位至第1528位的核苷酸序列作为靶序列，能够高效实现LOC_Os11g45295的定点敲除，并且在如序列2所示序列的第1390位至第1409位或/和序列3所示的第1509位至第1528位发生插入或缺失均会导致水稻LOC_Os11g45295基因的编码蛋白的生物学功能被破坏，使得水稻表现出白叶枯病抗性水平提高的性状，有效提高了基于LOC_Os11g45295基因突变的抗病植物的选育效率。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的基于pYLCRISPR/Cas9技术水稻反转座子基因LOC_Os11g45295定点敲除方法的载体活性检测测序峰图。

图2为本发明实施例2提供的水稻日本晴背景下cas9-loc_os11g45295纯合突变植株中LOC_Os11g45295基因核苷酸序列的突变类型，下划线处核苷酸序列为靶序列，黑色框内为缺失的核苷酸序列。

图3为本发明实施例2提供的水稻日本晴背景下cas9-loc_os11g45295纯合突变植株中LOC_Os11g45295基因氨基酸序列的突变类型。

图4为本发明实施例2提供的水稻日本晴背景下cas9-loc_os11g45295纯合突变植株接种白叶枯病菌IV、KS-6-6(C2)和PXO61后病斑长度统计图；***表示P<0.01。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中日本晴(Nipponbare,Oryza satiIVa ssp.japonica)记载过该材料的非专利文献是:Yongqing Jiao，Yonghong Wang，Dawei Xue，Jing Wang，Meixian Yan,Guifu Liu，Guojun Dong，Dali Zeng，Zefu Lu，Xudong Zhu，Qian Qian and JiayangLi.Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture inrice.Nature Genetics，2010,42，541-544；公众可从申请人处获得。

水稻白叶枯病菌菌株KS-6-6：记载在“方中达，许志刚，过崇俭，殷尚智，伍尚忠，徐羡明，章琦.中国水稻白叶枯病菌致病型的研究.植物病理学报，1990，20(2)：81-88”中，公众可以从申请人处获得。

水稻白叶枯病菌菌株IV：记载在“曾列先，黄少华，伍尚忠.IRBB21(Xa21)对广东稻白叶枯病菌5个小种的抗性反应.植物保护学报，2002,29(2):97-100”一文中，经广东省农业科学院曾列先老师同意后，公众可以从申请人处获得。

水稻白叶枯病菌菌株PXO61：记载在“Bing Yang，Frank F.White.DiverseMembers of the AvrBs3/PthA Family of Type III Effectors Are Major VirulenceDeterminants in Bacterial Blight Disease of Rice.Mol Plant Microbe Interact，2004,17(11):1192-200”一文中，经美国密苏里大学哥伦比亚分校植物科学系和唐纳德·丹福斯植物科学中心杨兵老师同意后，公众可以从申请人处获得。

实施例1、基于pYLCRISPR/Cas9系统的水稻反转座子基因LOC_Os11g45295定点敲除方法

一、水稻反转座子基因LOC_Os11g45295的序列分析及靶序列筛选

水稻反转座子基因LOC_Os11g45295的核苷酸序列为序列2所示，其编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1。序列分析显示，该基因共包括4个外显子，分别为序列2第1-26位(第一外显子)、第1308-1642位(第二外显子)、第2610-2709位(第三外显子)、第4359-4737位(第四外显子)。

以水稻反转座子基因LOC_Os11g45295第二外显子上的序列为基于pYLCRISPR/Cas9系统的水稻反转座子基因LOC_Os11g45295定点敲除方法的LOC_Os11g45295-T1和LOC_Os11g45295-T2靶序列。

经大量筛选，确定利用pYLCRISPR/Cas9技术靶向水稻LOC_Os11g45295基因第二外显子正义链的第1390位至第1409位和第1509位至第1528位分别作为靶序列LOC_Os11g45295-T1和LOC_Os11g45295-T2，靶序列如序列3和序列4所示。

pYLCRISPR/Cas9系统载体(包括pYLsgRNA-OsU6a、pYLsgRNA-OsU6b和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H等载体):记载过该材料的非专利文献是“Ma X.,Zhang Q.,Zhu Q.,Liu W.,Chen Y.,Qiu R.,Wang B.,Yang Z.,Li H.,Lin Y.,Xie Y.,Shen R.，Chen S.，Wang Z.，Chen Y.，Guo J.，Chen L.，Zhao X.，Dong Z.，and Liu Y.-G.(2015).A Robust CRISPR/Cas9 System for ConIVenient,High-Effificiency Multiplex Genome Editing inMonocot and Dicot Plants.Mol.Plant.8,1274–1284.”；经华南农业大学生命科学学院亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室刘耀光老师同意后，公众可从申请人处获得该载体。

二、pYLCRISPR/Cas9系统载体引物设计及目的重组表达载体的构建

1、pYLCRISPR/Cas9技术靶序列引物的设计与合成

基于pYLCRISPR/Cas9技术设计靶向LOC_Os11g45295基因的靶序列引物，LOC_Os11g45295-T1靶序列引物LOC_Os11g45295-gRT1和LOC_Os11g45295-U6aT1，其序列分别如序列5和序列6所示；LOC_Os11g45295-T2靶序列引物LOC_Os11g45295-gRT2和LOC_Os11g45295-U6bT2，其序列分别如序列7和序列8所示；

分别合成基于pYLCRISPR/Cas9技术的LOC_Os11g45295-T1和LOC_Os11g45295-T2的相关引物。

序列5：LOC_Os11g45295-gRT1：

5′-TCCGACCTCAAGCCTGTGACgttttagagctagaaat-3′

序列6：LOC_Os11g45295-U6aT1：

5′-GTCACAGGCTTGAGGTCGGAggcagccaagccagca-3′

序列7：LOC_Os11g45295-gRT2：

5′-GCCGGGGATCAACGCGAACCgttttagagctagaaat-3′

序列8：LOC_Os11g45295-U6bT2：

5′-GGTTCGCGTTGATCCCCGGCaacacaagcggcagca-3′。

2、pYLCRISPR/Cas9技术目的重组表达载体的构建

1)单独含LOC_Os11g45295-T1或LOC_Os11g45295-T2的重组表达载体的构建

重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T1为含有U6a-LOC_Os11g45295-sgRNA1和cas9编码基因，U6a-LOC_Os11g45295-sgRNA1具有20个核苷酸组成的靶序列区，靶序列区在LOC_Os11g45295基因上对应的靶序列为序列3所示的LOC_Os11g45295-T1；该重组表达载体的具体构建方法如下：

以pYLsgRNA-OsU6a载体为模板，使用引物UF(5′-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3′)和LOC_Os11g45295-U6aT1(序列6)进行PCR扩增获得正确的核苷酸序列U6aT1，使用引物gR-R(5′-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3′)和LOC_Os11g45295-gRT1(序列5)进行PCR扩增获得正确的核苷酸序列gRT1；使用引物Pps-GGL(5′-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3′)和Pgs-GGR(5′-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC-3′)通过巢式PCR的方式将U6aT1、gRT1连接在一起，并将其命名为U6a-LOC_Os11g45295-sgRNA1；

再用BsaI酶同时对U6a-LOC_Os11g45295-sgRNA1和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体进行酶切，以边酶切边连接的方式获得重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T1。

重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T2含有U6b-LOC_Os11g45295-sgRNA2和cas9编码基因，U6b-LOC_Os11g45295-sgRNA2具有20个核苷酸组成的靶序列区，靶序列区在LOC_Os11g45295基因上对应的靶序列为序列4所示的LOC_Os11g45295-T2；该重组表达载体的具体构建方法如下：

以pYLsgRNA-OsU6b载体为模板，使用引物UF(5′-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3′)和LOC_Os11g45295-U6bT2进行PCR扩增获得正确的核苷酸序列U6bT2，使用引物gR-R(5′-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3′)和LOC_Os11g45295-gRT2进行PCR扩增扩增获得正确的核苷酸序列gRT2；使用引物Pps-GGL(5′-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3′)和Pgs-GGR(5′-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC-3′)通过巢式PCR的方式将U6bT2、gRT2连接在一起，并将其命名为U6b-LOC_Os11g45295-sgRNA2；

再用BsaI酶同时对U6b-LOC_Os11g45295-sgRNA2和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体进行酶切，以边酶切边连接的方式获得重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T2。

2)含LOC_Os11g45295-T1和LOC_Os11g45295-T2的重组表达载体的构建

重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295含有U6a-LOC_Os11g45295-sgRNA-1、U6b-LOC_Os11g45295-sgRNA-2和cas9编码基因，U6a-LOC_Os11g45295-sgRNA-1具有20个核苷酸组成的靶序列区，靶序列区在LOC_Os11g45295基因上对应的靶序列为序列3所示的LOC_Os11g45295-T1；U6b-LOC_Os11g45295-sgRNA-2具有20个核苷酸组成的靶序列区，靶序列区在LOC_Os11g45295基因上对应的靶序列为序列4所示的LOC_Os11g45295-T2；该重组表达载体的具体构建方法如下：1)使用引物Pps-GGL(5′-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3′)和Pgs-GG2(5′-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3)通过巢式PCR的方式将U6aT1、gRT1连接在一起，并将其命名为U6a-LOC_Os11g45295-sgRNA-1；2)使用引物Pps-GG2(5′-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3′)和Pgs-GGR(5′-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC-3′)通过巢式PCR的方式将U6bT2、gRT2连接在一起，并将其命名为U6b-LOC_Os11g45295-sgRNA-2；3)将BsaI酶同时对U6a-LOC_Os11g45295-sgRNA-1、U6b-LOC_Os11g45295-sgRNA-2和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H进行酶切，以边酶切边连接的方式获得载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295。

3、重组表达载体的活性检测

将上述2制备的重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T1和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T2分别通过PEG介导导入(方法参见https://bio-protocol.org/bio101/e1010125)水稻日本晴原生质体，16小时后分别获得瞬时转导pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T1和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T2质粒的原生质体。

分别提取瞬时转导pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T1和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295-T2质粒的原生质体的基因组DNA，用序列表中序列11和序列12扩增LOC_Os11g45295基因的部分核苷酸序列，并进行测序验证。

结果如图1所示，图1为基于pYLCRISPR/Cas9技术水稻反转座子基因LOC_Os11g45295定点敲除方法的载体活性检测测序峰图，可以看出，pYLCRISPR/Cas9技术可在靶序列LOC_Os11g45295-T1和LOC_Os11g45295-T2处诱导LOC_Os11g45295基因的突变。

4、重组根癌农杆菌的获得

将上述2获得的重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295热激转化农杆菌EH105，获得含有重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295的重组农杆菌，命名为EH105-Cas9-LOC_Os11g45295。

根癌农杆菌EHA105：BioIVector NTCC典型培养物保藏中心，可市售购得。

实施例2、基于pYLCRISPR/Cas9技术定点敲除方法在水稻品种的应用

一、pYLCRISPR/Cas9技术定点敲除LOC_Os11g45295基因

将重组农杆菌EH105-Cas9-LOC_Os11g45295侵染水稻品种日本晴(以下简称为野生型水稻)成熟胚诱导的愈伤组织，将获得的水稻转化植株分别命名为NIP-Cas9-LOC_Os11g45295；实验具体方法如下：

1、将实施例1获得的重组农杆菌接种于YEB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和20μg/ml利福平)中，28℃、200rpm条件下振荡培养至OD600为0.6-0.8；以5000rpm、4℃离心5min，用AAM液体培养基(乙酰丁香酮浓度为200μM/L，pH 5.2)重悬菌体沉淀浓度至OD600为0.6-0.8。

2、分别将水稻品种日本晴的成熟种子除去颖壳，在75％乙醇中浸泡1min，然后在NaClO溶液中(与水1:2混合，加1滴吐温20)振荡消毒20min，重复2次。经无菌水冲洗数次至无异味，将消毒后的水稻日本晴种子接种于NBD2培养基上诱导愈伤组织，26℃黑暗培养8-10天，切除根和残留胚乳，继代培养10天，获得成熟胚愈伤组织。

3、将步骤2获得的成熟胚愈伤组织分别浸于步骤1获得的重组农杆菌重悬液中，20-30min后移出水稻材料，接种于含有两层滤纸的共培养培养基(乙酰丁香酮浓度为100μM/L，pH 5.2)上，26℃黑暗条件下共培养3天。

4、将经过步骤3共培养的愈伤组织接种于筛选培养基(潮霉素浓度为50mg/L，pH5.8)中，28℃黑暗条件下筛选培养12天，转移抗性愈伤组织至含有50mg/L Hyg的选择培养基上继续筛选。

5、重复筛选2次后，转移抗性愈伤组织至分化培养基上(24小时光照/天)诱导分化；待新的无根幼苗生成，转移再生幼苗至1/2MS培养基上诱导生根；待小苗茁壮后移入人工气候室进行营养液栽培，得到再生植株NIP-Cas9-LOC_Os11g45295。

6、获得的再生植株移栽成活后，提取再生植株的叶片总DNA，基于重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295的自身引物序列9、序列10所示序列进行PCR扩增筛选阳性转化植株，扩增出1225bp条带大小的转化植株即为阳性转化植株。

统计检测的再生植株数、阳性转化植株数及阳性转化植株数占检测的再生植株数的百分比即阳性率(％)，结果如表1所示。

表1为pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC Os11g45295转化水稻品种的阳性率检测结果

再生植株	再生植株数	阳性转化植株数	阳性率(％)
				NIP-Cas9-LOC_Os11g45295	68	53	77.9

7、以阳性转化植株数的基因组为模板，用水稻反转座子基因LOC_Os11g45295特异性引物LOC_Os11g45295-TF如序列11所示序列和LOC_Os11g45295-TF如序列12所示序列(扩增基因LOC_Os11g45295中含有2个靶序列的片段)进行PCR扩增。以日本晴为对照。

将所获得998bp的扩增产物进行测序验证，与日本晴相比，扩增产物有突变的记作发生突变转化植株数；测序验证结果如表2所示。统计检测的再生植株数、发生突变转化植株数及发生突变转化植株数占检测的再生植株数的百分比即突变效率(％)，结果如表2所示。

表2.pYLCRISPR/Cas9Pubi-H-LOC_Os11g45295诱导水稻反转座子基因LOC_Os11g45295发生突变的检测结果

二、pYLCRISPR/Cas9技术定点敲除LOC_Os11g45295基因突变转化植株的表型

收集上述一获得的53株发生突变转化植株的种子，播种后，获得T1代植株。

提取220个T1代植株的基因组DNA，用序列11所示引物和序列12所示的引物进行扩增，得到PCR产物，送去测序，选取纯合突变株，获得9种纯合突变类型，每个突变类型2株。

LOC_Os11g45295基因纯合突变体中某种突变形式如下：两靶序列LOC_Os11g45295-T1和LOC_Os11g45295-T2均发生突变且缺失119bp核苷酸，该种LOC_Os11g45295基因纯合突变体的核苷酸序列如图2所示，该种LOC_Os11g45295基因纯合突变体的氨基酸序列如图3所示；将具有该突变形式的LOC_Os11g45295基因纯合突变体命名为T1代LOC_Os11g45295-D119缺失植株。

将T1代LOC_Os11g45295-D119缺失植株(cas9-loc_os11g45295)接种白叶枯病菌IV、KS-6-6(C2)、PXO61。以野生型日本晴为对照。每个株系接种15株；实验重复3次，结果取平均值。

接种白叶枯病菌IV、KS-6-6(C2)、PXO61 14天后，观察叶片表型。

统计接菌叶片病斑长度，结果如图4所示，与野生型(条形图横坐标中的日本晴)相比，cas9-loc_os11g45295突变体(条形图横坐标中的cas9-loc_os11g45295)均表现出白叶枯病斑变短的表型，接种白叶枯病菌IV叶片病斑长度缩短63.1％，接种白叶枯病菌KS-6-6叶片病斑长度缩短41.4％，接种白叶枯病菌PXO61叶片病斑长度缩短35％。

其他纯合突变类型也进行上述白叶枯病抗病性检测，发现也具有白叶枯病抗性。

上述结果说明利用CRISPR/Cas9技术创制的cas9-loc_os11g45295突变体增强了水稻对白叶枯病菌IV、KS-6-6、PXO61的抗病性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>水稻反转座子基因LOC_Os11g45295及其编码蛋白与应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 279

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Ala Ser Tyr Pro Val Phe Gln Val Ser Pro Glu Glu Ala Ala Lys

1 5 10 15

Gly Lys Trp Tyr Met Ala Thr Ala Ala Thr Asn His Met Thr Arg Asp

20 25 30

Gln Ser Leu Ile Ser Asp Leu Lys Pro Val Thr Gly Arg Val Val Ser

35 40 45

Arg Gly Asn Gly Ala Gly Leu Lys Val His Gly Ser Gly Ala Val Asn

50 55 60

Thr Glu Thr Val Ala Ile Pro Asp Val Trp His Val Pro Gly Ile Asn

65 70 75 80

Ala Asn Leu Val Ser Val Pro Gln Leu Ser Leu Leu Gly Leu Asn Ile

85 90 95

Ser Phe Asp Arg Gly Gly Cys Thr Val Thr Arg Ala Ser Asp Gly Ser

100 105 110

Val Val Gly Lys Ala Arg Arg Ser Ala Leu Ser Leu Ile Phe Ser Arg

115 120 125

Ser Ser Arg Pro Arg Arg Leu Gly Leu Ala Thr Ala Ala Asp Ser Ser

130 135 140

Glu Met Ala Ser Tyr Pro Ala Phe Gln Val Ser Pro Glu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Lys Gly Lys Trp Tyr Ile Ala Thr Ala Ala Thr Asn His Met Thr Arg

165 170 175

Asp Gln Ser Val Ile Ser Asn Leu Lys Pro Val Thr Gly Arg Val Val

180 185 190

Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Leu Gln Val His Gly Ser Gly Ala Val

195 200 205

Asn Thr Glu Thr Val Ala Ile Pro Asp Val Trp Tyr Val Pro Gly Ile

210 215 220

Asn Cys Asn Leu Val Ser Val Gly Gln Leu Cys Gln Leu Gly Leu Glu

225 230 235 240

Val Ser Ile Phe Arg Gly Val Cys Thr Val Thr Arg Ala Ser Asp Gly

245 250 255

Ser Val Val Gly Lys Ala His Arg Ser Gly Ala Val Tyr Glu Val Glu

260 265 270

Phe Leu Lys Val Pro Leu Asn

275

<210> 2

<211> 4737

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atggcctcct acccggtgtt ccaagtgtaa tgtgccgtct ttcccctccc atctcctccc 60

cctgcacacg tgctctgtac atatgggttt gattccttgt cgcgcgtgcg tcgtttcttt 120

ggatcgatct ggaggacccc atcctttttt tggtgggttg tgctttgttt caagtcttcc 180

atgttcagat ttcatttgtt ggaagatgtt gtgcaagatg gaggaatgct ttgggatttg 240

atgatttctt gggaatacct actactttgt ttgtttcccc ttttatattc tagtgggttt 300

taggtttaag aatttgtagg tttggacatg gtcttacatg attaaaatat gggtaaagta 360

gcatggaagc atttggtata cctttggtgt ggcattgcat tctttatagt ggcacttcta 420

aagtttcaat tttttttttt gggggggggg gggtgattgt tgtagcaaag ccctagattt 480

gtgagatttt taggggtttt atgccacgaa tttgtagatc tgatcattac ccagaaccac 540

gaagccctag atttgtgtgt attgaatggt ctttacttat aaacttgcag atctggacat 600

gaacaggaat aatgaatttg ggaaaagtat tgcatttttg cctatttcta tggtagcttg 660

aatggcagtg tattccttgc tgtggcataa atccatccat aaccctagtt tcaagtgttg 720

tattttcagg gtagcatgaa ttgcagtaca ttctttgttg tatcaaattg tacgaatgct 780

cagaacctag tttctgagat ttagtggggt ttatgccaag aatttgtagt tctggatgcg 840

aaaaatctga ttctgatggt tgcgatctaa tctaagctag ccttcatcat tcatagattt 900

cttgcgctgc attcgctcct agatttgtgg gattttaatg ggtttttagt taataatttc 960

gaaattgaga catgaacatg attgaaaatt aggtaaagta gcaagtgatg tgcttttagg 1020

gtagcatcaa tggtgtacat tctttgcaat ttcatttttt aaatcttggg agagaataaa 1080

gccacccata agcctagatt tatgagactg caatggcgtt tatgtcaaga atctgtagat 1140

taagaagtga aaatctgatg ctaatgtttt gccaacagtc taaatttcct tcagtgatta 1200

acgattattg tttttgtgca ctaatgtagc tagcctgtac cttcttgatt gacattcatt 1260

cctgaatcaa gtcctaacct gctactgttg cttgttacta tctccagaag cccagaggaa 1320

gcagcgaagg gtaaatggta catggcaact gctgctacca accacatgac tcgcgaccag 1380

agcctcatct ccgacctcaa gcctgtgacc ggccgtgtcg ttagccgtgg caatggcgca 1440

gggttgaagg tgcatggcag tggagctgtg aacacagaga cggtggcgat cccagacgtg 1500

tggcatgtgc cggggatcaa cgcgaacctg gtttctgttc cccagctctc tctacttggg 1560

ctcaacattt cgttcgaccg tggtggctgc actgtcacta gagctagtga tggatctgta 1620

gttggcaaag cgcgtagatc aggtgcgatc tatgaggtgg aattcctcaa agttccgctt 1680

aattagcacc agaaattcct cgctgcagta tcagttgtgg tagtcagact catatggtgg 1740

ctaatatcgc gtactgtttc caatgcttgt tgggttagaa cttaagtggg atctttcagt 1800

tgttagttaa ggatctggag gtttttctga atgtaaaaag tgaaagaagg atgatgttgg 1860

ttatgtcgct ggctatgagc agaactgatg agtttaccat gttggattga ccttgtcttt 1920

taccactgtt gttaagttcc tgtagcccgt tgggctgttc atatccatcg acttgcaatt 1980

gttattccag tttcagtctt cctgcatcgc tgaattatgt ctgattatct ttgcaagatt 2040

ctcttccgtc gaccaaatct ccattcatgt tgcatggtag tatggtacat gatagagttc 2100

catcggtagt cctaaaatga ataagctaaa gccaaaattt aaattttaaa atttaatttt 2160

gaagttggat ttaaggtatt tttaacataa tttttttagc tttggctttt aagttgctaa 2220

gattatttat acatataagt tttagatgca aaattacctt tttttttatc tctaataaac 2280

tgtcactcct gtctcaattc tccacgtttg gggtaaaaat gggacgtgta tttttcgtcc 2340

gtccacctat atcaattatt caattcatgg caaaatttgg tcagaggaaa acactaatta 2400

ctcccaaaaa taaaaggaat aataattgcc cttcaaaagt tactccgtaa tactggagta 2460

atagcaataa taacccttca aaaaaattaa taatagcaat aatactccct atgccaaccg 2520

gggcccacca ggaggagtcc acgaaccacg atacataggg acccgataca tatgtgtgtt 2580

gcggtgtgaa ccagcttgtg tgcgcgtagc actttctctc atcttctccc ggagctcacg 2640

ccctcgccgc ctcggcctcg ccaccgccgc cgactcgtcg gagatggcct cctacccggc 2700

gttccaagtg taatgtgccc tctctcctcc ccctcctcct cctagctcaa cccctgaaca 2760

cgtgctctgt acatatgagc ttgattcttt atcgcgtcgt tttctttgat cgatctggac 2820

ccatctttgt ttggtggatt gtgctctggt ttcatgttca atttcatttc ttggaagatg 2880

ctgtgcaaga tggaggaatg gtttgggatt tgaggatttc ttgggaacac ctccctactt 2940

tgtttatttc cccttcatat tataatgggt tttaggttta agaattttta gatctggaca 3000

tgatcttata tgattaaaat atgggcaaat agcacagaag catttggtgc atctttgttg 3060

tggcacatga ggcattgcat tatttgtagt agcactttca aggtttcaat ttttaggggt 3120

aactacacca ttaaaaccct agatttgtga tattttaagg cgttttatgc cacgaatttg 3180

tagatctgat catttacaca aaaccacata accctagatc tgtgagtctt attgggtttt 3240

agtttgttgt ggcacatgag gcattgcatt atttgtagta gcactttcaa ggtttcaatt 3300

tttaggggta actacaccat taaaacccta gatttgtgat attttaaggc gttttatgcc 3360

acgaatttgt agatctgatc atttacacaa aaccacataa ccctagattt gtgagtctta 3420

ttgggtttta gtttgttgtg gcacatgagg cattgcatta tttgtaatag cactttcaag 3480

gtttcaattt ttaggggtaa ctacaccatt aaaaccctag atttgtgata ttttaaggcg 3540

ttttatgcca cgaatttgta gatctgatca tttacacaaa accacataac cctagatctg 3600

tgagtcttat tgggttttag ttaataattt gaacatctgg atatgaacag caataattaa 3660

aatttgggca aagtagaaag tgttgtactt tgcctatttt tagggtagct tgaatggcag 3720

cacattcctt tggtgttgca taaacccaac caaaaccata gattgctgat actctaatgg 3780

ggttcacatc aagagttttt agatctggat gtgaaaaatc tgatgctaat gttttgccaa 3840

cacccctgac cgtttgacac taaaatttct tcagtggtta ccgttcttct gaaataatct 3900

agctagcatg tgccattctt agattgctta cactgcattt gcttgtagat ttgtcggatt 3960

ctgatgagct atggttaata atttctgaat ctgtacatga acatgaaggg ttgaaattta 4020

tgtaaagtag caagggatgt attttttggg cagcatcaat ggtggtacat tctttgcggt 4080

agaatttatc aaaacgtcaa ctcttaggag tgcataaagc cacccaaaag cctatatttc 4140

tgacgctgta atggtgttta tgtcaacaat ttgttgatta agaagtgaaa tctgatgcta 4200

atgttttgcc aacagtctac cgattgacac taaattcctt cagcgattaa cgatcattgt 4260

tttgcaaact aatgtagcta aaccttgtac cttcttcatt ggcattcact cctaaatcaa 4320

gtcctaacct gctactgttg ctttgctact atctccagaa gcccggagga agcagcgaag 4380

ggtaaatggt acattgcgac tgctgctacc aaccacatga cccgcgacca gagcgtcatc 4440

tccaacctca agcccgtgac tggccgtgtc gttggtggtg gcaacggctc aggattgcaa 4500

gtgcatggca gtggagctgt gaacacagag acggtggcga tcccagacgt gtggtatgtg 4560

ccggggatca attgcaactt ggtttctgtt ggccagctct gtcaactcgg gcttgaagtt 4620

tcgattttcc gaggtgtctg caccgtcact agagctagtg atggatccgt agttggcaaa 4680

gcgcatagat caggtgcagt ctatgaggtg gaattcctca aagttccgct taattag 4737

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tccgacctca agcctgtgac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gccggggatc aacgcgaacc 20

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

tccgacctca agcctgtgac gttttagagc tagaaat 37

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gtcacaggct tgaggtcgga ggcagccaag ccagca 36

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

gccggggatc aacgcgaacc gttttagagc tagaaat 37

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

ggttcgcgtt gatccccggc aacacaagcg gcagca 36

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

gcggtgtcat ctatgttact ag 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

ccgacataga tgcaataact tc 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

tggcagtgta ttccttgctg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

ccacctcata gatcgcacct 20

Claims

1.抑制或降低植物中LOC_Os11g45295蛋白编码核酸表达的物质在提高水稻抗白叶枯病性或改良水稻抗白叶枯病性中的应用：

所述LOC_Os11g45295蛋白为如下（a1）-（a2）中任一种：

（a1）序列表中序列1所示的蛋白质；

（a2）在（a1）所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

所述抑制或降低植物中LOC_Os11g45295蛋白编码核酸表达的物质为如下：

1）干扰RNA；

2）CRISPR/Cas9系统；

所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶序列为所述LOC_Os11g45295蛋白的编码核酸中的XXXNGG形式的核苷酸序列，其中，XXX为所述LOC_Os11g45295蛋白的编码核酸中任意19-20bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述LOC_Os11g45295蛋白编码核酸为编码区为序列表中序列2所示的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述sgRNA为sgRNA1和/或sgRNA2；

所述sgRNA1的靶序列为序列3；所述sgRNA2的靶序列为序列4。

4.一种提高植物抗病性的方法，为如下1）-2）中任一种方法，实现提高植物抗病性；

1）包括如下步骤：抑制或降低目的植物中LOC_Os11g45295蛋白编码核酸表达；

2）包括如下步骤：对目的植物中LOC_Os11g45295蛋白编码核酸进行基因编辑；

或，一种制备高抗病性的转基因植物的方法，为如下1）-2）中任一种方法，

1）包括如下步骤：抑制或降低目的植物中LOC_Os11g45295蛋白编码核酸表达，得到转基因植物；

2）包括如下步骤：对目的植物中LOC_Os11g45295蛋白编码核酸进行基因编辑，得到转基因植物；

所述转基因植物中的抗白叶枯病性高于所述目的植物；

所述LOC_Os11g45295蛋白为如下（a1）-（a2）中任一种：

（a1）序列表中序列1所示的蛋白质；

所述抑制或降低植物中LOC_Os11g45295蛋白编码核酸表达是通过对LOC_Os11g45295蛋白编码核酸借助CRISPR/Cas9系统实现；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述sgRNA为sgRNA1和/或sgRNA2；

所述sgRNA1的靶序列为序列3；所述sgRNA2的靶序列为序列4。