CN110699369B

CN110699369B - 水稻受体激酶基因OsRLCK21及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN110699369B
Application number: CN201910994534.3A
Authority: CN
Inventors: 周永力; 李全林; 史晓荣
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2039-10-18
Also published as: CN110699369A

Abstract

本发明涉及水稻受体激酶基因OsRLCK21及其编码的蛋白和应用。所述水稻受体激酶基因OsRLCK21核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过CRISPR/Cpf1技术定点敲除水稻中的OsRLCK21基因进行该基因的功能研究，结果显示敲除了OsRLCK21基因的水稻对白叶枯病菌IV、GD1358的抗病性显著提升，IV病斑长度缩短26.4％～48.8％，C5病斑长度缩短43％～52.3％，并且在SEQ ID NO.2所示序列的第503位至第508位发生插入或缺失均会导致水稻基因突变，表现出白叶枯病抗性水平提高的性状。

Description

水稻受体激酶基因OsRLCK21及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及水稻受体激酶基因OsRLCK21及其编码的蛋白和应用。

背景技术

由黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起的白叶枯病是制约水稻生产的一种重要细菌性病害，一般可致水稻减产20％-30％左右，严重可达50％，对于水稻种植产业危害严重。利用抗性基因，培育抗病品种是防治水稻白叶枯病最经济有效的措施。然而，目前已报道的42个水稻白叶枯病抗性基因/位点(http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/gene/list)大部分表现出抗谱较窄或者难以利用，仅Xa3、Xa4、Xa21和Xa23等基因在生产中得以广泛应用。

水稻与黄单胞杆菌水稻致病变种存在特异性的互作。黄单胞杆菌水稻致病变种易于变异，导致水稻品种抗性极易丧失。因此，鉴定并敲除白叶枯病易感性基因提高水稻品种的抗病性，对于水稻抗病育种具有重要的应用价值。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供水稻受体激酶基因OsRLCK21及其编码的蛋白和应用。

第一方面，本发明提供水稻受体激酶基因OsRLCK21，所述水稻受体激酶基因OsRLCK21核苷酸序列为：

i)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明通过对1440份国内外水稻材料接种白叶枯病菌IV和GD1358后病斑长度的全基因组关联分析(Genome-wide associated study,GWAS)鉴定到抗性相关候选基因OsRLCK21(LOC_Os01g04490)，其参与水稻受体类胞质激酶RLCK21的生物合成。本发明通过对CRISPR/Cpf1技术制备的敲除了该基因的日本晴的抗性评价，发现该基因的突变可以提高水稻对白叶枯病的抗性。

本发明提供上述水稻受体激酶基因OsRLCK21编码的蛋白，针对于核苷酸序列i)，其编码而成的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供用于扩增出上述基因的引物对，序列如下：

RLCK21-T1F：5′-AGATTGCTCCTTCTCTGCCACCACGCG-3′

RLCK21-T1R：5′-AAAACGCGTGGTGGCAGAGAAGGAGCA-3′。

本发明进一步提供含有水稻受体激酶基因OsRLCK21的生物材料，可以为表达盒、载体、工程菌或转基因细胞。

第二方面，本发明提供一种定点敲除方法，包括如下步骤：

使用基因编辑技术破坏水稻中OsRLCK21基因的生物学功能，优选地，使水稻基因中如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列中TTTNXXX形式的核苷酸序列发生插入或缺失；其中，XXX为22-24bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基。

更优选地，使水稻基因中SEQ ID NO.2所示序列第503位至第508位发生插入或缺失。

实际上，使用任何生物技术破坏水稻OsRLCK21基因的生物学功能均能达到增强水稻品种的白叶枯病抗性，优选地本发明利用CRISPR/Cpf1系统靶向编辑的TTTNXXX形式及在远离TTTN的18-23bp处切割产生5nt粘性末端的技术特征，从而造成该基因编码蛋白的翻译提前终止或蛋白构象改变，进而破坏该基因编码蛋白的生物学功能，本发明选用具有代表性的SEQ ID NO.2的第486位至第508位作为突变的位置，验证得到TTTNXXX形式(XXX为22-24bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基)的序列发生插入或缺失均可以导致植物突变并且表现出白枯病抗性提高的性状。

进一步地，方法具体为：

a)构建含有靶序列RLCK21-T1的Lb-RLCK21-1质粒；

b)将Lb-RLCK21-1质粒转入水稻中；

其中，所述靶序列RLCK21-T1为位于SEQ ID NO.2的第486位至第508位的核苷酸序列；所述Lb-RLCK21-1质粒含有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

进一步地，步骤b)具体为将含Lb-RLCK21-1质粒的根癌农杆菌转入水稻品种中。

本发明基于CRISPR/Cpf1技术的水稻受体类胞质激酶RLCK21定点敲除方法。具体为利用基于Lb-CRISPR/Cpf1技术的Lb-RLCK21-1载体对水稻受体类胞质激酶RLCK21实现定向基因编辑。

实验证明，单独使用Lb-RLCK21-1导入所述水稻中获得的OsRLCK21基因突变植株的突变率100％；同时在水稻中定点敲除诱导产生的纯合突变转化植株表现出白叶枯病抗性水平提高的特征。

进一步地，所述CRISPR/Cpf1为II类V型CRISPR/Cas载体系统；

所述CRISPR/Cpf1载体系统基于pCAMBIA1300为骨架载体的Lb-CRISPR/Cpf1构建而来；

所述CRISPR/Cpf1载体系统采用的靶序列为OsRLCK21基因序列中任一包括TTTNXXX的核酸序列；其中，XXX为22-24bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基。

进一步地，所述水稻为日本晴或OsRLCK21等位基因与日本晴相同的其它水稻品种。

本发明提供上述水稻受体激酶基因OsRLCK21或其编码的蛋白或生物材料或定点敲除方法在制备水稻白叶枯抗病材料中的应用。

进一步地，所述应用具体为：

在定点敲除水稻中OsRLCK21基因后进行筛选和鉴定，获得水稻白叶枯抗病材料。

优选地，筛选方法为通过CRISPR/Cpf1系统载体自身的引物和所述RLCK21-T1靶序列引物的聚合酶链式反应扩增，若是扩增出287bp的目的条带，则表明植株已成功转化Lb-RLCK21-1质粒。

优选地，鉴定方法为通过使用OsRLCK21基因的特异性引物扩增OsRLCK21基因的基因组片段，若无特异性条带则说明植株OsRLCK21基因表达受到抑制。

本发明提供上述水稻受体激酶基因OsRLCK21或其编码的蛋白或生物材料或定点敲除方法在提高水稻白枯病抗性方面的应用。

本发明提供上述水稻受体激酶基因OsRLCK21或其编码的蛋白或生物材料或定点敲除方法在减少水稻白枯病病斑长度方面的应用。

本发明提供了一种水稻受体激酶基因OsRLCK21及其编码的蛋白和应用，具有如下有益效果：

(1)本发明利用OsRLCK21基因及其编码的蛋白参与调控水稻对白叶枯病菌免疫响应的特点，采用CRISPR/Cpf1技术的基因组靶向修饰OsRLCK21基因，定点敲除该基因后，水稻白枯病IV病斑长度缩短26.4％～48.8％，C5病斑长度缩短43％～52.3％，通过突变OsRLCK21基因的核苷酸序列制备水稻抗白叶枯病材料，在农业生产上具有十分重要的应用价值。

(2)使水稻基因中如SEQ ID NO.2所示序列使水稻基因中TTTNXXX形式的核苷酸序列发生插入或缺失均会使水稻发生突变，表现出白叶枯病抗性提升的性状；其中，XXX为22-24bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基。

(3)本发明为创造基于水稻受体激酶基因OsRLCK21及其编码的蛋白的白叶枯抗病材料提供一种高效的育种方式。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的基于CRISPR/Cpf1技术水稻受体激酶基因OsRLCK21定点敲除方法的载体活性检测测序峰图；

图2为本发明实施例2提供的水稻日本晴背景下Cpf1-rlck21纯合突变植株中OsRLCK21基因核苷酸序列的四种突变类型；

图3为本发明实施例2提供的水稻日本晴背景下Cpf1-rlck21纯合突变植株中OsRLCK21基因编码的氨基酸序列的四种突变类型；

图4本发明实施例2提供的水稻日本晴背景下Cpf1-rlck21纯合突变植株Cpf1-rlck21-1、Cpf1-rlck21-2、Cpf1-rlck21-3和Cpf1-rlck21-4接种白叶枯病菌IV后病斑表型及长度统计图，其中，A图为四种Cpf1-rlck21纯合突变植株接种白叶枯病菌IV后病斑表型，B图为四种Cpf1-rlck21纯合突变植株接种白叶枯病菌IV后的病斑长度对比图；

图5为本发明实施例2提供的水稻日本晴背景下Cpf1-rlck21纯合突变植株Cpf1-rlck21-1、Cpf1-rlck21-2、Cpf1-rlck21-3和Cpf1-rlck21-4接种白叶枯病菌GD1358后病斑表型及长度统计图，其中A图为四种Cpf1-rlck21纯合突变植株接种白叶枯病菌GD1358后病斑表型；B图为四种Cpf1-rlck21纯合突变植株接种白叶枯病菌GD1358后的对比图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、基于Lb-CRISPR/Cpf1系统的水稻受体激酶基因OsRLCK21定点敲除方法

1、水稻受体激酶基因OsRLCK21的序列及分析

水稻受体激酶基因OsRLCK21的序列SEQ ID No.2所示。序列分析显示，该基因共包括5个外显子，分别为SEQ ID No.2序列的第1-3位(第一外显子)、第469-1154位(第二外显子)、第2773-2808位(第三外显子)、第3360-3688位(第四外显子)、第3752-4429位(第五外显子)。

本发明以水稻受体激酶基因OsRLCK21第二外显子上的序列为基于CRISPR/Cpf1技术的水稻受体激酶基因OsRLCK21定点敲除方法的RLCK21-T1靶序列。

2、Lb-CRISPR/Cpf1载体引物设计及其重组表达载体的构建

2.1 Lb-CRISPR/Cpf1技术靶序列的选择

Lb-CRISPR/Cpf1技术靶向水稻OsRLCK21基因的第二外显子的正义链，RLCK21-T1靶序列如SEQ ID No.3序列所示。

2.2 Lb-CRISPR/Cpf1技术靶序列引物的设计与合成

基于Lb-CRISPR/Cpf1技术设计靶向OsRLCK21基因的靶序列引物，RLCK21-T1靶序列引物RLCK21-T1F和RLCK21-T1R序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；

分别合成基于Lb-CRISPR/Cpf1技术的RLCK21-T1靶序列引物RLCK21-T1F和RLCK21-T1R。

RLCK21-T1F：5′-AGATTGCTCCTTCTCTGCCACCACGCG-3′

RLCK21-T1R：5′-AAAACGCGTGGTGGCAGAGAAGGAGCA-3′。

2.3 Lb-CRISPR/Cpf1技术重组表达载体的构建

将RLCK21-T1靶序列引物RLCK21-T1F和RLCK21-T1R通过引物退火方法合成双链靶序列，并通过BsaI-HF酶切、连接方法插入到Lb-CRISPR/Cpf1载体的水稻U6启动子下游，获得Lb-RLCK21-1重组表达载体；经测序证实，Lb-RLCK21-1重组表达载体的水稻U6启动子下游插入如SEQ ID No.3所示序列。

Lb-CRISPR/Cpf1载体:记载过该材料的非专利文献是“Mugui Wang,Yanfei Mao,Yuming Lu,Xiaoping Tao and Jian-kang Zhu.Multiplex Gene Editing in Rice Usingthe CRISPR-Cpf1 System.Molecular Plant,2017,10,1011–1013”。经中国科学院上海植物逆境生物学研究中心朱健康老师同意后，公众可从申请人处获得该载体。

3、Lb-RLCK21-1重组表达载体的活性检测

将2.3中的重组表达载体Lb-RLCK21-1通过PEG介导导入水稻原生质体，获得重组表达载体Lb-RLCK21-1的瞬时表达结果；经测序验证得到图1所示结果，图1为基于CRISPR/Cpf1技术水稻受体激酶基因OsRLCK21定点敲除方法的载体活性检测测序峰图。

4、重组根癌农杆菌的获得

将2.3中重组表达载体Lb-RLCK21-1热激转化农杆菌EH105，获得含有重组表达载体Lb-RLCK21-1的重组农杆菌，命名为EH105-Lb-RLCK21-1。

根癌农杆菌EHA105：BioVector NTCC典型培养物保藏中心，可市售购得。

实施例2、基于Lb-CRISPR/Cpf1技术定点敲除方法在水稻品种的应用

将重组农杆菌EH105-Lb-RLCK21-1侵染水稻品种日本晴成熟胚诱导的愈伤组织，将获得的水稻转化植株分别命名为NIP-Lb-RLCK21-1；实验具体方法如下：

1、将实施例1获得的重组农杆菌接种于YEB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和20μg/ml利福平)中，28℃、200rpm条件下振荡培养至OD600为0.6-0.8；以5000rpm、4℃离心5min，用AAM液体培养基(乙酰丁香酮浓度为200μM/L，pH 5.2)重悬菌体沉淀浓度至OD600为0.6-0.8。

2、分别将水稻品种日本晴的成熟种子除去颖壳，在75％乙醇中浸泡1min，然后在NaClO溶液中(与水1:2混合，加1滴吐温20)振荡消毒20min，重复2次。经无菌水冲洗数次至无异味，将消毒后的水稻日本晴种子接种于NBD2培养基上诱导愈伤组织，26℃黑暗培养8-10天，切除根和残留胚乳，继代培养10天，获得成熟胚愈伤组织。

3、将步骤2获得的成熟胚愈伤组织分别浸于步骤1获得的重组农杆菌重悬液中，20-30min后移出水稻材料，接种于含有两层滤纸的共培养培养基(乙酰丁香酮浓度为100μM/L，pH 5.2)上，26℃黑暗条件下共培养2天。

4、将经过步骤3共培养的愈伤组织接种于筛选培养基(潮霉素浓度为50mg/L，pH5.8)中，28℃黑暗条件下筛选培养12天，转移抗性愈伤组织至含有50mg/L Hyg的选择培养基上继续筛选。

5、重复筛选2次后，转移抗性愈伤组织至分化培养基上(24小时光照/天)诱导分化；待新的无根幼苗生成，转移再生幼苗至1/2MS培养基上诱导生根；待小苗茁壮后移入人工气候室进行营养液栽培。

6、获得的再生植株移栽成活后，提取再生植株的叶片总DNA，分别以基于重组表达载体Lb-RLCK21-1的自身引物SEQ ID No.6所示序列和Lb-RLCK21-T1R靶序列引物如SEQ IDNo.5所示序列进行PCR扩增筛选阳性转化植株。统计检测的再生植株数、阳性转化植株数及阳性转化植株数占检测的再生植株数的百分比即突变效率(％)，结果如表1所示。

表1.Lb-RLCK21-1转化水稻品种的阳性率检测结果

再生植株	再生植株数	阳性转化植株数	阳性率(％)
				NIP-Lb-RLCK21-1	25	25	100.0

7、以水稻受体激酶基因OsRLCK21的基因组为模板，用水稻受体激酶基因OsRLCK21特异性引物RLCK21-F如SEQ ID No.7所示序列和RLCK21-R如SEQ ID No.8所示序列进行PCR扩增，将所获得932bp扩增产物进行测序验证。测序验证结果如表2所示。统计检测的再生植株数、发生突变转化植株数及发生突变转化植株数占检测的再生植株数的百分比即突变效率(％)，结果如表2所示。

表2.Lb-RLCK21-1诱导水稻受体激酶基因OsRLCK21发生突变的检测结果

再生植株	再生植株数	发生突变转化植株数	突变效率(％)
				NIP-Lb-RLCK21-1	25	25	100.0

8、收集水稻品种日本晴中杂合突变植株的种子，以自主分离的方式筛选纯合突变植株，筛选后得到4种不同纯合突变类型，其核苷酸序列如图2所示，氨基酸序列如图3所示。

对上述4种不同纯合突变类型接种白叶枯病菌IV、GD1358得到如图4和图5所示的结果，结果显示，与野生型(条形图横坐标中的WT)相比，4种Cpf1-rlck21突变体(条形图横坐标中的Cpf1-rlck21-1、Cpf1-rlck21-2、Cpf1-rlck21-3和Cpf1-rlck21-4)均表现出白叶枯病斑变短的表型，IV病斑长度缩短26.4％～48.8％，C5病斑长度缩短43％～52.3％，这说明利用CRISPR/Cpf1技术创制的Cpf1-rlck21突变体增强了水稻对白叶枯病菌IV、GD1358的抗病性。

日本晴(Nipponbare,Oryza sativa ssp.japonica:记载过该材料的非专利文献是Yongqing Jiao，Yonghong Wang，Dawei Xue，Jing Wang，Meixian Yan,Guifu Liu，Guojun Dong，Dali Zeng，Zefu Lu，Xudong Zhu，Qian Qian and Jiayang Li.Regulationof OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice.NatureGenetics，2010,42，541-544。公众可从中国农业科学作物科学研究所获得。

水稻白叶枯病菌菌株IV：记载在“曾列先，黄少华，伍尚忠.IRBB21(Xa21)对广东稻白叶枯病菌5个小种的抗性反应.植物保护学报，2002,29(2):97-100”一文中，经广东省农业科学院曾列先老师同意后，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

水稻白叶枯病菌菌株GD1358：记载在“方中达，许志刚，过崇俭，殷尚智，伍尚忠，徐羡明，章琦.中国水稻白叶枯病菌致病型的研究.植物病理学报，1990，20(2)：81-88”一文中，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 水稻受体激酶基因OsRLCK21及其编码的蛋白和应用

<130> KHP191115038.9

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 577

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Val Leu Ala Ser Phe Leu Leu Leu Leu Cys His His Ala His

1 5 10 15

Ala Asp Cys Glu Pro Ala Thr Cys Gly Asn Leu Thr Ile Asn Pro Pro

20 25 30

Phe Trp Leu Asp Glu Pro Gly Arg Pro Pro Cys Gly Pro Pro Thr Phe

35 40 45

Gln Leu Gln Cys Arg Gly Ser Glu Ala Phe Val Ala His Ser Phe Phe

50 55 60

Gln Thr Tyr Gln Val Val Arg Ile Phe Thr Gly Asn Ser Ser Val Val

65 70 75 80

Val Val Asp Arg Ser Leu Pro Leu Glu Ser Gly Cys Pro Val Pro Trp

85 90 95

Phe Asn Ile Ser Ile Gly Phe Val Met Gly Pro Phe Leu Ile Ser Arg

100 105 110

Ala Asn Lys Glu Leu Val Phe Val His Asn Cys Thr Thr Thr Lys Arg

115 120 125

Arg Pro Pro Gln Gly Phe Arg Arg Met Pro Cys Ser Pro Asp Glu Ser

130 135 140

Phe Val Phe Leu Gly Asp Gly Arg Pro Arg Leu Leu Leu Pro Gly Cys

145 150 155 160

Ser Met Ser Val Val Pro Val Leu Gly Leu Gln Asp Gly Asp Tyr Val

165 170 175

Ala Ser Met Arg Arg Gly Leu Leu Leu Glu Trp Met Leu Val Pro Gly

180 185 190

Asp Cys Gln Lys Cys Ser Ala Ser Gly Gly Gln Cys Glu Tyr Ser Ser

195 200 205

Asp Gly Met Gly Phe Ser Cys Lys Cys Pro Ser Gly Val His Asn Pro

210 215 220

Thr Ser Cys Val Ala Gly Asp Ser Lys Ser Asn Gly Arg Lys Lys Thr

225 230 235 240

Leu Ile Val Leu Ile Pro Val Ala Val Ser Leu Leu Phe Pro Cys Ala

245 250 255

Tyr Val Leu Ile Trp His Arg Lys Gly Gln Ile Leu Cys Tyr Leu Leu

260 265 270

Cys Asn Lys Thr Arg Ser Arg Asn Glu Ser Asn Ile Gln Lys Leu Ile

275 280 285

Val Ser Tyr Gly Ser Leu Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Tyr Ser Glu Val

290 295 300

Ala Lys Ile Thr Ser Phe Leu Ser Asn Lys Leu Gly Glu Gly Gly Tyr

305 310 315 320

Gly Val Val Phe Lys Gly Lys Leu Gln Asp Gly Arg Leu Val Ala Val

325 330 335

Lys Phe Leu His Asp Ser Lys Gly Asn Gly Glu Glu Phe Val Asn Glu

340 345 350

Gly Ser Lys Arg Ala Leu Ile Tyr Asp Tyr Met Pro Asn Ser Ser Leu

355 360 365

Asp Asn Tyr Ile Tyr Ser Glu Lys Pro Lys Glu Thr Leu Gly Trp Glu

370 375 380

Lys Leu Tyr Asp Ile Ala Ile Gly Ile Ala Arg Gly Leu Glu Tyr Leu

385 390 395 400

His His Gly Cys Asn Thr Arg Ile Val His Phe Asp Ile Lys Pro Gln

405 410 415

Asn Ile Leu Leu Asp Gln Asp Phe Cys Pro Lys Ile Ala Asp Phe Gly

420 425 430

Leu Ala Lys Leu Cys Cys Thr Lys Glu Ser Lys Leu Ser Met Thr Gly

435 440 445

Ala Arg Gly Thr Ile Gly Phe Ile Ala Pro Glu Val Leu Tyr Arg Ser

450 455 460

Phe Gly Val Val Ser Ile Lys Ser Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Met Met

465 470 475 480

Leu Leu Glu Met Ile Gly Gly Arg Lys Asn Val Lys Ser Met Val Gln

485 490 495

Asn Ser Ser Glu Lys Tyr Phe Pro Asp Trp Ile Tyr Asp His Phe Tyr

500 505 510

Gln Gly Asp Gly Leu Gln Ala Cys Glu Val Thr Ser Glu Val Glu Glu

515 520 525

Ile Ala Lys Lys Met Thr Leu Ile Gly Leu Trp Cys Val Gln Val Leu

530 535 540

Pro Met His Arg Pro Thr Ile Thr Gln Val Leu Asp Met Phe Glu Lys

545 550 555 560

Ala Leu Asp Glu Leu Asp Met Pro Pro Lys Gln Ser Phe Cys Glu Ser

565 570 575

Leu

<210> 2

<211> 4429

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtgagat gagatgtctc actaacgccg ggtctacagt gactggtcaa aagagtacca 60

atcagccccc acaaaaaaaa aagaaaagaa aagagtacca atcagcgtgt cagactcgat 120

cgatcgtcgg ctatattgta ctccctcctt ccaaaaaaga caaaccctgg tttccgtgcc 180

caatatttaa ccgtttgtct tatttgaaaa aattacgaaa aaaattaaaa agacaagtca 240

cgcataaaat attaatcatg ttttatcatc tagcaacaat gaaaatacga attataaaaa 300

aatttcatat aacacgaaca gttaaagttg gacacggaaa cccatgattt gctttttttt 360

ttgggacaga gggagtacag tcctacatcg tgttttcttt tccagctgtc cttcagaatt 420

tcgtcagcta atctgcagat tgatcatgca tcaaacctca tcgcagctag tcttggcctc 480

gtttctgctc cttctctgcc accacgcgca cgccgactgc gagccggcga catgcggcaa 540

cctcaccatc aatcccccgt tctggctgga cgagccaggc cggccgccgt gcgggccgcc 600

gacgttccag ctccagtgca ggggcagcga agcgttcgtg gcgcacagct tcttccagac 660

ctaccaggtg gtccgcatct tcaccggcaa ctcctccgtc gtcgtcgtcg acaggagcct 720

cccgctggag agcggctgcc cggtgccgtg gttcaacatc tccatcggct tcgtcatggg 780

gccattcctc atcagcaggg ccaacaagga gctcgtcttc gtccacaact gcaccaccac 840

gaagcggcgg ccgccgcagg ggttccgccg tatgccctgc agccccgacg agtcgttcgt 900

cttcctcggc gacggccgcc ctcgtctctt gctgccggga tgctccatgt ccgtcgtgcc 960

ggtccttggg ttgcaggacg gggactacgt cgcgagcatg aggcgagggc ttctgctcga 1020

gtggatgctg gtgccgggtg attgccagaa gtgctcggcg agtggcgggc aatgcgagta 1080

cagcagcgac ggcatggggt tctcgtgcaa atgtcccagc ggcgtccaca accccaccag 1140

ctgcgttgca ggcggtgagt tcttcgcatc tcgcatgcct ctggccctcg gccacgaaaa 1200

cactttaatg gtacatacgt atgtataaag tactcctacg tatatacttc ctccgtccca 1260

aaacaagtgc aggcatggtt ttccgcatcc aactttgacc atttgtctta tttaaaattt 1320

ttttaagaaa attaaagaca tactgttcat gttttatcat cttataacaa caaaaatgct 1380

aattataaaa aaaattcaaa taagacggac gatcaaagtt gagcgcgaaa acttatggct 1440

gcacttattt taagacggag gtagtatgtt agagcaggta caatagcagg ctataagcca 1500

gctgcaaaca tattttaaag agataaatca ggaaagagaa gagcagcggg ctacagattt 1560

atagccagtt gtagcgcgga ctccaagacg caatgtgtct atgacagatg ggactaggta 1620

ttaatagtgt agaatgtaac tattgtataa atgagctatt agattgtcta taaatgaatt 1680

gaagtaagta gttggctata ctattgaact tgctcttata tatacaggag agagacgagt 1740

agacaatacg gccgtaaaaa tcctgagaat agtcaagatt ttacagtcac cgttagccat 1800

ttcgcaccat gttttctgtc actagtcact accttaagaa atcaagtcaa atactaatat 1860

ttttaagtca caatcagcac cgacgaaatc agtgcccttt gaaatcaacc gaagacacgg 1920

aagattcaaa cgacaaacaa taaagctgtc aactggacca tgcagaagtt ggattggttg 1980

aacaatgatc gttttttaat aaataacgtg ttgataattt tttaaagaaa taagacgaac 2040

aaaacgatca aacattattt caaaaatcgt cagcgtcgtc tattaaaatg cggatgtagt 2100

agtagcattg gccacgctcc agctgcacac catcgataca ctcatacacc ccattgttgc 2160

gctgcaggat gcatatcgcc cattcctggt acgtgtgtgt ccatgctcgt agtattcacc 2220

gtgctgataa accccacaac tggcaccatc aacattcaac actactctat gcaaatcttt 2280

aatgatattg attacttggt aacatgacag gacaatattc aatactttca gtgcactatt 2340

attacattag ctacggtcaa tccttttgtt gaacagttca gtcaagtgtt ggactgttct 2400

agacaatcag ttagctgtaa agaagtgaac tctgcatgaa tatcaatttg ttatacagtg 2460

cagggaaaaa cactaacaaa aacaaagtag tgttacacaa ctatatcgac aatcgatcaa 2520

cctagtatga gataaagaac atataattcc tatggttata ttaaatcgag gtttaattga 2580

catacttctt caatctttca tcaaaagaaa gacgaacggc ccatgctcct cgctatcttg 2640

caatatattt cccatcattc atcttcaaaa tattaaaatt tcttcacaca ttcttcgttt 2700

ctttctttaa cgaaatcata aatatagttc tactcaaaat gcgttgacga ttaatgttct 2760

gttctattcc agatagcaag agcaatggca ggaagaaaac gctaataggt atgtaaaatt 2820

ttattcttct ttcatatcta acccatccct gtttcagcta ttattcttta atgactgcca 2880

tttcagaatc tatgcagtca agccttaaaa atttcagtca ctaatatata caatttctca 2940

catgaaaatg acaccagtgg actggccttt ttttttttca tatcagtgta gtttcagtat 3000

ttcgtactag catataacta caaatgtagt ggccatatgt gtgaattgaa gactatgttg 3060

atgtccaaag tgacaactaa agtagaacaa atagagtagt tattttatat aacaaaaatt 3120

cttttcaaaa tctaccctgc tataatcatt tatgctttat ttcaattgat gaatattaaa 3180

aacaagcaac cctcaaaatt gtgtcagata tggagcaaaa tttatggcct agtgtagtcc 3240

tacttttgcc gcccttatgc tttttaatta gttctttact aaaaaaaaat caaaatattg 3300

atatcaataa tacgacttat gatcttgaaa aagaatataa cttctctttt ttttctcagt 3360

tttgatacca gtagctgtaa gcctgctctt tccatgtgct tatgtgctga tatggcatag 3420

aaaggggcaa atattgtgct atctcctatg caacaagact cgcagcagaa atgaaagtaa 3480

cattcagaaa ttaatagtat cgtacggatc cctagctcca aaaagataca agtattcgga 3540

ggtagcaaag ataacatcat ttctgagtaa taagcttgga gaaggtggtt atggtgtggt 3600

tttcaaagga aagctacaag atggtcgtct ggttgctgtg aaattcttgc atgactccaa 3660

aggaaatggg gaagaattcg taaacgaggt aatgagcatt ggcaggacat cacatgttaa 3720

tattgttagc ttatttggat tttgtttgga gggctcaaaa cgagctctta tatatgacta 3780

catgcccaac agttctctgg ataactacat ttactcagaa aaacccaaag aaactttagg 3840

atgggaaaag ctctatgata tagcaattgg gattgctcgt gggctagaat acttgcacca 3900

tggttgtaat acacgaatcg tgcattttga tatcaagcct caaaatatcc ttctagacca 3960

ggatttttgc ccaaagattg ccgattttgg tttagctaaa ttgtgttgta ccaaggagag 4020

caagctttca atgaccggtg ctagaggaac aattggattc attgctcctg aagttttgta 4080

tcggtctttt ggggttgttt caataaagtc ggatgtttat agttacggaa tgatgttgct 4140

tgagatgatt ggaggccgga aaaatgtgaa atcaatggtt caaaactcta gtgaaaaata 4200

tttcccagac tggatttatg accactttta tcaaggtgat ggattgcaag cttgtgaagt 4260

cacaagtgag gttgaggaaa tcgccaaaaa gatgacttta attggcttgt ggtgtgtaca 4320

agtattacct atgcatcgcc caacaataac ccaggtttta gatatgtttg agaaagcttt 4380

agacgaactg gacatgcctc caaagcaaag cttctgtgaa tcactgtaa 4429

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgctccttct ctgccaccac gcg 23

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agattgctcc ttctctgcca ccacgcg 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaacgcgtg gtggcagaga aggagca 27

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatcatgaac caacggcctg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggagtacag tcctacatcg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggtcaaag ttggatgcgg 20

Claims

1.水稻受体激酶基因OsRLCK21或该基因编码的蛋白在制备水稻白叶枯抗病材料中的应用；所述水稻受体激酶基因OsRLCK21的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

2.水稻受体激酶基因OsRLCK21或该基因编码的蛋白在提高水稻白枯病抗性方面的应用；所述水稻受体激酶基因OsRLCK21的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

3.水稻受体激酶基因OsRLCK21或该基因编码的蛋白在减少水稻白枯病病斑长度方面的应用；所述水稻受体激酶基因OsRLCK21的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

4.一种定点敲除方法，其特征在于，包括如下步骤：

使用基因编辑技术破坏水稻中水稻受体激酶基因OsRLCK21的生物学功能；具体为：使水稻基因如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列中TTTNXXX形式的核苷酸序列发生插入或缺失；其中，XXX为22-24bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基。

5.根据权利要求4所述的定点敲除方法，其特征在于，步骤具体如下：

a)构建含有靶序列RLCK21-T1的Lb-RLCK21-1质粒；

b)将Lb-RLCK21-1质粒转入水稻中；

6.根据权利要求4或5所述的定点敲除方法，其特征在于，所述水稻为日本晴。

7.权利要求4-6任一项所述的定点敲除方法在制备水稻白叶枯抗病材料中的应用。

8.权利要求4-6任一项所述的定点敲除方法在提高水稻白枯病抗性方面的应用。

9.权利要求4-6任一项所述的定点敲除方法在减少水稻白枯病病斑长度方面的应用。