CN112011558A

CN112011558A - 一种通过提高sa含量增强作物抗病性的方法及基因

Info

Publication number: CN112011558A
Application number: CN202010943333.3A
Authority: CN
Inventors: 张可伟; 俞宁宁; 张艳军; 赵利; 俞启璐; 赵江哲
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2020-09-09
Publication date: 2020-12-01

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种通过提高SA含量增强作物抗病性的方法及基因，水稻SA羟基化酶基因核苷酸序列如Seq ID No.1、Seq ID No.2所示，编码蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.3、Seq ID No.4所示。本发明通过鉴定水稻SA羟基化酶蛋白的编码基因，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统筛选功能缺失的突变株系，检测功能缺失株系在不同时期的SA含量；通过白叶枯菌抗病试验和产量性状的统计分析，证明OsS5H1和OsS5H2的功能缺失可以一定程度上减少水稻SA降解，提高游离SA和总SA含量，进而提高植物抗病性。

Description

一种通过提高SA含量增强作物抗病性的方法及基因

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种通过提高SA含量增强作物抗病性的方法及基因，具体涉及一种通过提高作物SA含量增加抗病性的方法。

背景技术

目前，由于人口数量以及对粮食需求的不断增加与粮食产出之间的矛盾，世界上仍有部分地区面临粮食短缺和营养不良问题的威胁。水稻作为一种重要的粮食作物，其产量是遗传育种以及粮食生产上被广泛关注的重要性状，然而稻米的产量和粮食安全问题常常受到有各种病原菌引起的疾病的威胁。作物产量与抗病性状之间的关系通常是矛盾的，因此平衡两者之间的复杂关系成为解决当前粮食问题的有效途径。

水杨酸(SA)是一种重要的植物内源激素，在植物生长发育、抗病、抗逆以及叶片衰老等过程中起到重要作用。维持水杨酸的稳态对于发挥水杨酸的生理功能非常重要。水杨酸在植物体内的含量受到精确调控，植物通过调控水杨酸的合成和分解代谢来维持水杨酸的动态平衡。之前的研究发现水杨酸主要通过莽草酸途径的代谢通路起始合成，一条是位于细胞质的苯丙氨酸解氨酶(PAL)途径，另一条是位于质体的异分支酸(IC)途径。水杨酸被合成后，一部分以活性形式存在发挥其生物学功能，其它的则通过各种修饰失去活性被用于存储、运输或者失活。水杨酸的修饰主要包括羟基化、甲基化、氨基酸化、糖基化等形式。2,3-DHBA(2,3-羟基苯甲酸)和2,5-DHBA(2,5-羟基苯甲酸)被认为是水杨酸失活的两种主要存在形式。水杨酸的羟基化在水稻中的作用和功能目前还不清楚，编码催化水杨酸羟基化酶的相关基因目前也尚未找到。

综上所述，现有技术存在的问题是：(1)水稻中负责催化水杨酸羟基化作用的酶未被鉴定。

(2)水杨酸羟基化在水稻中的具体功能和作用尚不清楚，特别是在水稻抗病性以及产量方面的影响。

解决上述技术问题的难度和意义：水稻SA代谢相关研究还未有突破性的进展。已明确拟南芥中存在水杨酸羟基化酶参与SA分解代谢途径，其通过催化SA反应生成2,3-DHBA和2,5-DHBA，调控拟南芥的叶片衰老和抗病性。但与拟南芥相比，水稻SA含量要高出约8倍，且生物合成不受病原菌诱导，暗示两者的代谢途径可能存在较大的差异。因此，鉴定水稻SA羟基化酶，揭示SA羟基化对水稻抗病性及产量的影响，对于研究水稻SA代谢途径和抗病机制以及遗传改良都有着重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过提高SA含量增强作物抗病性的方法及基因。要解决上述技术问题，需要在水稻中鉴定一种可以调控水杨酸羟基化的羟基化酶，因此首先通过查阅本实验室发表的拟南芥水杨酸羟基化酶序列，利用公共数据库来筛选编码水稻羟基化酶的候选基因，然后通过体外酶活测定的方法鉴定催化SA生成羟基化SA的候选基因，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得SA羟基化酶的基因编辑突变体，观察其在水稻抗病性和产量相关农艺性状。

本发明涉及一种水稻OsS5H1(LOC_Os04g49210.1)和OsS5H2(LOC_Os03g03034.1)基因提高水稻抗病性的方法。通过CRISPR-Cas9敲除的方法，发现水稻OsS5H1和OsS5H2基因功能缺失增加了其抗病性但对产量没有显著影响，表明OsS5H1和OsS5H2基因在水稻遗传改良中具有重要的应用价值。

本发明是这样实现的，一种从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性的基因，所述从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性基因为OsS5H1和OsS5H2，核苷酸序列分别为Seq IDNo.1、Seq ID No.2。

进一步，所述OsS5H1、OsS5H2进一步包括因插入、替代、缺失一个或多个碱基所产生的突变体等位基因以及衍生物。

本发明的另一目的在于提供一种蛋白，为Seq ID No.1编码的Seq ID No.3、SeqID No.2编码的Seq ID No.4。

进一步，所述蛋白进一步与Seq ID No.3、Seq ID No.4所示序列有70％同源性的蛋白或者蛋白衍生物；所述蛋白进一步包括因插入、缺失或替代一个或多个氨基酸所产生的功能发生改变的蛋白或者蛋白衍生物。

本发明的另一目的在于提供一种从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性且基本不影响产量的基因的鉴定方法包括:

鉴定OsS5H1和OsS5H2为水稻SA羟基化蛋白，利用pMAL和pET28a载体表达和纯化蛋白并测定酶活，通过CRISPR-Cas9基因编辑系统获得功能缺失突变体，在不同时期测定SA含量以及抗病性，获得抗病性增强的水稻植株。

进一步包括：

利用公共数据库筛选编码水稻羟基化酶的候选基因，再通过体外酶活测定的方法鉴定催化SA生成羟基化SA的候选基因，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得SA羟基化酶的基因编辑突变体。

进一步，所述从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性且基本不影响产量的基因的鉴定方法进一步包括：

(1)OsS5H1、OsS5H2基因蛋白表达载体连接，通过将cDNA序列连接至相关蛋白表达载体上，转化大肠杆菌表达相关蛋白，通过超声法破碎细胞膜过柱提取相关蛋白进行生物学功能分析；

(2)s5h1s5h2突变体的创建，在OsS5H1、OsS5H2相应基因组序列上设计gDNA敲除片段构架至pC1300-Cas9载体，通过农杆菌转染水稻获得相关基因功能缺失的双突变体材料；

(3)s5h1s5h2突变体不同时期SA含量的测定，通过对OsS5H1、OsS5H2基因功能缺失突变材料SA含量进行分析，候选基因缺失使得SA含量升高，SA羟基化产物2,5-DHBA含量降低；

(4)s5h1s5h2突变体抗病性的分析，通过对大田成熟期的功能缺失突变体接种白叶枯菌，分析突变体和WT之间病斑长度的差异判断突变后其抗病性的变化；

(5)s5h1s5h2突变体农艺性状分析，进行不同时期SA含量以及抗病性进行分析后，还需对相应的农艺性状进行分析。

本发明的另一目的在于提供一种应用方法，包括通过下调所述基因的表达或者功能缺失，调控植物抗病性。

进一步，所述应用方法进一步包括：通过下调所述基因在植物中表达的蛋白表达量或活性，增加抗病性。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性且基本不影响产量的S5H1和S5H2基因设计的靶位点构建CRISPR-Cas9基因敲除载体，所述基因敲除载体骨架为pC1300-Cas9，并通过农杆菌介导的基因转化法将CRISPR-Cas9载体转入水稻受体品种盐稻8号中。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明提供一种通过调控水稻SA羟基化酶基因OsS5H1(LOC_Os04g49210.1)和OsS5H2(LOC_Os03g03034.1)的功能提高植物抗病性的方法，本发明涉及的水稻SA羟基化酶基因核苷酸序列如Seq ID No.1、Seq ID No.2所示，编码蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.3、Seq ID No.4所示，通过鉴定水稻SA羟基化酶蛋白的编码基因OsS5H1和OsS5H2编码蛋白的酶活(图1-2)，利用CRISPR-Cas9基因编辑系统筛选功能缺失的突变株系(图3)，检测功能缺失株系在的SA含量(图4)；通过白叶枯菌抗病试验和产量性状的统计分析(图5)，证明OsS5H1和OsS5H2的功能缺失可以一定程度上减少各时期水稻SA降解，提高游离SA和总SA含量，进而提高植物抗病性，且对单株产量没有显著的影响(图6-7)。

相比于现有技术，本发明的优点进一步包括：

本发明利用本实验室之前在拟南芥中鉴定的AtS5H蛋白序列通过NCBI公共数据库搜索获得同源基因，与拟南芥AtS5H、AtS3H基因以及其同源基因做同源性比对，初步确定候选基因。

本发明对候选基因利用原核表达系统表达纯化候选基因的蛋白，测定其酶活以及相关生理生化性质，进一步缩小候选范围。

本发明将OsS5H1、OsS5H2分别设计应物扩增靶点序列并将其构建至pC1300-Cas9载体上。

本发明通过农杆菌介导的基因转化法将CRISPR-Cas9载体转入水稻受体盐稻8号中，获得转化植株。

本发明对盐稻8号的相关的转基因植株通过基因测序检测转化效果，对T2代植株进行SA含量测定、抗病性分析和农艺性状的统计。

本发明发现了在水稻中控制SA降解为2,5-DHBA的水杨酸羟化酶基因OsS5H1、OsS5H2，填补了这一领域的空白。

本发明阐述了OsS5H1、OsS5H2基因在增加水稻抗病性的功能。

本发明发现了一种利用OsS5H1、OsS5H2基因来对水稻进行遗传改良的方法。

附图说明

图1是本发明实施例提供的所涉及SA羟基化酶基因进化树分析图。

图2是本发明实施例提供的所涉及SA羟基化酶基因在最适条件下测定的酶活性图。

图3是本发明实施例提供的OsS5H1、OsS5H2的CRISPR靶点敲除示意图。

图中：A为OsS5H1和OsS5H2基因靶点敲除示意图；B为s5h1s5h2突变体靶点突变方式一览。

图4是本发明实施例提供的s5h1s5h2功能缺失突变体96天SA及衍生物含量的测定结果图。

图中：A为对96天材料叶片总水杨酸含量的测定结果；B为对96天材料叶片游离水杨酸含量的测定结果；C为对96天材料2,5-DHBA含量的测定结果。

图5是本发明实例所提供的s5h1s5h2功能缺失突变体以及对照(盐稻8号)抽穗后白叶枯菌接种15天的病斑长度统计和病斑侵染图。

图中：A为83天水稻剑叶接种白叶枯菌14天后病斑表型对比；B为对水稻病斑长度的统计，Bar＝2cm。

图6是本发明实例所提供的s5h1s5h2功能缺失突变体以及对照(盐稻8号)穗部表型图Bar＝2cm。

图7是本发明实例所提供的s5h1s5h2功能缺失突变体以及对照(盐稻8号)农艺性状统计。

图中：A为单株分蘖数统计；B为单穗粒数统计；C为穗部一级枝梗数统计；D为粒长统计；E为粒宽统计；F为千粒重统计；G为单株粒数统计；H为单株产量统计。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

水稻中负责催化水杨酸羟基化作用的酶未被鉴定。水杨酸羟基化在水稻中的具体功能和作用尚不清楚，特别是在水稻抗病性以及产量方面的影响。

为解决上述问题，下面结合附图对本发明作进一步描述。

本发明提供了一对从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性的突变体以及相关基因完整编码区段的DNA片段，分别命名为OsS5H1和OsS5H2，并通过功能验证确认了这对基因的突变可以通过调控水稻SA含量提高水稻抗病性。本发明的另一目的是提供了一种通过OsS5H1、OsS5H2基因来增加水稻抗病性的遗传转化载体和方法。OsS5H1、OsS5H2具有Seq IDNo.1、Seq ID No.2所示的核苷酸序列，也包括因插入、替代、缺失一个或多个碱基所产生的突变体等位基因以及衍生物。

本发明还包括OsS5H1、OsS5H2基因编码的蛋白质，如Seq ID No.3、Seq ID No.4所示，包括与Seq ID No.3、Seq ID No.4所示序列有70％同源性的蛋白质序列，也包括因插入、缺失或替代一个或多个氨基酸所产生的功能发生改变的蛋白或者蛋白衍生物。本发明通过抑制OsS5H1、OsS5H2的表达显著增加了水稻的抗病性且几乎不影响水稻的产量，这些结果表明OsS5H1、OsS5H2基因在水稻育种中具有重要的利用价值。OsS5H1、OsS5H2基因的蛋白编码序列如Seq ID No.3、Seq ID No.4所示。

本发明提供的OsS5H1、OsS5H2基因可用于与其他调控元件，如组成型启动子(CaMV35S启动子)和诱导型启动子等融合构建表达载体，通过转基因技术降低植物SA的含量，获得低SA含量的植物；也可通过反义RNA、RNAi、锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFN)、CRISPR-Cas9等技术对其进行操控从而调控水稻的抗病性。利用本发明，可将OsS5H1和OsS5H2基因应用于水稻抗病优良品种的培育，同时也能为水稻研究提供高SA含量和低SA含量的遗传学材料。

本发明提供一种从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性基因的鉴定方法包括:

鉴定OsS5H1和OsS5H2为水稻SA羟基化蛋白，利用pMAL和pET28a载体表达和纯化蛋白并测定酶活，通过CRISPR/Cas9基因编辑系统获得功能缺失突变体，在不同时期测定SA含量以及抗病性，得到抗病性增强的水稻植株。

进一步包括：

利用公共数据库选择编码水稻羟基化酶的候选基因，再通过体外酶活测定的方法鉴定催化SA生成羟基化SA的候选基因，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得SA羟基化酶的基因编辑突变体。

所述从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性的基因的鉴定方法进一步包括：

(1)OsS5H1、OsS5H2基因蛋白表达载体连接，通过将cDNA序列连接至相关蛋白表达载体上，转化大肠杆菌表达相关蛋白，通过超声法破碎细胞膜过柱提取相关蛋白进行生物学功能分析。

(2)s5h1s5h2突变体的创建，在OsS5H1、OsS5H2相应基因组序列上设计gDNA敲除片段构架至pC1300-Cas9载体，通过农杆菌转染水稻获得相关基因功能缺失的双突变体材料

(3)s5h1s5h2突变体SA含量的测定，通过对OsS5H1、OsS5H2基因功能缺失突变材料SA含量进行分析，候选基因缺失使得SA含量升高，SA降解产物2,5-DHBA含量降低。

(4)s5h1s5h2突变体抗病性的分析，通过对大田成熟期的功能缺失突变体接种白叶枯菌，分析突变体和WT之间病斑长度的差异判断突变后其抗病性的变化。

(5)s5h1s5h2突变体农艺性状分析，进行不同时期SA含量以及抗病性分析后，还需对相应的农艺性状进行分析。

本发明提供一种应用方法，包括通过下调所述基因的表达或者功能缺失，调控植物抗病性。

所述应用方法进一步包括：通过下调所述基因在植物中表达的蛋白表达量或活性，增加抗病性。

本发明提供一种利用所述从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性的基因OsS5H1和OsS5H2。

本发明提供一种利用所述从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性的基因等融合构建表达载体，所述表达载体为pC1300-Cas9，并通过农杆菌介导的基因转化法将CRISPR-Cas9载体转入水稻受体盐稻8号中。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：水稻水杨酸5’羟化酶S5H的预测和功能分析

1.基因的预测和比较分析。

利用本实验室鉴定的拟南芥S5H的氨基酸序列通过Gene Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源性比对，最终在水稻基因组中找到LOC_Os03g03034.1(OsS5H2)、LOC_Os04g49210.1(OsS5H1)、LOC_Os04g49194.1和LOC_Os10g39140.1四个候选基因。

2.候选基因的载体构建

设计如下引物1、2、3、4分别对OsS5H1、OsS5H2、OsS5H3、OsS5H4基因进行扩增。

引物1-F：GGCATCTAGAATGGCTCCAGCCAT

引物1-R：AAACAAGCTTTCAGACGGCCTGAT

引物2-F：GGCAGAATTCATGGCGGACCAGCTCATCTCCACGG

引物2-R：AAACAAGCTTCCGTGGAGATGAGCTGGTCCGCCAT

引物3-F：CCGGAATTCATGGCGGCGGAGGCGGAGCA

引物3-R：CCCAAGCTTCTAAGTCCTGAACAGCTCGA

引物4-F：CGGGATCCATGGCAACGACGCAGTTGCT

引物4-R：CCAAGCTTCTACTGGCCTTTGAAGAGCT

使用日本晴水稻为对象，使用Trizol法提取总RNA，将其反转为cDNA，分别使用引物1和引物2对OsS5H1(Seq ID No.1)、OsS5H2(Seq ID No.2)基因进行扩增，扩增产物验证无突变后，分别使用Xba I、Hind III酶切pMAL载体以及OsS5H1基因扩增产物；EcoR I、HindIII用于酶切pET28a载体以及OsS5H2基因扩增产物。酶切产物回收后使用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α验证，选取阳性菌进行保菌备用。

3.蛋白表达纯化

pMAL载体

取保存好的菌液30μl至5ml培养基中，使用的培养基配方为：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，葡萄糖2g/L，添加氨苄青霉素至浓度为100mg/L，37℃过夜培养活化目的菌。取2-5mL菌液转接到500mL含对应浓度抗生素的液体培养基中，37℃温度条件下200rpm摇菌培养至OD600范围为0.4-0.6。冷却到室温，加IPTG诱导蛋白表达，调节菌浓至0.3mM，37℃温度下培养2h，4000rpm，4℃条件下离心20min收集菌体。加入25ml ColumnBuffer悬浮沉淀，具体配方为：Tris-HCl,pH 7.4 20mM，NaCl 200mM，EDTA 1mM。-20℃冷冻8h，冰浴融化后，使用超声波进行破碎，具体流程为：破碎10s，静置10s，不断重复，每过1min摇匀，直到液体由白色变为浅灰色。收集破碎液12000g，1h，收集上清加入1.5ml直链淀粉树脂，8000g条件下离心1min，弃上清，重复3次。之后在4℃条件下置于混合仪1h混合均匀。将混合液倒入Ni-Agarose分离柱中，静置3min，将裂解液放出。使用5mL Column Buffer洗柱，重复4次，待其流尽后，加洗脱缓冲液(Column Buffer+10mM麦芽糖)洗脱蛋白，使用离心管进行收集。

在本发明实施例中，pET28a载体包括：

取保存好的菌液30μl至5ml培养基中，pET28a使用LB培养基，配方为：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，添加卡那霉素至50mg/L。37℃过夜培养活化目的菌。取2-5mL菌液转接到500mL含对应浓度抗生素的液体培养基中，37℃,200rpm摇菌培养至OD600范围为0.4-0.6。冷却到室温，加IPTG诱导蛋白表达，18℃温度条件下培养24h。后取菌液在8000rpm，4℃条件下离心10min收集菌体。pET28a载体收集菌体后直接进行破碎，后续分离收集过程同pMAL，所用平衡缓冲液具体配方为：Tris-HCl 20mM，NaCl 0.5M。裂解缓冲液配方为：20mM Tris·HCl(pH 7.5)、2mMβ-巯基乙醇、2mM PMSF、2mM EDTA，10mM吲哚，20mM抗坏血酸、0.1％Triton-X-100、0.25M NaCl。清洗缓冲液配方为：20mM Tris·HCl(pH 7.5)、20mM吲哚，、0.5M NaCl、20mM抗坏血酸。洗脱缓冲液配方为：20mM Tris·HCl(pH 7.5)、300mM吲哚、10％甘油、0.5M NaCl、20mM抗坏血酸。

4.酶活测定：

根据下列配方配置不同pH值缓冲液：

pH 4-6：

pH 8-9：

称取三羟基氨基甲烷0.3035g，溶解至约50ml蒸馏水中，然后用1N盐酸调节至pH 8(或pH 9)，定容至50ml。

pH 10：

称取甘氨酸0.1877g(＝0.05*75.07*0.050)，溶解至约50ml蒸馏水中，然后用1N氢氧化钠调节至pH 10，定容至50ml。

配置完成的pH缓冲液用于配置不同pH的反应液环境，具体方法为在1.5mL离心管中，依次加入缓冲液10μl，1M抗坏血酸0.4μl，10mM FeSO4 2.5μl，20mg/ml catalase 5μl，1M DTT 0.5μl，0.1M酮戊二酸1μl，蛋白洗脱液若干，ddH₂O补至100μl。水浴保温，然后依次分别加入10μl不同浓度的的SA溶液，混匀后开始计时，反应时间为6min。之后依次加入100μl 50％的乙腈，在95℃的水浴锅中放置1min，终止反应，在15000rpm、4℃条件下离心10min，上清液移至新的1.5ml离心管中，然后采用HPLC检测2,5-DHBA浓度。分别改变反应pH、温度以及底物浓度，重复上述操作，即可得出相应最适条件，最后测定酶活。结果发现LOC_Os03g03034.1、LOC_Os04g49210.1候选基因的催化活性最高，为水稻中SA 5端羟化酶基因，即OsS5H1、OsS5H2。

图1是本发明实施例提供的所涉及SA羟化酶基因进化树分析图。

图2是本发明实施例提供的所涉及SA羟化酶基因在最适条件下测定的酶活性图。

实施例2：水稻水杨酸5’羟化酶S5H CRISPR-Cas9载体的构建

根据CRISPR-PLANT

(http://www.genome.arizona.edu/CRIPSR/CRIPSRsearch.html)网站上提供该基因可用的gRNA靶点序列，在OsS5H1基因组序列230-249bp(引物3、4)和OsS5H2基因组序列304-323bp位置(引物5、6)各设计两对CRISPR引物：

引物3-F：GGCACAGGTCGATGACCGGAATGC

引物3-R：AAACGCATTCCGGTCATCGACCTG

引物4-F：GGCAGAAGAATCACGGGATCCCGG

引物4-R：AAACCCGGGATCCCGTGATTCTTC

引物5-F：GGCAGCCGACCTGGGAGACGAGCT

引物5-R：AAACAGCTCGTCTCCCAGGTCGGC

引物6-F：GGCAGAGCTCGGATTCAGACTGTA

引物6-R：AAACTACAGTCTGAATCCGAGCTC

每对引物都是互补序列，在PCR仪中退火形成具有粘性末端的双链，将pC1300-Cas9载体用Nhe I和Kpn I酶切回收，将回收产物和退火产物进行连接，转化DH5α菌株中进行质粒扩增，提取质粒并验证，获得目的质粒。

实施例3；转基因水稻的获得

将上一步得到的目的质粒转入到农杆菌GV3101中，菌落PCR验证获得阳性菌株，用于后续水稻转基因。利用水稻品种“盐稻8号”为材料，送至百格公司创制相关转基因植株。CTAB法提取阳性植株的基因组DNA，用以下两对引物扩增目的片段验证突变体位点：

引物7-F：ATGGCTCCAGCCATTGCCAAGCCTC

引物7-R：TCAGACGGCCTGATCGTTAGGCCGG

引物8-F：CGCGCCATAACACATCCGTGAGAGT

引物8-R：GGCGTAGCCTATGTTCCATCTTTGC

引物9-F：CCTGACTACGCTTCTCCGCT

引物9-R：GGAGAGGCGGATCTTCTTGG

引物10-F：GTGTGATGGTGGATGACTTTATTTC

引物10-R：ATGAGGAGGATGGTGAGGGCGTTCG

引物7、8用于验证OsS5H1靶点序列，引物9、10用于验证OsS5H2靶点序列。

实施例4：SA含量分析

1.不同时期突变体SA提取

将s5h1s5h2 T2代突变体和野生型(“盐稻8号”)种植到浙江金华水田中，待植物生长到14天(幼苗期)，71天(分蘖期)，96天(灌浆期)，115天(成熟期)，125天(衰老期)时分别获取叶片材料，收集的叶片放入液氮中速冻，-80℃冰箱保存备用。

将叶片放置于液氮冷却后的研钵中加液氮进行研磨，磨碎后取大约0.1g样品至装有80％色谱纯甲醇的2ml离心管中，放置于4℃混合仪中混合，时间大于1h，之后再离心机上进行离心，条件为4℃，14000rpm条件下离心10min。小心吸取上清液于新的离心管中，于氮吹仪中吹干。剩余沉淀继续加入100％甲醇进行重提取，过程同第一次，将两次上清混合到一起使用氮吹仪吹干。最后加入500μL 0.1M乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，放置于4℃混合仪中混合1h以上，在4℃，14000rpm离心15min，取200μL至高效液相色谱(安捷伦1260型液相色谱系统)中用于分析SA。

2.HPLC测定SA含量

SA分析通过安捷伦1260型液相色谱系统进行分析，根据有关资料的参考设计分析方法和流程，流动相使用醋酸钠(0.2M，pH 5.5)和甲醇组成。初始甲醇梯度为3％(v/v)维持12min，12.5min时浓度线性增加到7％(v/v)，维持38min；1min后恢复到初始条件，整个过程中流动相流速保持为0.8ml/min。SA使用SA用296nm激发波长和410nm发射波长荧光检测器检测，2,5-DHBA用320nm激发波长和449nm发射波长荧光检测器检测。根据之前已有的标准曲线通过LC离线端软件积分分析获得浓度。结果发现各个时期中功能缺陷型水稻体内游离SA以及总SA含量相对WT均有升高，2’5-DHBA降解产物含量下降。

实施例5：突变体抗病性表型分析

1.白叶枯菌菲律宾亚种P6培养基制作，马铃薯培养基的具体成分为：鲜土豆，300g/L；Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.5g/L；Na₂HPO₄·12H₂O 2g/L；蛋白胨，5g/L；蔗糖，15g/L；琼脂，15g/L；具体方法为：取新鲜土豆去皮，称取300g鲜土豆切碎，加适量水煮沸20-30min，直至土豆完全煮烂，使用纱布对过其进行过滤，收集滤液按配方依次加入上述药品，加水至1L定容，121℃条件下灭菌15min，倒固体平板备用。

2.菌种的涂板和活化，取P6白叶枯菌涂布至配好的固体平板中，28℃条件暗培养2天，之后将长出的菌转涂至新的PDA平板中，28℃继续培养2天，待菌覆盖满平板表面后备用。

3.菌液的制备以及大田接种，将已培养好的P6白叶枯菌的培养基从28℃培养箱中取出，使用刀片等工具将其从培养基表面刮下，与清水混匀制备菌液，选取83天抽穗后的s5h1s5h2双突材料以及对照材料(“盐稻8号”)作为接种对象，选择晴天较多的时间段进行接种，将剪刀头浸没于溶好的菌液中使其充分接触并携带病原菌，选取剑叶于其顶端2cm左右处将叶片剪下，14天左右进行病斑长度观察和记录。结果发现功能缺失突变体对白叶枯菌P6的抗病性强于对照。

实施例6：农艺性状分析

将盐稻8号野生型与s5h1s5h2双突变体材料种于田中，生长100天以后对材料进行拍照和农艺性状的统计，所有农艺性状包括穗长、穗粒数、单株分蘖数和单株产量均以单株数据为基础，统计数据使用Microsoft Excel数据表软件进行统计分析。结果发现功能缺失突变体的产量性状与对照比较影响不明显，尽管突变体的单株穗粒数减少，但是其有效分蘖数增加，因此突变体的单株产量与野生型比较没有明显减少，单株产量甚至在个别实验组中升高。

在本发明中，Seq ID No.1为

Seq ID No.2为：

Seq ID No.3为：

Seq ID No.4为：:

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江师范大学

<120> 一种通过提高SA含量增强作物抗病性的方法及基因

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctccag ccattgccaa gcctctcctg agcgatctgg tggcacaatc cgggcaagtc 60

ccctcgagcc acattcgtcc ggttggcgac cgcccggacc tcgacaacgt cgaccacgag 120

tccggcgccg gcattccggt catcgacctg aaacagctcg acggcccgga tcgccgcaag 180

gttgtcgagg ccatcggttc ggcgtgcgaa accgacggtt ttttcatggt gaagaatcac 240

gggatcccgg aggaggtggt ggaagggatg ctgcgcgtgg cgagggagtt cttccacatg 300

ccggagtcgg agcggctcaa gtgctattcc gacgacccca agaaggcgat ccggctgtcg 360

acgagcttca acgtgcgcac cgagaaggtg agcaactggc gcgacttcct gcgcttgcat 420

tgctaccctc tcgagagctt catcgaccag tggccctcca acccaccctc cttcaggcaa 480

gtggtcggca cctactcgag ggaggcgagg gcgctggcgc tgcggttgct ggaggcgata 540

tctgagagcc tcgggctgga gaggggccac atggtgtcgg ccatggggcg gcaggcgcag 600

cacatggcgg tgaactacta tccgccatgc ccacagccgg agctcaccta cggcctgccg 660

gggcacaagg accccaatgc catcacgctg ctgctccagg acggcgtctc cggcctgcag 720

gtccagcgca acggccgctg ggtggccgtc aaccccgtgc ccgacgccct ggtcatcaac 780

atcggagatc aaatccaggc gctgagcaac gaccggtata agagcgtgct ccaccgggtg 840

atcgtgaaca gcgagagcga gaggatctcc gtgccgacgt tctactgccc gtccccggac 900

gcggtgatcg cgccggccgg cgcgctggtg gacggcgccc tgcacccgct ggcgtaccgg 960

cccttcaagt accaggccta ctacgacgaa ttctggaaca tgggcctcca gtccgccagc 1020

tgcttagacc ggttccggcc taacgatcag gccgtctga 1059

<210> 2

<211> 1029

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcggacc agctcatctc cacggcagac cacgacacgc tgccgggcaa ctacgtgcgc 60

cccgaggcgc agcgcccgcg cctcgccgac gtgctctccg acgcctccat ccccgtcgtc 120

gacctcgcca accccgaccg cgccaagctc gtctcccagg tcggcgccgc ctgccgctcc 180

cacggcttct tccaggtgct caaccatggg gtgccagtgg agctgacact gtcggtgctg 240

gcggtggcgc acgacttctt ccggctgccg gcggaggaga aggccaagct ctactccgac 300

gacccggcca agaagatccg cctctccacc agcttcaacg tccgcaagga gaccgtgcac 360

aactggcgcg actacctccg cctccactgc tacccgcttc accgctacct ccctgattgg 420

ccatccaacc ccccttcctt cagggagatc ataagcacat actgcaaaga agttcgggag 480

ctcggattca gactgtacgg agcgatatcc gagagcctgg gcttggaaca ggactacatc 540

aagaaggttc ttggtgagca ggagcagcat atggcggtga acttctaccc caagtgcccg 600

gagccagagc tgacgttcgg actgccggcg cacaccgacc cgaacgccct caccatcctc 660

ctcatggacc agcaggtggc cggcctgcaa gttctcaagg aaggcaggtg gatcgccgtg 720

aatccacagc ccaacgcgct ggtgatcaac attggtgatc agctacaggc gctaagcaac 780

ggaagataca agagcgtgtg gcaccgtgct gtcgtcaact ctgacaaagc gaggatgtcc 840

gtcgcatcgt tcctgtgccc ctgcaacgac gtgctcatcg gcccagctca gaagctcatc 900

accgatggct ccccggccgt ctaccggaac tacacctacg acgagtacta caagaagttc 960

tggagcagaa acctcgacca agaacactgc ttggagctct tcagaacaac acctacagac 1020

acatcttga 1029

<210> 3

<211> 352

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Pro Ala Ile Ala Lys Pro Leu Leu Ser Asp Leu Val Ala Gln

1 5 10 15

Ser Gly Gln Val Pro Ser Ser His Ile Arg Pro Val Gly Asp Arg Pro

20 25 30

Asp Leu Asp Asn Val Asp His Glu Ser Gly Ala Gly Ile Pro Val Ile

35 40 45

Asp Leu Lys Gln Leu Asp Gly Pro Asp Arg Arg Lys Val Val Glu Ala

50 55 60

Ile Gly Ser Ala Cys Glu Thr Asp Gly Phe Phe Met Val Lys Asn His

65 70 75 80

Gly Ile Pro Glu Glu Val Val Glu Gly Met Leu Arg Val Ala Arg Glu

85 90 95

Phe Phe His Met Pro Glu Ser Glu Arg Leu Lys Cys Tyr Ser Asp Asp

100 105 110

Pro Lys Lys Ala Ile Arg Leu Ser Thr Ser Phe Asn Val Arg Thr Glu

115 120 125

Lys Val Ser Asn Trp Arg Asp Phe Leu Arg Leu His Cys Tyr Pro Leu

130 135 140

Glu Ser Phe Ile Asp Gln Trp Pro Ser Asn Pro Pro Ser Phe Arg Gln

145 150 155 160

Val Val Gly Thr Tyr Ser Arg Glu Ala Arg Ala Leu Ala Leu Arg Leu

165 170 175

Leu Glu Ala Ile Ser Glu Ser Leu Gly Leu Glu Arg Gly His Met Val

180 185 190

Ser Ala Met Gly Arg Gln Ala Gln His Met Ala Val Asn Tyr Tyr Pro

195 200 205

Pro Cys Pro Gln Pro Glu Leu Thr Tyr Gly Leu Pro Gly His Lys Asp

210 215 220

Pro Asn Ala Ile Thr Leu Leu Leu Gln Asp Gly Val Ser Gly Leu Gln

225 230 235 240

Val Gln Arg Asn Gly Arg Trp Val Ala Val Asn Pro Val Pro Asp Ala

245 250 255

Leu Val Ile Asn Ile Gly Asp Gln Ile Gln Ala Leu Ser Asn Asp Arg

260 265 270

Tyr Lys Ser Val Leu His Arg Val Ile Val Asn Ser Glu Ser Glu Arg

275 280 285

Ile Ser Val Pro Thr Phe Tyr Cys Pro Ser Pro Asp Ala Val Ile Ala

290 295 300

Pro Ala Gly Ala Leu Val Asp Gly Ala Leu His Pro Leu Ala Tyr Arg

305 310 315 320

Pro Phe Lys Tyr Gln Ala Tyr Tyr Asp Glu Phe Trp Asn Met Gly Leu

325 330 335

Gln Ser Ala Ser Cys Leu Asp Arg Phe Arg Pro Asn Asp Gln Ala Val

340 345 350

<210> 4

<211> 342

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Asp Gln Leu Ile Ser Thr Ala Asp His Asp Thr Leu Pro Gly

1 5 10 15

Asn Tyr Val Arg Pro Glu Ala Gln Arg Pro Arg Leu Ala Asp Val Leu

20 25 30

Ser Asp Ala Ser Ile Pro Val Val Asp Leu Ala Asn Pro Asp Arg Ala

35 40 45

Lys Leu Val Ser Gln Val Gly Ala Ala Cys Arg Ser His Gly Phe Phe

50 55 60

Gln Val Leu Asn His Gly Val Pro Val Glu Leu Thr Leu Ser Val Leu

65 70 75 80

Ala Val Ala His Asp Phe Phe Arg Leu Pro Ala Glu Glu Lys Ala Lys

85 90 95

Leu Tyr Ser Asp Asp Pro Ala Lys Lys Ile Arg Leu Ser Thr Ser Phe

100 105 110

Asn Val Arg Lys Glu Thr Val His Asn Trp Arg Asp Tyr Leu Arg Leu

115 120 125

His Cys Tyr Pro Leu His Arg Tyr Leu Pro Asp Trp Pro Ser Asn Pro

130 135 140

Pro Ser Phe Arg Glu Ile Ile Ser Thr Tyr Cys Lys Glu Val Arg Glu

145 150 155 160

Leu Gly Phe Arg Leu Tyr Gly Ala Ile Ser Glu Ser Leu Gly Leu Glu

165 170 175

Gln Asp Tyr Ile Lys Lys Val Leu Gly Glu Gln Glu Gln His Met Ala

180 185 190

Val Asn Phe Tyr Pro Lys Cys Pro Glu Pro Glu Leu Thr Phe Gly Leu

195 200 205

Pro Ala His Thr Asp Pro Asn Ala Leu Thr Ile Leu Leu Met Asp Gln

210 215 220

Gln Val Ala Gly Leu Gln Val Leu Lys Glu Gly Arg Trp Ile Ala Val

225 230 235 240

Asn Pro Gln Pro Asn Ala Leu Val Ile Asn Ile Gly Asp Gln Leu Gln

245 250 255

Ala Leu Ser Asn Gly Arg Tyr Lys Ser Val Trp His Arg Ala Val Val

260 265 270

Asn Ser Asp Lys Ala Arg Met Ser Val Ala Ser Phe Leu Cys Pro Cys

275 280 285

Asn Asp Val Leu Ile Gly Pro Ala Gln Lys Leu Ile Thr Asp Gly Ser

290 295 300

Pro Ala Val Tyr Arg Asn Tyr Thr Tyr Asp Glu Tyr Tyr Lys Lys Phe

305 310 315 320

Trp Ser Arg Asn Leu Asp Gln Glu His Cys Leu Glu Leu Phe Arg Thr

325 330 335

Thr Pro Thr Asp Thr Ser

340

Claims

1.一种从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性的基因，其特征在于，所述从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性的基因为OsS5H1和OsS5H2，所述OsS5H1的核苷酸序列为Seq IDNo.1，所述OsS5H2的核苷酸序列为Seq ID No.2。

2.如权利要求1所述的从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性的基因，其特征在于，所述OsS5H1、OsS5H2进一步包括因插入、替代、缺失一个或多个碱基所产生的突变体等位基因以及衍生物。

3.一种如权利要求1所述的从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白为Seq ID No.1编码的Seq ID No.3、Seq ID No.2编码的Seq ID No.4。

4.如权利要求3所述蛋白，其特征在于，所述蛋白进一步与Seq ID No.3、Seq ID No.4所示序列有70％同源性的蛋白或者蛋白衍生物；

所述蛋白进一步包括因插入、缺失或替代一个或多个氨基酸所产生的功能发生改变的蛋白或者蛋白衍生物。

5.一种如权利要求1所述的从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性基因的鉴定方法，其特征在于，所述从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性的基因的鉴定方法包括:

6.如权利要求5所述的从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性基因的鉴定方法，其特征在于，所述从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性的基因的鉴定方法进一步包括：

(1)OsS5H1、OsS5H2基因蛋白表达载体的构建，通过将cDNA序列连接至相关蛋白表达载体上，转化大肠杆菌表达相关蛋白，通过超声法破碎细胞膜过柱提取相关蛋白进行生化功能分析；

(2)OsS5H1、OsS5H2基因植物双元表达载体的构建，通过将cDNA序列连接至相关植物双元表达载体上，转化水稻，提取SA和2,5-DHBA,通过高效液相色谱(HPLC)进行定量，检测OsS5H1、OsS5H2的体内生化功能；

(3)s5h1s5h2突变体的创建，在OsS5H1、OsS5H2相应基因组序列上设计gDNA敲除片段构架至pC1300-Cas9载体，通过农杆菌转染水稻获得相关基因功能缺失的双突变体材料；

(4)s5h1s5h2突变体不同时期SA含量的测定，通过对OsS5H1、OsS5H2基因功能缺失突变材料SA含量进行分析，候选基因缺失使得SA含量升高，SA降解产物2,5-DHBA含量降低；

(5)s5h1s5h2突变体抗病性的分析，通过对大田成熟期的功能缺失突变体接种白叶枯菌，分析突变体和WT之间病斑长度的差异判断突变后其抗病性的变化；

(6)s5h1s5h2突变体农艺性状分析，对不同时期SA含量以及抗病性进行分析后，还需对相应的农艺性状进行分析。

7.一种如权利要求1所述从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性的基因在调控植物抗病性中的应用，其特征在于，所述应用方法包括通过下调所述基因的表达或者功能缺失，调控植物抗病性。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用方法进一步包括：通过下调所述基因在植物中表达的蛋白表达量或活性，增加抗病性。

9.一种利用权利要求1所述从水稻中分离鉴定的提高水稻抗病性的基因等融合构建表达载体，其特征在于，所述表达载体为pC1300-Cas9，并通过农杆菌介导的基因转化法将CRISPR-Cas9载体转入水稻受体盐稻8号中。

10.一种权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用方法进一步包括：通过上调所述基因在植物中表达的蛋白表达量或活性，将体内SA转化成2，5-DHBA，进而获得SA含量降低的植物。