CN101663398A

CN101663398A - 控制植物的开花时间的svp基因

Info

Publication number: CN101663398A
Application number: CN200880004329A
Authority: CN
Inventors: 李钟燮; 李政焕; 刘圣殿; 朴秀玹; 黄日斗; 安芝薰; 崔良焘
Original assignee: Seoul National University Industry Foundation
Current assignee: Seoul National University Industry Foundation
Priority date: 2007-02-06
Filing date: 2008-01-24
Publication date: 2010-03-03
Also published as: WO2008096969A1; US20080263726A1; KR100833473B1

Abstract

本发明涉及源自拟南芥的控制植物的开花时间的SVP蛋白、编码SVP蛋白的基因、含有所述基因的重组载体、被所述重组载体转化的植物、使用所述基因控制植物的开花时间的方法、以及使用所述SVP蛋白或其编码基因搜寻控制植物的开花时间的蛋白或基因的方法。

Description

控制植物的开花时间的SVP基因

技术领域

本发明涉及控制植物的开花时间的基因和用该基因控制植物的开花时间的方法。具体而言，本发明涉及源自拟南芥的控制植物的开花时间的SVP蛋白、编码SVP蛋白的基因、含有该基因的重组载体、被所述重组载体转化的植物、采用所述基因控制植物的开花时间的方法、以及采用所述SVP蛋白或SVP蛋白的编码基因搜寻控制植物的开花时间的蛋白或基因的方法。

背景技术

植物的开花时间通常受环境条件的影响或由基因所决定。影响植物的开花时间的因素包括外部环境条件(如光和温度)和内部条件(如生长信号等)。对于拟南芥，长期公认其开花时间随光周期而改变；即在长日照条件下开花时间加速，而在短日照条件下开花时间被延迟。例如，已知当植物于低温下生长时植物的开花时间明显延迟。据信这种温度影响是由于整体新陈代谢速率的减慢。

植物是固着生物，因此暴露在环境中易受到各种各样的非生物的和生物的环境的胁迫。其中最常见的是温度。在植物可忍受的温度范围内，很好理解对低温(尤其是接近冰点的温度)的反应。植物进化产生了大量的适应性机制，以应对低温的挑战。在拟南芥中，通过延长低温胁迫可加速开花，该处理被称为春化。开花基因座C(FLC)的后天沉默对春化处理很重要，且这种沉默是由于春化1(VRN1)基因、春化2(VRN2基因)、以及春化非敏3(VIN3)基因的活性。

突变植物的分析鉴别了在冷驯化中依赖和不依赖于C重复结合因子(CBF)的信号传导途径，表明了植物采用不同机制以应对低温(Sharma，P.etal.，2005 Bioessays 27：1048-1059)。

对于拟南芥而言，在低温适应期中诱导了很多基因的表达。具体而言，发生了包括RD29A(也称为COR78或LTI78)、KIN1、KIN2、COR15A和COR47(或RD17)等基因的表达。

人们越来越关注全球气温变化的影响，其明显影响了植物生长的环境温度。多组证据表明，近来观察到的许多植物物种的开花时间的变化和植物呼吸速率的上升与环境温度的这些变化密切相关(Fitter，A.H.and Fitter，R.S.2002.Science 296：1689-1691；Atkin，O.K.and Tjoelker，M.G.2003.TrendsPlant Sci.8：343-351)。

在USP No.6,225,530中，公开了从拟南芥中分离的控制植物的开花时间的FT(开花基因座T)基因，由FT基因编码的多肽和采用FT基因调节植物的开花时间的方法。

尽管我们对通过低温来调控植物生长的认识有了很大进步，但目前针对环境温度变化的植物反应的分子机制仍知之甚少。

发明内容

在这种情况下，在研究拟南芥中与控制开花时间的新机制相关的基因时，本发明人发现了短营养阶段(short vegetative phase)(SVP)基因能够调节拟南芥中的环境温度信号传导过程以及SVP介导的对开花基因座T(FT)基因表达的控制能够调节生长转变至开花阶段的时间，以应对环境温度的变化，从而完成本发明。

因此，本发明的一个目的是提能够供控制植物的开花时间的SVP蛋白。

本发明的另一目的是提供编码所述控制植物的开花时间的SVP蛋白的基因。

本发明的另一目的是提供一种重组载体，其中，该重组载体含有所述控制植物的开花时间的基因。

本发明的另一目的是提供一种植物，其中，该植物转化有所述载体。

本发明的另一目的是提供一种控制植物的开花时间的方法，其中，该方法通过使用所述控制植物的开花时间的基因来控制植物的开花时间。

本发明的另一目的是提供采用所述控制植物的开花时间的基因和蛋白来搜寻可控制植物的开花时间的蛋白或基因的方法。

本发明所分离的SVP基因和由所述基因表达的SVP蛋白，可用于改进与植物开花相关的植物的光周期并且可用于搜寻在其他植物中负责调控开花时间的基因。此外，本发明的优势在于，通过加速植物的开花时间可在短时间内产生花和种子，或通过延迟植物的开花时间持续诱导营养生长，以改善有用植物部位(如叶片或茎)的生产率。

附图说明

图1显示了拟南芥中SVP在依赖温度的开花控制中的作用。(A)长日照条件下开花时间的突变体组在23℃和16℃下的开花时间。以上所列基因型的数值表示了在16℃和23℃下开花时间的比值(16℃/23℃)。误差线表示标准偏差。插图显示了在23℃和16℃下生长的野生型哥伦比亚(Columbia)(Col)植物和svp-32植物。(B)低温对野生型植物(Col)中SVP表达的影响。通过实时PCR测定在指定温度下生长的10天龄幼苗叶片中SVP、FLC、以及FT的表达。以微管蛋白作为内标。(C)在23℃和16℃下生长的SVP::GUS和FT::GUS植物的10天龄幼苗的组织化学分析。比例尺500μm。(D)在16℃和23℃下温育的洋葱表皮细胞中的SVP-GFP融合蛋白的细胞核定位(nuclear localization)。以箭头指示细胞核。采用4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)作为细胞核染剂。比例尺10μm。

图2显示了SVP与FCA、FVE、以及FLC的遗传相互作用。(A)在长日照条件下svp-32 fca-9、以及svp-32 fve-3双突变体在23℃和16℃的开花时间。以下所列数值表示开花时间的比值(16℃/23℃)。(B)在10天龄幼苗中fca和fve的突变对SVP表达的影响。(C)在缺失和获得FLC等位基因功能的10天龄幼苗中的SVP表达。(D)在SVP缺失和获得功能突变体的10天龄幼苗中的FLC表达。(E)包含svp、fri、以及flc的各种突变组合的突变体，在23℃和16℃下的开花时间。SVP fri FLC和svp fri FLC分别表示野生型哥伦比亚植物和svp-32植物。以下所列数值表示开花时间的比值(16℃/23℃)。

图3显示了SVP作为FT阻遏物的作用。(A)在23℃和16℃下野生型(Col)和svp-32植物中FT的表达时程。在6天、8天、10天、12天以及14天龄幼苗中监测的FT表达水平。(B)野生型(Col)和svp-32植物的10天龄幼苗在23℃时的pFT::GUS表达模式。比例尺500μm。(C)svp-32 ft-10、svp-3235S::FT、以及ft-10soc1-2双突变体在23℃和16℃下的开花时间。以下所列数值表示开花时间比值(16℃/23℃)。

图4显示了SVP蛋白与FT启动子中vCArG III的结合。(A)采用以SVP-HA和FLC-HA结构转染的原生质体的染色质免疫沉淀试验。表示了通过PCR分析在1.8-kb的FT启动子和不同片段中鉴定的六个CArG基序(vCArG I-VI)变种的位置。四倍系列稀释的输入DNA作为半定量标准。输入，总输入染色质DNA；HA，使用HA抗体选择的DNA；Myc，使用Myc抗体选择的DNA。(B)SVP-HA蛋白对FT启动子活性的影响。显示了试验所用的报告基因和效应基因的图示。CArG基序的变种为灰色阴影，并以小写字母表示CArG基序所引入的突变。m3FT::LUC表示含有突变vCArGIII的FT::LUC结构。

具体实施方式

为实现上述目的，本发明提供了称为短营养阶段(SVP)的蛋白，该蛋白源自拟南芥且由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成，并且能控制植物的开花时间。

本发明所述的能够控制植物的开花时间的蛋白的范围包括：从拟南芥中分离的具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白和该蛋白的功能等效物。术语“功能等效物”是指由于氨基酸残基的增加、取代或缺失，而使所述功能等效物具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，还更优选至少95％的同源性的氨基酸序列，从而表示所述功能等效物是具有与SEQ ID NO：2所代表蛋白实质相同的生理活性的蛋白。

术语“实质相同的生理活性”是指若在植物中被过度表达，所述活性可延迟植物开花。更具体而言，可以是能够实现通过控制植物的开花时间来应对环境温度变化的活性。优选地，本发明所述的控制植物的开花时间的SVP蛋白具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明所述的SVP蛋白可以通过从天然来源(如植物细胞)中提取或通过使编码SVP蛋白的重组核苷酸表达或通过化学合成方法获得。

本发明还提供了编码所述控制植物的开花时间的SVP蛋白的基因。本发明所述的控制植物的开花时间的基因包括编码SVP蛋白的基因组DNA和cDNA。优选地，本发明所述的基因可含有如SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列。而且，本发明所述的基因可以与能够促进植物开花的FT(开花基因座T)基因的CArG基序直接相连，以抑制FT基因的表达，从而控制植物的开花时间。

所述核苷酸序列的变体也包括在本发明范围之内。具体而言，所述基因可含有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，还更优选至少95％的同源性的核苷酸序列。所述特定的多聚核苷酸的“序列同源性％”是通过比较在待比较区域中具有优化排列的两个核苷酸序列而确定的。在这点上，在待比较区域中的一部分多聚核苷酸序列与参照序列(无任何增加或缺失)相比可含有与两个序列的优化排列相关的增加或缺失(即缺口)。

本发明还提供了含有本发明所述的控制植物的开花时间的基因的重组载体。所述重组载体优选是重组的植物表达载体。

术语“重组”是指能够复制异源核苷酸，或能够表达所述核苷酸、肽、异源肽、或由异源核苷酸编码的蛋白的细胞。重组细胞能以正义或反义的形式表达在天然状态的细胞中未发现的基因或基因片段。此外，倘若通过人工手段将所述基因修饰或重转入细胞，所述重组细胞可表达天然状态发现的基因。

本文中术语“载体”是指递送至细胞的DNA片段和核苷酸分子。载体可复制DNA并在宿主细胞中独立复制。术语“递送系统”和“载体”通常可交替使用。术语“表达载体”是指含有所需编码序列和在特定宿主微生物中表达连锁编码序列所必需的其他适当核苷酸序列的重组DNA分子。可用于真核细胞的启动子、增强子、终止信号和多腺苷酸化信号都是公共熟知的。

植物表达载体的优选实例是Ti-质粒载体，当载体存在于适当宿主中(如根癌农杆菌)时所述Ti-质粒载体可以将自身的一部分(即所谓的T区)转入植物细胞。其他类型的Ti-质粒载体(参见EP 0116718B1)目前通常用于将杂交基因转入到可以产生新植物的原生质体，这是通过适当地将植物细胞或杂交DNA插入至植物基因组而实现的。Ti-质粒载体的具体优选形式是EP0 120 516 B1和USPNo.4,940,838中公开的所谓二元载体。可用于将本发明DNA导入宿主植物的其他载体可选自双链植物病毒(例如CaMV)、单链植物病毒、以及源自双粒病毒等的病毒载体(例如非完整植物病毒载体)。特别在植物宿主不能被适当的转化时，采用所述载体很有优势。

所述表达载体可含有至少一个选择标记。所述选择标记是具有可通过普通化学方法实现选择的特性的核苷酸序列。可用于区分转化细胞和非转化细胞的任何种类的基因都可作为选择标记。实例包括：除草剂(如草甘膦和草酊膦)抗性基因；抗生素(如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素和氯霉素)抗性基因，但不限于此。

对于本发明一个实施方式所述的植物表达载体，启动子可以是CaMV35S、肌动蛋白、泛素、pEMU、MAS或组蛋白启动子中的任意一个，但不限于此。术语“启动子”是指能够结合RNA聚合酶以启动转录且对应于结构基因上游DNA区域的DNA分子。术语“植物启动子”表示可启动植物细胞转录的启动子。术语“组成型启动子”表示在大部分环境条件和生长状态或细胞分化状态下都有活性的启动子。因为可采用多种机制在不同阶段选择转化体，本发明优选组成型启动子。因此，本发明并不限制选择组成型启动子的可能性。

对于上文描述的终止子，本发明可采用任何常规的终止子。实例包括：胭脂碱合酶(NOS)、水稻α-淀粉酶RAmyl A终止子、菜豆碱终止子、以及根癌农杆菌Optopine基因的终止子等，但不限于此。关于终止子的必要性，公知该区域能增强植物细胞转录的可靠性和效率。因此，在本发明中非常优选使用终止子。

本发明还提供了被本发明所述重组载体转化的植物。植物转化是指任何能够将DNA递送到植物中的方法。这种转化方法不必要具有再生期和/或组织培养期。对于双子叶植物和单子叶植物而言，植物种的转化都非常普通。原则上，可采用任何转化方法将本发明的杂交DNA转化到适宜的祖细胞中。可以在以下方法中选择合适的转化方法：用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.et al.，1982，Nature 296，72-74；Negrutiu I.et al.，June 1987，PlantMol.Biol.8，363-373)；用于原生质体的电穿孔方法(Shillito R.D.et al.，1985Bio/Technol.3，1099-1102)；用于植物组成部分的微注射方法(Crossway A.etal.，1986，Mol.Gen.Genet.202，179-185)；用于多种植物组成部分的粒子轰击方法(DNA或RNA包被)(Klein T.M.et al.，1987，Nature 327，70)；或通过植物侵入或完全成熟花粉或小孢子的转化由根癌农杆菌介导基因转移的(非完整)病毒感染方法(EP 0 301 316)等。本发明优选的方法包括农杆菌介导的DNA转移。尤其是，优选采用EP A 120 516和USP No.4,940,838公开的所谓二元载体技术用于本发明。

术语“植物组织”包括分化的或未分化的植物组织，包括根、茎、叶、花粉、种子、癌组织和具有多种形状的用于培养的细胞，即单细胞、原生质体、芽和愈伤组织，但不限于此。植物组织可以是位于植物中的植物组织或为器官培养、组织培养或细胞培养状态下的植物组织。

本发明还提供了使用本发明的能够控制植物的开花时间的基因来控制植物的开花时间的方法。更具体而言，本发明提供了控制植物的开花时间的方法，其特征在于，所述植物的开花时间被植物中SVP基因的过度表达所延迟或被植物中SVP基因表达的抑制所加速。

对于在植物中实施过度表达SVP基因的方法，SVP基因可被导入到带有SVP基因的植物或不带SVP基因的植物中。关于这点，术语“基因过度表达”是指SVP基因以高于野生型植物的正常水平被表达。对于将SVP基因导入植物，在启动子的调节下，含有SVP基因的表达载体可用于转化植物。对此，启动子无特殊限定只要能够实现所插入基因在植物中的过度表达即可。这种启动子的非限制性实例包括：CaMV的35S RNA和19S RNA启动子；源于元参花叶病毒(FMV)的完整转录启动子和TMV的外壳蛋白启动子。此外，为了实现SVP基因在单子叶植物或木本植物中的过度表达，可使用泛素启动子。

对于抑制SVP基因在植物中的表达的方法，可采用本领域已知的多种方法。术语“基因表达的抑制”包括抑制基因转录以及抑制其翻译成蛋白。此外，抑制不仅包括基因表达的完全终止也包括表达的降低。

为抑制特定内源基因在植物中的表达，使用反义分子是最普遍的。反义分子抑制靶基因表达的机制，存在如下几种方式：通过形成三链抑制转录的启动，通过在RNA聚合酶形成开环的位点形成杂交链的抑制，与负责进行翻译的RNA形成杂交链的抑制，在内含子和外显子之间的连接位置上形成杂交链的剪接抑制，在形成Splisome的位点上形成杂交链的剪接抑制，通过与mRNA形成杂交链来抑制由细胞核向细胞质的运输，以及通过在翻译启动子的结合位点上形成杂交链来抑制翻译启动等。所述方法抑制转录、剪接或翻译过程，最终都能够抑制靶基因的表达。

本发明所用的反义分子可基于各种机制来抑制靶基因的表达。示例性的反义分子包括：形成三链的寡核苷酸、核酶、RNAi、以及反义分子等。形成三链的寡核苷酸环绕DNA以形成三链，从而抑制了转录的启动(Maher etal.，Antisense Res.和Dev.，1(3)：227，1991；Helene，C.，Anticancer Drug Design，6(6)：569，1991)。核酶是可特异性消化单链RNA的RNA分子。核酶可被人工改造，以使其能够识别包含在RNA分子内的特定核苷酸序列，并进行位点特异性的消化(Cech，J.Amer.Med.Assn.，260：3030，1998)。因此，该方法的主要优势在于特异性地针对特定的核苷酸序列，能够特异性地钝化含有特定序列的mRNA分子。RNAi方法是使用对核苷酸序列有特异性作用的具有发卡形状的小RNA分子来抑制转录水平或转录后水平(Mette et al.，EMBO J.，19：5194-5201，2000)。反义核苷酸是其中至少一部分序列与特定mRNA分子互补的DNA或RNA分子(Weintraub，Scientific American，262：40，1990)。反义核苷酸与细胞所含的相应mRNA杂交以形成双链分子。从而，抑制了mRNA的翻译(Marcus-Sakura，Anal.Biochem.，172：289，1988)。

本发明所述的控制植物的开花时间的方法可通过抑制SVP基因的表达而加速园艺植物的开花时间，以用于在短期内产生花和种子，或通过过度表达SVP基因而延迟作物的开花时间以实现营养生长的持续诱导，以用于增加可从农作物中获取的有用植物部分的生产率。

所述植物可以是包括水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、红豆、燕麦和栗在内的食用作物；包括拟南芥、大白菜(Chinese cabbage)、萝卜、辣椒、草莓、番茄、西瓜、黄瓜、卷心菜(cabbage)、甜瓜、西葫芦、韭菜、洋葱和胡萝卜在内的蔬菜作物；包括人参、烟草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、野生芝麻、花生和油菜籽在内的特用作物；包括苹果、梨、枣、桃、猕猴桃、葡萄、桔子、柿子、李子、杏和香蕉在内的水果；包括玫瑰、剑兰、大丁草、康乃馨、菊花、百合、和郁金香在内的花卉；和包括黑麦草、红三叶草、鸭茅、紫花苜蓿、高酥油草、以及多年生黑麦草在内的饲料作物。

本发明还提供了通过上述的本发明方法制备的具有受控的开花时间的转化植物。

通过本领域公知方法可获得具有受控的开花时间的植物，例如有性繁殖方法或无性繁殖方法。更具体而言，通过有性繁殖方法获得本发明植物是首先通过花授粉产生种子然后用其进行繁殖而实现的。此外，也可通过无性繁殖方法获得，其首先以包括本发明SVP基因的重组载体转化植物，然后诱导愈伤组织，按常规方法形成根并移植于土壤。换句话说，将已被包括SVP基因的重组载体转化的植物部分置于本领域已知的适宜培养基中在适宜条件下培养以诱导形成愈伤组织，然后在形成植物芽之后立即将其转移至不含激素培养基进行培养。大约2周后，将芽转移至新培养基以诱导形成根。一旦根被诱导，将其移植至土壤中以获得具有受控的开花时间的植物。根据本发明，转化植物不仅包括整株植物还包括由其获得的组织、细胞和种子。此外，本发明还提供了使用SVP蛋白或该蛋白的编码基因进行分析以搜寻控制开花时间的蛋白或基因的方法，其中，所述分析选自由以下方法所组成的组中：DNA芯片法、蛋白芯片法、聚合酶链式反应(PCR)、RNA印迹分析(Northern blot analysis)、DNA印迹分析(Southern blot analysis)、酶联免疫吸附分析(ELISA)和二维(2D)凝胶电泳分析。此外，通过确定出能够与本发明基因结合的物质或可抑制或活化SVP基因表达的物质，本发明所述方法可以作为研究感兴趣植物的开花机制的工具。更具体而言，可采用多种方法进行研究，包括DNA芯片法、蛋白芯片法、聚合酶链式反应(PCR)、RNA印迹分析、DNA印迹分析、酶联免疫吸附分析(ELISA)和二维(2D)凝胶电泳分析等。

将参照以下实施例更为具体地描述本发明。但是，其仅是具体举例说明本发明而本发明范围并不受这些实施例的限制。

实施例

材料与方法

植物材料、生长条件、以及对开花时间的测定

除非特别指明，本研究所用的所有突变都是基于哥伦比亚(Col)本底(columbia background)。svp-31(SALK_026551)和svp-32(SALK_072930)都是SVP的T-DNA插入株，是从拟南芥生物资源中心(ABRC)所获取的(Alonso，J.M.et al.，2003.Science 301：653-657)。为确认这些等位基因的T-DNA插入位点，我们对以左边界引物和基因特异性引物扩增的PCR产物进行了测序。之前已经公开了从H.Sommer获得的过度表达SVP的植物(Masiero，S.et al.，2004.Development 131：5981-5990)。在23℃或16℃下，并提供120μmol m^-2s^-1光强度的长日照(LD)条件[16/8h(光/暗)]下，植物在土壤或MS培养基中生长。通过PCR的基因分型来确认双突变体的纯合性。植物的开花时间以至少12株植物的初生叶总数表示。

表达分析

控制开花时间的基因的表达水平可通过由半定量反转录酶介导的PCR或实时PCR来确定。采用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)提取总RNA，并使用1μg合成互补DNA。引物序列和扩增条件都是符合要求可用的。采用ABI PRISM 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)进行实时PCR分析，以微管蛋白的表达水平作为标准。对于组织化学的GUS分析，我们构建了SVP::GUS翻译融合体。使用JH2929(5’-GTGGTCGACACTTTTTATTTTACTCTGG-3’)(SEQ ID NO：3)和JH2985(5’-GGATCCGCACCACCATACGGTAAGCTGC-3’)(SEQ ID NO：4)扩增出4.9-kb的SVP基因组区域，然后将其与GUS报告基因融合在一起。从K.Goto获得FT::GUS植物。SVP cDNA-GFP嵌合结构作为报告基因以检测SVP的定位模式。为了制备35S启动子驱动的SVP cDNA-GFP结构，将GFP序列与35S::SVP嵌合质粒的C末端在结构内融合。采用粒子轰击系统(PDS-1000/He；Bio-Rad，Hercules，Calif.)，将包被DNA的钨粒递送至洋葱表皮细胞中。在23℃或16℃下温育24小时后，在荧光显微镜(Carl Zeiss)下观察亚细胞的定位模式(localization pattern)。

染色质免疫沉淀(ChIP)分析

按(Tang，W.和Perry，S.E.2003.J.Biol.Chem.278：28154-28159)的描述并经稍微修正进行ChIP试验。以融合于HA标签的SVP cDNA或融合于HA标签的FLC cDNA转染拟南芥原生质体，然后在室温下温育24小时。使用原生质体提取物通过蛋白质印迹来测定SVP-HA和FLC-HA蛋白的表达。甲醛固定后，通过超声波处理剪切，并分离原生质体的染色质。使用鼠抗-HA抗体(Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，Calif.)或抗-Myc 9B11抗体(Cell SignalingTechnology，Beverly，Mass.)对基因组片段进行免疫沉淀。跨越启动子内六个CArG基序(vCArG)和FT第一内含子中的CArG基序的五个序列片段，从免疫沉淀的基因组DNA中被扩增出来。使用针对HA或Myc的抗体，从免疫沉淀中纯化的DNA在35个循环后的PCR产物是可见的。将由以非选择性的输入DNA和Myc抗体所选择的DNA分别作为阳性和阴性对照的PCR模板。通过SVP-HA和FLC-HA蛋白在光成像板(Fujifilm BAS 2500；Fuji，Tokyo，Japan)上进行CArG基序丰度的定量分析。

荧光素酶报告基因分析

为制备FT::LUC结构，我们使用JH3096(5’-TGAACACTAACATGATTGAATGACA-3’)(SEQ ID NO：5)和JH2865(5’-GATCTTGAACAAACAGGTGGT-3’)(SEQ ID NO：6)扩增了1.8-kb的FT启动子片段，并将其与荧光素酶融合。这个在FT启动子内含有突变的vCArG基序的荧光酶报告基因结构被用作报告基因，以检查vCArG基序对SVP与FT启动子特异性结合的影响。利用QuickChange II XL定点突变试剂盒(Stratagene，La Jolla，Calif.)按照供应商的说明，通过定点突变制备得到含有突变vCArG基序的FT::LUC结构。通过测序，确定了突变已被引入到这些结构的vCArG基序中。具有或不具有MADS结构域的SVP(分别是35S::SVP-HA和35S::SVP ΔM-HA)作为效应基因。报告基因和效应基因被共转染至原生质体中。以35S::GUS结构作为内标。以GUS活性来标准化荧光素的活性。

结果

作为确定植物中感知和转导环境温度信号的机制的第一步，我们测试了已知的控制开花时间的基因的突变体对生长环境温度变化的敏感度。在受试的开花时间的突变体中，svp有损伤确实对这种变化不敏感。在16℃下，大部分开花时间的突变体的开花被明显延迟，其开花时间的比值((16℃/23℃)在1.1-2.0范围内(图1的A)，除ld-1之外。但是，svp-31和svp-32突变体，SVP的T-DNA等位基因，在23℃和16℃下的开花时间几乎相同(图1的A)。svp突变体早开花，尤其是在16℃下，表明了SVP活性的降低显著减弱了植物对低温的反应，且SVP活性的缺乏会导致低温效应的损失。反之，SVP过度表达植物晚开花，尤其是在23℃下，表明了SVP过度表达可模拟低温效应。降低的FT表达可能是造成35S::SVP植物晚开花表现型的原因。35S::SVP植物的温度反应较弱可由不同的FT表达所解释，如35S::SVP植物在23℃的FT表达高于16℃的表达。由于AGL24(最接近的SVP同源体)功能的缺失不会诱导温度的非敏性，SVP可能在环境温度感知中起非冗余作用(nonredundant role)(Yu，H.et al.，2002.Proc.Natl.Acad.Sci.99：16336-16341)。

通过实时PCR分析野生型植物在不同温度下的SVP表达模式的特征化，表明了在16℃下叶片中的SVP的表达被轻微地增强(图1的B)。相反，16℃时叶片中的FT的表达被强烈地抑制。组织化学β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)分析检测了整个扩大叶片中的SVP和FT的表达，但SVP的表达上升，而FT的表达下降(图1的C)。因为SVP的上调控对解释FT表达的急剧下降可能是不重要的，低温下SVP的转录后调节或改变SVP的蛋白与蛋白的相互作用也可能是造成FT转录降低的原因。考虑到将SVP作为开花阻遏物，这些数据表明了低温下叶片中存在其他的开花抑制因素。亚细胞定位分析显示了在16℃和23℃下SVP-绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白位于细胞核中(图1的D)。综合而言，这些结果表明了SVP表达是弱温度依赖型的，类似于其他种类的温敏基因。

通过需要拟南芥的FCA和FVE的遗传途径(温敏途径)感知了环境温度。对svp突变体与fca和fve突变体的遗传相互作用进行分析，以确定SVP是否以与FCA和FVE相同的遗传途径来运作。长日照条件下，在fca-9和fve-3突变体中观察到的晚开花表现型主要被SVP功能的缺失所掩蔽(图2A)，证明了svp对fca和fve突变体具有上位效应(epistatic)。

此外，甚至在缺乏SVP功能的情况下下还能够持续由fca和fve突变体所诱导的温度不敏感性，这表明SVP在温敏途径的FCA和FVE下游发挥作用，且SVP调控温度的信号传导。与此一致，在fca和fve突变体中SVP的表达被提高(图2的B)，而在其他自主途径突变体中则不是这样，flk和fpa突变体是温度敏感的(图1的A)。然而，SVP表达既不由春化所调节也不由长日照途径的关键调节因子CONSTANS(CO)所调节。观察到svp-32突变体和野生型植物的响应与赤霉素(GA)处理或不同光照条件的响应类似，这支持了SVP主要在温敏途径内起作用的假设。

检测了svp突变体与flc突变体的遗传相互作用，以试图确定SVP是否与FLC相互作用，因为FLC是在自主途径中介导春化效应的重要调节因子，且FLC和SVP都在FCA和FVE的下游起作用(图2的A，图2的B)。结果表示，在温敏途径中，在转录水平上SVP不依赖于FLC而起作用：存在FRI或FLC功能性等位基因时，SVP的表达无变化(图2的C)且FLC的表达仍然不受SVP活性增强或降低的影响(图2的D)。基于这些结果，我们构想SVP很可能是迄今未鉴定到的调控FCA和FVE的温度依赖作用的阻遏物。SVP表现为至少一定程度上在FLC下游起作用，以通过调整开花时间来应对环境温度。

通过svp-32的突变加速了fri flc、FRI flc、以及FRI FLC突变体的开花(图2的E)。相反地，由fri flc和FRI flc突变体展示的温度响应性在缺乏SVP功能时消失了，从而表明了SVP主要在温敏途径中发挥作用。有趣的是，在开花时，FRIFLC植物在23℃和16℃下具有相似的叶片数(叶片64比67)，这种现象还发现在fca和fve突变体中，该fca和fve突变体中甚至在缺乏功能性FRI时FLC的水平也被提高。FRIFLC植物的这种开花时间表现型的可能解释是在FRI FLC突变体中FLC的开花抑制活性被大幅提高，因此可进一步掩蔽16℃下的开花抑制作用。与假设一致，在与flc单突变体所表现的水平相似的fve flc和fca flc双突变体中，温度响应得到了恢复。尤其让人关注的是，通过svp-32突变大幅度地抑制了FRIFLC植物的超晚期开花(severelate flowering)，这表明了FLC需要SVP以抑制开花。考虑到已知的在蛋白复合物中MADS-Box蛋白在物理上的相互作用，这种通过svp-32突变的抑制的可能解释模式是温度信号传导期间复合物中SVP和FLC蛋白可能相互作用。近来有关在体内FLC是多聚体蛋白复合物的成分以及SVP与某些MADS-Box蛋白具有相互作用的发现支持了这种想法。

SVP作为开花阻遏物(floral repressor)的作用的结论引发了一个重要的问题：哪个开花时间基因(flowering time gene)使SVP在环境温度信号转导中发挥其负面影响？对svp突变体中已知开花时间基因的表达水平的分析显示，在23℃和16℃时svp-32突变体中花综合基因(floral integrator)FT的表达水平基本上都提高了(图3的A)。在一系列确定的生长阶段，svp-32突变体中观察到类似的FT上调。这些现象表明了温敏信号途径至少在一定程度上通过FT而起作用。

为确定受SVP影响的FT表达的反向调节而进行的报告基因试验显示，在svp-32突变体的叶片和脉管根组织中pFT::GUS的表达明显异常(图3的B)。这表明了野生型植物叶片的基本组织中FT的稳定抑制需要SVP。考虑到FT是主要的CO输出(Schmid，M.et al.，2003.Development 130：6001-6012)而FT的mRNA是引发开花的长距离信号传导机制的重要组成，在svp-32突变体中观察到的早开花表现型可作如下解释：SVP活性的缺乏诱导了FT mRNA在可运输至苗端的叶片中的积累，从而引发了花的发育。与SVP下游的FT作用一致，FT功能的缺乏部分抑制了svp-32突变体的早开花，FT的组成型表达掩蔽了svp-32突变体中的表现型(图3的C)，而在35S::SVP植物中FT的表达明显降低。重要的是，svp-32 ft-10双突变体表现出如同ft-10突变体的弱温度响应(开花时间的比值＝1.6对1.5，分别地)，尽管svp-32单突变体表现出温度不敏感性。在fca flc和fve flc突变体中观察到类似的温度敏感性突变体的表现型掩蔽。关于svp-32 ft-10突变体为什么比svp-32单突变体更具响应性的一种可能的解释模式是由于增强的FT活性svp-32突变体表现为温度不敏感性表现型，其开花促进效应在16℃更明显。当双突变体缺乏FT功能时，在16℃不发生FT的开花促进效应，因此，温度敏感性可恢复至类似于在ft-10单突变体中观察到的水平。虽然svp-32 ft-10突变体为较弱的温度敏感性的现象表明了SVP的环境温度信号传导机制要求FT和其他下游靶点。一个可能的候选靶点是CONSTANS 1过度表达抑制剂(SOC1)，因为soc1-2突变辅助降低了ft-10突变体的温度敏感性(ft-10 soc1-2双突变体开花时间比值＝1.2)(图3的C)，尽管soc1-2单突变体对温度变化有反应。与FT和SOC1的这种冗余作用相符，ft-10和soc1-2单突变体都未完全抑制svp-32植物的早开花表现型(图3的C)。而是svp-32突变体的早开花很大程度上被ft-10 soc1-2双突变所掩蔽。

SVP是MADS-Box蛋白的成员，其通过它的DNA结合基序发挥转录调节因子的作用。这样，可能出现通过直接与FT序列结合实现SVP蛋白对FT表达的反向调节。1.8-kb的FT启动子区域含有六个CArG基序(vCArG)变种(图4的A)和MADS-Box蛋白的共有结合序列以及FT的第一内含子含有直接结合FLC的CArG基序的发现，支持了这种假设。采用拟南芥原生质体进行染色质免疫沉淀(ChIP)试验以评估这个假设。采用HA抗体的染色质免疫沉淀，我们检测了来自含有vCArG III/IV、vCArG V、以及CArG VII片段的扩增产物(图4的A)，表明了在体内SVP和FLC与这些基序结合。

通过SVP-HA可更有效地沉淀vCArG III/IV和vCArG V基序。通过FLC-HA蛋白可高度地富集存在于FT第一内含子中的CArG VII基序，这与之前的发现一致。SVP-HA蛋白也可沉淀该基序，但SVP的结合亲和力表现得比FLC的更弱。因此可能是SVP优选与FT启动子vCArG基序结合而FLC优选与FT第一内含子中的CArG VII结合。对于观察到vCArG III/IV和V基序有效结合，我们通过在以SVP-HA蛋白和FT-启动子驱动的荧光素酶(LUC)报告基因转染的原生质体中进行瞬时表达试验证实在体内SVP蛋白与这些基序的直接结合(图4的B)。

大量SVP蛋白(35S::SVP-HA)导致了FT::LUC活性的降低。当所用的SVP蛋白不具有其MADS结构域(35S::SVP ΔM-HA)时，这种降低就消失，由此表明了荧光素酶活性的降低是由SVP通过MADS结构域与FT启动子的结合所诱导的。为检测SVP-HA抑制含有突变vCArG基序的FT启动子活性的能力的试验表明了SVP-HA不能降低含有突变vCArG III(m3FT::LUC)的FT::LUC的表达。这结果表明了对FT表达的SVP-介导反向调节需要vCArG III。

序列表

<110>首尔大学校产业财团

<120>控制植物的开花时间的SVP基因

<160>6

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>1546

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

atccttcacc aatcaaaacc ttctcatgtc ttcttctctc ctcgaccttt gaggtggaaa 60

attaaatata ttcccttagc tttttttctc ctttagtttt cttcttcttc ttgagttttt 120

tttcttttga tcctctctaa tttccttgtt gattcatcga ctagatctaa ttcttctcac 180

aaaagactga gtgtgttctt tctttcaaat ctttcaaaaa ctagggtttt tactgtcttg 240

aaatcatatt tattcttcta aatttagcaa aaagaacacg atttactttc catttcagtc 300

gtcttgtcac tctctctctc ttctttaaag tctccctttt tagcaaaaat tctctctctc 360

acaaaattta tttcctctgg cttcttcttc ctcctcctcc atctcttctc tttactctct 420

ctttaatcat ctctcattct tgaatcttga tccatcaaaa tcaatcccgt tctcgaaaga 480

tccattaaaa tcaaaaccta agctctctct cttgcttcta gggttttttt gttcgttgtg 540

atggcgagag aaaagattca gatcaggaag atcgacaacg caacggcgag acaagtgacg 600

ttttcgaaac gaagaagagg gcttttcaag aaagctgaag aactctccgt tctctgcgac 660

gccgatgtcg ctctcatcat cttctcttcc accggaaaac tgttcgagtt ctgtagctcc 720

agcatgaagg aagtcctaga gaggcataac ttgcagtcaa agaacttgga gaagcttgat 780

cagccatctc ttgagttaca gctggttgag aacagtgatc acgcccgaat gagtaaagaa 840

attgcggaca agagccaccg actaaggcaa atgagaggag aggaacttca aggacttgac 900

attgaagagc ttcagcagct agagaaggcc cttgaaactg gtttgacgcg tgtgattgaa 960

acaaagagtg acaagattat gagtgagatc agcgaacttc agaaaaaggg aatgcaattg 1020

atggatgaga acaagcggtt gaggcagcaa ggaacgcaac taacggaaga gaacgagcga 1080

cttggcatgc aaatatgtaa caatgtgcat gcacacggtg gtgctgaatc ggagaacgct 1140

gctgtgtacg aggaaggaca gtcgtcggag tctattacta acgccggaaa ctctaccgga 1200

gcgcctgttg actccgagag ctccgacact tcccttaggc tcggcttacc gtatggtggt 1260

tagagatgga acaattcaaa gaagttgatg gagtgaggag agtaatgtaa atctttttaa 1320

ctcggtagta acaagagaca atgtctaagt agtgaattct caaatgtttg tgtaagtttc 1380

tgcctatgga agaggctttc atttttatga ttttcactat gtatgatctc tcttcactgc 1440

atttctggtt agtaacgctt gtcaccgata aactttctcg ttatggaaag ttagaatata 1500

aaatattgta gaattttgat tatcgatata ctcttggtta gggatc 1546

<210>2

<211>240

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln Ile Arg Lys Ile Asp Asn Ala Thr Ala

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala

20 25 30

Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Ile Phe

35 40 45

Ser Ser Thr Gly Lys Leu Phe Glu Phe Cys Ser Ser Ser Met Lys Glu

50 55 60

Val Leu Glu Arg His Asn Leu Gln Ser Lys Asn Leu Glu Lys Leu Asp

65 70 75 80

Gln Pro Ser Leu Glu Leu Gln Leu Val Glu Asn Ser Asp His Ala Arg

85 90 95

Met Ser Lys Glu Ile Ala Asp Lys Ser His Arg Leu Arg Gln Met Arg

100 105 110

Gly Glu Glu Leu Gln Gly Leu Asp Ile Glu Glu Leu Gln Gln Leu Glu

115 120 125

Lys Ala Leu Glu Thr Gly Leu Thr Arg Val Ile Glu Thr Lys Ser Asp

130 135 140

Lys Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Gln Lys Lys Gly Met Gln Leu

145 150 155 160

Met Asp Glu Asn Lys Arg Leu Arg Gln Gln Gly Thr Gln Leu Thr Glu

165 170 175

Glu Asn Glu Arg Leu Gly Met Gln Ile Cys Asn Asn Val His Ala His

180 185 190

Gly Gly Ala Glu Ser Glu Asn Ala Ala Val Tyr Glu Glu Gly Gln Ser

195 200 205

Ser Glu Ser Ile Thr Asn Ala Gly Asn Ser Thr Gly Ala Pro Val Asp

210 215 220

Ser Glu Ser Ser Asp Thr Ser Leu Arg Leu Gly Leu Pro Tyr Gly Gly

225 230 235 240

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gtggtcgaca ctttttattt tactctgg 28

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

ggatccgcac caccatacgg taagctgc 28

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

tgaacactaa catgattgaa tgaca 25

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

gatcttgaac aaacaggtgg t 21

Claims

1、一种控制植物的开花时间的SVP蛋白，该SVP蛋白源自拟南芥，该SVP蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2、如权利要求1所述的控制植物的开花时间的SVP蛋白，其特征在于，该SVP蛋白根据环境温度的变化来控制植物的开花时间。

3、编码权利要求1所述的控制植物的开花时间的SVP蛋白的基因。

4、如权利要求3所述的编码控制植物的开花时间的SVP蛋白的基因，其特征在于，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

5、如权利要求3所述的编码控制植物的开花时间的SVP蛋白的基因，其特征在于，所述开花时间是基于开花基因座T的序列与CArG基序的结合，并通过抑制能够加速开花的开花基因座T的基因的表达来控制的。

6、一种重组载体，其中，该重组载体含有如权利要求3所述的编码控制植物的开花时间的SVP蛋白的基因。

7、一种植物，其中，该植物转化有权利要求6所述的重组载体。

8、一种控制植物的开花时间的方法，其中，该方法通过使用如权利要求3所述的编码控制植物的开花时间的SVP蛋白的基因来控制植物的开花时间。

9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述开花时间通过在植物中过度表达SVP基因而被延迟。

10、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述开花时间通过抑制植物的SVP基因的表达而被加速。

11、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物选自由以下植物所组成的组中：包括水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、红豆、燕麦和粟在内的食用作物；包括拟南芥、大白菜、萝卜、辣椒、草莓、番茄、西瓜、黄瓜、卷心菜、甜瓜、西葫芦、韭菜、洋葱和胡萝卜在内的蔬菜作物；包括人参、烟草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、野生芝麻、花生和油菜籽在内的特用作物；包括苹果、梨、枣、桃、猕猴桃、葡萄、桔子、柿子、李子、杏和香蕉在内的水果；包括玫瑰、剑兰、大丁草、康乃馨、菊花、百合和郁金香在内的花卉；和包括黑麦草、红三叶草、鸭茅、紫花苜蓿、高酥油草和多年生黑麦草在内的饲料作物。

12、一种转化植物，其中，该转化植物通过权利要求8-11中的任意一项所述的方法来控制开花时间。

13、一种搜寻控制植物的开花时间的蛋白或基因的方法，其中，该方法通过使用权利要求1中的SVP蛋白或该SVP蛋白的编码基因进行分析，该分析选自由DNA芯片法、蛋白芯片法、聚合酶链式反应、RNA印迹分析、DNA印迹分析、酶联免疫吸附分析和二维凝胶电泳分析所组成的组中。