CN112608930B

CN112608930B - BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用、具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法

Info

Publication number: CN112608930B
Application number: CN202110049541.3A
Authority: CN
Inventors: 范楚川; 周永明; 翟云孤; 黄会斌; 许磊
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-01-14
Filing date: 2021-01-14
Publication date: 2022-12-13
Anticipated expiration: 2041-01-14
Also published as: CN112608930A

Abstract

本发明属于油菜分子育种技术领域，尤其涉及BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用、具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对BnaSVP基因靶向突变，通过多代自交分离，获得不同拷贝突变组合的纯合突变体。通过两个世代不同地区对获得的纯合突变体进行开花期调查发现，与野生型相比，四个拷贝纯合突变体的开花期提前最多，在两个地区分别提前了40.57％和50.71％。其他不同拷贝组合突变的纯合突变体的开花期产生不同程度的开花期提前的现象，结果证明BnaSVP基因调控开花期的提前存在突变拷贝数量的累加效应。本发明为油菜花期调控的遗传改良提供重要的功能基因和育种材料。

Description

BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用、具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法

技术领域

本发明属于油菜分子育种技术领域，尤其涉及BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用、具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法。

背景技术

油菜不仅可以为人类提供食物油来源，而且也可以为动物提供丰富的蛋白质饲料，与此同时，油菜在工业生产上也起着十分重要的作用，因此，在农业生产中，油菜是一种必不可少的油料作物。油菜的开花期为农业生产上重要的农艺性状之一，合适的开花时间和开花周期可以使油菜的成熟期保持良好的一致性，进而在机械化收获过程中使机械化收获效率增加。开花时间是由一个复杂的遗传网络控制的，该遗传网络整合了许多内源性信号和环境刺激，例如春化、温度、光周期、赤霉素等。

甘蓝型油菜来源于甘蓝和白菜之间的自然杂交，是与拟南芥亲缘关系最近的农作物品种之一。截至目前为止，拟南芥中鉴定出了300多个与花期调控相关的基因，并且发现了控制开花期的各种途径中的许多关键调控因子。例如，FRIGIDA(FRI)，FLOWERING LOCUSC(FLC)和SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)是控制春化反应的必需基因，而CONSTANS(CO)基因在响应光周期反应过程中发挥至关重要的作用。另外还有FLOWERING LOCUS D(FLD)，FLOWERING LOCUS CA(FCA)和FLOWERING LOCUS KH DOMAIN(FLK)等一些基因可以通过抑制FLC基因的表达来促进花期的转变。在花期调控的ABCDE模型中，花发育的早期阶段，SVP和AGAMOUS-LIKE 24AGL24基因与APETALA1(AP1)相互作用，通过抑制B类PISTILLAT(API)和(AP3)、C类AGAMOUS(AG)和E类SEPALLATA1(SEP1)、SEP2、SEP3和SEP4基因来保证花期的精准调控。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用、具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本发明靶向甘蓝型油菜BnaSVP基因的四个同源拷贝，快速高效的获得了能稳定遗传的具有不同开花期的甘蓝型油菜种质资源，对油菜早熟品种的选育具有重要的意义。该突变体不含有T-DNA插入，和野生型相比，开花期显著提前。

本发明是这样实现的，BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用，所述BnaSVP基因的四个拷贝的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.1所示的BnaA09.SVP，SEQ ID NO.2所示的BnaA04.SVP，SEQ ID NO.3所示的BnaC08.SVP，SEQ ID NO.4所示的BnaC04.SVP。

进一步地，所述BnaA09.SVP的氨基酸序列见SEQ ID NO.5，所述BnaA04.SVP的氨基酸序列见SEQ ID NO.6，所述BnaC08.SVP的氨基酸序列见SEQ ID NO.7，所述BnaC04.SVP的氨基酸序列见SEQ ID NO.8。

本发明还提供了具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法，克隆如上所述的BnaSVP的基因组序列，利用CRISPR/CAS9技术靶向BnaSVP的四个同源拷贝，获得突变体，所述突变体材料由所述的BnaSVP的同源拷贝中BnaA09.SVP的单拷贝突变，BnaA09.SVP和BnaC04.SVP两个拷贝同时突变，BnaA09.SVP和BnaC08.SVP两个拷贝同时突变，BnaA04.SVP、BnaA09.SVP和BnaC08.SVP三个拷贝同时突变，及BnaSVP的四个拷贝同时突变所产生的基因编码区内的核苷酸序列突变获得。

进一步地，所获突变体单株为：BnaSVP17-5 aa1aa2cc1cc2、BnaSVP29-3aa1aa2CC1cc2、BnaSVP52-11 aa1aa2cc1cc2、BnaSVP48-3 AA1aa2cc1CC2、BnaSVP38-5AA1aa2CC1cc2、BnaSVP25-8 AA1aa2CC1CC2。

本发明还提供了获取如上述的突变体单株的方法，包括以下步骤：

步骤1：获取BnaSVP基因片段；

步骤2：针对BnaSVP基因的核苷酸序列设计sgRNA，并构建载体；

步骤3：将步骤2中构建的载体转化至油菜株系中，获得突变体油菜株系；

步骤4：对突变体油菜株系进行检测并测序，确定株系基因型；

步骤5：获得的突变体油菜株系种植并自交分离，获得BnaA09.SVP的单拷贝突变，BnaA09.SVP和BnaC04.SVP两个拷贝同时突变，BnaA09.SVP和BnaC08.SVP两个拷贝同时突变，BnaA04.SVP、BnaA09.SVP和BnaC08.SVP三个拷贝同时突变，及BnaSVP的四个拷贝同时突变的突变体材料；

步骤2中设计四个sgRNA，其中S1，S2，S3靶向BnaA04.SVP拷贝，S1，S2，S4靶向BnaA09.SVP，BnaC04.SVP和BnaC08.SVP拷贝。

进一步地，步骤2中运用pYLCRIPSR/Cas9多重基因组靶向载体系统构建载体。

进一步地，步骤3中用农杆菌介导的下胚轴遗传转化方法将构建好的载体转入半冬性甘蓝型油菜纯系J9707中。

进一步地，步骤5中获得的一系列纯合突变体的核苷酸序列见。

进一步地，获得的纯合突变体的sgRNA序列为：

BnaSVP17-5 aa1aa2cc1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGG wt

a1 ATGAGAGGAGAGGA----CAAGG-4bp

S2

CCGTTC--TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCT-TCTGCGACGCTGATGTT+A

c1-1 CCGTTCTATCTGCGACGCTGATGTT+2bp

c1-2 CCGTTC------CGACGCTGATGTT-4bp

c2-1 CCGTTCT-TCTGCGACGCTGATGTT+T

c2-2 CCGTTC---CTGCGACGCTGATGTT-T

BnaSVP29-3 aa1aa2CC1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGG wt

a1 ATGAGAGGAGAGG------AAGG-6bp

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT+T

c2-1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT+T/58％

c2-2 CCGTTC-T—GCGACGCTGATGTT-2bp/42％

S4

CGAGAGAGAAGATTCAG-ATCAGG wt

a2 CGAGAGAGAAGATTCAGTATCAGG+T

c2/--------------------AGG-31bp

BnaSVP52-11 aa1aa2cc1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGGAACTTCAAGG wt

a1-1 ATGAGAGGAGAGGGAAC-TCAAGG-T/60％

a1-2 ATGAGAGGAGAGGGAAC----AGG-4bp/40％

a2 ATGAGAGGAGAGGG-----CAAGG-5bp

S2

CCGTTCT--CTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTTACTGCGACGCTGATGTT+2bp/74％

a2-2 CCGTTCT---TGCGACGCTGATGTT-C/10％

c1-1 CCGTTCTA-CTGCGACGCTGATGTT+A/45％

c1-2 CCGTT------GCGACGCTGATGTT-4bp/55％

c2 CCGTTCT-------ACGCTGATGTT-5bp

BnaSVP48-3 AA1aa2cc1CC2

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2 CCGTT----TGCGACGCTGATGTT-3bp

c1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT+T

S4

CGAGAGAGAAGATTCAGATCAGG wt

c1 CGAGAGAGAAGAT-----TCAGG-5bp

BnaSVP38-5 AA1aa2CC1cc2

S2

CCGTTCT--CTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTA---GCGACGCTGATGTT+A/60％

a2-2 CCGTTCT----GCGACGCTGATGTT-2bp/40％

c2 CCGTTCTATCTGCGACGCTGATGTT+2bp

BnaSVP25-8 AA1aa2CC1CC2

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT+T/43％

a2-2 CCG--------------------/-28bp/57％。

本发明还提供了BnaSVP基因在油菜育种中的应用。

本发明通过对所获突变体和野生型单株进行开花期性状调查发现，相较于野生型，BnaSVP基因的不同拷贝组合的纯合突变体的开花期具有不同程度的提前，四拷贝纯合突变体开花最早，三拷贝纯合突变体、双拷贝纯合突变体及单拷贝纯合突变体依次开花。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明使用的CRISPR/Cas9是一种高效的定点靶向基因编辑技术，该技术针对性强，用其对油菜进行基因敲除，可以快速高效的获得突变体。将突变体种植，经过多代自交分离，可以获得不含T-DNA插入的纯合突变体。这种方法比传统的杂交育种技术更快速，比诱变育种更安全。

对获得的突变体开花期调查发现，相较于野生型，BnaSVP基因的不同拷贝组合的纯合突变体的开花期具有不同程度的提前，四拷贝纯合突变体开花最早，三拷贝纯合突变体、双拷贝纯合突变体及单拷贝纯合突变体依次开花。

本实验获得了开花期不同的甘蓝型油菜突变体种质资源，相较于野生型，不同突变体的开花期不同程度的提前。该材料为油菜早熟育种提供了宝贵的资源。

附图说明

图1是BnaSVP的基因结构图及利用CRISPR/CAS9技术构建的载体图；

图2是突变体和野生型的表型图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用、具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法。本发明利用CRISPR/Cas9技术靶向BnaSVP同源基因，通过遗传转化得到突变体单株，经过T₁代和T₂代自交分离，最后获得了不含T-DNA插入的一系列纯合突变体，并对这些突变体的两个世代分别在两个地区进行了开花期调查。研究结果表明，和野生型相比，BnaSVP基因的单纯合突变体、双纯合突变体、三纯合突变体及四个拷贝同时突变的纯合突变体开花期提前，均达到了极显著水平。在这些突变体中，四个拷贝同时突变的纯合突变体首先开花期，三纯合突变体、双纯合突变体及单纯合突变体依次开花。BnaSVP基因对于油菜开花期调控具有巨大的应用潜力和前景，为油菜早熟品种的选育提供新的种质资源。具体如下实施例所示。

实施例

本发明利用CRISPR/Cas9技术靶向BnaSVP的同源基因，原理图见图1，

潮霉素抗性盒由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动的潮霉素磷酸转移酶CDS序列组成。Cas9表达盒，其包含编码Cas9的p35S驱动的序列；分别由拟南芥的U3D，U3B，U6-1和U6-29启动子驱动的四个sgRNA(S1-S4)。

(a)白色方框和黑色实线代表该基因的外显子和内含子，BnaA09g42480D，BnaC04g35060D和BnaC08g34920D包含八个外显子，七个内含子，而BnaA04g12990D包含六个外显子和一个内含子。基因模型中的垂直虚线表示靶位点，箭头表示sgRNA的方向。S1-S4展示了靶点序列，带下划线的PAM区；(b)SBnaSVP载体的构建图。通过遗传转化得到突变体单株，经过自交分离，最后获得不同拷贝突变组合的纯合突变体材料；并对获得的突变体材料开花期调查。具体过程如下。

步骤1，基因克隆：种植半冬性油菜纯系J9707(种子来自中国武汉油菜籽国家工程研究中心)，从鲜嫩叶片中提取基因组DNA，具体制备方法参照一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994,13(5):521-523，报道的方法进行，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用紫外分光光度计检测DNA浓度。从提取的DNA中克隆分离得到BnaA09.SVP、BnaC04.SVP、BnaC08.SVP和BnaA04.SVP的基因组DNA和编码序列。基因克隆的实验条件参照朱恺毓(2017)利用CRISPR/CAS9技术创建甘蓝型油菜多室突变体[硕士学位论文]。

步骤2，载体构建：对分离得到的BnaA09.SVP、BnaC04.SVP、BnaC08.SVP和BnaA04.SVP的基因组DNA和编码序列进行分析，使用CRISPR-P程序在BnaSVP的两个拷贝上设计了四个sgRNA。sgRNA1：ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGG，SEQ ID NO.9；sgRNA2：AACATCAGCGTCGCAGAGAACGG，SEQ ID NO.10；sgRNA3：CTCTAATACTTCCCTCATGCTGG，SEQ IDNO.11；sgRNA4：CGAGAGAGAAGATTCAGATCAGG，SEQ ID NO.12。

其中S1，S2，S3靶向BnaA04.SVP拷贝，S1，S2，S4靶向BnaA09.SVP，BnaC04.SVP和BnaC08.SVP拷贝，四个sgRNA序列在两个拷贝上完全一样。运用pYLCRIPSR/Cas9多重基因组靶向载体系统进行载体构建，具体构建流程参照文献Ma(2015b)A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot andDicot Plants.Mol Plant,2015b,8:1274-1284。通过测序验证构建的载体。

步骤3，用农杆菌介导的下胚轴遗传转化方法将构建好的载体转入半冬性甘蓝型油菜纯系J9707中，具体操作流程参照武语笛(2015)白菜型油菜多室基因BrCLV3的功能研究。

步骤4，突变体的检测：

(1)用特异性引物BnaSVPT2-F/PB-R对突变单株进行转基因的阳性鉴定，挑选出含有T-DNA插入的阳性单株。PCR体系及程序参照朱恺毓(2017)利用CRISPR/CAS9技术创建甘蓝型油菜多室突变体[硕士学位论文]。

PB-R：GCGCGCggtctcTACCGACGCGTATCC，SEQ ID NO.13；

BnaSVPT2-F：gtcAACATCAGCGTCGCAGAGAA，SEQ ID NO.14。

(2)根据目标片段附近的序列用primer premier5设计引物，引物确定后进行blast分析，保证没有其他同源序列。

(3)用设计的目标片段引物进行PCR扩增。PCR体系及程序参照朱恺毓(2017)利用CRISPR/CAS9技术创建甘蓝型油菜多室突变体[硕士学位论文]。

(4)1％琼脂糖水平电泳对PCR扩增效果进行检测。

(5)Sanger测序法和HI-TOM测序对PCR扩增产物进行测序，确定转基因植株的基因型。

编辑鉴定引物为

SUN20-F ggagtgagtacggtgtgccttaaagttctttctctaggg，SEQ ID NO.15；

SUN20-R gagttggatgctggatggagaaagacctggagctac，SEQ ID NO.16；

SUN21-F tcaattcaagatcttcctcctgt，SEQ ID NO.17；

SUN21-R gattagagatatgtgttaaagac，SEQ ID NO.18；

SUN22-F taattcaagatcttcctcctgt，SEQ ID NO.19；

SUN22-R cgtcggagatatgtgttaaag，SEQ ID NO.20；

SUN23-F ggagtgagtacggtgtgcgaaataactatcattttcttacg，SEQ ID NO.21；

SUN23-R gagttggatgctggatggcgcgagtcaaaccggattc，SEQ ID NO.22；

SUN24-F ggagtgagtacggtgtgcaaacaattatcattttcttacg，SEQ ID NO.23；

SUN24-R gagttggatgctggatggggtttcaattacgcgagtc，SEQ ID NO.24；

SUN25-F ggagtgagtacggtgtgccaatccatacttttcctcttgg，SEQ ID NO.25；

SUN25-R gagttggatgctggatggcgagagagacacaaggtag，SEQ ID NO.26；

SUN26-F ggagtgagtacggtgtgccactacatatgcatattctac，SEQ ID NO.27；

SUN26-R gagttggatgctggatggcataagtgagaacaacctttg，SEQ ID NO.28；

SUN27-F ggagtgagtacggtgtgcaagagttcccaactatcatat，SEQ ID NO.29；

SUN27-R gagttggatgctggatggaatatacgttgtatcatacaa，SEQ ID NO.30；

SUN28-F tatcaataatgttgctgttta，SEQ ID NO.31；

SUN28-R tacttatttattaacgtcaagt，SEQ ID NO.32；

SUN29-F ggagtgagtacggtgtgcggaatgtgttttcattatata，SEQ ID NO.33；

SUN29-R gagttggatgctggatgggctagagaatagcaaagc，SEQ ID NO.34；

步骤5，自交纯合：获得的T₀代编辑单株自花授粉产生T₁代和T₂代，通过靶位点附近的PCR产物测序得到不同拷贝突变组合的纯合突变体，这些纯合突变体都会引起移码突变产生功能丧失的蛋白质。经过PCR测序验证获得了一批不含T-DNA插入的双纯合突变体。

步骤6，表型观察和统计：分别对T₁代种在湖北和T₂代种在甘肃的野生型和突变体材料进行开花期调查，结果见图2，其中(a)图表示的是T₁代种在湖北的野生型和突变体材料开花期的调查结果；(b)图表示的T₂代种在甘肃的野生型和突变体材料开花期的调查结果；(c)图表示的突变体和野生型在播种后71天后的生长状况。

表型测定中，获得的纯合突变体的sgRNA序列为：

BnaSVP17-5 aa1aa2cc1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGG wt

a1 ATGAGAGGAGAGGA----CAAGG-4bp

S2

CCGTTC--TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCT-TCTGCGACGCTGATGTT+A

c1-1 CCGTTCTATCTGCGACGCTGATGTT+2bp

c1-2 CCGTTC------CGACGCTGATGTT-4bp

c2-1 CCGTTCT-TCTGCGACGCTGATGTT+T

c2-2 CCGTTC---CTGCGACGCTGATGTT-T

BnaSVP29-3 aa1aa2CC1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGG wt

a1 ATGAGAGGAGAGG------AAGG-6bp

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT+T

c2-1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT+T/58％

c2-2 CCGTTC-T—GCGACGCTGATGTT-2bp/42％

S4

CGAGAGAGAAGATTCAG-ATCAGG wt

a2 CGAGAGAGAAGATTCAGTATCAGG+T

c2/--------------------AGG-31bp

BnaSVP52-11 aa1aa2cc1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGGAACTTCAAGG wt

a1-1 ATGAGAGGAGAGGGAAC-TCAAGG-T/60％

a1-2 ATGAGAGGAGAGGGAAC----AGG-4bp/40％

a2 ATGAGAGGAGAGGG-----CAAGG-5bp

S2

CCGTTCT--CTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTTACTGCGACGCTGATGTT+2bp/74％

a2-2 CCGTTCT---TGCGACGCTGATGTT-C/10％

c1-1 CCGTTCTA-CTGCGACGCTGATGTT+A/45％

c1-2 CCGTT------GCGACGCTGATGTT-4bp/55％

c2 CCGTTCT-------ACGCTGATGTT-5bp

BnaSVP48-3 AA1aa2cc1CC2

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2 CCGTT----TGCGACGCTGATGTT-3bp

c1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT+T

S4

CGAGAGAGAAGATTCAGATCAGG wt

c1 CGAGAGAGAAGAT-----TCAGG-5bp

BnaSVP38-5 AA1aa2CC1cc2

S2

CCGTTCT--CTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTA---GCGACGCTGATGTT+A/60％

a2-2 CCGTTCT----GCGACGCTGATGTT-2bp/40％

c2 CCGTTCTATCTGCGACGCTGATGTT+2bp

BnaSVP25-8 AA1aa2CC1CC2

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT+T/43％

a2-2 CCG--------------------/-28bp/57％。

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对BnaSVP基因靶向突变，通过多代自交分离，获得了不同拷贝突变组合的纯合突变体。通过两个世代不同地区对获得的纯合突变体进行开花期调查发现，与野生型相比，四个拷贝纯合的突变体的开花期提前最多，在两个地区分别提前了40.57％和50.71％。调查发现其他不同拷贝组合突变的纯合突变体的开花期产生不同程度的开花期提前的现象，结果证明BnaSVP基因调控开花期的提前存在突变拷贝数量的累加效应。本发明为油菜花期调控的遗传改良提供重要的功能基因和育种材料。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用、具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1714

<212> DNA

<213> BnaA09.SVP

<400> 1

atgagggaag tgttagagag gcataacttg cagtcaaaga acttggagaa gcttgatcaa 60

ccatctcttg agttacaggt tagcttgcca ttctgtttaa attaccattt tcagattatc 120

ctcaagtaca tggattttgg tcaagaagat ctagtgtatt atattaataa taggacagca 180

ttatacttat tgcatacgat tagactacat tttagtgaca ctgaactcat actaaagtcg 240

atcgatacaa actaagagta ttaaaaatat gtgagactca gactattagc tttgtagttc 300

tctttgtgtg atggtagttt ggttcaaaac ctttataatc atagttacat gaatgaatgc 360

gagctttttg aagccagaca tgcatgtaca gttagtcatg tgtagagatc tgagcttaga 420

ttattatgga tttgtttaat gttatcattt agctagtcga gaacagcgat cacgccctgt 480

tgagcaaaga gattgcggaa aagagccacc gattaaggta cacaaatata tgcgtattct 540

ttaaatttcg aaataactat cattttctta cggtatgtgt ttatatgatc atgtacaggc 600

aaatgagagg agaggaactt caaggactta acattgaaga acttcaacag ctggaaaagg 660

cccttgaatc cggtttgact cgcgtaattg aaacaaaggt tgttaaaaac ttagatgtca 720

aaagatgtaa tgccatgata ttatgaataa gaagaatatg ttgcttaact actatgatat 780

gttgttgcag agtgaaaaga ttatgaatga gatcagttac cttcaaagaa aggtaagaag 840

caaaacaacg ttttatcttt acttcttgat tcaaataatt ttggcaataa caagttacaa 900

atttctcttt tccaagggaa tgcaactgat ggatgagaac aagcggctaa ggcagcaagt 960

aggcatctta ctctttgtct ttaacacata tctctaatca tattttgaga aaagtgtatt 1020

tatatctaat ggtaaattaa tatttagcta attagttcca attagttaaa aaaaaaatct 1080

cggtcctagc tgcatgtggg aatgtgcatg gttttggttt gcgctcttta tgttttcaga 1140

ttgttttgtg gaatatggaa ctgaaataat caaactctcg tttgatttga tttaacttgg 1200

ttctgattaa aattttgtat atttataaca tgttttcaag atttattttg tttcatatta 1260

ttttgtttga gatcaaatta ttttagttga ttatttttag ataaaagtaa tcatccctca 1320

gtcagtcgat ctctagagaa gaccaagaca tttggtgcca tttttaaaac tcaaaattca 1380

aatcttctca ttgttttttc tatgatcaaa tcttgatttt gcaggggaca cagttaacag 1440

aagagaacga gcgactaggt cagcaggtac gttggtgtta tatcgaatgt taagtacatt 1500

gtttatattt ttggttaaat gttaaatttg gaagttttat ttggtgacgg tgtagatata 1560

caataatgtg catgaaaggt acggtggttg tgaatcagag aacattgccg tgtacgagga 1620

aggacactcg tcggagtcca ttactaacgc tggaaattcc accggcgctc ctgttgactc 1680

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atatagatag atgttgggaa tctaaaacca cttatcataa agatatgatt tttggatttc 1440

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tttactgtat attaaacctt actggaccac taactttata tataagaaat attaatgacc 360

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gttgatatat ggaaagccat caatgtcata tttatttata aatatgtggt gactatatgt 540

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50 55 60

Leu Thr Val Cys Val Tyr Met Ile Met Tyr Arg Gln Met Arg Gly Glu

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Glu Leu Gln Gly Leu Asn Ile Glu Glu Leu Gln Gln Leu Glu Lys Ala

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Leu Glu Ser Gly Leu Thr Arg Val Ile Glu Thr Lys Ser Glu Lys Ile

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Glu Asn Lys Arg Leu Arg Gln Gln Gly Thr Gln Leu Thr Glu Glu Asn

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Glu Arg Leu Gly Gln Gln Ile Tyr Asn Asn Val His Glu Arg Tyr Gly

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taattcaaga tcttcctcct gt 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> SUN22-R

<400> 20

cgtcggagat atgtgttaaa g 21

<210> 21

<211> 41

<212> DNA

<213> SUN23-F

<400> 21

ggagtgagta cggtgtgcga aataactatc attttcttac g 41

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> SUN23-R

<400> 22

gagttggatg ctggatggcg cgagtcaaac cggattc 37

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> SUN24- F

<400> 23

ggagtgagta cggtgtgcaa acaattatca ttttcttacg 40

<210> 24

<211> 37

<212> DNA

<213> SUN24-R

<400> 24

gagttggatg ctggatgggg tttcaattac gcgagtc 37

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> SUN25- F

<400> 25

ggagtgagta cggtgtgcca atccatactt ttcctcttgg 40

<210> 26

<211> 37

<212> DNA

<213> SUN25-R

<400> 26

gagttggatg ctggatggcg agagagacac aaggtag 37

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> SUN26- F

<400> 27

ggagtgagta cggtgtgcca ctacatatgc atattctac 39

<210> 28

<211> 39

<212> DNA

<213> SUN26-R

<400> 28

gagttggatg ctggatggca taagtgagaa caacctttg 39

<210> 29

<211> 39

<212> DNA

<213> SUN27- F

<400> 29

ggagtgagta cggtgtgcaa gagttcccaa ctatcatat 39

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> SUN27-R

<400> 30

gagttggatg ctggatggaa tatacgttgt atcatacaa 39

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> SUN28- F

<400> 31

tatcaataat gttgctgttt a 21

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> SUN28-R

<400> 32

tacttattta ttaacgtcaa gt 22

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> SUN29- F

<400> 33

ggagtgagta cggtgtgcgg aatgtgtttt cattatata 39

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> SUN29-R

<400> 34

gagttggatg ctggatgggc tagagaatag caaagc 36

Claims

1.具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法，其特征在于：克隆BnaSVP的基因组序列，利用CRISPR/CAS9技术靶向BnaSVP的四个同源拷贝，获得突变体，所述突变体材料由所述的BnaSVP的同源拷贝中BnaA09.SVP的单拷贝突变，BnaA09.SVP和BnaC04.SVP两个拷贝同时突变，BnaA09.SVP和BnaC08.SVP两个拷贝同时突变，BnaA04.SVP、BnaA09.SVP和BnaC08.SVP三个拷贝同时突变，及BnaSVP的四个拷贝同时突变所产生的基因编码区内的核苷酸序列突变获得；

其中，所述BnaSVP基因的四个拷贝的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.1所示的BnaA09.SVP，SEQ ID NO.2所示的BnaA04.SVP，SEQ ID NO.3所示的BnaC08.SVP，SEQ IDNO.4所示的BnaC04.SVP;

所述BnaA09.SVP的氨基酸序列见SEQ ID NO.5，所述BnaA04.SVP的氨基酸序列见SEQID NO.6，所述BnaC08.SVP的氨基酸序列见SEQ ID NO.7，所述BnaC04.SVP的氨基酸序列见SEQ ID NO.8。

2.根据权利要求1所述的具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法，其特征在于：

所获突变体单株为：BnaSVP17-5 aa1aa2cc1cc2 、BnaSVP29-3 aa1aa2CC1cc2 、BnaSVP52-11 aa1aa2cc1cc2 、BnaSVP48-3 AA1aa2cc1CC2 、BnaSVP38-5 AA1aa2CC1cc2 、BnaSVP25-8 AA1aa2CC1CC2。

3.获取如权利要求2中所述的突变体单株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：获取BnaSVP基因片段；

步骤2：针对BnaSVP基因的核苷酸序列设计sgRNA，并构建载体；

步骤5：获得的突变体油菜株系种植并自交分离，获得BnaA09.SVP的单拷贝突变，BnaA09.SVP和BnaC04.SVP两个拷贝同时突变，BnaA09.SVP和BnaC08.SVP两个拷贝同时突变，BnaA04.SVP、BnaA09.SVP和BnaC08.SVP三个拷贝同时突变，及BnaSVP的四个拷贝同时突变的突变体材料；

4.根据权利要求3所述的获取突变体单株的方法，其特征在于，获得的纯合突变体的sgRNA序列为：

BnaSVP17-5 aa1aa2cc1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGG wt

a1 ATGAGAGGAGAGGA----CAAGG -4bp

S2

CCGTTC--TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCT-TCTGCGACGCTGATGTT +A

c1-1 CCGTTCTATCTGCGACGCTGATGTT +2bp

c1-2 CCGTTC------CGACGCTGATGTT -4bp

c2-1 CCGTTCT-TCTGCGACGCTGATGTT +T

c2-2 CCGTTC---CTGCGACGCTGATGTT -T

BnaSVP29-3 aa1aa2CC1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGG wt

a1 ATGAGAGGAGAGG------AAGG -6bp

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT +T

c2-1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT +T/58%

c2-2 CCGTTC-T—GCGACGCTGATGTT -2bp/42%

S4

CGAGAGAGAAGATTCAG-ATCAGG wt

a2 CGAGAGAGAAGATTCAGTATCAGG +T

c2 /--------------------AGG -31bp

BnaSVP52-11 aa1aa2cc1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGGAACTTCAAGG wt

a1-1 ATGAGAGGAGAGGGAAC-TCAAGG -T/60%

a1-2 ATGAGAGGAGAGGGAAC----AGG -4bp/40%

a2 ATGAGAGGAGAGGG-----CAAGG -5bp

S2

CCGTTCT--CTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTTACTGCGACGCTGATGTT +2bp/74%

a2-2 CCGTTCT---TGCGACGCTGATGTT -C/10%

c1-1 CCGTTCTA-CTGCGACGCTGATGTT +A/45%

c1-2 CCGTT------GCGACGCTGATGTT -4bp/55%

c2 CCGTTCT-------ACGCTGATGTT -5bp

BnaSVP48-3 AA1aa2cc1CC2

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2 CCGTT----TGCGACGCTGATGTT -3bp

c1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT +T

S4

CGAGAGAGAAGATTCAGATCAGG wt

c1 CGAGAGAGAAGAT-----TCAGG -5bp

BnaSVP38-5 AA1aa2CC1cc2

S2

CCGTTCT--CTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTA---GCGACGCTGATGTT +A/60%

a2-2 CCGTTCT----GCGACGCTGATGTT -2bp/40%

c2 CCGTTCTATCTGCGACGCTGATGTT +2bp

BnaSVP25-8 AA1aa2CC1CC2

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT +T/43%

a2-2 CCG--------------------/ -28bp/57%。