CN116621959B - 大豆GmMADS5基因及其在植物花期调控中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆GmMADS5基因及其在植物花期调控中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明大豆GmMADS5基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。将本发明的基因构建植物表达载体，分别转化拟南芥和大豆，获得转基因拟南芥和转基因大豆。研究转基因拟南芥在长短日照下的开花情况发现，该基因可以抑制拟南芥开花。研究转基因大豆在长短日照下的开花情况发现，在长日照和偏长日照的情况下，该基因可以促进大豆开花，而在短日照和偏短日照的情况下，对大豆的开花没有影响。因而，大豆GmMADS5基因在植物花期调控中有重要的应用前景。

Description

大豆GmMADS5基因及其在植物花期调控中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种大豆GmMADS5基因及其在植物花期调控中的应用。

背景技术

不同地区由于地域维度原因，光周期存在较大差异。光周期与开花关系密切，光周期影响开花时间，而开花影响大豆产量。植物通常需要精确的计算开花时间来保证自己的成功繁殖，这也是它保证种子完成发育的基础，是提高种子产量的前提。植物如果太早开花，会使得其营养生长期变短，不利于养分积累，若太晚开花，则很大可能会受到有害环境的影响，对其生长十分不利，这些不利条件能够抑制生物的生长，甚至导致生物体死亡。为满足各地区对大豆开花时间的需求，培育各种花期的生物新品种已成为广大育种家研究的主要目标之一。

MADS-box类基因广泛存在于各类植物中，是植物最重要的转录因子之一。在模式植物拟南芥中，基于其结构和进化类型的差异，MADS-box基因大致分为I型、II型等不同类型(De Bodt et al.,2003)。不同类型的MADS-box基因对植物生长发育表现出的影响作用有很大差异。例如：Chi等发现大豆GmSHPA基因参与荚皮的开裂和花器官的发育(迟英俊等,2011)；Yue等发现过表达GmFULa基因增加了大豆营养生长过程中积累的生物量但不影响株高或改变开花时间和成熟度，农艺性状测定中它还促进了分枝数，豆荚数和百粒重等产量因素，最终导致产量提高(Yue Yanlei et al.,2021)；2007年，Wang证实了GmAGL15基因在幼胚中表达，在根、茎、叶、花中不表达，在大豆种子发育的不同时期均有表达，表明其对于大豆种子发育具有重要作用(汪潇琳等，2008)；此外，该家族基因对于响应生物、非生物胁迫方面也表现出显著效果(姚琦园等，2018)。当前发展迅速的基因工程技术为生物遗传改良提供了新的途径，利用在光周期应答中起重要作用的基因进行遗传转化是获得新种质的重要手段。

参考文献

De Bodt S,Raes J,Florquin K,et al.Genomewide structural annotationand evolutionary analysis of the type I MADS-box genes in plants[J].Journalof molecular evolution,2003,56(5):573-586.

迟英俊.大豆MADS-box基因家族成员的鉴定及GmAP1和GmSHPa基因的功能研究[D].南京农业大学,2011.

Yue Yanlei,Sun Shi,Li Jiawen,et al.GmFULa improves soybean yield byenhancing carbon assimilation without altering flowering time or maturity.[J].Plant cell reports,2021,40(10):1-14.

汪潇琳,陈艳萍,喻德跃.MADS-box基因GmAGL15在大豆种子发育过程中的表达[J].作物学报,2008,(02):330-332.

姚琦园,李纷芬,张林成等.植物MADS-box转录因子参与调控非生物胁迫的研究进展[J].江西农业学报,2018,30(05):73-79.

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种大豆GmMADS5基因及其在植物花期调控中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种大豆GmMADS5基因，所述基因的编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在一个具体的实施例中，所述大豆GmMADS5基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述大豆GmMADS5基因在植物花期调控中的应用。

在上述方案的基础上，所述的花期调控为在长日照或短日照条件下，促进植物开花或抑制植物开花。

一种用于调控植物花期的重组载体、表达盒，含有大豆GmMADS5基因的编码区序列，所述大豆GmMADS5基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种用于调控植物花期的重组菌，含有大豆GmMADS5基因的编码区序列，所述大豆GmMADS5基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种抑制拟南芥开花的方法，将大豆GmMADS5基因的编码区序列构建到植物表达载体中，转化拟南芥，使其在拟南芥中表达，以抑制拟南芥在长日照和短日照条件下开花；所述大豆GmMADS5基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在一个具体的实施例中，所述的长日照条件为光照时间与黑暗时间为16/8h，光照强度为14000Lx；

短日照条件为：光照时间与黑暗时间为8/16h，光照强度为14000Lx。

一种促进大豆开花的方法，将大豆GmMADS5基因的编码区序列构建到植物表达载体中，转化大豆，使其在大豆中表达，以促进大豆在长日照和偏长日照条件下开花；所述大豆GmMADS5基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在一个具体的实施例中，所述偏长日照的条件为：光照时间为14.5h，黑暗时间为9.5h；所述偏短日照的条件为：日照时间为10h，黑暗时间为14h；所述长日照条件为：光照时间为16h，黑暗时间为8h，光照强度为14000Lx。

本发明技术方案的优点

本发明公开了一种大豆GmMADS5基因及其在植物花期调控中的应用，将本发明的基因构建植物表达载体，分别转化拟南芥和大豆，获得转基因拟南芥和转基因大豆。研究转基因拟南芥在长短日照下的开花情况，结果发现，大豆GmMADS5基因可以抑制拟南芥开花；研究转基因大豆在长短日照下的开花情况，结果发现，在长日照和偏长日照的情况下，大豆GmMADS5基因可以促进大豆开花，而在短日照和偏短日照的情况下，对大豆的开花没有影响。因而，大豆GmMADS5基因在植物花期调控中有重要的应用前景。

附图说明

图1GmMADS5基因系统发育进化树；

图2GmMADS5基因与多物种氨基酸序列比对结果；

图3DNA水平检测拟南芥转基因阳性植株(M是DL2000的Marker，P代表重组质粒，1、2胶孔代表阳性株系条带，Col代表阴性对照，H₂O代表阴性对照)；

图4不同拟南芥株系中GmMADS5表达量分析；

图5GmMADS5转基因拟南芥长日照表型观察及其统计数据(A三个拟南芥株系的表型观察；B为三个拟南芥株系的莲座叶片数；C为三个拟南芥株系的开花的天数)；

图6GmMADS5转基因拟南芥短日照表型观察及其统计数据(A三个拟南芥株系的表型观察；B为三个拟南芥株系的莲座叶片数；C为三个拟南芥株系的开花的天数)；

图7GmMADS5转基因大豆阳性苗鉴定图(M是DL2000的Marker，1-8胶孔代表阳性株系条带，P代表阳性对照即重组质粒，W代表阴性对照即野生型Wi82大豆DNA，H代表阴性对照即水)；

图8稳定遗传的GmMADS5转基因大豆株系鉴定(M是DL2000的Marker，P代表重组质粒，1、2胶孔代表阳性株系条带，W代表阴性对照即野生型Wi82大豆DNA，H代表阴性对照即水)；

图9GmMADS5基因在大豆中的表达量的检测；

图10自然光(偏长日照)条件GmMADS5转基因大豆表型初观察(A为大豆Williams82，B为转基因大豆GmMADS5)；

图11自然光(偏短日照)条件GmMADS5转基因大豆表型初观察及数据统计(A、B：分别对应C中转基因大豆植株及Williams82植株的局部放大图；C：左边为转基因大豆植株开花表型，右边为Williams82植株开花表型；D：GmMADS5转基因大豆植株及Williams82植株开花天数统计，Bar＝4cm)；

图12长日照条件下大豆开花表型的观察及数据统计(A为C中Williams82植株的局部放大图，B为C中转基因大豆植株的局部放大图；C：为转基因大豆植株(右)和Williams82植株(左)开花表型；D：转基因大豆植株及Williams82植株开花天数统计，(*P<0.05，***P<0.001)，Bar＝4cm)；

图13短日照条件下GmMADS5转大豆开花表型的观察及数据统计(A为C中Williams82植株的局部放大图，B为C中转基因大豆植株的局部放大图，C：转基因大豆植株(右)及Williams82植株(左)开花表型图，D：转基因大豆植株及对照植株开花天数统计柱形图。Bar＝4cm)。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

大豆(Williams)由青岛农业大学生命科学学院作物应用功能基因组学实验室提供；

哥伦比亚型拟南芥(Columbia-0)由青岛农业大学生命科学学院作物应用功能基因组学实验室提供。

实施例1GmMADS5基因的克隆

首先提取大豆Wi82叶片RNA，然后反转录为cDNA。然后通过NCBI设计引物GmMADS5-F/R对得到的cDNA进行扩增，进而获得GmMADS5基因的cDNA全长序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码序列包含705个核苷酸，编码了234个氨基酸，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:1(5’→3’)：

ATGACGAGAACGAGGATAAAGATAAAGAAAATCGACAACATAACGGCGAGGCAGGTAACATTTTCTAAGAGGAGGCGAGGGCTATTCAAGAAAGCTGAAGAGCTTTCTGTGCTATGCGATGCTGAGGTTGGTCTCATTGTTTTCTCATCTACCGGGAAGCTCTTTGATTATAGCAGCTCCAGTATGAATGACATAGTTACAAAGTACAGTACGCATTCCCATGGCATCAACAAATTGGATAAGCCATCACTAGAACTGCAGCTAGAAGCTAGCAATAGCGCCAAATTGAGTAAGGAAATTGCAGATAGAACCCAAGAATTAAGTTGGTTGAAAGGCGACGATCTTCAAGGACTAGGTCTAAATGAGTTGCAGCAACTGGAGAAAACACTTGAAATAGGACTCGATCGCGTGACTGACATAAAGGAAAATCAGATAATGAGCCAGATTTCTGAACTTCAGAAAAAGGGAATCCTGTTAGAAGAGGAGAACAAGCATTTAACGAAAAAGCTAGCGGAGAAGGAGAAGGAGGCTATGCTGTGTAAGGCAAAAATTCCTTTCATGGTGGACTCAGATAAGGGAATAATGCAGGAAGAAGGTGTCTCGTTAGATTCTACAAATAACATTAGTAGTTGCATCAGTGATCCTCCTCTCGAGGATGGTTCCTCGGACATATCTCTTACGTTAGGGCTACCCTTCTCTAACTGA

SEQ ID NO:2：

MTRTRIKIKKIDNITARQVTFSKRRRGLFKKAEELSVLCDAEVGLIVFSSTGKLFDYSSSSMNDIVTKYSTHSHGINKLDKPSLELQLEASNSAKLSKEIADRTQELSWLKGDDLQGLGLNELQQLEKTLEIGLDRVTDIKENQIMSQISELQKKGILLEEENKHLTKKLAEKEKEAMLCKAKIPFMVDSDKGIMQEEGVSLDSTNNISSCISDPPLEDGSSDISLTLGLPFSN

所述GmMADS5-F/R序列如下：

GmMADS5-F：5’-ATGACGAGAACGAGGATAAAG-3’(SEQ ID NO:3)；

GmMADS5-R：5’-TCAGTTAGAGAAGGGTAGCCC-3’(SEQ ID NO:4)。

实施例2

GmMADS5基因信息与同源性的分析

通过NCBI网站查找已报道的不同物种中SVP-like基因，利用CluatalX及MEGA7构建了系统发育进化树(如图1)，进化树结果显示，GmMADS5与AcSVP2、AcSVP3、AcSVP4具有较高的同源性。

将GmMADS5氨基酸序列与其他SVP-like氨基酸序列进行了比对，多物种氨基酸序列比对结果表明(如图2)，GmMADS5具有与其他已经报道的SVP-like蛋白一样保守的MADS域及K域，说明其在功能可能具有保守性。

实施例3

GmMADS5的过表达载体以及重组菌株的获得

首先对实施例1中获得的GmMADS5 cDNA全长片段和过表达载体PPTN1171(青岛农业大学生命科学学院作物应用功能基因组学实验室提供)进行酶切位点分析，然后选取XhoⅠ和XbaⅠ限制性内切酶对GmMADS5 cDNA全长片段和过表达载体PPTN1171进行双酶切，保证片段和载体之间能够连接。将酶切的体系放置在PCR仪中，设置37℃，酶切时间设置为5h，酶切结束后利用艾瑞克生物Steady Pure DNA凝胶回收试剂盒对片段和载体进行胶回收。通过T4 DNA连接法对回收得到的片段和载体进行连接，将体系构建好后在16℃过夜反应，即得过表达载体(GmMADS5-PPTN1171)。随后，将构建好的过表达载体(GmMADS5-PPTN1171)通过热击转化DH5α，37℃过夜培养菌后，挑取单克隆送到擎科公司进行测序，获得正确的含过表达载体的菌液(GmMADS5-PPTN1171-DH5α)，即重组菌。

实施例4

GmMADS5转基因拟南芥的获得以及在调控其开花中的应用

1)提取实施例3中含有正确过表达载体的大肠杆菌质粒，并通过冻融法转化至农杆菌GV3101(购买自上海唯地生物技术有限公司)中。利用验证正确的农杆菌对哥伦比亚型拟南芥(Columbia-0)进行侵染，获得转基因拟南芥植株，成熟后收获T0代的种子。通过在MS培养基加上PPT筛选标记对T0代拟南芥种子进行筛选。筛选后的种子放在4℃冰箱春化3d后放到光照培养箱里进行光照培养。大约培养两周后将拟南芥幼苗转移到营养土中种植培养。移苗的过程中注意不要将小苗的根弄断，刚移土的幼苗需要用保鲜膜覆盖，等待苗子生长到一定的大小后再把保鲜膜揭掉。

2)DNA水平进行阳性苗鉴定以及qRT-PCR检测基因表达量

由于上述筛选的拟南芥植株可能存在假阳性情况，所以需要对筛选到的植株进行DNA水平阳性苗检测，证明得到的植株是转化成功的阳性植株。具体操作为：首先对于得到的小苗进行DNA检测，提取拟南芥苗的叶片DNA作为阳性苗鉴定的模板，在GmMADS5基因CDS两端设计鉴定的引物，阳性苗鉴定的引物序列如下：

正向引物为Gm5-2022-F：5’-ATGACGAGAACGAGGATAA-3’(SEQ ID NO:5)；

反向引物为Gm5-2022-R：5’-TCAGTTAGAGAAGGGTAG-3’(SEQ ID NO:6)。

实验用的酶为艾科瑞公司的2×Accurate Taq Master Mix酶。PCR结束后进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测。将植株DNA和构建好的过表达载体(GmMADS5-PPTN1171)质粒分别作为模板的PCR片段条带大小做对比，若是植株DNA扩增出的片段大小与质粒对照扩增出的条带大小一致，可以初步判断植株为转基因阳性植株。阳性苗检测结果显示转化拟南芥一共得到了2个T1代阳性株系(图3)。

接着通过qRT-PCR实验分析两个转基因拟南芥株系中目的基因GmMADS5的表达量。在植株生长2-3周后，对于阳性植株的叶片进行RNA取样，每个株系选择三株，分别进行取样，三个植株尽量保证生长状况无明显差异。从哥伦比亚型拟南芥(Columbia-0)上取样作为对照组。取得的样品立即放入液氮保存，然后进行RNA提取，提取样品后检测一下RNA样品的A₂₆₀和A₂₈₀的数值，记录其浓度和纯度，使用1μg的RNA进行反转录。检测GmMADS5基因表达量的qRT-PCR特异性引物序列和内参Actin基因的引物序列如下：

GmMADS5-QRT-F1：5’-TGAACTTCAGAAAAAGGGAATCCTG-3’(SEQ ID NO:7)；

GmMADS5-QRT-R1：5’-GCCTTACACAGCATAGCCTCC-3’(SEQ ID NO:8)；

Atactin-F：5’-GCTCCTCTTAACCCAAAGGC-3’(SEQ ID NO:9)；

Atactin-R：5’-CACACCATCACCAGAATCCAGG-3’(SEQ ID NO:10)。

引物设计要求跨外显子，扩增的产物大小为150-180bp左右，不要超过300bp。qRT-PCR体系包含酶、cDNA样品、上下引物和RNase Free Water。将体系各组分加入到96孔板中，离心去掉气泡，将96孔样品板放在PCR仪ABI中进行扩增，对得到的qRT-PCR的溶解曲线及C_T值进行分析，计算相对表达量。GmMADS5-50株系GmMADS5基因的表达量高于GmMADS5-49，在哥伦比亚型拟南芥(Columbia-0)中没有检测到GmMADS5基因的表达(图4)。

3)GmMADS5转基因拟南芥表型观察

将两个转基因拟南芥株系种植分别种植在长、短日照条件下进行表型观察，从而探究GmMADS5基因功能。

在长日照条件下，拟南芥植株抽薹后，统计其莲座叶数目，结果显示转基因植株的莲座叶片数目比哥伦比亚型拟南芥(Columbia-0)多1片左右，莲座叶数目为11-12片。结果表明GmMADS5基因异源转化拟南芥在长日照条件下能够微弱抑制拟南芥的开花(图5)。长日照培养条件是：光照时间与黑暗时间为16/8h，光照条件下的温度为22℃，黑暗条件下的温度为18℃，湿度为55％，光照开始时间为7:00，长日照的光照强度为14000Lx。

在短日照条件下，转基因植株的抽薹时间晚于哥伦比亚型拟南芥(Columbia-0)，对其莲座叶数目进行统计发现，转基因株系的莲座叶数目比哥伦比亚型拟南芥(Columbia-0)多3-4片左右。结果说明，GmMADS5基因异源转化拟南芥在短日照条件下也能够抑制拟南芥的开花(图6)。短日照的培养条件为：光照时间与黑暗时间为8/16h，温度恒定为22℃，湿度为55％，光照开始时间为7:00，光强为14000Lx。

实施例5

GmMADS5转基因大豆植株的获得以及在调控其开花中的应用

1)提取实施例3中含有正确过表达载体的大肠杆菌质粒，并通过冻融法转化至农杆菌LBA4404(购买自上海唯地生物技术有限公司)中，利用验证正确的农杆菌对大豆Williams82品种进行转化，通过侵染大豆的子叶节部分慢慢长出再生芽，通过组织培养直到最后得到再生T0代的转基因大豆植株。对于稳定遗传的转基因植株进行长、短日照不同条件下表型观察，分析基因功能。

2)转基因大豆植株的DNA水平阳性苗鉴定

首先对于得到的T0代大豆进行DNA检测，提取大豆苗的叶片DNA作为阳性苗鉴定的模板，在GmMADS5基因CDS两端设计鉴定的引物，阳性苗鉴定的正向引物和反向引物如SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示。实验用的酶为艾科瑞公司的2×Accurate Taq Master Mix酶。PCR结束后进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测。将植株DNA和构建好的过表达载体(GmMADS5-PPTN1171)质粒分别作为模板的PCR片段条带大小做对比，若是植株DNA扩增出的片段大小与质粒对照扩增出的条带大小一致，可以初步判断植株为转基因阳性植株。GmMADS5转化大豆实验一共得到了8株T0代阳性植株(如图7所示)，阳性转基因大豆植株放置在实验室温室进行培养，直到收取成熟后的种子。

将上述获得的8个T0代转基因大豆植株收到的种子种植在试验田，每个株系种植十几株，对于长出的每一株大豆植株进行阳性苗的鉴定同时进行T1代转基因大豆表型观察。阳性苗鉴定结果显示T1代有1个阳性株系基因稳定的遗传了下来，将这个株系命名为GmMADS5-6(如图8所示)。

3)qRT-PCR检测转基因大豆植株GmMADS5基因的表达量

通过PCR鉴定阳性苗后，利用实时荧光定量PCR对转基株系以及Wi82中GmMADS5的相对表达量进行了检测。在植株生长了21d后进行RNA取样，GmMADS5-6株系取了三株的样品。RNA取样时需要提前准备液氮，并且将锡箔纸袋叠好。用剪刀将大豆叶片剪下来放入锡箔纸袋，立即将样品放入液氮中，过程一定及时，避免RNA降解使得实验结果不准确。取完样品后进行样品RNA的提取，提取完RNA最好立即进行反转录，将剩余RNA放在-80℃储存。qRT-PCR实验实验利用GmMADS5-QRT-F1和GmMADS5-QRT-R1引物检测转基因大豆植株GmMADS5基因的表达量，包含有3个生物学重复，2个技术重复，本实验选择大豆的持家基因Cons4作为内参基因，Williams82植株作为对照。

内参基因Cons4的引物序列如下：

GmCons4-RT-F：5’-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3’(SEQ ID NO:11)；

GmCons4-RT-R：5’-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3’(SEQ ID NO:12)；

对得到的qRT-PCR数据进行分析处理，计算了GmMADS5基因在不同植株的相对表达量。结果表明，转基因株系中GmMADS5基因的表达量高于对照组(图9)。

4)自然光(偏长日照)条件下转基因大豆开花时间观察

对5月底种植在试验田的T1代转基因大豆植株进行表型初步观察。当时种植地区的日照时间约14.5h，黑暗时间9.5h，属于自然光偏长日照条件。在对T1代自然光条件下生长的GmMADS5转基因大豆的表型观察中发现，GmMADS5-6的转基因株系开花时间明显早于对照大豆植株Williams82(图10)。初步表型观察结果表明GmMADS5基因能促进大豆提前开花。

5)自然光条件下(偏短日照)转基因大豆开花时间观察

在试验田初步观察到转基因植株的早花表型后，将收获的成熟的种子播种在实验室阳台上进行表型观察，种植时间是11月24日，室内温度25℃左右。当时种植地区日照时间为10h，黑暗时间为14h，属于自然光(偏短日照)条件。观察记录大豆刚开始露白的时间作为开花时间，第一株大豆开花后每天都要对植株的开花时间进行记录，避免错过植株开花的时间。统计开花时间后将得到的开花天数通过绘制柱形图进行结果分析(图11)，结果表明在自然光照(偏短日照)条件下，转基因大豆开花时间与对照组Williams82开花时间大约都在29d左右，没有明显的差异，表明GmMADS5基因在自然光条件下(偏短日照)条件下对于大豆的开花时间没有明显的影响。

6)长日照条件下转基因大豆开花时间观察

为探究GmMADS5基因对不同光周期的反应，分析基因在长、短日照条件下的功能。

在智能温室中种植了转基因植株以及对照大豆植株，在长日照条件下观察GmMADS5对于大豆植株开花时间的影响。首先准备了24个花盆，将营养土加水后混合均匀装入花盆中，每个花盆中种植四粒种子，每个株系种六盆，放入温室进行培养。因为种子质量的不同，有的种子并不能发芽，为保证每个花盆的植株数目保持一致，在种植一周左右后，对植株进行间苗，去除发育不好的植株同时保证每个花盆中有两棵大豆苗。对剩余的转基因大豆植株进行DNA检测，确定好阳性植株，观察开花时间统计它们的开花天数。

在长日照条件下(光照时间为16h，黑暗时间为8h，光照条件下的温度为25℃，黑暗时温度为23℃，每天的光照开始时间为5:00，光照强度为14000Lx)，观察到GmMADS5转基因的一个株系的开花时间早于Williams82。GmMADS5-6株系开花时间提前11d左右。结果表明，GmMADS5基因在长日照条件下能够促进大豆开花(图12)，使得大豆的开花期提前。

7)短日照条件下转基因大豆开花时间观察

使用智能培养箱来研究GmMADS5基因在短日照条件(光照时长为10h，黑暗时长为14h，温度无论是否光照都设置为25℃，光强设置为14000Lx)下的功能。将对照和实验组的种子播种在盛有营养土的花盆中，放置到培养箱中进行培养观察。因为有的种子并不能发芽，为保证每个花盆的植株数目保持一致，一周左右后，对植株进行间苗，去除发育不好的植株同时保证每个花盆中有两棵大豆苗。10d左右取大豆的叶片对转基因大豆植株进行DNA检测，确定阳性植株，观察开花时间统计开花天数。

在大豆生长10d左右后取每一株大豆的叶片进行DNA提取，间苗时优先去除阴性植株。种植后26d植株开始陆续开花，每天记录开花植株，开花时间统计以花苞露白为准。观察统计结果表明，转基因植株与栽培型Williams82开花天数平均在30d左右，GmMADS5基因在短日照条件下对大豆Williams82的开花时间没有影响(图13)。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.大豆GmMADS5基因在拟南芥花期调控中的应用，其特征在于，用于抑制拟南芥在长日照和短日照条件下开花；所述大豆GmMADS5基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.大豆GmMADS5基因在大豆花期调控中的应用，其特征在于，用于促进大豆在长日照和偏长日照条件下开花；所述大豆GmMADS5基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种抑制拟南芥开花的方法，其特征在于，将大豆GmMADS5基因构建到植物表达载体中，转化拟南芥，使其在拟南芥中表达，以抑制拟南芥在长日照和短日照条件下开花；所述大豆GmMADS5基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述抑制拟南芥开花的方法，其特征在于，所述的长日照条件为光照时间16h，黑暗时间8h，光照强度为14000Lx；

短日照条件为：光照时间8h，黑暗时间16h，光照强度为14000Lx。

5.一种促进大豆开花的方法，其特征在于，将大豆GmMADS5基因构建到植物表达载体中，转化大豆，使其在大豆中表达，以促进大豆在长日照和偏长日照条件下开花；所述大豆GmMADS5基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

6.根据权利要求5所述的促进大豆开花的方法，其特征在于，所述偏长日照的条件为：光照时间14.5h，黑暗时间9.5h；所述长日照条件为：光照时间为16h，黑暗时间为8h，光照强度为14000Lx。