CN117737114A - MtSPG6基因在提高植物耐旱中的用途 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了MsSPG6基因在提高植物耐旱中的用途，MsSPG6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从蒺藜苜蓿的全基因组序列出发，筛选出蒺藜苜蓿中编码蛋白质小于150个氨基酸的序列，从中提挑选在干旱胁迫下表达量存在明显升高的MsSPG6基因，并对其响应干旱胁迫的分子和生理功能进行了解析，提供的MsSPG6基因及其蛋白定位在细胞膜和细胞质上。通过拟南芥转基因功能验证分析发现，MsSPG6基因在提高植株的抗性方面具有显著效果，提高了转基因植株的抗逆境能力，尤其是和野生型相比，在干旱胁迫下，转基因植株的耐受性强于野生型，可见，MsSPG6基因跟耐旱有关，能够提高植株的耐旱性，利于培育抗逆性更强的植物品种或者改造其它植物的抗逆性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蒺藜苜蓿MsSPG6基因在提高植物耐旱中的用途。
背景技术
干旱胁迫是一种多维胁迫，能够引起植物的表型、生理、生化及分子水平上发生一系列的变化。干旱首先会引起植物叶片缺水，引起叶片萎蔫，植物自身会通过叶片卷曲或关闭气孔以减少自身水分损失，同时植物本身会分泌植物激素来响应干旱胁迫，这些过程离不开基因的调控作用。随着全球气候变暖，土壤和水资源的破坏，干旱胁迫成为限制农作物及饲草生长、分布、产量的主要限制因素。
蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)具有遗传转化效率高、基因组小(470Mb)、生育期短等优点，同时蒺藜苜蓿与大多豆科植物都具有较高的遗传相似性，已成为豆科生物学和基因组学研究的新型模式植物。通过挖掘蒺藜苜蓿MtSPG基因与其响应干旱/盐胁迫的功能，可为后续研究紫花苜蓿(Medicago sativa)及其他豆科植物提供理论依据。
植物小分子信号肽(small signaling peptides，SSPs)是继植物激素后在植物中发现的又一重要的信号分子，其最早被发现于1991年被Pearce等人在番茄(Solanumlycopersicum)中提取的系统素。小肽应用广泛，例如过量表达橡胶素类多肽抗生素Ah-AMP2，同样增强了烟草对青枯病和黑胫病的抗性，在谷子(Setaria italica)中发现的含有CEP结构域的信号肽SiCEP3具有促进ABA导入和信号传导相关的响应非生物胁迫的功能。此类研究结果表明小分子肽作为重要的胞间信号感应分子，在植物响应生物与非生物胁迫中都发挥着重要作用。本发明中，我们筛选出的MtSPG6基因，在蒺藜苜蓿响应干旱胁迫中发挥重要作用，可为丰富豆科抗旱理论以及通过基因工程技术创制高抗旱种质提供新思路和新基因资源。
发明内容
本发明的目的之一在于提供蒺藜苜蓿MtSPG6基因，该基因属于编码小分子肽基因。
本发明的目的之二在于提供上述蒺藜苜蓿MtSPG6基因的用途，通过对MtSPG6响应干旱胁迫的生理和分子功能进行解析，提供的MtSPG6基因及重组MtSPG6基因的蛋白定位在细胞膜和细胞质上，在甘露醇和盐的诱导下表达且可以提高植物耐旱性。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
本发明通过小肽基因筛选方法，先确定编码氨基酸的长度，找出编码小肽蛋白的基因，再借助转录组、基因探针等类型数据研究基因，找到一个蒺藜苜蓿的MtSPG6基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的核苷酸序列由219个碱基组成。
一种蒺藜苜蓿的MtSPG6蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的序列由72个氨基酸残基组成。
扩增上述MtSPG6基因的引物对，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示。
包含上述蒺藜苜蓿的MtSPG6基因的过表达载体也落入本发明的保护范围，本发明所选用的过表达载体为农杆菌过表达载体。
本发明最主要的目的是在分子水平上对蒺藜苜蓿的MtSPG6基因进行克隆和鉴定，从而解析响应干旱胁迫的生理和分子功能。
本发明还公开了上述蒺藜苜蓿的MtSPG6基因的用途。
研究发现，所述MtSPG6基因及重组MtSPG6基因的蛋白定位在细胞膜和细胞质上，在甘露醇和盐的诱导下表达且可以提高植物抗旱性。
本发明还公开了一种培育转基因植物的方法，将MtSPG6基因导入目的植物，得到转基因植物，所述转基因植物的耐旱性强于目的植物。
具体地，为了提高植物的优良性状，本发明还保护一种新的植物育种方法，包括如下步骤(1)和/或(2)：
(1)通过向目的植物外源施加MtSPG6蛋白，获得耐旱性强于目的植物的植株表型；
(2)通过促进目的植物中MtSPG6基因的表达，获得耐旱性强于目的植物的植株；
“促进目的植物中MtSPG6基因的表达″的实现方式可为如下(1)或(2)或(3)：
(1)将MtSPG6基因导入目的植物；
(2)引入强启动子和/或增强子；
(3)本领域内的其它常见方法。
本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。
作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：蒺藜苜蓿、拟南芥，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。尤其适用于需要提高耐旱性的植物，在实际的应用过程中，对于需要提高耐旱性的植物，均可以通过转基因的方式培育转入该基因的株系。
本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。
本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。
本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。
本发明具有如下优点：
本发明首次对蒺藜苜蓿特有的小分子肽基因进行了筛选，得到了两个与干旱相关的基因，分别命名为MtSPG6基因、MtSPG9基因(为了避出现单一性的问题，两个基因分开申请专利)，并且分别对MtSPG6基因、MtSPG9基因响应干旱胁迫的生理和分子功能进行了解析，结果显示，提供的MtSPG6基因、MtSPG9基因及其蛋白定位在细胞膜和细胞质上，在甘露醇和盐的诱导下表达且可以提高植物抗旱性；本发明抗逆性相关蛋白的DNA序列及所编码的蛋白相对于原始蛋白及其编码基因序列在抗逆性(尤其是抗旱性能)上增强，为人工控制抗逆相关基因的表达提供了理论基础，利于培育抗逆性更强的植物品种或者改造其它植物的抗逆性。
附图说明
图1是MtSPG6基因在洋葱表皮亚细胞定位图；
图中，从左到右分别为目的基因的绿色荧光蛋白、明场和三个通道的叠加照片；GFP空载体作对照。
图2是MtSPG6转基因拟南芥阳性植株PCR检测结果；
图中，最左侧为2000bpMarker，1-16为转基因拟南芥的16个过表达株系，WT为野生型拟南芥。
图3是MtSPG6转基因拟南芥表达量鉴定。
图4是MtSPG6转基因拟南芥平板根长表型的评价；
图中，A.MtSPG6转基因拟南芥在不同浓度甘露醇和ABA平板上的根长表型；B.MtSPG6转基因拟南芥在不同浓度甘露醇和ABA平板上的根长统计，误差线表示4个生物学重复的标准误；C.培养基中添加300mM甘露醇以及对照的总根长对比。
图5是过表达MtSPG6转基因拟南芥土壤干旱表型图。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。
此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。
另外，为了对本发明技术方案更直观的理解，对于本发明涉及到的一些专业术语解释如下：
“表达载体”，Expression vectors，是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、PBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。
“农杆菌介导转化法”，Agrobacterium-mediated transformation，指将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株的技术。
目的植物：target plant，本发明所述目的植物是拟南芥。
目的基因：target gene,也称靶标基因，在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。可以是生物体本身的，也可以是来自不同生物体的。
实施例
首先借助蒺藜苜蓿全基因组，挑选出蒺藜苜蓿中编码氨基酸数量小于150个的基因，再借助干旱胁迫下的转录组数据，从中挑选在干旱胁迫下表达量能够明显上升的基因，再借助探针数据，最终筛选得到一个蒺藜苜蓿MtSPG6基因，该基因全长编码框核苷酸序列长度为219bp，由72个氨基酸组成，经过测序得到其核苷酸序列如序列为：(SEQ ID NO.1)，其蛋白序列：(SEQ ID NO.2)。
一.MtSPG6的克隆和载体构建
根据MtSPG6基因，使用DNAMAN设计克隆全长的带有酶切位点的特异性引物，其中正向引物序列为：ATGCTTCCTCTTCCTCGTT(SEQ ID NO.3)，反向引物序列为：ATGGTCCCCTGTATTTATC(SEQ ID NO.4)。引物由上海生工生物技术有限公司合成并选用HAP纯化方法。
克隆DNA序列的反应体系：cDNA 2 μL，kod DNA聚合酶0.5μL，正向引物/10μM 0.8μL，反向引物/10μM 0.8μL，2mM dNTPs 2μL，10×缓冲液2μL，DMSO 1μL，ddH2O 10.9μL，总体积20μL。
PCR扩增反应程序：94℃ 4min；94℃ 30s，60℃ 30s，68℃ 45s，40cycles；68℃8min。
每个反应管中加入适量10×上样buffer，在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳。在0.5×TBE缓冲液中以5～10V/cm进行电泳，结束电泳，在凝胶成像系统中拍照。使用捷瑞生物的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(GK2042)将目的片段回收：将DNA目标条带小心割下，放入1.5ml EP管中。向管中加入400μl的banding B，放入70℃水浴中，直到凝胶完全溶解。向管中加入100μl的异丙醇，室温放1min，5000rpm离心1min过柱。重复步骤3。加500μ1washbuffer 12000rmp洗两次，10000rmp离心1min。向柱中加入40μl双蒸水，37℃放置2min，12000rmp离心1min收集。将上述纯化的目的片段与PHG载体分别进行单酶切，获得同样酶切位点的目的片段与载体片段。Hind III/PST I 6μL，10×酶切缓冲液4μL，10×BSA 4μL，质粒模板量≤1ng，ddH2O定容至40μL，整个体系PCR 37℃条件下反应1h。PC片段经琼脂糖凝胶回收后，与酶切回收的空载体混合，加入EasyGenoDNA重组体系连接，10μl重组体系如下：2×EasyGeno Assembly Mix 5μL，酶切载体DNA 2.5μL，片段DNA 2.5μL。将反应体系加入250μl EP管中，放50℃水浴30分钟后转化大肠杆菌涂板，放37℃培养箱16小时后，挑菌，送测序，测序正确的提质粒放在-20℃长期保存。
二.农杆菌转化与洋葱表皮细胞亚细胞定位
将上一步测序正确的质粒通过电击转化法转入根癌农杆菌GV3101细胞。使用到的仪器有奥林巴斯激光共聚焦显微镜、Thermo Sorvall ST16R离心机、HH-S3数显恒温水浴锅、DYY-8D稳压稳流电泳仪。
(1)洋葱表皮细胞瞬时转化方案：
a.洋葱表皮预培养：用镊子撕取洋葱里表皮1cm2小块放在MS培养基上，28℃预培养5h。
b.侵染液制备：将菌液加入含抗生素的LB培养基过夜培养，5000rmp离心5分钟，收集菌体，LB培养液重悬浮，用分光光度计测定菌液浓度，其浓度调至OD＝1左右。
c.浸染：将上述菌液倒入到预培养培养基中，浸泡30min，期间摇动数次。倒去菌液，将洋葱表皮置于灭菌滤纸上吸干表面菌液。将其接入共培养培养基(MS培养基加AS)，28℃暗培养2天后观察。
(2)共聚焦显微镜观察：
a.打开计算机。
b.打开激光器。
c.打开汞灯电源开关。
d.打开软件。
e.打开白光灯开关，放置标片，调整焦距。
f.打开激光灯开关，点击拍照按钮拍照。
g.添加标尺，导出.GIF图片。
为了探究MtSPG6基因的亚细胞定位情况和潜在作用，将MtSPG6的编码序列与加强型GFP基因融合，在组成型CaMV35S启动子的控制下形成MtSPG6：：eGFP载体，通过农杆菌介导法瞬时转化入洋葱表皮细胞，使用空载体PHG-eGFP作为对照。通过共聚焦显微镜观察，结合质壁分离前后的结果，发现空载细胞中的eGFP荧光信号在细胞壁、细胞质和细胞核中均有分布，而MtSPG6融合的eGFP荧光信号主要分布在细胞质和细胞间隙中(图1)，细胞核中未见分布，表明MtSPG6定位在细胞膜。
三.MtSPG6基因的功能鉴定
1.浸花法遗传转化拟南芥
热激法转化根癌农杆菌及鉴定。取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。每100μl感受态加0.1μg(体积不大于10μl)质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。加入700μl无抗生素的LB液体培养基，于28℃，200rpm振荡培养2～3小时。6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含卡那霉素50μg/ml的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。随机挑选1个单菌落，做菌落PCR，鉴定正确的农杆菌单克隆做标记待用。用无菌枪头挑取做标记的农杆菌单克隆接种到1.5m1含相应抗生素的LB液体培养基中30℃，200rpm振荡培养24小时。按1％比例将过小摇的农杆菌培养物接种加入100ml含有抗生素的LB液体培养基中，30℃，振荡培养到OD600＝1.0左右；20℃，4000rpm，离心15min，收集菌体；将菌体用转化Buffer吹打均匀，重悬至OD600＝1.0左右。拟南芥的种植。
培养基的配制：拟南芥的培养基选择1/2MS(0.8％琼脂粉，1％蔗糖，pH＝5.8)。种子消毒：用1ml 7％的次氯酸钠溶液消毒，颠倒混匀15分钟，然后用无菌水上下颠倒冲洗5次。把消毒后的种子分装后用40～50℃的培养基混匀，倒入平板中，均匀的铺满一层(小培养皿大约需要4-5m1培养基)。平皿封口，4℃冰箱内春化2～3天，放入到人工气候室中开始萌发生长。植物生长环境为相对湿度60％；恒温21-23℃；光照周期为16h光照，8h黑暗。
种植土的配制：泥炭土和蛭石按2：1混匀，放置备用。浸土：把土装入到种植盆中至距盆口约1cm，用花无缺复合肥(N、P、K＝20％、20％、20％)，完全浸透。移栽：萌发后7～12天的苗，选取健壮、生长一致的移栽到事先用花无缺浸过的培养土中，其上覆盖保鲜膜，幼苗整株长势茁壮后揭去。
拟南芥转化，将正在抽苔开花的植物提前一天浇足水。小盆倒置，将所有的花序倒置入事先用转化Buffer悬浮好的菌液中约30秒钟。7天后按上述方法重复转化一次。2-3周后，尽量少浇营养液，加速衰老，成熟种子收在纸袋中，干燥7天。
2.转基因拟南芥阳性植株检测
当转基因拟南芥成熟后，收获T0代种子，将T0代种子铺于含有HYB(50μg/mL)抗性的平板上进行筛选，将具有HYB活性的幼苗移栽至花盆中，收获T1代种子，继续进行抗性筛选，直至获得T2代纯合株系的种子。获得纯合的转基因株系后，通过使用SDS法提取Col-0野生型及转基因不同株系拟南芥叶片的DNA，利用35S-F和MtSPG6-R，以及HPT-F、HPT-R这两对引物，2×Taq Master Mix酶扩增检测阳性植株。
HPT-F：GGTCGCGGAGGCTATGGATGC；
HPT-R：GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT；
反应体系为：cDNA 2μL，2×Taq Master Mix 10μL，正向引物/10μM 0.8μL，反向引物/10μM 0.8μL，ddH2O 6.4μL，总体积20μL。PCR扩增反应程序：94℃ 3min；94℃ 30s，60℃30s，72℃ 1min，35cycles；72℃ 5min。
将MtSPG6基因在拟南芥中进行过表达后，共获得了16个转基因株系。经过PCR鉴定，共有7个株系含有HPT-F/HPT-R扩增的长度是219bp的潮霉素抗性基因HPT片段(图2)，继而用qPCR检测了这7个转基因株系中MtSPG6的表达量。结果表明，7个转基因株系中MtSPG6的表达水平均比野生型有所提高(图3)，最小的表达量是7号株系，最大的表达量是1号株系，可以达到1号株系的7倍，可选取表达量相对较突出的1、4、6号株系作为研究对象。
3.转基因拟南芥抗旱性评价指标的测定
为了解析转基因拟南芥的抗逆特性，对获得的转基因拟南芥进行1/2MS平板模施加300mM甘露醇(Mannitol)的1/2MS平板和对照平板中，对照即不含有其他添加的1/2MS培养基，将Col-0拟南芥及转基因株系同时铺摆于同一平板上，每一皿中摆放包括野生型拟南芥共4个株系，每个株系包含4个重复。摆根长完成后，随即移入步入式培养箱，16h光照/8h黑暗，22℃条件萌发生长7d左右，对幼苗表型进行拍照并测量每一株幼苗的绝对根长。使用R语言绘图，使用SPSS20分析显著性。
根据qPCR实验结果，选择表达量最高三个纯合转基因株系的幼苗，分别是OE-1、0E-4、OE-6，验证它们是否比野生型拟南芥更强的抗旱性。在1/2MS培养基上萌发拟南芥种子，待幼苗根长生长至1cm左右，挑选根长一致的野生型和转基因幼苗移到同一1/2MS培养基上，培养基中添加300mM甘露醇，观察生长趋势，生长7d时统计主根长(图4)。在未施加胁迫的培养基上，野生型和MtSPG6转基因株系的长势比较一致，无明显差异；但在300mM甘露醇施加的干旱胁迫平板上，转基因株系生长状况要明显优于野生型，叶片发皱发黄情况也明显低于野生型，因此MtSPG6转基因株系具有更高的耐旱性。
从植株生长的表型来看(图5)，停止浇水14天后野生型WT几乎干旱致死，而表达量高的三个MtSPG6转基因株系的叶片虽然一定程度上出现了卷曲和萎蔫，但是和野生型相比，其长势明显好于野生型。并且经过复水处理后，野生型WT没有成活，而MtSPG6转基因株系几乎又恢复到原来的生长状态，可见，MtSPG6转基因拟南芥的幼苗具备了较野生型拟南芥更强的耐旱性。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
Claims (7)
1.MsSPG6基因在提高植物耐旱性方面的用途，其特征在于，所述MsSPG6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述MsSPG6基因的正向引物序列如SEQ IDNO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述植物为蒺藜苜蓿、拟南芥。
4.一种培育转基因植物的方法，其特征在于，将权利要求1中所述的MsSPG6基因导入目的植物，得到转基因植物，所述转基因植物的耐旱性强于目的植物。
5.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为以下(1)或(2)：
(1)通过向目的植物外源施加MtSPG6蛋白，获得耐旱性强于目的植物的植株表型；
(2)通过促进目的植物中MsSPG6基因的表达，获得耐旱性强于目的植物的植株；所述MsSPG6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MsSPG6蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
6.根据权利要求5所述的植物育种方法，其特征在于，“促进目的植物中MsSPG6基因的表达”的实现方式包括如下(1)或(2)：
(1)将MsSPG6基因导入目的植物；
(2)引入强启动子和/或增强子。
7.根据权利要求5或6所述的植物育种方法，其特征在于，所述目的植物为蒺藜苜蓿、拟南芥。
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