CN116515857B - 一种仁用杏PaPIP1-2基因及其在提高植物抗寒性中的应用 - Google Patents
一种仁用杏PaPIP1-2基因及其在提高植物抗寒性中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种仁用杏PaPIP1‑2基因及其在提高植物抗寒性中的应用，涉及生物技术领域。该仁用杏PaPIP1‑2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明研究发现，PaPIP1‑2基因在仁用杏花芽休眠和萌发阶段的四个样本中差异表达，PaPIP1‑2在酵母表达系统中赋予了其冷胁迫抗性，PaPIP1‑2在拟南芥中的过表达增加了抗氧化酶活性并提高了转基因植物在冷胁迫下的耐受性。本发明提供的与抗寒性、休眠期和萌芽期相关的重要基因PaPIP1‑2，将有助于通过转基因方式培育花期延后的仁用杏，从而避免霜冻损害。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种仁用杏PaPIP1-2基因及其在提高植物抗寒性中的应用。
背景技术
仁用杏具有很高的经济价值和生态价值，是重要的生态经济型干果树种、木本油料树种和植物蛋白饮料树种。由于仁用杏休眠期短、花期早极易遭受晚霜为害，造成减产甚至绝产，实现花期的人为调控是解决仁用杏低产和不稳产的有效途径之一。
水通道蛋白（AQPs）又名水孔蛋白，是一种位于细胞膜上的蛋白质（内在膜蛋白），在细胞膜上组成“孔道”，可控制水在细胞的进出，就像是“细胞的水泵”一样。水分子经过水通道蛋白时会形成单一纵列，进入弯曲狭窄的通道内，内部的偶极力与极性会帮助水分子旋转，以适当角度穿越狭窄的通道，因此水通道蛋白的蛋白构象为仅能使水分子通过之原因。植物水通道蛋白是一个超家族，根据氨基酸序列同源性和亚细胞定位可以划分为四个家族：质膜内在蛋白（PIP）、液泡膜内在蛋白（TIP）、类Nodulin26膜内在蛋白（NIP）和小的基本膜内在蛋白（SIP）。PIP被分为两个亚家族：PIP1和PIP2。从蛋白序列看，与PIP2亚家族成员相比，PIP1亚家族成员有一个长的N末端和短的C末端。PIP1和PIP2亚家族成员在功能上也存在差异。
目前对仁用杏特定PIP成员的功能仍然了解有限，并且在仁用杏中不同休眠和萌发阶段的花芽中PIP亚家族基因的表达模式在很大程度上是未知的。目前新发现的仁用杏水通道蛋白成员PaPIP1-2在花芽休眠和萌发阶段的四个样本中差异表达，其在低温下维持抗寒性的作用还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种仁用杏PaPIP1-2基因及其在提高植物抗寒性中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该仁用杏PaPIP1-2基因可以提高植物的抗寒性。
本发明发现了休眠期和萌芽期相关的重要基因PaPIP1-2，PaPIP1-2基因在仁用杏花芽休眠和萌发阶段的四个样本中有差异表达，说明PaPIP1-2与花芽休眠和萌芽相关和在花芽休眠和萌发阶段起重要作用。
基于此，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种仁用杏PaPIP1-2基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种仁用杏PaPIP1-2蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种重组质粒，包含上述的仁用杏PaPIP1-2基因。
本发明还提供一种重组微生物菌株，包含上述的重组质粒。
本发明还提供上述的仁用杏PaPIP1-2基因、仁用杏PaPIP1-2蛋白质、重组质粒或重组微生物菌株在提高植物或酵母菌的抗寒性中的应用。
本发明还提供上述的仁用杏PaPIP1-2基因、仁用杏PaPIP1-2蛋白质、重组质粒或重组微生物菌株在提高植物在冷胁迫下的抗氧化酶SOD的活性中的应用。
本发明还提供上述的仁用杏PaPIP1-2基因、仁用杏PaPIP1-2蛋白质、重组质粒或重组微生物菌株在提高植物在冷胁迫下的MDA含量中的应用。
本发明还提供上述的仁用杏PaPIP1-2基因、仁用杏PaPIP1-2蛋白质、重组质粒或重组微生物菌株在提高植物在冷胁迫下的脯氨酸含量中的应用。
本发明还提供一种提高植物抗寒性的方法，包括将编码如SEQ ID NO.1所示的蛋白质的基因，通过遗传转化进入植物植株，得到转基因植株的步骤。
进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明公开了以下技术效果：
本发明深化了仁用杏水通道蛋白PIP亚家族的功能研究。本发明研究发现，PaPIP1-2基因在仁用杏休眠和萌发阶段的花芽中差异表达，GFP融合的PaPIP1-2的瞬时表达显示融合蛋白定位于质膜。蛋白质相互作用预测分析显示，一些PIP和TIP亚家族蛋白，如PIP2A、PIP1B、TIP2;2、PP2C和RLK7与PaPIP1-2相互作用。共表达网络显示PaPIP1-2与PaPTK、PaZFER、PaFAD、PaPP2C、PaEREBP和PaADH等6个抗寒基因存在共表达的趋势，这6个抗寒基因与PaPIP1-2在仁用杏花芽的4个时期（PD-生理休眠期、ED-生态休眠期、SP-萌动期和GS-萌发期）的表达趋势基本一致。此外，PaPIP1-2在酵母表达系统中赋予了其冷胁迫抗性。PaPIP1-2在拟南芥中的过表达增加了转基因拟南芥抗氧化酶活性并提高了转基因植物在冷胁迫下的耐受性。本发明发现的与抗寒性、休眠期和萌芽期相关的重要基因PaPIP1-2，将有助于通过转基因方式培育花期延后的仁用杏，从而避免霜冻损害。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pGAPZA载体（A）和改进的pBI121载体（B）的图谱；
图2为PaPIP1-2基因扩增图；M为DL2000 Marker；1: 阴性对照扩增；2，3:PaPIP1-2基因扩增；
图3为PaAQPs在仁用杏休眠期和萌发期的表达情况；
图4为PaPIP1-2在仁用杏不同时期的基因表达情况；其中，（a）为PaPIP1-2在不同时期（PD、ED、SP和GS）的FPKM值；（b）为在仁用杏PD、ED、SP和GS期，花芽和茎中PaPIP1-2的转录水平；
图5为PaPIP1-2的蛋白序列与仁用杏PIPs的蛋白序列的进化树分析结果；
图6为PaPIP1-2蛋白质互作网络图；
图7为PaPIP1-2共表达网络图；
图8为在仁用杏的PD、ED、SP和GS期，参与花芽和茎中抗寒性的6个基因的转录水平；
图9为亚细胞定位实验结果；其中，标尺均为5 μm；
图10为PaPIP1-2基因对酵母抗寒性的影响；其中，（a）为用含有PaPIP1-2的pGAPZA载体或pGAPZA空载体转化的GS115酵母菌株的生长情况；（b）为响应冷胁迫的酵母转化体的OD600值；
图11为为PaPIP1-2转基因拟南芥和野生型拟南芥在不同低温胁迫处理后的表型观察结果；
图12为转基因株系PIPOE-1和PIPOE-2，在低温胁迫处理后的PaPIP1-2基因表达情况；
图13为转基因株系PIPOE-1和PIPOE-2，在低温胁迫处理后的抗氧化酶SOD的活性测试结果；
图14为转基因株系PIPOE-1和PIPOE-2，在低温胁迫处理后的脯氨酸含量测试结果；
图15为转基因株系PIPOE-1和PIPOE-2，在低温胁迫处理后的MDA含量测试结果；肌动蛋白actin用作对照基因。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
术语说明：
在本发明中，即使在最佳环境条件下也不能爆裂的芽处于被称为生理休眠（physiological dormancy，PD）或自然休眠的阶段，而由于缺乏花芽萌发的合适温度而不能爆裂的芽处于生态休眠期（ecological dormancy，ED）。当气候条件适合花芽萌发时，花芽进入萌动期（sprouting period，SP）和萌发期（germination stage，GS），并进一步开始花芽萌发和花发育的过程。
FPKM代表每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片。
以下实施例中pGAPZA载体来自于Invitrogen公司，pBI121载体来自于Novagen公司，农杆菌GV3101来自于上海唯地生物技术有限公司，酵母菌株GS115来自于上海圻明生物科技有限公司。
实施例1
1 方法
1.1 仁用杏PaPIP1-2基因的克隆
仁用杏主栽品种‘龙王帽’种植于内蒙古自治区赤峰市喀喇沁旗锦山镇，采取花芽组织提取总RNA。RNA提取及第一链cDNA反转录步骤如下：
（1）RNA提取步骤及第一链cDNA反转录方法：
1）研磨花芽组织，加1mL Trizol，匀浆后，花芽组织与Trizol混合物室温放置5min，使得组织样本能被Trizol充分裂解。
2）取1mL Trizol裂解的样本组织加入200 μL三氯甲烷。
3）管盖盖严，上下剧烈摇晃15秒。
4）置室温放置3 min。
5）在离心机4 ℃下转速12000g离心15 min。
6）离心后静置，待管中液体分层，将明显分层的最上层的无色液体（约占总体积45%左右）转移到一个新的无RNA酶的EP管中。
7）向移取的上层液体中加500 μL 100%异丙醇。
8）室温放置10 min。
9）在离心机4 ℃下12000g离心10min。
注意：离心管放置时，管柄一致向外侧，离心后，RNA将沉淀于管柄一侧的底部。
10）小心给上清吸去，加入DEPC水配置的75%乙醇。
11）上下颠倒十次，转速7500g，4℃离心5 min。
12）去除乙醇后，开管盖室温放置5-10 min，即得到纯化的RNA。
13）DEPC水溶解后琼脂糖电泳检测。
使用Takara公司的PrimeScripTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (PerfectReal Time)试剂盒将RNA逆转录为cDNA，取适量上述反转录产物，后续进行PCR扩增分离目的基因。
目的基因扩增
根据pGAPZA载体图谱（图1中A）设计EcoR I和Xho I为插入位点，根据改进的pBI121的图谱（图1中B）设计Xba I和Sal I为插入位点。
扩增基因引物序列为：
构建pGAPZA- PaPIP1-2的引物序列：
PaPIP1-2-GAP-F:caactatttcgaaacgaggaattcATGGAGGGCAAGGAAGAAGATGTT（SEQID NO：3）；
PaPIP1-2-GAP-R:agctggcggccgccgcggctcgaggtTTAGCCCCTGGACTTGAAAGGAAT（SEQID NO：4）；
其中小写字母代表酶切位点和保护碱基序列，大写字母代表来自参考模板的5’和3’端的序列。
构建pBI121-PaPIP1-2的引物序列：
PaPIP1-2-flag-F:TGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGAGGGCAAGGAAGAAGATGTT（SEQID NO：5）；
PaPIP1-2-flag-R:CATGATCTTTGTAATCCATGTCGACTTAGCCCCTGGACTTGAAAGGAAT（SEQID NO：6）。
使用高保真酶扩增得到目的片段，扩增体系见表1。
表1 KOD酶扩增体系
② PCR反应程序：
94℃预变性2 min；循环情况为94℃变性15 s，55℃退火15s，68℃延伸1min，共35个循环；68℃延伸5min。
③电泳检测与回收：PCR产物在1％琼脂糖凝胶进行电泳，电压调节至100 V，电泳时间为20 min，凝胶成像系统拍照后切取目的基因的条胶，使用诺唯赞胶回收试剂盒回收目的基因条胶，具体步骤按照试剂盒说明书进行。
如PaPIP1-2基因扩增图（图2）所示，PCR产物约为1000 bp；M为DL2000 Marker；1:阴性对照扩增；2，3:PaPIP1-2基因扩增。对PCR产物进行测序，并提交至NCBI数据库中进行BLASTN核酸序列的同源性分析(https://blast .ncbi .nlm .nih .gov/Blast .cgi)，确定通过上述PCR反应克隆到的是PIP的同源基因。
该基因含有一个完整的开放阅读框架，全长为861 bp，见SEQ ID NO.2，该基因编码的蛋白的氨基酸序列，见SEQ ID NO.1。将这个来源于仁用杏的PIP同源基因命名为PaPIP1-2。
1.2 转录组测序用于分析PaAQPs在杏休眠期和萌发期的表达。
1.3PaPIP1-2的不同组织定量表达及转基因拟南芥的PaPIP1-2和抗寒相关基因的荧光实时定量PCR分析
花芽休眠和萌发的4个时期（PD-生理休眠期、ED-生态休眠期、SP-萌动期和GS-萌发期）样本的RNA提取按照1.1描述的方法进行，利用MM-LV反转录试剂盒(Promega, 美国)进行cDNA的反转录。利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计荧光实时定量PCR引物，根据PaPIP1-2、PaPTK、PaZFER、PaFAD、PaPP2C、PaEREBP和PaADH基因的编码区序列，设计8对能够扩增200 bp左右片段的引物，并以肌动蛋白actin作为内参基因。PaPIP1-2基因、内参基因AtActin和抗寒相关基因的荧光实时定量PCR引物序列见表2：
表2
PCR反应按照SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa，日本)试剂盒提供的方法进行：在PCR 8连管中依次加入10 µL SYBR Premix Ex TaqTM、0.4 µL PCR Forward primer、0.4 µLPCR Reverse primer、0.4 µL ROX Reference dye II、2 µL cDNA和6.8 µL灭菌蒸馏水，终体积为20 µL，轻微离心，收集到管底。PCR反应在ABI 7500 Real-time PCR仪上按照下列程序进行：95°C 10s；95°C 5s，59°C 34s，共40个循环。
PCR结束后，制作熔解曲线检查是否有非特异扩增，然后应用ABI sequencedetection system分析软件分析定量PCR结果。
1.4 蛋白质相互作用分析
从STRING数据库(https://string-db.org/?tdsourcetag=s_pctim_aiom)中生成蛋白质相互作用网络的预测。
1.5 共表达网络的构建与分析
PaPIP1-2的共表达数据是从RNA-Seq数据（SRA数据库编号SRS1042411）中获得的。对于PaPIP1-2基因共表达网络的构建，使用了来自仁用杏两组花芽样本三个时期的RNA-seq数据。筛选出Pearson相关系数>0.876的基因，共筛选出50个基因作为PaPIP1-2共表达基因。在这50个与PaPIP1-2共表达的基因中，选择了6个与低温胁迫相关的基因来构建PaPIP1-1的共表达网络。运用Cytoscape软件（http://www.cytoscape.org/)用于生成共表达网络图。
1.6 亚细胞定位
1.6.1 去内毒素质粒提取
提前一天用LB培养基摇菌，第二天离心收集菌体，提取去内毒素质粒，并测浓度。
1.6.2 亚细胞定位实验
（1）材料准备：
a) 拟南芥培养条件：选择吸水性好，土质松软的蛭石配合基质（2：1）作为拟南芥种植土壤。选择直径9cm的花盆，每盆播种80颗。播种以后浇水并覆膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。拟南芥室生长条件为光照强度为2500-3500lx，光照时间14h/day，湿度45-65%。
b) 移栽：播种12-15天，待拟南芥幼苗长至四叶时期开始移栽，每盆5-6棵。覆膜，6天后揭膜。
c) 需用3-4周大的抽薹前的苗子，取第6-8片真叶用于分离原生质体。需选择健康、长势良好的苗子。
（2）拟南芥原生质体的制备：
1）配制好酶解液，同时准备0.4M甘露醇。
2）将处理好的酶解液倒入合适大小的干净、干燥的平皿中。
3）挑取健康、长势良好的叶片，在0.4M甘露醇的环境中将叶片切成0.5mm宽的细丝。
4）切好的叶片立即放入平皿中，完全浸没在酶解液里，切完之后置于黑暗中。
5）于40-50rpm摇床上避光酶解2h。
6）加入等体积的W5 solution终止酶解反应，用50mL注射器（去掉针头）吸起酶解产物，经40目NYLON MESH过滤到圆底的离心管中。
7）4℃，100g离心8min，加速减速设为3档。
8）小心吸出上清弃去，不要搅动底下原生质体，再用5mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体，同上步离心。
9）小心吸出上清弃去，视原生质体数目用适量预冷W5溶液重悬原生质体至数目大约为2×105mL-1，冰浴30min。
10）同第7步离心，小心吸出上清弃去，换MMG溶液重悬原生质体，至原生质体数目大约为2×105mL-1。
（3）PEG转化：
1）每次操作一管：取200μL原生质体放入2mL离心管中，加入所需转化质粒10μL(浓度调至1μg/μL)，轻叩管壁混匀，放置5min。然后加入210μL的PEG溶液，立即轻柔颠倒混匀，室温23℃放置30min。
2）加入800μL W5溶液稀释，轻柔颠倒混匀。
3）室温23℃，120g离心8min，加速减速设为3-4挡。
4）小心弃去上清，用1mL WI溶液重悬原生质体，20~23℃弱光下培养过夜。
5）室温23℃，120g离心8min，弃上清，加入500μL WI溶液悬浮，加入5μL的Dil或MitoSOX试剂，混匀，黑暗条件下孵育20min。
6）室温23℃，120g离心8min，弃上清，加入1mL WI溶液悬浮。
7）室温23℃，120g离心8min，弃上清，加入500μL WI溶液悬浮，加入1μL的DAPI试剂，混匀，黑暗条件下孵育5min。
8）室温23℃，120g离心8min，弃上清，加入1mL WI溶液悬浮。
9）室温23℃，120g离心8min，弃上清，加入100μL WI溶液悬浮，共聚焦观察。
10）拍摄荧光图片。
使用的共聚焦显微镜仪器型号：Leica TCS SP8 Scan Head(Germany)
GFP：激发488nm，主接收峰510nm；DAPI：激发405nm，主接收峰450nm；Dil或MitoSOX：激发551nm，主接收峰568nm；叶绿体自发荧光：激发488nm，主接收峰650nm。
1.7用于酵母和拟南芥转化的表达载体的构建
实施例1得到的PaPIP1-2目的片段与pGAPZA（图1）载体或pBI121载体的酶切。其中pGAPZA载体进行EcoR I、Xho I双酶切，改进的pBI121载体进行Xba I、Sal I双酶切。同样，PaPIP1-2目的片段也分别进行EcoR I、Xho I双酶切，Xba I、Sal I双酶切，具体酶切体系见表3。
表3 目的片段与载体的酶切体系
(2) 将酶切的pGAPZA载体或改进的pBI121载体与同样酶切的目的基因进行体外连接，连接体系见表4，在22℃进行2小时连接。
表4 目的基因与重组质粒的连接体系
(3) 连接产物的转化
a. 超净工作台提前进行30 min灭菌，从-70 ℃超低温冰箱中取出100 μL的DH5α感受态细胞，置于冰上预冷10 min；
b. 取出一个Ep管，编上记号，置于冰盒上，加入80 μL的感受态细胞(冰上操作)
c. 然后加入10 μL目的基因与重组质粒的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；
d. 冰浴结束后，连接产物与感受态细胞混匀后的产物一起放在42℃的恒温水浴锅中热激90 s，然后迅速放入冰块中，进行2 min的冰浴；
e. 吸取500 μL不含Kan的LB液体培养液加入到Ep管中，混匀并放置于摇床中转速160 rpm，37℃振荡摇菌1 h；
f. 取出摇床振荡摇菌结束的Ep管，2500～3500 rmp转速离心5 min，弃去上清300μL，剩余的底部菌液轻柔吸打混匀，加在含Kan的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀和涂干；
g. 37 ℃恒温培养箱中静置培养16～20 h至出现单克隆。
(4) 融合表达载体的鉴定
将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定，菌液PCR鉴定的体系见表5。
表5 单菌落检测PCR体系
引物序列：
PaPIP1-2-F (正向引物P1): ATGGAGGGCAAGGAAGAAGATGTT（SEQ ID NO.23）；
PaPIP1-2-R (反向引物P2): TTAGCCCCTGGACTTGAAAGGAAT（SEQ ID NO.24）。
菌液PCR鉴定鉴定插入片段无误后，pBI121-PaPIP1-2载体转化农杆菌GV3101感受态细胞。PCR筛选阳性克隆，提质粒进行限制性酶切验证后，证明成功转化入农杆菌中，并采用花序浸染法将pBI121-PaPIP1-2载体遗传转化到拟南芥中。
1.8 pGAPZA-PaPIP1-2质粒转化酵母菌株GS115
1、准备酵母感受态细胞
（1）从固体YPD平板上挑取GS115单克隆菌落，接种在含有10 mL YPD液体培养基的100 mL摇瓶中，30 ℃转速250-300 rpm振荡过夜。
（2）按1/1000比例接种到含100mL新鲜培养基的1L摇瓶里，过夜振荡培养至OD600＝1.3-1.5。
（3）室温1500 g转速离心5min，用50 mL预冷无菌水进行洗涤，4 ℃下1500g转速离心5min收集细胞。
（4）用20 mL无菌水洗涤一次，4 ℃下1500g转速离心5 min收集细胞。
（5）用10 mL无菌水洗涤一次，4 ℃下1500g转速离心5 min收集细胞。
（6）同样4 ℃，1500 g转速离心5 min收集细胞，加入提前预冷的5 mL 1M山梨醇悬浮细胞。
（7）洗涤三次后离心，最后用2mL预冷的1M山梨醇悬浮细胞。
2、pGAPZA-PaPIP1-2质粒转化酵母菌株GS115
（1）向100 μL酵母感受态加入线性化质粒pGAPZA-PaPIP1-25 μL，一起转移至电转杯中，进行冰浴10分钟。
（2）使用电转仪将融合表达载体质粒转化至酵母感受态GS115中。
（3）加入1 mL提前预冷的1 M山梨醇，并将溶液转移至15 mL离心管中。
（4）30 ℃恒温摇床，大约150 rpm振荡摇动95 min。
（5）离心机800 g转速室温离心4 min收集转化后的酵母细胞。
（6）弃去上清，加入400 μL 0.9% NaCl溶液轻轻悬浮酵母细胞。
（7）吸取上述悬浮的酵母细胞于选择性的博来霉素培养基的平板上，用刮铲涂抹开整个平板并没有液体流动。
（8）平板置于30 ℃恒温箱培养3天。
PCR筛选阳性克隆，含有该表达载体的酵母菌株可直接用于酵母菌株的低温检测等实验。
1.9PaPIP1-2转化酵母菌的低温检测实验
分别挑取含有pGAPZA-PaPIP1-2转化酵母菌和空载pGAPZA转化酵母菌的克隆至1mL含有500 μg/mL博来霉素的全氨基酸液体培养基中，30 ℃恒温培养12小时直至菌液变浑浊。转移100 μL菌液至含2 mL全氨基酸液体培养基的10 mL离心管中，30 ℃恒温培养22-24小时，测定并调整OD值至OD600=1.0（如需进行低温处理，此时将菌液放入-20 ℃冰箱中低温处理24小时）。将菌液进行1、1:10、1:100和1:1000稀释，取每种稀释液的5 μL点固体平板，30 ℃恒温培养3天。另外，取1 mL菌液到含有10 mL全氨基酸液体培养基的50 mL培养管中，30 ℃恒温过夜培养后测定OD600。
1.10PaPIP1-2转基因拟南芥的PCR鉴定和低温处理实验
转基因拟南芥种子筛选和PCR鉴定：在含有卡那霉素抗生素的平板上培养浸染后的PaPIP1-2转基因拟南芥种子。取大约300颗种子于含卡那霉素25 μg/mL的0.5×MS培养基上春化2天，然后持续光照培养10天。成功转入pBI121-PaPIP1-2载体的拟南芥种子能在卡那霉素抗性培养基上正常生长，长出4片以上的真叶。根据pBI121载体上的nptⅡ报告基因序列设计引物，对PaPIP1-2转基因拟南芥植株进行PCR检测。引物序列为:
正向引物：NPT-F1：ACTCTCAATCCAAATAATCTG（SEQ ID NO.25）；反向引物：NPT-R1：GAAATCTCGTGATGGCAGGTTG（SEQ ID NO.26）。
非转基因拟南芥种子不能正常生长，只能长出2片子叶，并且根的生长也受到严重抑制，一般情况下种子萌发10天后便死亡。
（1）PaPIP1-2转基因拟南芥植株移栽培养。将在卡那霉素抗性培养基上正常生长，并经过PCR鉴定的转基因拟南芥植株移栽到土壤继续培养。
（2）转基因拟南芥的种植和低温处理：选用吸水性好、土质松软的至石配合营养土（1：1/2）作为拟南芥种植土壤。选用直径9 cm的花盆，每盆播种15-20颗种子。播种后在花盆上搭建薄膜装置，让转基因植株在湿润的环境里生长。待拟南芥长到八片叶子时，进行低温处理10天并拍照和记录，具体为正常生长条件22℃ 24小时，低温设计分别为16℃ 24小时生长，16℃ 16小时和4℃ 8小时的三种处理进行植株的培养。具体转基因植株的低温设计方案见表6，转基因拟南芥植株进行三次平行重复实验。
表6PaPIP1-2转基因拟南芥材料处理条件
2 结果
2.1PaPIP1-2在杏的休眠期和萌芽期表达量最高
在发明人前期的研究中，转录组测序用于分析PaAQPs在杏休眠期和萌发期的表达，PaPIP1-2在ED、SP和GS的不同时期表现出最高的表达水平（图3）。ED阶段两次重复测量数据中的FPKM值分别为197.1和196.8，在SP期达到最高值347.3和380.9，在GS阶段，FPKM值略微下降至217.3和200.7，见图4中（a）。qRT-PCR显示PaPIP1-2的表达趋势与通过RNA-seq分析在花芽休眠期和萌发期鉴定的转录水平变化一致，见图4中（b）。
2.2PaPIP1-2的分离和鉴定
本发明从仁用杏的花蕾中分离出861 bp的cDNA序列（SEQ ID NO.2）。该序列与仁用杏PaPIP1-1的开放阅读框（ORF）有86.6%的同源性，我们将其命名为PaPIP1-2。进化树和序列分析显示，PaPIP1-2的cDNA序列与仁用杏PIPs的cDNA序列有70.8-86.6%的同源性（图5）。
2.3 PaPIP1-2蛋白的相互作用网络
为了进一步阐明PaPIP1-2在与其他蛋白质相互作用中的功能，本发明建立了一个蛋白质相互作用网络来评估PaPIP1-2的预测功能伙伴。如图6所示，几种PIP和TIP亚家族蛋白与PaPIP1-2相互作用，如PIP2A、PIP1B、PIP3、PIP 2;5、TIP和TIP 2;2。这些蛋白质相互作用信息表明，PaPIP1-2与萌发和耐冷基因相协调，在花芽休眠和抗寒性中起关键作用。
2.4 仁用杏PaPIP1-2共表达网络
构建PaPIP1-2共表达网络以阐明PaPIP1-2在仁用杏休眠期和萌发期的机制（图7）。总共选择50个基因与PaPIP1-2共表达（共表达系数>0.876）。其中，6个基因（12%）与耐冷性相关。在本发明的研究中，蛋白酪氨酸激酶（PaPTK）、锌指蛋白（PaZFER）、脂肪酸去饱和酶家族基因（PaFAD）、蛋白磷酸酶2C（PaPP2C）、乙烯反应元件结合蛋白（PaEREBP）和醇脱氢酶蛋白（PaADH）与PaPIP1-2在仁用杏休眠和萌发阶段的不同组织中高度共表达，可能与仁用杏的抗寒性有关。
挖掘基因表达模式有助于识别共表达基因及其协调关系。为了分析由关键PaPIP1-2介导的网络，本发明在仁用杏植物的花芽和茎的PD、ED、SP和GS中测试了PaPIP1-2共表达网络中与抗寒能力相关的6个基因的表达（图8）。在共表达的6对基因中，所有这些基因和PaPIP1-2在仁用杏花芽的4个时期（PD、ED、SP和GS）的表达趋势几乎一致。
2.5亚细胞定位结果
利用瞬转拟南芥原生质的方法，借助Leica SP2荧光显微镜和Confocal激光共聚焦显微镜观察，确定EGFP-PaPIP1-2融合蛋白定位在质膜（图9）。
2.6PaPIP1-2基因赋予酵母抗寒性
为了分析与低温耐受性相关的PaPIP1-2基因的功能，本发明在酵母菌株GS115中表达了PaPIP1-2融合载体，以评价其冷胁迫抗性。用pGAPZA空载体和pGAPZA::PaPIP1-2重组表达载体转化的酵母菌株在固体和液体SC-U培养基（2%半乳糖）中孵育用于冷应激处理。在-20℃低温处理后，用pGAPZA::PaPIP1-2转化的酵母细胞在SC-U固体培养基上的生长比对照空载体转化的酵母细胞生长得更好。此外，携带PaPIP1-2基因的酵母细胞菌落比那些携带空载体菌株的菌落生长得更大，见图10中（a）。在2 M SC-Μ液体培养基中，三种空载体菌株的平均OD值为2.33，而携带PaPIP1-2的酵母菌株的平均OD值为2.55。-20℃处理后，平均OD值分别为1.99和2.54，见图10中（b）。这些结果表明，PaPIP1-2基因可以增强酵母细胞的抗寒性。
2.7PaPIP1-2转化的拟南芥具有低温耐受性
为了解PaPIP1-2基因在低温胁迫中的特定功能，本发明将在酵母中表现出冷胁迫抗性的PaPIP1-2单独转化到拟南芥植物中。将PaPIP1-2转基因拟南芥和野生型拟南芥分别进行如下培养：22℃、16℃或16℃ 16h/4℃ 8h。通过该过程处理10天后，在野生型植物中观察到黄叶，其对低温胁迫表现出明显的敏感性。如图11所示，PaPIP1-2过表达（OE）的拟南芥植物比野生型植物生长得更好，这表明PaPIP1-2-OE植物表现出更好的低温抗性。在低温胁迫处理后，两个独立的PaPIP1-2转基因株系（PIPOE-1和PIPOE-2）显示出比未处理的转基因品系更高的基因表达水平，这通过qRT PCR得到证实，见图12。
在PaPIP1-2-OE植物中进一步测试了植物中主要ROS抗氧化酶SOD的活性。低温胁迫下，PIPOE-1和PIPOE-2 株系的SOD活性明显高于野生型株系，且相比野生型株系提高了29.21%，见图13。通过测定冷胁迫后MDA和脯氨酸含量，进一步分析了PaPIP1-2转化拟南芥的抗寒生理特性。冷胁迫野生型拟南芥的叶片中的MDA含量高于PaPIP1-2转基因拟南芥的叶片中的丙二醛（MDA）含量，冷胁迫野生型拟南芥相比转基因拟南芥MDA含量提高了26.52%，表明野生型拟南芥中发生了更强的质膜损伤，见图15。在低温胁迫下，PaPIP1-2转化植株的脯氨酸含量显著高于野生型植株，且相比野生型植株提高了125.91%，表明PaPIP1-2转基因植物表现出对低温环境的适应性，见图14。这些转基因研究表明PaPIP1-2基因与植物的抗寒性相关，提高PaPIP1-2转基因拟南芥中PaPIP1-2的表达可以提高抗氧化酶的生理活性，增强转基因植物的低温抗性。
综上所述，本发明深化了仁用杏水通道蛋白PIP亚群的功能研究。本发明研究发现，PaPIP1-2基因在仁用杏休眠和萌发阶段的花芽中差异表达，GFP融合的PaPIP1-2的瞬时表达揭示了融合蛋白定位于质膜。蛋白质相互作用预测分析显示，一些PIP和TIP亚家族蛋白，如PIP2A、PIP1B、TIP22、PP2C和RLK7与PaPIP1-2相互作用。共表达网络显示PaPIP1-2与6个抗寒基因共表达，并且这6个基因与PaPIP1-2在山杏花芽的4个休眠和萌发时期（PD、ED、SP和GS）的表达趋势基本一致。此外，PaPIP1-2在酵母表达系统中赋予了冷胁迫抗性。PaPIP1-2在拟南芥中的过表达增加了抗氧化酶活性并提高了转基因植物在冷胁迫下的耐受性。本发明的研究发现了一个与抗寒性、休眠期和萌芽期相关的重要基因PaPIP1-2，这将有助于通过转基因方式培育花期延后的仁用杏，从而避免霜冻损害。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种仁用杏PaPIP1-2基因、重组质粒或重组微生物菌株在提高植物或酵母菌的抗寒性中的应用，其特征在于，所述仁用杏PaPIP1-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述重组质粒包含所述仁用杏PaPIP1-2基因；所述重组微生物菌株包含所述重组质粒；
通过过表达所述仁用杏PaPIP1-2基因来提高植物或酵母菌的抗寒性；
所述植物为拟南芥。
2.一种提高植物抗寒性的方法，其特征在于，包括将编码如SEQ ID NO.1所示的蛋白质的基因，通过遗传转化进入植物植株，得到转基因植株的步骤；
所述植物为拟南芥。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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