CN112746078A

CN112746078A - 蜡梅CpSRG1基因、启动子及其应用

Info

Publication number: CN112746078A
Application number: CN202110159239.3A
Authority: CN
Inventors: 马婧; 李桂香; 刘道凤; 罗江会; 门维婷; 李名扬; 眭顺照
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2021-02-05
Filing date: 2021-02-05
Publication date: 2021-05-04

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及蜡梅CpSRG1基因、启动子及其应用。本发明提供了蜡梅CpSRG1蛋白、编码该蛋白的基因及启动子的克隆其应用。本发明首次克隆获得蜡梅CpSRG1基因，并通过实时荧光定量PCR技术检测CpSRG1基因的表达特性，通过转基因技术，在植物(拟南芥)中验证了该基因启动子的功能。对于蜡梅花和叶片衰老、胁迫响应(激素)及其调控机制方面的研究提供参考和依据，为进一步改良观赏性植物，如蜡梅花期的延长提供可能。

Description

蜡梅CpSRG1基因、启动子及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及蜡梅CpSRG1基因、启动子及其应用。

背景技术

蜡梅(Chimonanthus praecox)蜡梅科蜡梅属的落叶丛生灌木，原产于中国，广泛分布于中国中南及西南地区。蜡梅是少有的冬季开花植物，花期12月至翌年2月。蜡梅以其独特的花色、怡人的芳香，可盆栽做桩景、切花观赏及园林绿化植物。目前，关于蜡梅在非生物胁迫及花发育方面的研究已经取得一定的进展。

双加氧酶超家族2-OGD是植物中第二大酶家族，其成员广泛参与了各种氧化/羟基化反应。最近研究还发现，2-OGD参与表观遗传的调节，以及一些植物特有的一些代谢途径。例如：赤霉素、类黄酮、生长素、水杨酸、以及乙烯等的合成代谢。然而，目前尚未有在蜡梅中发现双加氧酶超家族基因的报道。

发明内容

本发明的目的是蜡梅逆境胁迫研究提供一种新选择。

本发明提供了蜡梅CpSRG1基因，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，蜡梅CpSRG1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了蜡梅CpSRG1基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了蜡梅CpSRG1基因在调控植物衰老中的用途，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，蜡梅CpSRG1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

具体的，所述的植物为蜡梅或拟南芥。

本发明还提供了蜡梅CpSRG1基因启动子在调控植物衰老或调控植物抗逆境胁迫能力中的用途；其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

具体的，所述的植物为蜡梅或拟南芥。

进一步的，所述的逆境胁迫为激素处理。

具体的，所述的激素为SA、GA3或Eth处理。

本发明的有益效果：本发明提供蜡梅CpSRG1蛋白、编码该蛋白的基因及启动子的克隆其应用。本发明首次克隆获得蜡梅CpSRG1基因，并通过实时荧光定量PCR技术检测CpSRG1基因的表达特性，通过转基因技术，在植物(拟南芥)中验证了该基因启动子的功能。对于蜡梅花和叶片衰老、胁迫响应(激素)及其调控机制方面的研究提供参考和依据，为进一步改良观赏性植物，如蜡梅花期的延长提供可能。

附图说明

图1、序列比对；上图为CpSRG1基因结构示意图；下图CpSRG1编码的蛋白与其他物种的SRG1蛋白的多序列比对结果，黑色横线下的序列分别为保守结构域HX(D/E)XnH和RxS的序列，结构域HX(D/E)XnH中红色框为Fe²⁺结合基序，结构域RxS框中的序列为为2-OG结合基序；序列来源于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

图2、CpSRG1编码蛋白的蛋白聚类分析。

图3、基因表达分析；A、CpSRG1基因在不同时期的表达分析；B、CpSRG1基因在不同花发育时期的表达分析。

图4、转基因拟南芥和野生型株系生理指标测定；A、叶绿素含量；B、类黄酮含量；WT为野生型株系，L6和L15为过表达株系；下同。

图5、低氮胁迫下(含氮量为4.7mM)转基因拟南芥和野生型株系生理指标测定；A、根长；B、萌发率与存活率。

图6、15天大拟南芥外源赤霉素处理下(10μM)转基因和野生型株系生理指标测定；A、拟南芥表型拍照；B、侧根数；C、平均根长；D、萌发率。

图7、CpSRG1启动子顺式元件分析。

图8、转启动子载体CpSRG1-pro/PBⅠ121拟南芥各组织GUS化学染色；a/k种子；b/l萌发的种子；c/m二叶期；d/n四叶期；e/o六叶期；f/p花；g/q茎；h/r根；i/s果荚；j/t成熟叶片；在前述每两张图片为一组的组合中，前一个字母标记的图为野生型，后一个字母标记的图为转基因株系。

图9、转启动子载体CpSRG1-pro/PBⅠ121拟南芥GUS酶活性；A、转基因拟南芥不同部位GUS酶活性；B、转基因拟南芥不同花发育时期GUS酶活性；C、外源植物激素处理(50μMEth,100μM SA和100μM GA3)对转基因拟南芥GUS活性影响。

具体实施方式

实施例1蜡梅CpSRG1基因的分离

从蜡梅cDNA文库(由西南大学园艺园林学院花卉研究室提供)随机挑选克隆子测序得到EST序列，对其进行聚类分析，初步确认功能属性，根据注释结果选择目标克隆子进行双向测序确认，得到蜡梅衰老相关基因(Senescence Related Gene 1)SRG1的基因序列，用软件Primer primer 5.0设计特异引物进行PCR扩增，引物序列如下：

CpSRG1-F：5‘-ccgagccgcgtgagctgctac-3’(SEQ ID No.4)

CpSRG1-R：5‘-ccgcatgcataagcttgctcgag-3’(SEQ ID No.5)

以蜡梅cDNA为模板，扩增蜡梅CpSRG1基因，PCR反应体系及反应条件如下：10×TaqPCR Buffer 2.5μL，dNTP(10mM)1.5μL，CpSRG1-F(10μM)1μL，CpSRG1-R(10μM)1μL，TaKaRaEx TaqTM 0.2μL，模板2μL，加ddH₂O至25μL。反应条件如下：95℃5min；95℃30s，52℃30s，26循环；72℃1min；72℃10min。

将PCR产物回收后连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取重组子进行测序，蜡梅CpSRG1基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

蜡梅CpSRG1基因cDNA全长为1489bp，包含一个1083bp的完整开放阅读框架，编码361个氨基酸。5’端有119bp长的非翻译区，3’端包含287bp的非编码序列。根据NCBI数据库进行保守结构域分析表明，CpSRG1蛋白质(其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)中存在1个吗啡N端合成双加氧酶超家族(non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal,DIOX_N superfamily)保守结构域，分布于第45～155位氨基酸；还存在1个Fe2+依赖的加氧酶超家(2OG-Fe(II)oxygenase superfamily，2OG-Fe(II)-Oxy)保守结构域，分布于第200～299位氨基酸。此外，CpSRG1蛋白质包括1个SRG1蛋白相关的保守结构域PLN02216，分布于第6～348位氨基酸，PLN02216可能跨越不止一个已知结构域，但目前还无法被归入某一已知超家族。因此，使用MEGA7.0软件进行了进化树分析，所有的比对序列来自于NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库，结果发现这个基因与苹果、梨中的同源SRG1基因进化关系较近(图1、2)。与蜡梅分支较近的苹果、梨中的同源SRG1基因均是基因组注释的序列，并没有对其基因功能的相关研究。

实施例2蜡梅CpSRG1基因的表达特性分析

1、RNA提取

(1)提RNA所用器具研钵、研钵棒、勺子、剪刀等用锡箔纸包好，置于180℃烘箱4h，冷却待用。

(2)取蜡梅叶片，在研钵中用液氮将其充分研磨，迅速倒入去RNA酶离心管中，加入600μL Trizol(植物RNA提取试剂)，涡悬混匀，室温放置10min。

(3)加入120μL三氯甲烷，涡旋混匀，室温放置10min。

(4)4℃，12000rpm离心10min，吸取200μL上清至另一离心管。

(5)加入2倍体积的无水乙醇，并充分混匀后，12000rpm，4℃，离心30min，弃上清，并保留沉淀。

(6)75％乙醇洗沉淀3次，然后风干沉淀。

(7)将沉淀溶解于适量的去RNA酶水中。

(8)电泳检测总RNA的质量并用NanoDrop测定总RNA的浓度和纯度。

2、cDNA第一链的合成

去除基因组DNA，反应体系：5×gDNA Eraser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，mRNA1μg，RNase Free H₂O补至10μL；42℃变性5min，取出后置于冰上。向反应体系中加入：5×PrimeScript Buffer 4μL，RNase Free H₂O 4μL，RT Primer Mix 1μL，PrimeScript RTEnzyme MixⅠ1μL；PCR反应条件：37℃,15min，进行cDNA第一链的合成；85℃变性5s，使反转录酶失活。-20℃保存反转录产物。

3、实时荧光定量PCR

用荧光定量PCR方法分析CpSRG1基因在不同组织、花发育时期及胁迫处理条件下的表达模式。各样本RNA提取及cDNA的合成按以上步骤进行。利用Ssofast EvaGreenSupermix(Bio-Rad,CA)反应试剂盒，在实时定量PCR仪Bio-Rad CFX96 Real-time system(USA)上完成反应。蜡梅CpActin和CpTublin作为内参基因。所用引物、PCR反应体系及反应条件如下：

CpActin-F：5‘-aggctaagattcaagacaagg-3’(SEQ ID No.6)

CpActin-R：5‘-ttggtcgcagctgattgctgtg-3’(SEQ ID No.7)

CpTublin-F：5‘-gtgcatctctatccacatcg-3’(SEQ ID No.8)

CpTublin-R：5‘-caagcttccttatgcgatcc-3’(SEQ ID No.9)

RT-CpSRG1-F：5‘-taagaacaccgtcccatctcgctac-3’(SEQ ID No.10)

RT-CpSRG1-R：5‘-gagtgcagtctctccaattcatcag-3’(SEQ ID No.11)

PCR反应体系如下：2×SsoFast EvaGreen Supermix 5μL，dNTP(10mM)1.5μL，Primer 1(10μM)0.5μL，Primer 2(10μM)0.5μL，cDNA模板0.5μL，加RNase Free dH₂O至10μL。反应条件如下：95℃5min；95℃5s，60℃5s，72℃5s，40循环；melt cycle from 65to 95℃，0.5℃/s。

首先，用荧光定量PCR技术分析蜡梅根、茎、叶和花中基因的表达水平(图3)。CpSRG1基因主要集中在内瓣、中瓣和雄蕊中优势表达，而根、茎和叶中的表达量较低。同时，检测了蜡梅花萌动期到初衰期的6个不同花发育时期中的基因表达量，结果显示，CpSRG1基因在蜡梅花发育的各个时期均有表达，其中衰老期表达量最高。

进一步分析CpSRG1基因在激素处理下的表达模式，结果显示转CpSRG1基因后拟南芥的叶绿素和类黄酮含量增加(图4)，在低氮胁迫下的成活率提高(图5)，外源赤霉素处理(10μM)可以弥补转基因效应，即可以将野生型拟南芥的种子萌发率和根系发育情况提升到转基因株系的水平(图6)，推测转基因可能通过调控赤霉素、叶绿素、类黄酮、氮素吸收转运等代谢途径，影响植物的生长发育。

实施例3蜡梅CpSRG1启动子的克隆

1蜡梅CpSRG1基因启动子片段的获得

用hiTAIL-PCR法扩增蜡梅CpSRG1基因的启动子。以已克隆到的蜡梅CpSRG1基因5’端序列为基础，分别设计3条特异的巢式引物RB0、RB1、RB2，结合简并引物LAD及AC0/AC1，分别进行三轮扩增。PCR过程中用到的引物序列如下所示。其中n、v、b、d为简并碱基，n代表a、g、c或t，v代表g、a或c，b代表g、t或c，d代表g、a或t。

LAD1:5‘-acgatggactccagagcggccgcvnvnnnggaa-3’(SEQ ID No.12)；

LAD2:5‘-acgatggactccagagcggccgcbnbnnnggtt-3’(SEQ ID No.13)

LAD3:5‘-acgatggactccagagcggccgcvvnvnnnccac-3’(SEQ ID No.14)

LAD4:5‘-acgatggactccagagcggccgcbdnbnnnccaa-3’(SEQ ID No.15)

LAD5:5‘-acgatggactccagagcggccgcbdnbnnncggt-3’(SEQ ID No.16)

AC0:5‘-ggacgatggactccag-3’(SEQ ID No.17)

CpSRG1-RB0:5‘-caaatccctcaagatcgtctgcctg-3’(SEQ ID No.18)

CpSRG1-RB1：5‘-acgatggactccagtccggccagggatacatcaatggctggtgggtc-3’(SEQID No.19)

AC1：5‘-acgatggactccagag-3’(SEQ ID No.20)

CpSRG1-RB2：5‘-gcgagatgggacggtgttcttatgc-3’(SEQ ID No.21)

以50ng的蜡梅基因组DNA为模板，用根据CpSRG1基因设计的3个特异性的巢式引物分别和简并引物LAD1-5、AC0、AC1进行组合，进行3轮TAIL-PCR扩增。将预扩增的PCR产物稀释50倍，作为第一轮PCR扩增的模板，第一轮PCR产物稀释10倍作为第二轮PCR的模板。各轮PCR反应体系及反应条件见表1。

表1 3轮TAIL-PCR扩增的反应体系及反应条件

将PCR产物回收后连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取重组子进行测序。

将获得的启动子片段提交在线数据库PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE)进行调控元件预测。

结果显示，通过hiTAIL-PCR法克隆到了CpSRG1基因上游起始密码子ATG上游1597bp。CpSRG1启动子序列包含的顺式作用元件可分为5类：启动子核心元件、非生物胁迫类元件、激素响应类元件、光应答元件及其他元件(图7)，具体见表2。核心元件包括TATABox和CAAT Box。非生物胁迫类元件包括高温响应元件HSE、干旱响应元件MBS。激素响应类元件包括茉莉酸响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif、水杨酸响应元件TCA-element、赤霉素响应元件GAREAT、乙烯响应原件ERE。光应答元件包括GATA-motif、AE-box、TGG、G-box、Box I、ATCT-motif、sp1。其他元件包括Skn-1_motif、O2-site、Box III等。结果表明，CpSRG1基因的表达可能受非生物胁迫和激素等因素诱导，与CpSRG1在蜡梅里的表达模式一致。

表2 CpSRG1启动子序列包含的顺式作用元件

实施例4蜡梅CpSRG1启动子发育时空表达特性和诱导表达特性分析

1、表达载体的构建

根据实验要求，本实施例中使用了pBI121载体，利用双酶切方法,将克隆到的启动子片段替换载体pBI121上的35S启动子。

2、蜡梅CpSRG1基因启动子融合植物表达载体转入农杆菌

(1)取50μl GV3101农杆菌感受态细胞，加入0.5μg质粒，轻轻混匀，置于冰上30min；

(2)取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中(电击杯-20℃预冷)，在2500V高压下电击；

(3)取出电击杯，加入500μl预冷的YEB培养液(不含抗生素)，轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养3-5h；

(4)涂布适量的细胞于筛选YEB固体培养基平板上，28℃培养36h。

3、花序侵染法转化拟南芥

(1)在含有抗生素(Gen:50mg/L,Kan:50mg/L)的YEB固体培养基上划单线活化含有pCpSRG1:GUS质粒的农杆菌GV3101，28℃暗培养24h；

(2)用无菌牙签挑取单菌落，接种至50mL含有抗生素(Gen:50mg/L,Kan:50mg/L)的YEB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜；

(3)取1mL上述菌液接种于100mL无抗的YEB液体培养基中，28℃，200rpm摇菌至OD600在1.0-2.0之间备用；

(4)收集上述菌液，5000rpm离心15min，弃去上清，收集沉淀，沉淀用侵染液(100mL无菌水+5g蔗糖+50μl silwet)重悬，稀释至OD600≈0.8；

(5)剪掉已开放的花朵，仅保留刚露白的花骨朵；用喷水喷壶将培养箱内壁喷湿(为侵染过程保持湿度)。将花葶头浸入侵染液(0.5cm)，3-5秒后取出放入培养箱中，盖上盖子，箱子外面外蒙上黑布(遮光)，20h左右取出，保持在光线较暗的环境中过夜，再转到正常的生长环境中。

4、转基因拟南芥的鉴定

(1)T0代转基因种子用20％的次氯酸钠消毒10min，清水洗5遍，播种于含有Kan50mg/L的培养基平板上进行筛选，转化成功的拟南芥能在含有抗生素的培养基上正常生长。

(2)以阳性植株的DNA作为模板,进行PCR检查，确认转基因植株中是否有插入的目的片段。

5、转基因拟南芥GUS组织染色分析和酶活性测定

对筛选获得的T3代纯合拟南芥植株进行GUS组织化学染色鉴定，取发芽后1-15天大的拟南芥幼苗及生殖生长阶段的花序、叶片、茎、角果，加入配制好的组织化学GUS染液使之没过材料，置于37℃恒温箱中过夜染色。用70％乙醇脱色至溶液为无色，排除颜色干扰，然后在体式显微镜下观察照相。

10天大pCpSRG1:GUS植株用于检测CpSRG1启动子的诱导表达特性。用10μM GA3、10μM SA、10μMEth处理幼苗12h，未处理的幼苗做对照。取处理后的拟南芥植株，在液氮中研磨成粉末，装入1.5ml离心管，加入600μl GUS酶提取液。4℃，12000rpm，离心10min，取上清至新的离心管中。用Bradford法蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。用酶标仪在激发光365nm，发射光455nm，狭缝10nm条件下测定个样品的GUS活性。

结果显示，春化后的种子不能染上蓝色。随后，在拟南芥不同发育阶段均检测到GUS染色。种子发芽后的胚根及3-15天大的拟南芥幼苗地上部分均能染上较深的蓝色，而叶的GUS活性较弱。进入生殖生长阶段后，在花序中，GUS活性随着花朵的开放逐渐增强，在成熟及衰老的花朵中活性最强。进一步分析成熟花朵中GUS活性，雄蕊、雌蕊及离层的GUS表达活性很强。在成熟的角果中，GUS染色主要集中在角果顶部及离层。CpSRG1启动子驱动的GUS基因的组织特异性表达模式与CpSRG1在蜡梅不同组织的表达模式相吻合，均在衰老的花及叶片中表达量高，表明CpSRG1参与了蜡梅花朵衰老及叶片衰老的调控(图8)。

CpSRG1启动子中含有响应激素相关的顺式作用元件。为了进一步研究这些顺式作用元件在CpSRG1启动子中的转录调节特性，分析了pCpSRG1:GUS转基因拟南芥幼苗中在激素处理下的GUS活性。结果显示，50μM Eth,100μM SA和100μM GA3分别处理幼苗12h后，GUS活性显著提高(图9)。

序列表

<110>西南大学

<120>蜡梅CpSRG1基因、启动子及其应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1489

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtgtccga gccgcgtgag ctgctaccgg gattcggcca ttacggccgg gattgagata 60

gcgtagatcg gcattctctc tcgcttcttt gcttgagcaa cataagagga cagaggaaga 120

tggtgagcct tggaagttca gttctagtgc caagtgttca agagctggcc acaaggcata 180

agaacaccgt cccatctcgc taccttcgtc cccatcaaga cccaccagcc attgatgtat 240

ccctgccgtc cattcccatc atcgacatga acaagctgcg tctacaacaa tcctcagctg 300

atgaattgga gagactgcac tcagcttgca aagagtgggg cttctttcag ttgataaacc 360

atggagttag ctcttcattg atagataaga tgaagactga tatgaaagac ttgttcaacc 420

ttccattaga agagaagaag aaatactggc agcaggcaga cgatcttgag ggatttggga 480

atgcctttgt tcaatcagaa gagcaaaagc ttgattgggg agacatgttc ttcttgacta 540

ctctcccaaa ttccttgagg aagccccgtt tatttgatca cctcccttca tctttcaggg 600

agaccatgga ggcttactca atggagttgc agagtcttgc catgaccgtc tttggtttga 660

tgtctagagc tttaggtgtg aagggtgacg agcttaacga gctttttgat ggtggtttcc 720

agtctttgag gctgaattgc tatcccccat gtccacaacc tgagtcggtg gtcggccttt 780

cgccgcacag tgatggaggg gggctcacca tcctccttca ggctaatgaa atggaaggcc 840

ttcaggtgaa gaaagaaggc ttgtgggttc ctgttaagcc cctcccaaat gcttttgtaa 900

tcaacatagg agattccctg gagataataa ccaatggggt gtatccaagc attgagcacc 960

gggggatggt gaattcgaca cgagagaggc tttcgattgc tgcattccac aatccgaaga 1020

tgacagcaga gatcgggcct ttgcggagtc tgatcagccc ggaaaaccca gcattattca 1080

gaagggttgg agcagagaaa tttcacaaag atctctttgc taggaagctg aaaggcaagg 1140

cattcgtcga ctctatgagg gtaggacatg aagaaggcag tgctgctgtt gctactgatt 1200

aaaattcaat gtctttattt cagataaata gatatgctcc tccattaagc atatattagc 1260

atgtattgct tgtaaattat gacaagaata atgttataaa caaattaaga cttaataaat 1320

tttttgagat agaactcatt ctcaaacctc aagtgttata cgaagtaatt ggtttcttga 1380

attaacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaacatg tcggccgcct cggcccagtc 1440

gactctagac tcgagcaagc ttatgcatgc ggccgcaatc gagctaccg 1537

<210> 2

<211> 1597

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gattgtcaat tctctgaaga acaagtacca agttttgcct tgtcaaccgt gtgtttggtt 60

ttttttcttt cttgattaca acttggatgg tgacagtaag actaaatgaa gggaagaaat 120

ggtcttagaa aaaaaattct tttgtcaatg atgttcttgt tgttattaag ttcacattgg 180

ctcatgtaat atactaatta aaaagttttt tgaataatac aaatacttcg gctctaaatt 240

agaggtgaaa ttaatcctat gaacaaacga aagagcagca atttttttat gggtattttt 300

tgtaatctga tatgagtttt actgtattat ccattttatc cttcgaatcg gctgaccgaa 360

ctctttgcgg taagtgattc gaagggttcc agtgagttag ttcgaagggt aaaatgagta 420

aaattcatgt caaattacac gaaatatcca tgccctaaac gaattggttg caaaatctcg 480

tatatcagac agaccaaaag tacaatttca atttggccag tttttaatct atgcctaaca 540

atctacctct tctcattatc gttgacgtgc ctaacaatct acatcttctc attatctttg 600

aagtttggta cctcttctca ttatctttga cgtgtaatct tctgagttct gacctcttct 660

attgcattac tattattgta tagatataac gaaattcaaa tgttatttct ttaccttttt 720

cttcggtttg agccttcaag tcatcaactg cctagttatg aatttggttc ggtgggtgtt 780

tgaaattaat ctttttacaa gtcggcactc atttgaaagt ttctgcagat cctaacattg 840

actattattt ttaattttat ttttattaaa ttaatttctt tataatcaaa agccggagta 900

gaaatctcga tattggatga tatatcgacc gatattcgga tatcggccaa taaatttctt 960

tctcctaatt ttttttacga aaatcaccaa tatgagtcga tattaacgat atatattgga 1020

tatcagttaa taaatttttc tcttaattat tcagaaccca tgaacacctc ccaacacgca 1080

cctattcttc ttggaagagt ggcattttga ggatgaacat ataagattct atttcccgag 1140

acaaattctt gacggtcagc cactcaaccc ctcgggattt ttaaattaaa ttagtcattt 1200

tttgtgttgg ttctagtata aatgtataat cttaatgatg gtttagcaac tttactaaaa 1260

tctcatttca tttcatgata gttcttctag aaagcatctc tcttttcact ttggacatct 1320

caatttctct tttttttttc aaatgctaat aatgaatgta tcacatcaag ggccctatca 1380

caactcataa taatttatgg gaggtccttg tccaagtccc aacaccttac ataataattt 1440

aaaatattga tgaaatgggt cacttccact cttccatttc ttactatata aagcaagagc 1500

aagagcagag cagatccatt gaaaatcagg ttctctctca ttctctctcg tccttctttg 1560

cttgagcaaa ttgaagaaac agaggaaaat cgtcgaa 1649

<210> 3

<211> 270

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Lys Thr Asp Met Lys Asp Leu Phe Asn Leu Pro Leu Glu Glu Lys

1 5 10 15

Lys Lys Tyr Trp Gln Gln Ala Asp Asp Leu Glu Gly Phe Gly Asn Ala

20 25 30

Phe Val Gln Ser Glu Glu Gln Lys Leu Asp Trp Gly Asp Met Phe Phe

35 40 45

Leu Thr Thr Leu Pro Asn Ser Leu Arg Lys Pro Arg Leu Phe Asp His

50 55 60

Leu Pro Ser Ser Phe Arg Glu Thr Met Glu Ala Tyr Ser Met Glu Leu

65 70 75 80

Gln Ser Leu Ala Met Thr Val Phe Gly Leu Met Ser Arg Ala Leu Gly

85 90 95

Val Lys Gly Asp Glu Leu Asn Glu Leu Phe Asp Gly Gly Phe Gln Ser

100 105 110

Leu Arg Leu Asn Cys Tyr Pro Pro Cys Pro Gln Pro Glu Ser Val Val

115 120 125

Gly Leu Ser Pro His Ser Asp Gly Gly Gly Leu Thr Ile Leu Leu Gln

130 135 140

Ala Asn Glu Met Glu Gly Leu Gln Val Lys Lys Glu Gly Leu Trp Val

145 150 155 160

Pro Val Lys Pro Leu Pro Asn Ala Phe Val Ile Asn Ile Gly Asp Ser

165 170 175

Leu Glu Ile Ile Thr Asn Gly Val Tyr Pro Ser Ile Glu His Arg Gly

180 185 190

Met Val Asn Ser Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Ala Ala Phe His Asn

195 200 205

Pro Lys Met Thr Ala Glu Ile Gly Pro Leu Arg Ser Leu Ile Ser Pro

210 215 220

Glu Asn Pro Ala Leu Phe Arg Arg Val Gly Ala Glu Lys Phe His Lys

225 230 235 240

Asp Leu Phe Ala Arg Lys Leu Lys Gly Lys Ala Phe Val Asp Ser Met

245 250 255

Arg Val Gly His Glu Glu Gly Ser Ala Ala Val Ala Thr Asp

260 265 270

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgagccgcg tgagctgcta c 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgcatgcat aagcttgctc gag 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggctaagat tcaagacaag g 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttggtcgcag ctgattgctg tg 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgcatctct atccacatcg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caagcttcct tatgcgatcc 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taagaacacc gtcccatctc gctac 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagtgcagtc tctccaattc atcag 25

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (24)..(24)

<223>代表g、a或c

<220>

<221> unsure

<222> (25)..(25)

<223>代表a、g、c或t

<220>

<221> unsure

<222> (26)..(26)

<223>代表g、a或c

<220>

<221> unsure

<222> (27)..(29)

<223>代表a、g、c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 12

acgatggact ccagagcggc cgcvnvnnng gaa 33

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (24)..(24)

<223>代表g、t或c

<220>

<221> unsure

<222> (25)..(25)

<223>代表a、g、c或t

<220>

<221> unsure

<222> (26)..(26)

<223>代表g、t或c

<220>

<221> unsure

<222> (27)..(29)

<223>代表a、g、c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 13

acgatggact ccagagcggc cgcbnbnnng gtt 33

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (24)..(25)

<223>代表g、a或c

<220>

<221> unsure

<222> (26)..(26)

<223>代表a、g、c或t

<220>

<221> unsure

<222> (27)..(27)

<223>代表g、a或c

<220>

<221> unsure

<222> (28)..(30)

<223>代表a、g、c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 14

acgatggact ccagagcggc cgcvvnvnnn ccac 34

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (24)..(24)

<223>代表g、t或c

<220>

<221> unsure

<222> (25)..(25)

<223>代表g、a或t

<220>

<221> unsure

<222> (26)..(26)

<223>代表a、g、c或t

<220>

<221> unsure

<222> (27)..(27)

<223>代表g、t或c

<220>

<221> unsure

<222> (28)..(30)

<223>代表a、g、c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 15

acgatggact ccagagcggc cgcbdnbnnn ccaa 34

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (24)..(24)

<223>代表g、t或c

<220>

<221> unsure

<222> (25)..(25)

<223>代表g、a或t

<220>

<221> unsure

<222> (26)..(26)

<223>代表a、g、c或t

<220>

<221> unsure

<222> (27)..(27)

<223>代表g、t或c

<220>

<221> unsure

<222> (28)..(30)

<223>代表a、g、c或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 16

acgatggact ccagagcggc cgcbdnbnnn cggt 34

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggacgatgga ctccag 16

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caaatccctc aagatcgtct gcctg 25

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acgatggact ccagtccggc cagggataca tcaatggctg gtgggtc 47

<210> 20

<211> 16

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acgatggact ccagag 16

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcgagatggg acggtgttct tatgc 25

Claims

1.蜡梅CpSRG1基因，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.如权利要求1所述的蜡梅CpSRG1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.蜡梅CpSRG1基因的启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.蜡梅CpSRG1基因在调控植物衰老中的用途，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，蜡梅CpSRG1基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

6.如权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述的植物为蜡梅或拟南芥。

7.蜡梅CpSRG1基因启动子在调控植物衰老或调控植物抗逆境胁迫能力中的用途，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的植物为蜡梅或拟南芥。

9.如权利要求7或8所述的用途，其特征在于，所述的逆境胁迫为激素处理。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的激素为水杨酸、赤霉素或乙烯处理。