CN106946985B - 拟南芥AtNAC018蛋白及其编码基因在植物耐逆及抗衰老中的应用 - Google Patents

拟南芥AtNAC018蛋白及其编码基因在植物耐逆及抗衰老中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了拟南芥AtNAC018蛋白及其编码基因在植物耐逆及抗衰老中的应用。本发明提供了AtNACO18蛋白或其编码基因的应用，为如下(a1)和/或(a2)：(a1)调控植物耐逆性；(a2)调控植物衰老过程；所述AtNACO18蛋白为如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性和/或抗衰老相关的由序列1衍生的蛋白质。将AtNACO18基因导入拟南芥中，转基因拟南芥对高盐和干旱的耐逆性显著增加，转基因拟南芥的衰老显著延缓。结果表明，AtNACO18蛋白或其编码基因具备耐干旱和耐盐性及延缓衰老的作用。

Description

拟南芥AtNAC018蛋白及其编码基因在植物耐逆及抗衰老中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及拟南芥AtNAC018蛋白及其编码基因在植物耐逆及抗衰老中的应用。
背景技术
农作物的生产受到盐碱、干旱等非生物胁迫的影响非常严重。全世界约有20％的耕地和50％的灌溉田受到不同程度的盐害威胁，并有逐年增加的趋势。我国盐渍土地面积约为1.4亿亩，占耕地总面积的近7％，此外还有盐渍荒地2亿多亩。全世界干旱和半干旱地区总面积占陆地总面积的34.9％；我国干旱、半干旱耕地面积占总面积的51％。通过转基因提高作物的耐盐抗旱能力是一条行之有效的办法。因此，寻找与盐、干旱胁迫有关的基因并研究其具体功能，以及调控途径具有重要的理论和实践意义。
植物衰老，一般认为是指一个器官或整个植株生命功能的衰退并最终导致其自然死亡的一系列变化过程。衰老过程通常伴随有植株生长速度减慢、植株活力下降、对周围环境的改变变得敏感、抗病虫能力减弱等现象的发生。衰老是受高度调控的一系列有序事件，包括光合作用能力丧失、叶绿体解体、CO2固定、酶和其它蛋白质降解、叶绿体丧失和氨基酸的去除等。
发明内容
本发明的目的是提供拟南芥AtNAC018蛋白及其编码基因在植物耐逆及抗衰老中的应用。
本发明提供了AtNACO18蛋白或其编码基因的应用，为如下(a1)和/或(a2)：
(a1)调控植物耐逆性；
(a2)调控植物衰老过程；
所述AtNACO18蛋白为如下(b1)或(b2)：
(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性和/或抗衰老相关的由序列1衍生的蛋白质。
AtNACO18蛋白的编码基因可为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：
(c1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(c2)序列表的序列3所示的DNA分子；
(c3)在严格条件下与(c1)或(c2)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性和/或抗衰老相关蛋白的DNA分子；
(c4)与(c1)或(c2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物耐逆性和/或抗衰老相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
AtNACO18蛋白的编码基因的表达量越高，植物的耐逆性越强。AtNACO18蛋白的编码基因的表达量越低，植物的耐逆性越弱。AtNACO18蛋白的编码基因的表达量越高，植物的衰老延缓程度越强。AtNACO18蛋白的编码基因的表达量越低，植物的衰老程度越强。
在实际应用中，当所选育的植物品种为耐逆性降低和/或提前衰老的植物品种时，需将AtNACO18蛋白的编码基因的表达量较低的植株作为亲本进行杂交。在实际应用中，当所选育的植物品种为耐逆性增强和/或延缓衰老的植物品种时，需将AtNACO18蛋白的编码基因的表达量较高的植株作为亲本进行杂交。
本发明还保护一种培育耐逆性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：将AtNACO18蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐逆性增强的转基因植物；
所述AtNACO18蛋白为如下(b1)或(b2)：
(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性和/或抗衰老相关的由序列1衍生的蛋白质。
所述AtNACO18蛋白的编码基因为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：
(c1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(c2)序列表的序列3所示的DNA分子；
(c3)在严格条件下与(c1)或(c2)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性和/或抗衰老相关蛋白的DNA分子；
(c4)与(c1)或(c2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物耐逆性和/或抗衰老相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
AtNACO18蛋白的编码基因的表达量越高，所述转基因植物的耐逆性越强。
所述耐逆性可为耐盐和/或耐旱。所述耐盐具体可体现为在高盐环境下的存活率高。所述高盐环境具体可为200mM的NaCl水溶液引起的环境。所述耐旱具体可体现为在干旱环境下的存活率高。所述干旱环境具体可为连续两周不浇水。
所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥，具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。
本发明还保护一种培育衰老延缓的转基因植物的方法，包括如下步骤：将AtNACO18蛋白的编码基因导入目的植物中，得到衰老延缓的转基因植物；
所述AtNACO18蛋白为如下(b1)或(b2)：
(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性和/或抗衰老相关的由序列1衍生的蛋白质。
所述AtNACO18蛋白的编码基因为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：
(c1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(c2)序列表的序列3所示的DNA分子；
(c3)在严格条件下与(c1)或(c2)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性和/或衰老相关蛋白的DNA分子；
(c4)与(c1)或(c2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物耐逆性和/或抗衰老相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
AtNACO18蛋白的编码基因的表达量越高，所述转基因植物的衰老延缓程度越强。
所述衰老延缓可为荚果衰老延缓和/或叶片衰老延缓。所述荚果衰老可以是在正常生长条件的环境。所述叶片衰老可以是在离体叶片在3μM ABA溶液中培养3天的环境。
所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥，具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。
上述任一所述方法中，AtNACO18蛋白的编码基因可以通过重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
可用现有的植物表达载体构建含有AtNACO18蛋白的编码基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用AtNACO18蛋白的编码基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用AtNACO18蛋白的编码基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体具体可为在质粒pCM1205的多克隆位点(例如BamHI和KpnI酶切位点之间)插入了序列表的序列2或序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
本发明的实验证明：将AtNACO18基因导入拟南芥中，转基因拟南芥对高盐和干旱的耐逆性显著增加，具体表现为存活率显著高于野生型及突变体对照，长势显著优于野生型及突变体对照；将AtNACO18基因导入拟南芥中，转基因拟南芥的衰老显著延缓，具体表现为荚果的叶绿素含量和叶片的叶绿素含量显著高于野生型及突变体对照。上述结果表明，AtNACO18蛋白或其编码基因具备耐干旱和耐盐性及延缓衰老的作用。
附图说明
图1为AtNACO18基因在各组织中的相对表达量。
图2为Western blot的结果。
图3为转基因植株中AtNACO18基因的表达量。
图4为耐盐性鉴定中的照片。
图5为耐盐性鉴定中的存活率结果。
图6为耐旱性鉴定中的照片。
图7为耐旱性鉴定中的存活率结果。
图8为荚果衰老实验中的照片。
图9为荚果衰老实验中叶绿素a/b及叶绿素的含量。
图10为叶片衰老实验中的照片。
图11为叶片衰老实验中叶绿素a/b及叶绿素的含量。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pEASY-T载体：全式金公司。质粒pCM1205：Clontech公司。哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)：ABRC。拟南芥anac018突变体(m)：ABRC；拟南芥anac018突变体中，AtNACO18基因被沉默。
提及“农杆菌GV3101”的参考文献：肖卫民,赵名琛,邹敏,苏承刚,杜小兵,谭远德,张兴国.拟南芥受伤和接种根癌农杆菌GV3101对转录的影响[J].农业生物技术学报.2013，21(5):537-545)。
培养基质是将营养土和蛭石为等体积混合得到的。
检测叶绿素a/b及叶绿素的含量的方法：参考文献：紫外分光光度计测定叶绿素含量(严衍禄,刘心生.叶绿素测定方法的研究[J].北京农业大学学报.1982,8(2):53-66.
AtNACO18蛋白如序列表的序列1所示。AtNACO18基因如序列表的序列2所示。
实施例1、通过荧光定量PCR分析AtNACO18基因的组织表达情况
分别提取哥伦比亚生态型拟南芥的根、茎、莲座叶、花、荚果组织的总RNA，反转录合成cDNA；然后分别以上述各组织的cDNA为模板，采用5’-TACTCATATTTGTGACTTCGG-3’和5’-ATGAATATGATGAAGATGATG-3’组成的引物对进行PCR扩增，检测AtNACO18基因在不同组织中的表达情况。同时以ACTIN2/8基因作为内参，检测内参的引物对如下：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’和5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。
反应条件：95℃预变性15min；95℃20sec、60℃30sec、72℃50sec，33个循环；72℃延伸5min。
AtNACO18基因在各组织中的相对表达量见图1。结果表明，AtNACO18基因在所有组织中均有表达，在根中表达量最低，在荚果中表达量最高。
实施例2、AtNACO18基因在提高植物耐逆性中的应用
一、重组质粒的构建
1、提取哥伦比亚生态型拟南芥的荚果的总RNA并反转录得到cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用引物1和引物2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物。
引物1：5’-ATGGAGAGTACAGATTCTTC-3’；
引物2：5’-C TCAAGAATACCAATTCAAAC-3’。
经测序，PCR扩增产物如序列表的序列2所示。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物与pEASY-T载体连接，得到重组质粒。
4、用限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切步骤3得到的重组质粒，回收小片段。
5、用限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切质粒pCM1205，回收约6800bp的载体骨架。
6、将步骤4得到的小片段与步骤5得到的载体骨架连接，得到重组质粒pCM1205-AtNACO18。根据测序结果，对重组质粒pCM1205-AtNACO18进行结构描述如下：在质粒pCM1205的BamHI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列3所示的双链DNA分子。序列表的序列3的第4位至第966位即序列表的序列2。重组质粒pCM1205-AtNACO18中，AtNACO18基因和GFP基因由同一个35S启动子启动表达。
二、制备转AtNACO18基因拟南芥
1、将重组质粒pCM1205-AtNACO18导入农杆菌GV3101，得到重组重组菌。
2、将步骤1得到的重组农杆菌的单克隆接种于含50mg/L氯霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养两天，然后3000rpm/min离心5分钟，收集菌体沉淀并用含5％蔗糖和0.03％SilwetL-77的水溶液悬浮，得到侵染液。
3、取步骤2得到的侵染液，采用沾花浸染法转化哥伦比亚生态型拟南芥，然后收获种子(T1代)。
4、取步骤3得到的种子，播种于含50mg/L氯霉素的MS固体培养基平板上进行抗性筛选14天。
5、将步骤4中存活的幼苗转移到培养基质中，收获种子(T2代)。
6、取步骤5得到的种子，播种于含50mg/L氯霉素的MS固体培养基平板上进行抗性筛选14天。
7、将步骤6中存活的幼苗转移到培养基质中，收获种子(T3代)。
8、将步骤7得到的种子播种到培养基质中，种子萌发后在长日照条件下生长两周左右开花。
9、将步骤7得到的种子播种到培养基质中，萌发10天后取整个植株，提取总蛋白，依次进行SDS-PAGE和Western blot。Western blot采用的一抗为GFP抗体(小鼠单抗)，购自碧云天生物技术有限公司，产品目录号为AG281。Western blot采用的二抗为碱性磷酸酯酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，购自自碧云天生物技术有限公司，产品目录号为A0258。结果见图2。图2中，T代表转基因植株，WT代表哥伦比亚生态型拟南芥。由于AtNACO18基因和GFP基因由同一个35S启动子启动表达，Western blot中，GFP蛋白阳性的植株即为转基因植株。
10、取步骤8中的转基因植株(萌发10天后取整个植株)，提取总RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板，用引物1和引物2组成的引物对(引物1：5’-ATGGAGAGTACAGATTCTTC-3’；引物2：5’-C TCAAGAATACCAATTCAAAC-3’)进行PCR鉴定，检测AtNACO18基因的表达量。同时以ACTIN2/8基因作为内参，检测内参的引物对如下：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’和5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。将哥伦比亚生态型拟南芥和拟南芥anac018突变体作为对照。
部分结果见图3。WT代表哥伦比亚生态型拟南芥，m代表拟南芥anac018突变体，T代表转AtNACO18基因拟南芥。结果表明，拟南芥anac018突变体中AtNACO18基因的表达量显著低于哥伦比亚生态型拟南芥，转AtNACO18基因拟南芥中AtNACO18基因的表达量显著高于哥伦比亚生态型拟南芥。
三、制备转空载体拟南芥
用质粒pCM1205代替重组质粒pCM1205-AtNACO18进行步骤二，得到转空载体拟南芥。
四、AtNACO18基因的功能研究
1、幼苗耐逆试验
(1)耐盐性
取哥伦比亚生态型拟南芥的种子(WT)、拟南芥anac018突变体的种子(m)、T3代纯合转AtNACO18基因拟南芥的种子(T)和T3代转空载体拟南芥的种子，分别作为待测种子，进行如下操作：
试验组：在MS培养基上播种待测种子并培养2周，然后将幼苗移至培养基质中培养2周(2周中，每两天浇一次200mM NaCl水溶液)，然后拍照并统计存活率。
对照组：在MS培养基上播种待测种子并培养2周，然后将幼苗移至培养基质中培养2周(2周中，每两天浇一次水)，然后拍照并统计存活率；
培养条件：光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400μmol m-2s-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。
试验重复3次，每次每个株系100粒种子，结果取平均值。
照片见图4，上图为对照组的照片，下图为试验组的照片。
存活率结果见图5。
结果表明：盐处理2周后，转AtNACO18基因拟南芥的幼苗的存活率显著高于哥伦比亚生态型拟南芥、拟南芥anac018突变体和转空载体拟南芥；盐处理2周后，哥伦比亚生态型拟南芥的存活率与转空载体拟南芥没有显著差异。
(2)耐旱性
取哥伦比亚生态型拟南芥的种子(WT)、拟南芥anac018突变体的种子(m)、T3代纯合转AtNACO18基因拟南芥的种子(T)和T3代转空载体拟南芥的种子，分别作为待测种子，进行如下操作：
试验组：在MS培养基上播种待测种子并培养2周，然后将幼苗移至培养基质中培养4周(前2周正常管理，后2周连续不浇水)，然后拍照并统计存活率；
对照组：在MS培养基上播种待测种子并培养2周，然后将幼苗移至培养基质中培养4周(4周均正常管理)，然后拍照并统计存活率；
培养条件：光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400μmol m-2s-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。
试验重复3次，每次每个株系100粒种子，结果取平均值。
照片见图6，上图为对照组的照片，下图为试验组的照片。
存活率结果见图7。
结果表明：干旱处理后，转AtNACO18基因拟南芥的幼苗的成活率显著高于哥伦比亚生态型拟南芥、拟南芥anac018突变体和转空载体拟南芥；干旱处理后，哥伦比亚生态型拟南芥的存活率与转空载体拟南芥没有显著差异。
2、荚果及叶片衰老实验
(1)荚果衰老实验
取哥伦比亚生态型拟南芥的种子(WT)、拟南芥anac018突变体的种子(m)、T3代纯合转AtNACO18基因拟南芥的种子(T)和T3代转空载体拟南芥的种子，分别作为待测种子，进行如下操作：
在MS培养基上播种待测种子并培养两周，然后将幼苗移至培养基质中培养50天，然后拍照、检测荚果中叶绿素a/b及叶绿素的含量；
培养条件：光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400μmol m-2s-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。
试验重复3次，每次每个株系100粒种子，结果取平均值。
照片见图8。
叶绿素a/b及叶绿素的含量见图9。
结果表明：转AtNACO18基因拟南芥的荚果中叶绿素a/b及叶绿素的含量均显著高于哥伦比亚生态型拟南芥、拟南芥anac018突变体和转空载体拟南芥；哥伦比亚生态型拟南芥的荚果中叶绿素a/b及叶绿素的含量与转空载体拟南芥没有显著差异。结果表明：转AtNACO18基因拟南芥的荚果衰老程度显著低于哥伦比亚生态型拟南芥、拟南芥anac018突变体和转空载体拟南芥。
(2)叶片衰老实验
取哥伦比亚生态型拟南芥的种子(WT)、拟南芥anac018突变体的种子(m)、T3代纯合转AtNACO18基因拟南芥的种子(T)和T3代转空载体拟南芥的种子，分别作为待测种子，进行如下操作：
在MS培养基上播种待测种子并培养两周，然后将幼苗移至培养基质中培养7天，然后取离体叶片，在3μM ABA水溶液中培养3天，然后拍照并检测叶片中叶绿素a/b及叶绿素的含量；
培养条件：光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400μmol m-2s-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％。
试验重复3次，每次每个株系100粒种子，结果取平均值。
照片见图10。
叶绿素a/b及叶绿素含量见图11。
结果表明：转AtNACO18基因拟南芥的叶片中叶绿素a/b及叶绿素的含量均显著高于哥伦比亚生态型拟南芥、拟南芥anac018突变体和转空载体拟南芥；哥伦比亚生态型拟南芥的叶片中叶绿素a/b及叶绿素的含量与转空载体拟南芥没有显著差异。结果表明：转AtNACO18基因拟南芥的叶片衰老程度显著低于哥伦比亚生态型拟南芥、拟南芥anac018突变体和转空载体拟南芥。
Figure IDA0000902135720000011
Figure IDA0000902135720000021
Figure IDA0000902135720000031
Figure IDA0000902135720000041

Claims (7)

1.AtNACO18蛋白或其编码基因的应用，为如下(a1)和/或(a2)：
(a1)调控植物耐逆性；
(a2)调控植物衰老过程；
所述AtNACO18蛋白为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述耐逆性为耐盐和/或耐旱；
所述植物为拟南芥。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：AtNACO18蛋白的编码基因为如下(c1)或(c2)：
(c1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(c2)序列表的序列3所示的DNA分子。
3.一种培育耐逆性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：将AtNACO18蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐逆性增强的转基因植物；
所述AtNACO18蛋白为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述耐逆性为耐盐和/或耐旱；
所述植物为拟南芥。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述AtNACO18蛋白的编码基因为如下(c1)或(c2)：
(c1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(c2)序列表的序列3所示的DNA分子。
5.一种培育衰老延缓的转基因植物的方法，包括如下步骤：将AtNACO18蛋白的编码基因导入目的植物中，得到衰老延缓的转基因植物；
所述AtNACO18蛋白为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述植物为拟南芥。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述AtNACO18蛋白的编码基因为如下(c1)或(c2)：
(c1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(c2)序列表的序列3所示的DNA分子。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述衰老延缓为荚果衰老延缓和/或叶片衰老延缓。
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