CN107973844B - 小麦抽穗期相关蛋白Ta-Hd4A及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小麦抽穗期相关蛋白Ta‑Hd4A及其应用。本发明提供了一种蛋白质，为如下a)‑e)中任一种蛋白质：a)氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；b)氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控植物花期或抽穗期功能的蛋白质。本发明的实验证明，本发明在小麦中发现一个新基因Ta‑Hd4A，将其导入目的植物中，发现其调控植物的开花时间和抽穗时间，为调控植物的花期提供新的基因资源和育种资源。

Description

小麦抽穗期相关蛋白Ta-Hd4A及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因工程领域，尤其涉及小麦抽穗期相关蛋白Ta-Hd4A及其应用。

背景技术

小麦是世界性的重要粮食作物，广泛分布于不同国家。抽穗期对于小麦来说异常重要，对生育周期与产量相关性状影响很大。由于小麦基因组庞大(17.9×10⁹bp)、重复序列多(>80％)，关于花期相关基因克隆的报道很少。因此，开展小麦抽穗相关的基因克隆对于研究小麦进化和适应性具有重要的意义。

植物花期调控目前主要采用的方法有：光照调控、化学调控和温度调控等。根据植物对光周期的反应，可分为短日照植物、长日照植物与日中性植物，使长日照植物开花的最短日照长度，或使短日照植物开花的最长日照长度，称为临界日长。光照调控就是根据临界日长进行调节，日照长度大于临界日长则短日照植物不能开花，小于临界日长则长日照植物不能花芽分化控制。温度调节花期主要包括：通过增温诱导或打破植物的休眠，以及通过降温满足植物低温春花所需的界限温度，促使其花芽分化和发育。光照和温度控制一般需要温室和大棚进行处理，造价和成本较高，无法对于长日照的作物进行大量实施。化学调控主要采用喷施植物激素和生长调节剂，利用激素和生长调节剂调控花期已有许多成功的报道，常用药剂成分为赤霉素和生长素及其相似物；通过施用外源药剂可以促进花芽分化，也促进花数的增加或提早开花期。由于植物体内代谢的复杂性，各物种对不同激素反应和所需浓度的差异较大，常给实际应用造成了困难。长期以来，人们对于花期调控技术已做了大量的研究，并在许多植物上成功应用，但调控方法大多集中在环境控制方面，通过花期调控的机理研究和生物技术结合，利用遗传方法控制花期的相关研究亟待开展。

发明内容

本发明的一个目的是提供小麦抽穗期相关蛋白Ta-Hd4A。

本发明提供的蛋白质，命名为Ta-Hd4A，为如下a)-e)中任一种蛋白质：

a)氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；

b)氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；

c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控植物花期或抽穗期功能的蛋白质；

d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有调控植物花期或抽穗期功能的蛋白质；

e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的蛋白。

编码上述蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：

1)其编码序列包括序列表中序列1；

2)其编码序列为序列表中序列1；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)任一限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码上述蛋白的DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码FBAPIL2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的FBAPIL2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码FBAPIL2且具有FBAPIL2功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同源性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

下述1)-8)中的任一种生物材料也是本发明保护的范围：

1)含有上述核酸分子的表达盒；

2)含有上述核酸分子的重组载体；

3)含有上述核酸分子的重组菌；

4)含有上述核酸分子的转基因细胞系；

5)正向片段，其核苷酸序列为序列1第635-887位；

6)包括所述正向片段和所述正向片段的反向互补片段的DNA片段；

7)DNA片段，其核苷酸序列为序列3；

8)含有5)或7)所述DNA片段的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

上述2)中的重组载体为将序列1所示的核酸分子插入表达载体得到的重组载体，具体为pBI121-Ta-Hd4A或pCAMBIA1305-Ta-Hd4A；

或8)中的重组载体为将序列3所示的核酸分子插入表达载体得到的重组载体，具体为pAHC-PSK-Ta-Hd4A-RNAi。

上述生物材料中，如重组载体是指能够在宿主细胞中表达相应蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动相关基因转录的启动子，还可包括终止相关基因转录的终止子。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：玉米Ubiquitin启动子、组成型启动子T7lac、花椰菜花叶病毒的组成型启动子CaMV35S、番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因启动子；来自西红柿的创伤诱导型启动子等。合适的转录终止子包括但不限于：根癌农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、T7终止子、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子等。

上述转基因细胞系不包括繁殖材料。

其中，上述蛋白的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物偏爱的密码子，在保持本发明上述Ta-Hd4A蛋白编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定。

4)引入增强子序列，如内含子序列和病毒前导序列。

5)上述Ta-Hd4A基因表达载体可通过使用农杆菌介导、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

上述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述蛋白质或上述核酸分子或上述的生物材料在调控植物花期或抽穗期中的应用也是本发明保护的范围；

或上述蛋白质或上述核酸分子或上述的生物材料在培育花期或抽穗期提前的植物中的应用也是本发明保护的范围；

或上述蛋白质或上述核酸分子或上述的生物材料在培育花期或抽穗期延后的植物中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述调控为提前或延后；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

本发明另一个目的是提供一种培育开花时间或者抽穗时间提前的转基因植物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：提高植物中编码上述蛋白的核酸分子的表达量和/或活性，获得转基因植物，所述转基因植物的开花时间或者抽穗时间早于所述目的植物。

上述方法中，所述提高植物中编码权利要求1所述蛋白的核酸分子的表达量和/或活性为将编码上述蛋白的核酸分子导入目的植物；

或，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

本发明第3个目的是提供一种培育开花时间或者抽穗时间延后的转基因植物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：降低植物中编码上述蛋白的核酸分子的表达量和/或活性，获得转基因植物，所述转基因植物的开花时间或者抽穗时间晚于所述目的植物。

上述方法中，所述降低植物中编码上述蛋白的核酸分子的表达量和/或活性为将干扰编码权利要求1所述蛋白的核酸分子表达的物质导入目的植物；

所述物质具体为上述5)-8)任一所述的生物材料；

本发明的实验证明，本发明在小麦中发现一个新基因Ta-Hd4A，将其导入目的植物中，发现其调控植物的开花时间和抽穗时间，为调控植物的花期提供新的基因资源和育种资源。

附图说明

图1为本发明实施例2中转基因拟南芥植株Ta-Hd4A的RT-PCR检测。

图2为本发明实施例2中过表达拟南芥植株与对照植株的表型。

图3为本发明实施例3中转基因水稻植Ta-Hd4A的表达量检测。

图4为本发明实施例3中转基因水稻植株与对照植株的表型。

图5为本发明实施例4中RNAi小麦植株与对照株Ta-Hd4A的表达量检测。

图6为本发明实施例4中RNAi小麦植株与对照株表型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中转基因拟南芥、水稻和小麦的方法可以参考文献(Zheng J，Liu H，Wang YQ，et al.TaTEF-7A，a transcript elongation factor influences yield-related traits in bread wheat(Triticum aestivum.L).Journal of ExperimentalBotany.2014，18(65):5351-5365；Gao H，Zheng X M，Fei GL，et al.Ehd4 encodes anovel and Oryza-genus-specific regulator of photoperiodic flowering inrice.PLoS Genet.2013，9，e1003281；叶兴国，徐惠君，杜丽璞，等.小麦规模化转基因技术体系构建及其应用.中国农业科学.2014，47(21):4155-4171)进行。

下述实施例中涉及到的生物材料小麦CH7034(Triticum aestivum L.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana，Col-0)、日本晴(Oryza sativa L.spp.japonica，varnippobare，AA genome)和科农199(TriticumaestivumL.)均为公知公用品种。2×Easy TaqPCR SuperMix、pEASY-T1Cloning Kit均购自北京全式金生物技术有限公司。本发明用于构建转基因的pBI121、pCAMBIA1305和pAHC-PSK等载体，公众可从山西省科学技术情报研究所获得；这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、小麦Ta-Hd4A蛋白与其编码基因的克隆

以小麦CH7034(TriticumaestivumL.；贺润丽，畅志坚，刘建霞等，源于长穗偃麦草的小麦新品系CH7034抗白粉病基因的染色体定位，分子植物育种，2008,6(2):251-256)抽穗期叶片为材料，提取RNA并反转录获得cDNA，以cDNA为模板，以Ta-Hd4A-F和Ta-Hd4A-R为引物，进行PCR扩增。

Ta-Hd4A-F：5'-GGTACCATGGCGAGCGCCGGCGCG-3'；

Ta-Hd4A-R：5'-CCCGGGTCAAAAACGGAAGCGCCCGT-3'；

上述PCR程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，重复35次；72℃延伸10分钟。

上述PCR体系：

得到约1233bp的PCR扩增产物。将上述PCR扩增产物切胶回收纯化后按照pEASY-T1Cloning Kit克隆方法克隆连接到pEASY-T1载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α，得到转化子。

提取转化子的质粒送去测序，结果该质粒含有PCR扩增产物，该PCR扩增产物的核苷酸序列为序列1，将该PCR产物具有的基因命名为Ta-Hd4A，该基因编码的蛋白命名为Ta-Hd4A，该蛋白的氨基酸序列为序列2。该质粒为将序列表中序列1所示Ta-Hd4A基因连接到pEASY-T1载体得到的质粒。

实施例2、小麦Ta-Hd4A蛋白在调控拟南芥花期中的应用

1、转Ta-Hd4A拟南芥的构建

1)拟南芥过表达载体pBI121-Ta-Hd4A构建

拟南芥过表达载体pBI121-Ta-Hd4A为将序列1所示Ta-Hd4A基因替换植物表达载体pBI121(参见Zheng J，Liu H，Wang YQ，et al.TaTEF-7A，a transcript elongationfactor influences yield-related traits in bread wheat(Triticum aestivum.L)Journal of Experimental Botany.2014，18(65):5351-5365)的KpnI和SmalI酶切位点间的片段得到载体。

2)、转Ta-Hd4A拟南芥的构建

将拟南芥过表达载体pBI121-Ta-Hd4A转入农杆菌GV3101菌株(北京华越洋生物，Waryong GT707)中，得到重组菌GV3101/pBI121-Ta-Hd4A。

再将重组菌GV3101/pBI121-Ta-Hd4A通过农杆菌介导法转化到拟南芥(Col-0)(以下称为野生型拟南芥)中，得到T0代转Ta-Hd4A拟南芥，

通过抗性筛选转基因阳性植株；收获的转基因种子消毒处理后，于MS选择培养基平板(50mg/L Kan)上发苗，转基因阳性植株经卡那霉素(Kan)筛选后，仍能正常生长，叶片及真叶呈鲜绿色，且长势良好。转基因植株纯系筛选：将农杆菌浸染后植株所结种子记为T0，种子经抗性筛选后植株为T1，成熟后单株收获种子。对T2的种子继续进行抗性筛选，全部为阳性株系的种子则为纯合株系，观察表型。

3)、转Ta-Hd4A拟南芥的鉴定

提取T2代转Ta-Hd4A拟南芥叶片的RNA，反转录得到cDNA作为模板，用MRT-F：5'-CTGCTCATGGGAGGAGTAGAA-3'和MRT-R：5'-TAAGTATCATCCCCGAGTCCGA-3'引物进行PCR扩增。以拟南芥的同源基因AT1G25440为对照。内参基因为actin。以野生型拟南芥为对照。

内参actin基因的扩增引物：

At-actin-F：5'-CCAACAGAGAGAAGATGACT-3'

At-actin-R：5'-ATGTCTCTTACAATTTCCCG-3'

拟南芥Ta-Hd4A同源基因AT1G25440的扩增引物如下：

AT1G25440-F：5'-ATGATGAAAAGTTTGGCGAA-3'

AT1G25440-R：5'-TAGCCGTCTTCAAACGGACT-3'

Ta-Hd4A基因的扩增引物如下：

MRT-F：5'-CTGCTCATGGGAGGAGTAGAA-3'

MRT-R：5'-TAAGTATCATCCCCGAGTCCGA-3'

结果如图1所示，可以看出，与野生型拟南芥(Col-0)相比，T2代转Ta-Hd4A拟南芥株系L1和T2代转Ta-Hd4A拟南芥株系L2中Ta-Hd4A基因表达。

将空载体pBI121转入野生型拟南芥中，得到转空载体拟南芥，继续培育，得到T2代转空载体拟南芥。

2、转Ta-Hd4A拟南芥的表型鉴定

将T2代转Ta-Hd4A拟南芥纯合株系L1、T2代转Ta-Hd4A拟南芥纯合株系L2、野生型拟南芥植株和T2代转空载体拟南芥种子点播于0.8％(w/v)琼脂粉的MS培养基中萌发培养。首先4℃春化处理30h，促使种子同期萌发，长势一致。低温处理后，转移到22℃、12h光照/12h黑暗的人工气候室中培养6-8d。随后将幼苗移入营养土和蛭石粉末(1:1)的花盆中中，在22℃、70％相对湿度，光强为150μmol m-2s-1，光周期为12h光照/12h黑暗的人工气候室中继续培养，进行后续实验。每个株系10个种子。实验重复3次，结果取平均值。

移苗20天左右，待拟南芥抽出花蕾后观察，结果如图2所示，可以看出，与野生型拟南芥相比，T2代转Ta-Hd4A拟南芥纯合株系L1、T2代转Ta-Hd4A拟南芥纯合株系L2提前开花。

统计各株系的开花时间，从播种当天记作第1天。

结果如下：

T2代转Ta-Hd4A拟南芥纯合株系L1的开花时间为20-21天。

T2代转Ta-Hd4A拟南芥纯合株系L2的开花时间为22-23天。

野生型拟南芥植株的开花时间为25-27天。

T2代转空载体拟南芥与野生型拟南芥植株结果无显著差异。

上述结果表明，与野生型拟南芥相比，T2代转Ta-Hd4A拟南芥纯合株系L1、T2代转Ta-Hd4A拟南芥纯合株系L2花期明显提前3-5天，提高Ta-Hd4A基因的表达量可缩短拟南芥花期。

实施例3、小麦Ta-Hd4A蛋白在调控水稻花期中的应用

1、转Ta-Hd4A水稻的构建

1)水稻过表达载体pCAMBIA1305-Ta-Hd4A构建

水稻过表达载体pCAMBIA1305-Ta-Hd4A为将序列1所示Ta-Hd4A基因导入植物表达载体pCAMBIA1305(Gao H，Zheng X M，Fei GL，et al.Ehd4encodes a novel and Oryza-genus-specific regulator of photoperiodic flowering in rice.2013，PLoS Genet9，e1003281)的KpnI和SpeI酶切位点间的片段得到的载体。

2)、转Ta-Hd4A水稻的构建

将水稻过表达载体pCAMBIA1305-Ta-Hd4A转入农杆菌GV3101菌株(北京华越洋生物，Waryong GT707中，得到重组菌GV3101/pCAMBIA1305-Ta-Hd4A。

再将重组菌GV3101/pCAMBIA1305-Ta-Hd4A通过农杆菌介导法转化到水稻(日本晴)(以下称为野生型水稻)中，得到T0代转Ta-Hd4A水稻，转基因水稻筛选标记为卡那霉素。

通过抗性筛选转基因阳性植株；收获的转基因种子消毒处理后，于MS选择培养基平板(50mg/L Kan)上发苗，转基因阳性植株经卡那霉素(Kan)筛选后，仍能正常生长，叶片及真叶呈鲜绿色，且长势良好。转基因植株纯系筛选：将农杆菌浸染后植株所结种子记为T0，种子经抗性筛选后植株为T1，成熟后单株收获种子。对T2的种子继续进行抗性筛选，全部为阳性株系的种子则为纯合株系，观察表型。

3)、转Ta-Hd4A水稻的鉴定

提取T2代转Ta-Hd4A水稻孕穗期叶片的RNA，反转录得到cDNA作为模板，用MRT-F：和MRT-R进行实时荧光定量扩增。以水稻的同源基因Os03g50310为对照。内参基因为actin。以野生型水稻为对照。

内参基因的扩增引物：

At-actin-F：5'-CCAACAGAGAGAAGATGACT-3'

At-actin-R：5'-ATGTCTCTTACAATTTCCCG-3'

水稻Ta-Hd4A同源基因Os03g50310的扩增引物如下：

Os03g50310-F：5'-CCTGGACATGGACATGGACTT-3'

Os03g50310-R：5'-ATGACTCGCTGGGATCGAA-3'

Ta-Hd4A基因的扩增引物如下：

MRT-F：5'-CTGCTCATGGGAGGAGTAGAA-3'

MRT-R：5'-TAAGTATCATCCCCGAGTCCGA-3'

结果如图3所示，可以看出，与野生型水稻相比，T2代转Ta-Hd4A水稻株系Line1中Ta-Hd4A基因表达。

因此，T2代转Ta-Hd4A水稻株系Line1为阳性转基因株系。

将空载体pCAMBIA1305转入野生型水稻中，得到转空载体水稻，继续培育，得到T2代转空载体水稻。

2、转Ta-Hd4A水稻的表型鉴定

将T2代转Ta-Hd4A水稻纯合株系Line1、野生型水稻植株和T2代转空载体水稻种子点播种子盒中萌发培养。待幼苗生长至两叶一心期时，于六月初插秧于大田中，进行后续实验。

待水稻抽穗后观察，结果如图4所示，可以看出，与野生型水稻相比，T2代转Ta-Hd4A水稻纯合株系Line1提前开花。

T2代转空载体水稻与野生型水稻植株结果无显著差异。

上述结果表明，与野生型水稻相比，T2代转Ta-Hd4A水稻纯合株系Line1花期提前约3天左右，提高Ta-Hd4A基因的表达量可使水稻花期提前。

实施例4、小麦Ta-Hd4A蛋白在调控小麦花期中的应用

1、转Ta-Hd4ARNAi小麦的构建

1)RNAi载体构建

RNAi载体pAHC-PSK-Ta-Hd4A-RNAi为将序列3所示片段替换pAHC-PSK质粒(毕惠惠,王根平,王成社,等.单子叶植物RNA干扰和过表达Gateway载体的构建.植物遗传资源学报,2013,14(1):115-123.)的SpeI和SacI酶切位点间的片段得到的载体。

序列3所示片段包括正向片段、内含子和反向片段，正向片段为序列3第1位至253位(对应序列1第635-887位)，内含子为序列3第254-387位，反向片段为正向片段的反向互补片段，为序列3第388-576位。

2)、转Ta-Hd4ARNAi小麦的构建

将RNAi质粒pAHC-PSK-Ta-Hd4A-RNAi和pAHC-PSK通过基因枪转化小麦科农199的幼胚愈伤组织(叶兴国，徐惠君，杜丽璞，等.小麦规模化转基因技术体系构建及其应用，中国农业科学2014，47(21):4155-4171)进行，经诱导分化、后代检测后，得到T0转Ta-Hd4ARNAi小麦，转Ta-Hd4ARNAi小麦筛选标记为Bar基因。

3)、转Ta-Hd4ARNAi小麦的构建

将该T0代转Ta-Hd4ARNAi小麦株系Line1继续培育，得到T2代转Ta-Hd4ARNAi小麦株系Line1。提取T2代转Ta-Hd4ARNAi孕穗期小麦叶片的RNA，反转录得到cDNA作为模板，用MRT-F和MRT-R引物进行实时荧光定量扩增。内参基因为actin。以野生型小麦为对照。

内参基因的扩增引物：

At-actin-F：5'-CCAACAGAGAGAAGATGACT-3'

At-actin-R：5'-ATGTCTCTTACAATTTCCCG-3'

Ta-Hd4ARNAi的扩增引物如下：

MRT-F：5'-CTGCTCATGGGAGGAGTAGAA-3'

MRT-R：5'-TAAGTATCATCCCCGAGTCCGA-3'

结果如图5所示，与野生型小麦(CK)相比，T2代转Ta-Hd4ARNAi小麦Line1中Ta-Hd4A基因表达量降低。

2、转Ta-Hd4ARNAi小麦的表型鉴定

将T2代转Ta-Hd4ARNAi小麦纯合株系Line1和野生型小麦植株萌发后，0-4度春化30天后，在30℃、70％相对湿度，光强为300μmol m^-2s^-1，光周期为16h光照/8h黑暗的人工气候室中继续培养，每个株系10个种子。实验重复3次，结果取平均值。

播种后至抽穗期开始观察，结果如图6所示，可以看出，与野生型小麦相比，T2代转Ta-Hd4ARNAi小麦纯合株系Line1延长抽穗。

统计各株系的抽穗时间，从播种当天记作第1天。

结果如下：

T2代转Ta-Hd4ARNAi小麦纯合株系Line1的抽穗时间较野生型晚抽穗7d左右。

上述结果表明，与野生型小麦相比，T2代转Ta-Hd4A小麦纯合株系Line1抽穗时间延长约7天左右，降低Ta-Hd4A基因表达可推迟小麦抽穗。

序列表

<110>山西省农业科学院小麦研究所 山西省科学技术情报研究所

<120>小麦抽穗期相关蛋白Ta-Hd4A及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1233

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 1

atggcgagcg ccggcgcggc gatcggtgcg cgcgcggccc gcgcctgcga cggctgcatg 60

cagcggcggg cgcggtggca ctgcgccgcg gacgacgcgt acctgtgcca ggcgtgcgac 120

gcctccgtcc actcggccaa cccgctcgcg cggcgccacc accgggtgcg cctcccctcc 180

tcgtcctcgc cggccgccac ctcctccctt cagcacgccg accccgacga gcccgcgtgg 240

ctgcacgggc tcaagcgccg gccgcgcacg ccgcggtcga agcccgggat ggtgggcaag 300

cacggcgcgc ccgccaccgc gaaggccgcg gctgcctcgg cggtccccga tctcgaggcg 360

gaggactccg gctccggcat cgtgggtgac aacgacgaag gccacggcgt ggaggtcgac 420

gacgaggatc tcctgtaccg cgtcccggtg ttcgacccca tgctcgccga gctctacaac 480

cccgtgccgg tcgacgagtt ccgggagccc ctcgagcaga agccttccgt ctgctgcttc 540

tcgtcgcttg ccaatcagcc gtcgtcggag tacgcctcgg gcgtggcgga ggcggccgac 600

gggttctccg ggttcgacgt cgtcccggac atggagctcg ccagcttcgc cgcggacatg 660

gagagcctgc tcatgggagg agtagaagag gggttcgacg acctgcggtt cttggacgaa 720

gagaagcccc agctgaacct tgacttcgac atggcggact tcgatgatca gagcaccgcg 780

gcgcctgcgc cggagcaaga gttagaggac aggaaaagga agcggtcgga ctcggggatg 840

atacttaagc tcgactacaa gagggttatc gactcctggg cccatgacgg cggctcgccg 900

tggttctacg gcgagcgccc ccacatcgac cccagtgatg attcctggct ggacttgccg 960

gcggggagcc gtggattcgg gctcggcgca gcggtgacgg cggtgaccgg cggcgagcgg 1020

gaggcgcggg tgtcgcggta ccgggagaag cggcggacgc ggctgttcgc caagaagatc 1080

cggtacgagg tgcgcaagct caacgccgag aagcggccgc ggatgaaggg ccggttcgtc 1140

aagcgcaccg cgctgccacc gctgccgccg cggccgccga tggtgctcgc gggccacggc 1200

cacggcggcg cgcacgggcg cttccgtttt tga 1233

<210> 2

<211> 410

<212> PRT

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 2

Met Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ile Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala Cys

1 5 10 15

Asp Gly Cys Met Gln Arg Arg Ala Arg Trp His Cys Ala Ala Asp Asp

20 25 30

Ala Tyr Leu Cys Gln Ala Cys Asp Ala Ser Val His Ser Ala Asn Pro

35 40 45

Leu Ala Arg Arg His His Arg Val Arg Leu Pro Ser Ser Ser Ser Pro

50 55 60

Ala Ala Thr Ser Ser Leu Gln His Ala Asp Pro Asp Glu Pro Ala Trp

65 70 75 80

Leu His Gly Leu Lys Arg Arg Pro Arg Thr Pro Arg Ser Lys Pro Gly

85 90 95

Met Val Gly Lys His Gly Ala Pro Ala Thr Ala Lys Ala Ala Ala Ala

100 105 110

Ser Ala Val Pro Asp Leu Glu Ala Glu Asp Ser Gly Ser Gly Ile Val

115 120 125

Gly Asp Asn Asp Glu Gly His Gly Val Glu Val Asp Asp Glu Asp Leu

130 135 140

Leu Tyr Arg Val Pro Val Phe Asp Pro Met Leu Ala Glu Leu Tyr Asn

145 150 155 160

Pro Val Pro Val Asp Glu Phe Arg Glu Pro Leu Glu Gln Lys Pro Ser

165 170 175

Val Cys Cys Phe Ser Ser Leu Ala Asn Gln Pro Ser Ser Glu Tyr Ala

180 185 190

Ser Gly Val Ala Glu Ala Ala Asp Gly Phe Ser Gly Phe Asp Val Val

195 200 205

Pro Asp Met Glu Leu Ala Ser Phe Ala Ala Asp Met Glu Ser Leu Leu

210 215 220

Met Gly Gly Val Glu Glu Gly Phe Asp Asp Leu Arg Phe Leu Asp Glu

225 230 235 240

Glu Lys Pro Gln Leu Asn Leu Asp Phe Asp Met Ala Asp Phe Asp Asp

245 250 255

Gln Ser Thr Ala Ala Pro Ala Pro Glu Gln Glu Leu Glu Asp Arg Lys

260 265 270

Arg Lys Arg Ser Asp Ser Gly Met Ile Leu Lys Leu Asp Tyr Lys Arg

275 280 285

Val Ile Asp Ser Trp Ala His Asp Gly Gly Ser Pro Trp Phe Tyr Gly

290 295 300

Glu Arg Pro His Ile Asp Pro Ser Asp Asp Ser Trp Leu Asp Leu Pro

305 310 315 320

Ala Gly Ser Arg Gly Phe Gly Leu Gly Ala Ala Val Thr Ala Val Thr

325 330 335

Gly Gly Glu Arg Glu Ala Arg Val Ser Arg Tyr Arg Glu Lys Arg Arg

340 345 350

Thr Arg Leu Phe Ala Lys Lys Ile Arg Tyr Glu Val Arg Lys Leu Asn

355 360 365

Ala Glu Lys Arg Pro Arg Met Lys Gly Arg Phe Val Lys Arg Thr Ala

370 375 380

Leu Pro Pro Leu Pro Pro Arg Pro Pro Met Val Leu Ala Gly His Gly

385 390 395 400

His Gly Gly Ala His Gly Arg Phe Arg Phe

405 410

<210> 3

<211> 576

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

acgaaggcca cggcgtggag gtcgacgacg aggatctcct gtaccgcgtc ccggtgttcg 60

accccatgct cgccgagctc tacaaccccg tgccggtcga cgagttccgg gagcccctcg 120

agcagaagcc ttccgtctgc tgcttctcgt cgcttgccaa tcagccgtcg tcggagtacg 180

cctcgggcgt ggcggaggcg gccgacgggt tctccgggtt cgacgtcgtc ccggacatgg 240

agctcgccag cttgaatcga tctgggaggc caaggtatct aatcagccat cccatttgtg 300

atctttgtca gtagatatga tacaacaact cgcggttgac ttgcgccttc ttggcggctt 360

atctgtctta ggggcagact cccgtttgaa gctggcgagc tccatgtccg ggacgacgtc 420

gaacccggag aacccgtcgg ccgcctccgc cacgcccgag gcgtactccg acgacggctg 480

attggcaagc gacgagaagc agcagacgga aggcttctgc tcgaggggct cccggaactc 540

gtcgaccggc acggggttgt agagctcggc gagcat 576

Claims (8)

1.一种蛋白质，为如下a）或b)蛋白质：

a）氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

b) a)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的编码序列如SEQ IDNO:1所示。

4.下述1）-6）中的任一种生物材料：

1）含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒；

2）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体；

3）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌；

4）含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系；

5）DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

6）含有5）所述DNA片段的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的生物材料在培育花期或抽穗期提前的植物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

7.一种培育开花时间或者抽穗时间提前的转基因植物的方法，包括如下步骤：提高植物中编码权利要求1所述蛋白的核酸分子的表达量和/或活性，获得转基因植物，所述转基因植物的开花时间或者抽穗时间早于所述目的植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述提高植物中编码权利要求1所述蛋白的核酸分子的表达量和/或活性为将编码权利要求1所述蛋白的核酸分子导入目的植物；

或，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

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