CN111041034B - 一种中间锦鸡儿Senescence_reg-1类蛋白编码基因CiDUF584-1及其应用 - Google Patents

一种中间锦鸡儿Senescence_reg-1类蛋白编码基因CiDUF584-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新的编码Senescence_reg‑1类蛋白基因及其蛋白、cDNA序列，该基因来源于豆科锦鸡属灌木中间锦鸡儿(Caragana intermedia Kuang et H.C.Fu)，该基因包括633bp的开放阅读框，编码210个氨基酸。利用所克隆到的cDNA序列，构建植物表达载体，转化野生型拟南芥，获得了转基因植物。转基因拟南芥表型观察发现，该基因可以增加植物抽薹数量、改变植物株型，并且延缓植物衰老，植物表现出明显的滞绿现象。

Description

一种中间锦鸡儿Senescence_reg-1类蛋白编码基因 CiDUF584-1及其应用
技术领域
本发明涉及一种Senescence_reg-1类蛋白编码基因及其应用。具体的说明，本发明涉及到一种来源于豆科灌木植物中间锦鸡儿的编码Senescence_reg-1类蛋白的基因，命名为CiDUF584-1。本发明还涉及该基因编码的蛋白的氨基酸序列，以及含有这类基因的载体，以及利用这类基因在植物基因工程中的应用。
背景技术
中间锦鸡儿(Caragana intermedia Kuang et H.C.Fu)是一种豆科锦鸡儿属饲用灌木，也是中国西北部干旱荒漠地区植树造林的重要树种，具有极大生态价值和经济价值。
本发明从中间锦鸡儿克隆得到一个新的Senescence_reg-1类蛋白编码基因，命名为CiDUF584-1。构建植物表达载体，在模式植物拟南芥中过量表达该基因后导致转基因植物外观形态改变、发育延缓、抽薹数量增加、衰老延缓、滞绿现象明显，说明该基因可以对植物多种生长发育性状进行调控。该基因可能被利用于植物基因工程中，对外观形态、发育和衰老进行调控。
发明内容
本发明提供一个可以对植物生长发育进行调控的CiDUF584-1，主要表现在发育延迟、延缓植物衰老及增加植物抽薹数量上，该基因来源于中间锦鸡儿(Caraganaintermedia Kuang et H.C.Fu)，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示。
本发明所提供的CiDUF584-1来源于中间锦鸡儿，是一个编码Senescence_reg-1类蛋白的基因，是具有与SEQ ID No.2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No.2氨基酸残基序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与序列表中的氨基酸残基序列相同活性的由序列衍生的蛋白质序列，表中氨基酸残基序列是由210个氨基酸残基组成的蛋白质，拥有SEQ ID No.2所示的全长ORF(开放阅读框)序列，长度是633bp。
附图说明
图1：CiSenescence_reg-1基因PCR产物电泳图；M：DL2000Marker；泳道1:CiSenescence_reg-1基因PCR产物；
图2：pCanG-CiSenescence_reg-1重组质粒酶切鉴定，M：DL5000Marker；泳道1:SacⅠ单酶切产物；泳道2:pCanG-CiSenescence_reg-1重组质粒对照；
图3：荧光定量PCR检测CiDUF584-1基因在不同转基因株系(8-2/11-3/14-3/18-4/28-4/31-3/35-4/41-1/45-3/51-4/54-2)中的表达；
图4：转基因拟南芥(OE-35-4/OE-8-2/OE-45-3)和野生型拟南芥(WT)发育进程；
图5：生长75天转基因拟南芥(OE-35-4/OE-8-2/OE-45-3)和野生型拟南芥(WT)表型。
具体实施方式
以下实施例用于本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1、中间锦鸡儿CiDUF584-1基因的克隆
取中间锦鸡儿一个月苗龄小苗用于实验，剪取叶片置于1.5mL离心管中，液氮速冻，保存于-80℃冰箱备用。利用TRIzole法(Invitrogen)提取样品总RNA，利用反转录试剂反转录获得cDNA(具体操作见Kit DRR019A,TaKaRa，宝生物工程大连有限公司)。
根据pCanG-HA载体序列，设计In-fusion特异性引物，扩增CiSenescence_reg-1基因的ORF全长，引物如下：
F-CiSenescence_reg-1：CGCCTCCCTCGTCGACATGGCGAAAGGTCGCAAATT
R-CiSenescence_reg-1：GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAGCCATCGAACCCGGTCT
以中间锦鸡儿cDNA为模板，利用高保真酶PrimeSTAR进行PCR扩增，反应体系和反应程序如下：
PCR反应体系：
Figure BDA0001826008070000021
PCR扩增条件：
Figure BDA0001826008070000031
PCR反应结束后，电泳检测结果显示PCR产物大小与预期一致(附图1)，回收含目的基因的胶块，用于与植物表达载体的连接。
实施例2、植物表达载体的构建与鉴定
用Sal I和Sac I双酶切pCanG-HA空载体，进行线性化处理，反应体系如下(CiSenescence_reg-1-pCanG重组质粒SacI单酶切验证体系与此相同)，总体积为40μL：
Figure BDA0001826008070000032
置于37℃水浴锅中酶切15min。胶回收线性载体，用于In-Fusion反应。目的基因与线性表达载体In-Fusion连接，反应体系如下，总体积10μL：
Figure BDA0001826008070000033
PCR仪控温，50℃，15min。
将CiDUF584-1-pCanG重组质粒转入到大肠杆菌感受态细胞Trans-T1(购于北京全式金公司)，具体方法见Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell说明书。将重组细胞涂于含有50mg/L卡那霉素的固体LB培养基上，37℃过夜培养。第二天对菌落进行PCR鉴定，鉴定后将阳性单菌落于含有50mg/L卡那霉素的液体LB培养基内37℃过夜培养，测序结果显示目的片段序列正确且与线性的pCanG-HA载体成功连接，植物表达载体构建成功。
同时，pCanG-CiSenescence_reg-1重组质粒单酶切结果(附图2)也显示，酶切片段符合预期大小，说明pCanG-CiSenescence_reg-1重组质粒构建成功。
实施例3、转CiDUF584-1基因拟南芥的获得及鉴定
将测序后获得的重组植物表达载体，转入农杆菌GV3101，提质粒再次PCR、酶切鉴定正确后，利用浸花法转化野生型拟南芥(哥伦比亚型，Col)，通过植物表达载体PBI-xs上所带卡那(Kan)抗性筛选转基因拟南芥。利用反转录PCR筛选、鉴定转基因植株，通过荧光定量PCR检测CiDUF584-1基因在不同转基因株系中的表达。检测结果显示在11个不同的转基因植物株系中，CiDUF584-1基因都有较高的表达(附图3)。
实施例4、转CiDUF584-1基因拟南芥中调控植物多种生长发育性状
将转基因拟南芥的不同株系和野生型拟南芥同时种植于装有营养土和蛭石的培养盘中，置于植物培养室(22℃，光照/黑暗：16h/8h)正常生长，观察转基因植物生长情况并拍照(附图4)。可以看到转基因植物生长发育明显慢于野生型拟南芥，转基因植物在生长初期一直小于野生型，抽薹开花晚于野生型，生长到42天后则大小没有明显区别。
转基因拟南芥在形态和叶片衰老方面与野生型拟南芥有着明显的区别(附图5)。转基因拟南芥植株高度低于野生型，抽薹数量比野生型多。生长72天后，野生型拟南芥叶片几乎全部衰老死亡，而转基因植物叶片叶片几乎没有衰老现象(白色箭头所示)。这说明该基因可以延缓植物衰老，带来滞绿的表型，这在草坪草等园林绿化中有重要的应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 申请人, 申请人
<120> 一种中间锦鸡儿Senescence_reg-1类蛋白编码基因CiDUF584-1及其应用
<130> 一种中间锦鸡儿Senescence_reg-1类蛋白编码基因CiDUF584-1及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 633
<212> DNA
<213> Caragana intermedia Kuang et H.C.Fu
<400> 1
atggcgaaag gtcgcaaatt aacgactagt cggagcgagc gtttcttggg aacctacgcc 60
tacgctaacc gccaagactc cgccgccgat ccgtcggagc tccgggaaga ggatatctgg 120
tccacagccg atgacgccgg ctaccctgac tcgaatgtct cacacggcga gtgggagcca 180
acacacgctg ccaccaccga gagcaacggc ggctcgtcct ttcggaaccg gcgccggatt 240
ccccaaaacg gcgatgtcca ccgcaacctg ggtggcctgt ccctggcgtt cgaagaccca 300
gctacggcgt cgtcgacgag gatcgtacac cagttccgcg cgcacgaggg tgtggcgtcg 360
tcgccgcggg gacaccacgt ggcatcgtcg gcgcctgtga acgtgccaga ctggagcaag 420
atactccgag tcgactcggt cgagtcgctg cacgacgcgg acgacggtct cgacgacgac 480
gatttggaga tggtcccgcc gcacgagtac ttggcgcgca gccgtaagat ggcggcgaag 540
tcggttttcg agggtgtggg ccgcactttg aagggccggg acttgagccg ggttcgtgat 600
gccgtttgga gccagaccgg gttcgatggc taa 633
<210> 2
<211> 210
<212> PRT
<213> Caragana intermedia Kuang et H.C.Fu
<400> 2
Met Ala Lys Gly Arg Lys Leu Thr Thr Ser Arg Ser Glu Arg Phe Leu
1 5 10 15
Gly Thr Tyr Ala Tyr Ala Asn Arg Gln Asp Ser Ala Ala Asp Pro Ser
20 25 30
Glu Leu Arg Glu Glu Asp Ile Trp Ser Thr Ala Asp Asp Ala Gly Tyr
35 40 45
Pro Asp Ser Asn Val Ser His Gly Glu Trp Glu Pro Thr His Ala Ala
50 55 60
Thr Thr Glu Ser Asn Gly Gly Ser Ser Phe Arg Asn Arg Arg Arg Ile
65 70 75 80
Pro Gln Asn Gly Asp Val His Arg Asn Leu Gly Gly Leu Ser Leu Ala
85 90 95
Phe Glu Asp Pro Ala Thr Ala Ser Ser Thr Arg Ile Val His Gln Phe
100 105 110
Arg Ala His Glu Gly Val Ala Ser Ser Pro Arg Gly His His Val Ala
115 120 125
Ser Ser Ala Pro Val Asn Val Pro Asp Trp Ser Lys Ile Leu Arg Val
130 135 140
Asp Ser Val Glu Ser Leu His Asp Ala Asp Asp Gly Leu Asp Asp Asp
145 150 155 160
Asp Leu Glu Met Val Pro Pro His Glu Tyr Leu Ala Arg Ser Arg Lys
165 170 175
Met Ala Ala Lys Ser Val Phe Glu Gly Val Gly Arg Thr Leu Lys Gly
180 185 190
Arg Asp Leu Ser Arg Val Arg Asp Ala Val Trp Ser Gln Thr Gly Phe
195 200 205
Asp Gly
210

Claims (4)

1.一种编码Senescence_reg-1类蛋白的基因CiDUF584-1，其核苷酸序列选自SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
2.来源于中间锦鸡儿的Senescence_reg-1类蛋白CiDUF584-1，其氨基酸序列选自SEQID No.2所示的氨基酸序列。
3.含有权利要求1所述的基因的表达载体。
4.权利要求1所述的Senescence_reg-1类蛋白的基因CiDUF584-1在植物增加抽薹数量和延缓衰老中的应用。
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