CN103319583B - 植物耐逆性相关蛋白TaNF-YB1及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与植物抗耐逆性相关的蛋白TaNF-YB1及其编码基因和应用。本发明所提供的蛋白质是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的蛋白质可以特异的调控含有CCAAT-box顺式元件的基因的转录表达，可以提高植物的耐旱性和抗冻性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

Description

植物耐逆性相关蛋白TaNF-YB1及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种与植物耐逆性相关的蛋白TaNF-YB1及其编码基因和应用。

背景技术

干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。因此，了解小麦对逆境条件的应答与信号传导机制，提高小麦品种的抗逆性，成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。

转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。

目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有：具有AP2结构域的AP2(APETALA2)/EREBP(乙烯应答元件结合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP(basic region/leucine zippermotif transcription factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY转录因子家族、结合CCAAT-box的主要核转录因子的CBF(CCAAT binding factor)类转录因子、含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家族。其中，NF-Y转录因子在高等植物中广泛存在，近年来，在拟南芥、玉米、水稻均有报道，这表明NF-Y转录因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物耐逆性相关的蛋白质。

本发明所提供的蛋白质是一种结合CCAAT-box的核转录因子蛋白，名称为TaNF-YB1，来源于小麦属小麦(Glycine max L.)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列1的蛋白质由182个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的TaNF-YB1便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的TaNF-YB1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的TaNF-YB1的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述TaNF-YB1蛋白的基因(命名为TaNF-YB1)；所述TaNF-YB1基因为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列是序列表中序列2自5’端第131至679位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2自5’端第131至679位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列2所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；

5)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列2中由690个核苷酸组成，开放阅读框架为自5′端第131-679位核苷酸。

含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

可用现有的植物表达载体构建含有所述核酸分子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如小麦贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建所述重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述核酸分子构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为如下a1)或a2)或a3)：

a1)35S启动子，如CaMV 35S启动子；

a2)Pmin启动子；

a3)Ubi启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为如下b1)-b3)中任一所述重组质粒：

b1)在YEP-GAP载体(参考文献Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.Two transcription factors，DREB 1and DREB2，withan EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways indrought-and low-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis，Plant Cell 1998 Aug；10(8)：1391-1406)的多克隆位点(BamH I和Xho I)之间插入所述TaNF-YB1基因得到的重组质粒；

b2)在入pBI121载体的多克隆位点(Xba I和Sac I)之间插入所述TaNF-YB1基因得到的重组质粒；

b3)在pAHC25载体的多克隆位点(Xba I和Sac I)之间插入所述TaNF-YB1基因得到的重组质粒。

所述TaNF-YB1蛋白或所述核酸分子在调控植物耐逆性中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆性转基因植物的方法。

该方法包括如下步骤：将所述TaNF-YB1蛋白的编码基因导入目的植物中，得到与所述目的植物相比耐逆性更高的转基因植物；所述耐逆性具体可为抗冻性和/或耐旱性。所述抗冻性和/或耐旱性的提高具体可体现在存活率的提高上。

所述TaNF-YB1蛋白的编码基因为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列是序列表中序列2自5’端第131至679位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2自5’端第131至679位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列2所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；

5)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

所述TaNF-YB1基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述TaNF-YB1基因的所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化目的植物，如植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。在本发明的一个实施例中，所述耐逆性具体为耐旱性和/或抗冻性。在本发明的一个实施例中，所述植物具体为单子叶植物小麦，如小麦品种济麦22；在本发明的另一个实施例中，所述植物具体为双子叶植物拟南芥，如拟南芥品种哥伦比亚生态型Col-0。

所述TaNF-YB1蛋白质在作为转录因子中的应用也属于本发明的保护范围。所述转录因子能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能。

本发明所提供的蛋白质可以特异的调控含有CCAAT-box顺式元件的基因的转录表达，可以提高植物的抗冻性和耐旱性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

附图说明

图1为TaNF-YB1受胁迫诱导表达的荧光实时定量(Real-time)PCR图谱。其中，A为干旱处理；B为200mM NaCl处理；C为100μM脱落酸处理；D为低温(4℃)处理；E为高温(42℃)处理。A-E中，横坐标的数据均表示处理时间；纵坐标均表示TaNF-YB1基因的相对表达量。

图2为重组表达载体pBI121-TaNF-YB1的质粒图谱。

图3为T3代转TaNF-YB1基因拟南芥中的TaNF-YB1基因的分子检测结果。其中，A为DNA水平检测；B为cDNA水平检测。A-B中，泳道M均为Marker(条带自上而下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道col均为哥伦比亚生态型拟南芥植物；泳道1-8均分别为8个待鉴定转TaNF-YB1基因拟南芥植株。

图4为T3代转TaNF-YB1基因拟南芥和野生型拟南芥耐旱性比较。其中，A为干旱处理前野生型植株；B为复水一周后的野生型植株；C为干旱处理前转TaNF-YB1基因植株；D为复水一周后的转TaNF-YB1基因植株。

图5为T3代转TaNF-YB1基因拟南芥和野生型拟南芥抗冻性比较。其中，A为冻处理前野生型植株；B为恢复一周后的野生型植株；C为冻处理前转TaNF-YB1基因植株；D为恢复一周后的转TaNF-YB1基因植株。

图6重组表达载体pAHC25-TaNF-YB1的质粒图谱。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

小麦品种小白麦(T.aestivum cv.Xiaobaimai)：参考文献Zhao-Shi Xu，Lan-Qin Xia，Ming Chen，et al.Isolation and molecular characterization of the Triticum aestivum L.ethylene-responsive factor1(TaERF 1)that increases multiple stress tolerance.Plant Mol.Biol.65：719-732.

实施例1、TaNF-YB1的克隆

一、mRNA的分离

将水培的生长10天左右的小麦品种小白麦(T.aestivum cv.Xiaobaimai)(中国农业科学院作物科学研究所景蕊莲赠送)三叶期幼苗干旱处理2小时，用液氮速冻，-80℃保存备用。采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)进行mRNA的分离。第一链cDNA合成用反转录酶(AMV)。采用SMART法合成双链cDNA，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

二、TaNF-YB1基因全长序列的获得

通过5’RACE和3’RACE方法获得小麦CCAAT-box核转录因子B族基因全长序列。

该基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，将该基因命名为TaNF-YB1基因，其开放阅读框架为自序列表的序列2的5′端第131位到679位核苷酸。TaNF-YB1基因编码序列表中序列1所示的蛋白质(命名为TaNF-YB1蛋白)，TaNF-YB1蛋白由182个氨基酸残基组成，具有保守的组蛋白折叠基序和TATA结合蛋白结合的结构域。

实施例2、实时荧光定量PCR分析TaNF-YB1的表达特性

一、胁迫处理

苗龄为10天的小白麦幼苗，进行以下处理：

(1)干旱处理：将盆栽的小麦幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)盐渍处理：将小麦幼苗置于200mM的NaCl溶液中，光照培养0.5小时、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(3)脱落酸处理：将小麦幼苗置于100μM的脱落酸(ABA)溶液中，光照培养0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(4)低温处理：将小麦幼苗置于4℃培养箱，光照培养0.5小时、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(5)高温处理：将小麦幼苗置于42℃下，光照培养0.5小时、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(6)对照的处理：直接取未经任何处理的小麦幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。

二、mRNA的分离

采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)对步骤一得到的各样品进行mRNA的分离。

三、反转录为cDNA

将步骤二得到的纯化后mRNA反转录为cDNA。

四、实时荧光定量PCR

将cDNA稀释50倍后用作Q-RT-PCR的模板。用基因3′端非编码区的特异引物对对样品进行Q-RT-PCR扩增，分析基因对步骤一中各种处理的应答情况，以actin做内参。Q-RT-PCR在ABI7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2-^ΔΔCT计算相对表达量。

ΔΔC_T＝(C_T TaNF-YB1-C_T.Actin)_Time x-(C_T.TaNF-YB1-C_T.Actin)_Time 0

Time x表示任意时间点，Time₀表示经actin校正后1倍量的目标基因表达所对应的时间点。

结果如图1所示。

实施例3、TaNF-YB1蛋白激活特性的检测

YEP-GAP载体：中国农业科学院作物科学研究保证向公众提供；参考文献Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.Twotranscription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domainseparate two cellular signal transduction pathways in drought-andlow-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis，Plant Cell 1998Aug；10(8)：1391-1406。

YPD液体培养基：细菌培养用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract)10g/L，细菌培养用胰化蛋白胨(Bacto-Peptone)20g/L，调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃以后加入40％的Glucose，使其终浓度为20g/L。

SD/His^-/Ura^-/Trp^-选择性培养基：不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base)6.7g/L，营养缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp)100ml，琼脂粉(Bacteriological agar)20g/L，调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其终浓度为20g/L。

配制SD/His^-/Ura^-/Trp^-选择性培养基所用到营养缺陷型混合物(drop-out mediawithout His/Ura/Trp)：(10×)：L-Isoleucine(异亮氨酸)300mg/L，L-Valine(缬氨酸)1500mg/L，L-Adenine(腺嘌呤)200mg/L，L-Arginine(精氨酸)200mg/L，L-Leucine(亮氨酸)1000mg/L，L-Lysine HCl(赖氨酸)300mg/L，L-Methionine(甲硫氨酸)200mg/L，L-Phenylalanine(苯丙氨酸)500mg/L，L-Threonine(苏氨酸)2000mg/L，L-Tyrosine(酪氨酸)300mg/L。

1×PEG/LiAc：50％(50g/100ml)PEG33508ml，10×TE buffer 1ml，10×LiAc 1ml。

10×TE Buffer：100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH＝7.5，121℃高压灭菌，室温保存。

1×TE/LiAc：10×TE buffer 1ml，10×LiAc 1ml，ddH₂O 8ml。

Z溶液：Na₂HPO₄·7H₂O 16.1g/L，NaH₂PO₄·H₂O 5.5g/L，KCl 0.75g/L，MgSO₄·7H₂O0.246g/L，调节pH至7.0，121℃/15min灭菌，4℃保存。

X-gal储存液(X-gal Stock Solution)：用N，N-dimethyl-formamide(二甲基甲酰胺，DMF)溶解X-gal，使其终浓度为20mg/ml，-20℃贮存。

含有X-gal的Z缓冲液100ml(Z/X-gal)，现用现配：Z溶液98ml，β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)0.27ml，X-gal储存液(X-gal stock solution)1.67ml。

10×LiAc：100Mm Tris-Hcl，100mM EDTA，pH＝7.5，121℃高压灭菌、室温保存。

SD/His^-选择性培养基：不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base)6.7g/L，营养缺陷型混合物(drop-out mix without His)100ml，琼脂粉(Bacteriological agar)20g/L，调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其终浓度为20g/L。

配制SD/His^-选择性培养基所用的营养缺陷型混合物(drop-out mix without His)(10×)：L-Isoleucine(异亮氨酸)300mg/L，L-Valine(缬氨酸)1500mg/L，L-Adenine(腺嘌呤)200mg/L，L-Arginine(精氨酸)200mg/L，L-Leucine(亮氨酸)1000mg/L，L-Lysine Hcl(赖氨酸)300mg/L，L-Methionine(甲硫氨酸)200mg/L，L-Phenylalanine(苯丙氨酸)500mg/L，L-Threonine(苏氨酸)2000mg/L，L-Tyrosine(酪氨酸)300mg/L，Uracil(尿嘧啶)300mg/L。

SD/His^-/Ura^-选择性培养基：不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base)6.7g/L，营养缺陷型混合物(drop-out mix without His/Ura/Trp)100ml，琼脂粉(Bacteriologicalagar)20g/L，调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其终浓度为20g/L。

配制SD/His^-/Ura^-选择性培养基所用的营养缺陷型混合物(drop-out mix withoutHis/Ura/Trp)(10×)：L-Isoleucine(异亮氨酸)300mg/L，L-Valine(缬氨酸)1500mg/L，L-Adenine(腺嘌呤)200mg/L，L-Arginine(精氨酸)200mg/L，L-Leucine(亮氨酸)1000mg/L，L-Lysine HCl(赖氨酸)300mg/L，L-Methionine(甲硫氨酸)200mg/L，L-Phenylalanine(苯丙氨酸)500mg/L，L-Threonine(苏氨酸)2000mg/L，L-Tyrosine(酪氨酸)300mg/L。

用酵母单杂交系统证明转录因子的激活特性的主要原理：将CCAAT顺式作用元件和突变体CCAAT顺式作用元件分别构建到pHISi-1载体和pLacZi载体的基本启动子Pmin(minimal promoter)上游，Pmin启动子下游连接报道基因(His3、LacZ和URA3)。当连接有编码转录因子的目的基因的表达载体YEP-GAP(不含激活功能)分别转化到连有CCAAT顺式作用元件和突变体CCAAT顺式作用元件的酵母细胞后，如果连有突变体CCAAT顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因不能表达，而连有特定的CCAAT顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因能够表达，说明该转录因子能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了目的转录因子的体内结合特异性和激活功能。

以下将详述检测TaNF-YB 1蛋白是否具有激活特性。具体操作如下：

一、重组表达载体YEP-GAP-TaNF-YB1的构建

1、TaNF-YB1基因的获得

根据TaNF-YB1基因的序列设计引物TaNF-YB1和TaNF-YB1-XI，引物末端分别引入BamH I和Xho I酶切位点，以小麦品种小白麦(T.aestivum cv.Xiaobaimai)(中国农业科学院作物科学研究所)的cDNA为模板，PCR扩增获得TaNF-YB1基因。

TaNF-YB1：5′-CGGGATCCGCACCCGCCTGCGCCGCCTTCT-3′(下划线部分的序列为BamH I酶切位点的识别序列，其后的序列对应序列2的第1-22位)；

TaNF-YB1-XI：5′-CCCTCGAGGGTCCATATCTTCAGTTTGAGAT-3′(下划线部分的序列为Xho I酶切位点的识别序列，其后的序列对应序列2的第668-690位的反向互补序列)。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化690bp左右的PCR产物。

2、重组表达载体YEP-GAP-TaNF-YB1的构建

①用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切表达载体YEP-GAP，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化JM109菌株(Clontech公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了的阳性重组质粒在YEP-GAP的BamH I和Xho I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5′端第1位-690位(其中第131位-679位为TaNF-YB1蛋白的编码序列)核苷酸所示的DNA片段，将该重组质粒命名为YEP-GAP-TaNF-YB1。重组表达载体YEP-GAP-TaNF-YB1中启动TaNF-YB1基因转录的启动子为Pmin启动子。

二、TaNF-YB1的体内结合特异性和激活特性的检测

1、酵母报道子的构建

(1)正常双重酵母报道子的构建

DNA片段A(含4个CCAAT元件；TTTAACCAATCAGAAA)：

5’-GAATTC-CCAAT-CCAAT-CCAAT-CCAAT-GTCGAC-3′(CCAAT的核心序列：CCAAT)。DNA片段A的核苷酸序列见序列表的序列3。

以上述DNA片段A为模板，以A1和A1-XI组成的引物对进行PCR扩增，将得到的PCR产物用限制性内切酶Xho I和Nco I双酶切，与经同样双酶切的pHis-1载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)大片段相连，将得到的重组质粒测序，将测序表明含有序列表中序列3所示的DNA序列的重组载体命名为pHis-1-CCAAT。在重组载体pHis-1-CCAAT中，所述DNA片段A位于Pmin启动子上游。用Xho I和Nco I内切酶将重组载体pHis-1-CCAAT切成线状。

A1：5′-CCGCTCGAGAATTCTTTAACCAATCAGAA-3′；

A1-XI：5′-ATCCCATGGGTCGACTTTCTGATTGGTTAA-3′

以上述DNA片段A为模板，以上述A1和A1-XI组成的引物对进行PCR扩增，将得到的PCR产物用限制性内切酶Xho I和Nco I双酶切，与经同样双酶切的pLacZi载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)大片段相连，将得到的重组质粒测序，将测序表明含有序列表中序列3所示的DNA序列的重组载体命名为pLacZi-CCAAT。在重组载体pLacZi-CCAAT中，所述DNA片段A位于Pmin启动子上游。用Xho I和Nco I内切酶分别将pLacZi-CCAAT载体切成线状。

先将线状pHis-1-CCAAT载体转化到酵母细胞YM4271株系(MATCHMAKEROne-Hybrid System，Clontech公司)内，获得能在SD/His^-选择性培养基上正常生长的酵母转化子(Yeasttransformant)。接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含有4个重复CCAAT元件的pLacZi-CCAAT载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His^-/Ura^-选择性培养基上，选择获得含有pHis-1-CCAAT和pLacZi-CCAAT的正常双重酵母报道子。

(2)突变体双重酵母报道子的构建

DNA片段B(含4个mCCAAT元件)：

5’-GAATTC-mCCAAT-mCCAAT-mCCAAT-mCCAAT-GTCGAC-3′(MDRE：将4个CCAAT元件的核心序列CCAAT突变成TTTTA)。DNA片段B的核苷酸序列见序列表的序列4。

用DNA片段B代替DNA片段A，方法同步骤(1)，得到突变体双重酵母报道子。

2、PEG/LiAc法转化酵母及结果分析

(1)接种酵母菌YM4271株系到1ml YPD液体培养基中，剧烈震荡2分钟，分散团块后将悬浮液转至含有50ml YPD液体培养基的三角瓶中，30℃/250rpm摇过夜，测OD600＝1.7-1.8(约4×10⁷cfu/mL)；

(2)取30ml步骤(1)过夜培养物接到300ml新鲜的YPD培养基中，30℃/250rpm培养，约3小时(至OD600＝0.5±0.1)，室温1000g离心5min，收集菌体，弃上清，用1/2体积1×TE悬浮，1000g/5min离心；

(3)吸弃上清，用1.5ml新鲜配制的1×TE/LiAc溶液悬浮，振荡混匀备用；

(4)取出0.1ml酵母感受态进行转化，依次加下列溶液：0.1μg步骤一制备的YEP-GAP-TaNF-YB1、0.1mg ssDNA(鲑鱼精DNA，SiTaa)、0.6mlPEG/LiAc高速振荡1分钟，30℃/200rpm振荡培养30分钟；

(5)加入70μl DMSO，轻轻倒置混匀，42℃热激30分钟，其间轻轻振荡，冰浴2分钟，室温1000g离心5min；

(6)吸弃上清，加入0.5ml 1×TE buffer悬浮细胞；

(7)用接种环蘸取悬浮液，分别在含有0、15mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-选择性培养基上画线培养。

(8)平板的一半培养正常双重酵母报道子，另一半培养突变体双重酵母报道子，以便做对照分析。

(9)颠倒放置于培养箱中，30℃培养3-4天。

(10)结果发现在0mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Tr^p-的培养基平板上正常的酵母报道子和突变的酵母报道子都有生长，但突变的酵母报道子的直径明显小；而在15mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长，但突变的酵母报道子被抑止没有生长。

3、半乳糖苷酶活性检测

(1)从0mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上分别挑取正常的酵母报道子和突变的酵母报道子菌落。转至YPD液体培养基中，于30℃振荡培养，待长至对数生长后期，取1.5ml菌液，3000rpm离心30s；

(2)弃上清，控干管中液体，将离心管置于液氮中速冻10min，取出使其自然融解，加50μl Z/X-gal溶液(含有X-gal的Z缓冲液)，30℃温育，结果发现正常的酵母报道子在6-8h内变蓝，而突变的酵母报道子在12h内没有变化，仍为白色。这说明转录因子TaNF-YB 1能与CCAAT顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了TaNF-YB1的体内结合特异性和激活功能。

实施例4、TaNF-YB1蛋白提高植物的抗旱性与抗冻性的检测

一、重组表达载体pBI121-TaNF-YB1的构建

1、TaNF-YB1基因的克隆

根据TaNF-YB1基因的序列设计引物对(TaNF-YB1-121F和TaNF-YB1-121R)，引物末端分别引入Xba I和SacI酶切识别位点，以小麦属小麦(Triticum aestivum L.)品种小白麦的cDNA为模板PCR扩增TaNF-YB1基因。

TaNF-YB1-121F：5′-GCTCTAGAATGTCGGACGCGCCGGCGAGCC-3′(划线部分为Xba I的识别位点序列，第9-30位对应序列2的第131-152位)；

TaNF-YB1-121R：5′-CGAGCTCTCAGTTTGAGATGTCCCCATTAT-3′(划线部分为Sac I的识别位点序列，第8-30位对应序列2的第657-679位的反向互补序列)。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化564bp左右的条带。

2、重组表达载体pBI121-TaNF-YB1的构建

①用限制性内切酶Xba I和Sac I酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶Xba I和Sac I酶切pBI121(Clontech公司)，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(北京天根公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到的阳性重组质粒在pBI121的Xba I和Sac I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5′端第131-679位核苷酸所示的DNA片段。将该重组质粒命名为pBI121-TaNF-YB1(质粒图谱如图2所示)。重组表达载体pBI121-TaNF-YB1中启动TaNF-YB1基因转录的启动子为CaMV 35S启动子。

二、转TaNF-YB1基因植物的获得

1、用步骤一构建的重组表达载体pBI121-TaNF-YB1转化农杆菌C58C1(北京拜尔迪生物技术公司)，具体操作如下：

A.感受态细胞的制备

1)YEB固体培养基平板上划线纯化受体菌株C58C1；

2)挑取C58C1单菌落接种于5ml含适当抗生素的YEB液体培养基中，28℃/250rpm振荡培养过夜；

3)将步骤2)中的培养液按1∶25接种于100ml含适当抗生素的YEB液体培养基中，继续培养4～6h；

4)将步骤3)的菌液冰浴30min，期间不断摇动；

5)将步骤4)的菌液转入2个50ml离心管，各装45ml，4℃/4000rpm离心10min；

6)去上清，加入10～15ml灭菌蒸馏水，重悬沉淀，4℃4000rpm离心10min；

7)去上清，加入10ml灭菌10％甘油，重悬沉淀，4℃4000rpm离心10min；

8)重复步骤7；

9)去上清，不完全倒净回流一些，将沉淀重悬；

10)取20μl步骤9)的C58C1菌悬液分装于0.5ml离心管，-80℃保存，得到C58C1感受态细胞。

B.农杆菌的转化

取20μl步骤A制备的C58C1感受态细胞，加入1μl步骤一构建的重组表达载体pBI121-TaNF-YB1混匀，电击转化，加入1ml YEB液体培养基28℃/180rpm恢复培养3h，取200μl涂YEB抗性平板(Kan 50mg/L，Rif50mg/L，Gen 50mg/L)28℃培养2～3d。之后以TaNF-YB1-121F：5′-ATGTCGGACGCGCCGGCGAGCC-3′和TaNF-YB1-121R：5′-TCAGTTTGAGATGTCCCCATTAT-3′所组成的引物对，进行菌液PCR鉴定。将经菌液PCR鉴定表明含有TaNF-YB1基因(大小约为549bp的目的条带)的农杆菌阳性克隆进行测序分析。将经测序表明转入pBI121-TaNF-YB1的农杆菌命名为pBI121-TaNF-YB1/C58C1。同时设置转入pBI121空载体的农杆菌，将其命名为pBI121/C58C1。

2、将步骤1得到的两种重组农杆菌接种于LB(含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml庆大霉素)液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时；

3、将步骤2的菌液按照1∶50的体积比接种至新的LB(含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml庆大霉素)中，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)；

4、收集菌体，4℃、4000g离心10min，用含10％蔗糖MS液体培养基(含0.02％silwet)稀释至OD600约为0.8-1.0；

5、将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24h后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T₁代种子，卡那霉素筛选(浓度为50μg/L卡那霉素)阳性植株。T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。将T₃代植株进行DNA和cDNA水平鉴定(DNA水平和cDNA水平鉴定的引物对均如下：F：5′-ATGTCGGACGCGCCGGCGAGCC-3′；R：5′-TCAGTTTGAGATGTCCCCATTAT-3′；两者的预期条带均为549bp)，部分样本的鉴定结果如图3所示。将经鉴定表明含有TaNF-YB1基因的阳性植株(DNA和cDNA水平检测均为阳性的植株)命名为pBI121-TaNF-YB1/Col-0。

三、转空载体对照植物的获得

用重组农杆菌pBI121/C58C1转化拟南芥Col-0，得到转入pBI121空载体的对照植株，命名为pBI121/Col-0。具体转化方法同步骤二。

四、转TaNF-YB1基因植物的耐旱性与抗冻性检测

1、转TaNF-YB1基因植物耐旱性检测

分别将经步骤二鉴定为阳性(DNA水平和cDNA水平鉴定均为阳性)的T₃代转基因植株pBI121-TaNF-YB1/Col-0(TL)、T₃代转空载体对照植株pBI121/Col-0(CK)和拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行耐旱性检测。设置三次重复实验，结果取平均值。

将正常生长的萌发15天的幼苗不浇水，直至野生型植株Col-0枯萎(2周左右)，然后复水一周，观察表型、拍照并统计存活率。

结果如图4和表1所示，转TaNF-YB1基因植株pBI121-TaNF-YB1/Col-0有90％存活且能正常生长；而野生型拟南芥Col-0的存活率仅为24％，且生长状态欠佳，转空载体对照植株pBI121/Col-0的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。

表1T₃代转基因拟南芥植株耐旱性鉴定的存活率统计结果

	重复1	重复2	重复3	平均
					TL	90％	90％	89％	90％
CK	24％	25％	25％	24％
					WT	23％	24％	25％	24％

2、转TaNF-YB1基因植物的抗冻性检测

分别将T₃代转基因植株pBI121-TaNF-YB1/Col-0(TL)、T₃代转空载体对照植株pBI121/Col-0(CK)和拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行抗冻性检测。设置三次重复实验，结果取平均值。

将正常生长的萌发15天的幼苗，置于-4℃处理2小时直至野生型植株Col-0叶片出现受冻表型，然后置于正常培养条件下继续培养，观察表型、拍照并统计存活率。

结果如图5和表2所示，转TaNF-YB1基因植株pBI121-TaNF-YB1/Col-0有88％存活且能正常生长；而野生型拟南芥Col-0的存活率仅为23％，且生长状态欠佳，转空载体对照植株pBI121/Col-0的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。

表2T₃代转基因拟南芥植株抗冻性鉴定的存活率统计结果

	重复1	重复2	重复3	平均
					TL	88％	89％	87％	88％
CK	24％	23％	23％	23％
					WT	20％	19％	21％	21％

实施例5、TaNF-YB1提高小麦抗旱性的验证实验

一、重组表达载体pAHC25-TaNF-YB1的构建

1、TaNF-YB1基因的获得

根据TaNF-YB1基因的序列设计引物对(TaNF-YB1-121F和TaNF-YB1-121R)，引物末端分别引入Xba I和Sac I酶切位点，以小麦品种小白麦的cDNA为模板，PCR扩增TaNF-YB1基因。

TaNF-YB1-121F：5′-GCTCTAGAATGTCGGACGCGCCGGCGAGCC-3′(划线部分为Xba I的识别位点序列，第9-30位对应序列2的第131-152位)；

TaNF-YB1-121R：5′-CGAGCTCTCAGTTTGAGATGTCCCCATTAT-3′(划线部分为Sac I的识别位点序列，第8-30位对应序列2的第657-679位的反向互补序列)。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化564bp左右的条带。

2、重组表达载体pAHC25-TaNF-YB1的构建

①用限制性内切酶Xba I和Sac I酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶Xba I和Sac I酶切pAHC25(北京拜尔迪生物技术公司)，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(天根生化科技(北京)有限公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了的阳性重组质粒在pAHC25的Xba I和Sac I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5′端第131位-679位核苷酸所示的DNA片段，将该重组质粒命名为pAHC25-TaNF-YB1(质粒图谱如图6所示)。重组表达载体pAHC25-TaNF-YB1中启动TaNF-YB1基因转录的启动子为Ubi启动子。

二、转TaNF-YB1线性片段基因小麦的获得

取大田小麦品种济麦22(山东农业科学院)授粉后14天的未成熟胚，接种于SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB 11mg/L，天冬门酰胺150mg/L，2，4_D2mg/L)上，26℃黑暗条件下诱导愈伤组织，7-10d后准备基因枪轰击。

线性片段TaNFYB1扩增并回收：以pAHC25-TaNF-YB1质粒为模板，以X2503PF和X2503TR引物序列作为引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

X2503PF：5′-TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAGCTTGCATGCCTGCAGTGCA-3′

X2503TR：5′-GTTTACCCGCCAATATATCTGTCACGAATTCCCCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3′

采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化大小为3376左右的PCR产物，将该PCR产物命名为线性片段TaNFYB1。线性片段TaNFYB1由完整的Ubi启动子序列(2520bp)加TaNF-YB1基因的ORF序列(549bp)加NOS终止子序列(307bp)组成。

取适量金粉(1.0μm)悬浮液(60μg/枪)，将金粉和以重组表达载体pAHC25-TaNF-YB1扩增的上述线性片段TaNFYB1以及携带有BAR抗性基因的pAHC20载体(由中国农业科学院徐惠君馈赠，参考文献：Zhao-Shi Xu，Chang-PingZhao，Liancheng Li，Hui-jun Xu，You-Zhi Ma etal.The soybean GmbZIP1 transcriptionfactor enhances multiple abiotic stress tolerances in transgenic plants)一同在4℃振荡10min，14000rpm离心5min去上清，加入无水乙醇(10μl/枪加乙醇)准备用于基因枪轰击。

采用PDS-1000/He基因枪(Bia-Rod公司生产)轰击小麦幼胚诱导的愈伤组织。选择1100Psi的可裂膜，对材料进行轰击。轰击后的愈伤组织继续在原渗透压培养基上培养16-18h，然后转入不加筛选剂的SD2培养基(MM培养基也可)中暗条件下(26℃)恢复培养2周。2周后，将愈伤组织转入第一次筛选培养基上(1/2MS+玉米素0.5mg/L+2％蔗糖+双丙氨膦钠3mg/L；或1/2MS+a-萘乙酸1mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+2％蔗糖+双丙氨膦钠3mg/L也可)在24℃(每天光照10h)条件下筛选分化培养4周。待到愈伤组织分化出绿芽以后，将分化的绿芽转入无激素培养基(1/2MS+双丙氨膦钠4mg/L)上直到小苗伸长(光照与温度同前)，待到小苗伸长到1-2cm时(大概需要4周)，将抗双丙氨膦钠的再生植株移入壮苗培养基(1/2MS+生长素0.5mg/L+多效唑0.5mg/L)上壮苗，再生植株生长到适宜大小(苗高6-8cm，根系较好)时移入营养钵中，在15℃左右光照培养，待苗壮后置于温室。

将得到的阳性苗进行DNA和cDNA水平鉴定(DNA水平和cDNA水平鉴定的引物对均如下：F：5′-ATGTCGGACGCGCCGGCGAGCC-3′；R：5′-TCAGTTTGAGATGTCCCCATTAT-3′；两者的预期条带均为549bp)。将经鉴定表明含有TaNF-YB1基因的植物(DNA和cDNA水平PCR检测均为阳性的植株)命名为TaNF-YB1/济麦22(T₀代)。T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株.

三、转对照片段对照植物的获得

对照线性片段Ubi0NOS扩增并回收：只是模板换做空载体pAHC25，其他引物等都同上述步骤二的线性片段TaNFYB1扩增并回收的步骤。用对照片段(由完整的Ubi启动子序列加NOS终止子序列组成)代替扩增的线性片段TaNFYB1。将金粉和对照片段以及携带有BAR抗性基因的pAHC20载体(由中国农业科学院徐惠君馈赠，参考文献：Zhao-Shi Xu，Chang-Ping Zhao，Liancheng Li，Hui-jun Xu，You-Zhi Ma etal.Thesoybean GmbZIP1 transcription factor enhances multiple abiotic stress tolerances intransgenic plants)一同轰击小麦幼胚诱导的愈伤组织，具体方法同步骤二，得到对照植株Ubi0NOS/济麦22。具体操作方法同步骤二。

四、转TaNF-YB1基因小麦的获得的耐旱性检测

种子抗逆萌发试验：2011年10月将转TaNF-YB1基因植株-TaNF-YB1/济麦22的T₂代植株、转对照片段的对照植株-Ubi0NOS/济麦22的T₂代植株和济麦22(各30株)种植于大田，2012年2月移栽于温室，收获的T₃代转基因植株种子做转基因小麦植株的初步的种子抗逆萌发试验。将两层滤纸平铺于常用的玻璃培养皿中，然后用含有8％的PEG6000的水溶液完全浸泡滤纸，然后将三种种子(TaNF-YB1/济麦22、Ubi0NOS/济麦22和济麦22的T₃代种子)各40粒均匀点播到滤纸上面，放于25℃恒温光照培养箱(16h光照/8h黑暗)培养，一周以后统计各种子的发芽率，每次三次重复试验，萌发率取三次试验的平均值，其中以水作为该实验的平行对照试验。

结果如表3所示：TaNF-YB1/济麦22的T₃代种子在8％PEG模拟抗旱的条件下有80％正常萌发；而相同条件下，对照植株Ubi0NOS/济麦22的T₃代种子的萌发率仅为28％，Ubi0NOS/济麦22的T₃代种子的萌发率为26％，与济麦22相比，无显著差异。

表3T₃代转基因小麦种子抗逆萌发的萌发率统计结果

	重复1	重复2	重复3	平均
					TaNF-YB1/济麦22	80％	80％	79％	80％
Ubi0NOS/济麦22	27％	28％	29％	28％
					济麦22	25％	25％	26％	26％

Claims (10)

1.蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下1)或2)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’端第131至679位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体；所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为如下a1)或a2)或a3)：

a1)35S启动子；

a2)Pmin启动子；

a3)Ubi启动子。

6.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。

7.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌。

8.权利要求1所述蛋白质，或权利要求2或3所述核酸分子在调控植物耐逆性中的应用；所述耐逆性为抗冻性和/或耐旱性；所述植物为拟南芥或/和小麦。

9.培育耐逆性转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的植物中，得到与所述目的植物相比耐逆性更高的转基因植物；所述耐逆性为抗冻性和/或耐旱性；所述植物为拟南芥或/和小麦。

10.权利要求1所述的蛋白质在作为转录因子中的应用。