CN101805401A - 植物耐逆性相关蛋白TaHSP90-1及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白TaHSP90-1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的TaHSP90-1在高温、干旱、盐、低温、乙烯(ET)和脱落酸(ABA)的诱导表达，但对各种胁迫响应的时间和强度不同，其中，对高温、干旱和ET响应比较强烈。并且TaHSP90-1-GFP融合蛋白激发的荧光主要分布在在细胞质中。本发明的TaHSP90-1为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

Description

植物耐逆性相关蛋白TaHSP90-1及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白TaHSP90-1及其编码基因和应用。

背景技术

高温等逆境胁迫是影响小麦生长、发育的障碍因子。因此，了解小麦对逆境条件的应答与信号传导机制，提高小麦品种的抗逆性，成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

在高温胁迫下，植物会产生各种防御响应，其中热激蛋白(Heat shock protein，HSP)合成的明显增加引起了人们的关注。近年来的研究表明，热激响应蛋白在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。热激蛋白又称为热休克蛋白，是在受热、病原体、理化因素等应激原刺激后，发生热激反应时所产生的一类在生物进化中最保守并有热激基因所编码的伴随细胞蛋白，它存在于细菌到人类的各个生物体中。据报道，当受到高温胁迫时，HSP能识别并参与体内蛋白的正确折叠、防止体内蛋白聚合(TrentJD 1996)。根据分子量大小，HSP可以分为不同的家族，包括小HSPs、HSP60、HSP70、HSP90和HSP110等。其中，HSP90的底物蛋白广泛参与了细胞信号的传递途径。

HSP90是一种高度保守并普遍存在于原核生物以及真核生物细胞中的分子伴侣，为真核生物生长发育所必需。尽管作为一种热激蛋白，HSP90非应激情况下依然是细胞中最丰富的蛋白质之一，约占总蛋白的1～2％。作为分子伴侣中最特别的一组蛋白，HSP90能辅助蛋白的折叠、激活和成熟并改变和维持参与信号转导的蛋白构象，在细胞的生长进程过程中起着重要的作用。

HSP90是一个受ATP调节的二聚体分子伴侣，几乎所有的的家族成员都共有一个结构模型。如图1所示，HSP90包含3个高度保守的结构域，一个约25KD大小的N端结构域、35KD的中间结构域(M)和一个12KD的C端结构域。在真核细胞的细胞质中，HSP90的N端和中间结构域之间还有一段荷电区，该区域的长度和组分因物种不同而异。N端结构域有一个ATP结合位点，此位点也是HSP90抑制剂的结合位点，并具内源ATPase活性，在ATP存在的情况下，会发生构象变化，进而参与信号转导，蛋白折叠以及形态进化等很多细胞过程。虽然ATPase活性较弱，但突变研究的结果显示ATPase活性是HSP90执行生物功能所必须的。这个ATP结合位点的晶体结构与二型拓扑异构酶DNA促旋酶B(GyrB)相同，它们与组氨酸激酶和MutL同属于GHKL家族。

荷电区是一个大约50个氨基酸残基的片段，其中20～30个氨基酸是荷电氨基酸。荷电区对于体内HSP90的功能，体外ATPase活性都是可有可无的，主要功能是共价连接N端结构域和中间结构域，使两个结构域很好的协作，以维持HSP90的ATP结合状态的构象。研究表明，单独的N端结构域是没有ATPase活性的，维持其完整活性需要中间结构域的参与，中间结构域有一个接触反应环可以感知ATP-γ磷酸盐的存在并进攻它，其内侧还有一个暴露的疏水区域，根据实验推测此位置可能是HSP90底物蛋白主要的结合位点。

在C端，HSP90通过二聚体结合区形成二聚体，这个二聚体的特性是HSP90执行其功能的关键所在，C端的缺失会造成N端结合的ATP不能被水解，说明两个单体HSP90的N端联合是ATP水解的先决条件，而C端的二聚化作用可以加强这一联合。同时，真核生物细胞质HSP90的C端还有一个保守的五肽结构(MEEVD)，含有TPR结构域的蛋白就是通过这个五肽结构来识别HSP90并与之结合的，从而使HSP90发挥不同的作用。没有结合ATP的HSP90二聚体处于开放状态，它可以通过分来的两个单体N端结构域来捕获底物蛋白；相反，当N端结合ATP后蛋白构象发生变化时，两个分开的N端就会发生短暂的联合，HSP90分子夹闭合，底物蛋白也被包裹在夹内(图2)。

HSP90在原核生物和真核生物中高度保守并普遍存在。研究发现，大多数HSP90定位于细胞质，但也有少部分存在于内质网和线粒体等亚细胞器中，在植物中甚至存在于叶绿体。

在动物细胞质中的HSP90有两种亚型：HSP90α和HSP90β，在氨基酸水平上具有76％的同源性；一种存在于内质网中分子量为94KD，受葡萄糖调节的蛋白Grp94，它与细胞质HSP90的一致性达50％；定位于线粒体上的HSP90的远缘亲属TRAP1也被分离报道，它与人类HSP90β的同源性约为35％。

植物中的HSP90家族有多个成员，拟南芥中存在7个HSP90成员，分别是AtHSP90-1、AtHSP90-2、AtHSP90-3、AtHSP90-4、AtHSP90-5、AtHSP90-6和AtHSP90-7，它们之间有45％的一致性。AtHSP90-2、AtHSP90-3和AtHSP90-4之间的蛋白序列高度相似，彼此之间同源性高达96％，说明在功能上可能是冗余的。AtHSP90-1、AtHSP90-2、AtHSP90-3和AtHSP90-4定位于细胞质，在它们的C末端的氨基酸序列末端都含有特异的定位信号MEEVD；AtHSP90-5和AtHSP90-6的编码基因中含有18～19个内含子，这与细胞质HSP90的基因一般含有2～3个内含子是不同的，两者分别定位于叶绿体和线粒体；AtHSP90-7包含18～30个氨基酸组成的N端信号序列和C端的KDEL内质网定位信号序列，定位于内质网上(。

HSP90在细胞的生长进程中起着至关重要的作用，包括细胞生长、凋亡、癌变、应激反应、内分泌功能、植物免疫、发育甚至进化。近几年发现，HSP90参与了信号传递蛋白的合成、折叠。最近，在拟南芥、烟草和水稻上的研究发现，HSP90在植物发育、对胁迫环境的应答以及抗病性中起着重要作用。拟南芥HSP90复合物直接调控了抗病蛋白的活性，在R(Resistance)基因介导的抗病性中起着关键作用；Liu等(2004)报道，烟草HSP90与RAR1和TIR-NB-LRR蛋白互作，赋予植株烟草花叶病毒(TMV)抗性，抑制烟草HSP90基因，导致植株发育严重畸形。刘大丽等(2006)利用差异显示法，从水稻中克隆到HSP90基因(rHSP90)，可明显提高烟草在盐胁迫下的生长势。上述研究表明，植物HSP90在植物适应逆境环境过程中起着重要的作用。因此，深入研究植物HSP90在逆境条件下的功能，对正确认识胁迫信号的传导、抗逆相关基因的调控、以及提高作物的抗逆性有重要的指导意义和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白TaHSP90-1及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，为热激响应蛋白90，来源于小麦属小麦(Triticum aestivumL.)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性和/或生长能力相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表1所示蛋白质由700个氨基酸残基组成，自氨基端第695位-700位氨基酸残基序列为保守的细胞质HSP90的五肽结构(MEEVD)。

为了使(a)中的TaHSP90-1便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的TaHSP90-1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的TaHSP90-1的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’端第71至2173位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2自5’端第68至2175位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列2所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性和/或生长能力相关蛋白的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码耐逆性和/或生长能力相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列2所示cDNA由2411个核苷酸组成，该基因的开放阅读框架为自5′端第71位-2173位核苷酸。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为pBI121-TaHSP90-1；所述pBI121-TaHSP90-1为将权利要求2所述基因插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5’端第68位-2175位位核苷酸所示的DNA片段插入pBI121的SmaI和SpeI酶切识别位点之间得到的重组质粒。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到耐逆性和/或生长能力高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物，如拟南芥(如哥伦比亚生态型拟南芥)。

所述耐逆性具体可为耐旱。

所述生长能力体现在生长速度和/或生长周期上，所述转基因植物的生长速度高于所述目的植物和/或生长周期长于所述目的植物。

扩增所述基因的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

实验证明本发明的TaHSP90-1在高温、干旱、盐、低温、乙烯(ET)和脱落酸(ABA)的诱导表达，但对各种胁迫响应的时间和强度不同，其中，对高温、干旱和ET响应比较强烈。并且TaHSP90-1-GFP融合蛋白激发的荧光主要分布在在细胞质中。本发明的TaHSP90-1为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

附图说明

图1为HSP90的结构模型。

图2为ATP驱动的HSP90分子夹；N.HSP90N端结构域；M.HSP90中间结构域；C.HSP90C端结构域。

图3为TaHSP90-1与拟南芥AtHSP90-1氨基酸序列的同源性比对结果。

图4为TaHSP90-1受胁迫诱导表达的实时荧光定量PCR图谱。

图5为重组质粒16318hGFP-HSP90-1图谱。

图6为TaHSP90-1亚细胞定位结果；A：HSP90-1定位于细胞质中；B：16318hGFP空载体对照。

图7为pBI121-TaHSP90-1图谱。

图8为转pBI121-HSP90-1基因和拟南芥Col-0的表型对比。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1、TaHSP90-1的克隆

一、总RNA提取及cDNA文库构建

将普通小麦(Triticum aestivumL.)品种小白麦(国家种质资源库，编号ZM242)播种在苗床上，20～24℃生长10d左右，从土壤中取出，用蒸馏水冲洗干净，放在滤纸上干旱处理2h，取叶片立即放入液氮中，并保存在-80℃条件下准备提取RNA。

采用Trizol法(TianGen)提取小麦叶片总RNA，第一链cDNA合成用反转录酶XL(AMV)(TaKaRa)。采用SMART法(BD)进行合成ds cDNA。PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。

二、诱饵载体的构建及自激活检测

根据W17基因的序列及pGBKT7(Clontech)的克隆位点，在基因的两端分别引入EcoR I和BamHI(Promaga)酶切位点。酶切、连接(T4连接酶；Promaga)到质粒pGBKT7。测序验证融合质粒pGBKT7-W17克隆正确。

将pGBKT7-W17、空pGBKT7以及阴性对照分别与pGADT7共同转入酵母菌株AH109中，SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板筛选培养，验证pGBKT7-W17是否具有自激活活性。

三、酵母感受态的制备、诱饵质粒及文库质粒的转化

按照Clontech公司酵母双杂交系统说明书(MATCHMAK2ER pLexA two-Hybrid UserManual和yeast Protocols Handbook)制备AH109感受态细胞，将pGBKT7-W17质粒、pGADT7和小麦文库混合转入酵母细胞AH109。

四、酵母双杂交筛选阳性克隆

1、诱饵载体BD质粒pGBKT7带有Trp筛选标记，AD质粒pGADT7带有Leu筛选标记。将pGBKT7-W17、pGADT7和文库质粒混合转化AH109，涂布于SD/-Trp/-Leu(SIGMA)营养缺陷型平板，30℃培养3～5d，用牙签挑取直径大于2mm的阳性克隆，然后在SD/Raf/Gal/x-gal(Sigma)平板上划线培养，筛选蓝色克隆。

2、将筛选出的阳性酵母菌落进行PCR检测，将插入片段大于500bp的克隆提取质粒(TianGen)，转化到大肠杆菌DH5α(TransGen)，测序(SunBiotech)，通过检索GenBank和利用DNAMAN软件进行多重序列比较和同源性分析。

3、选取插入片段大于800bp的克隆进行测序，采用双脱氧核苷酸链终止法测定序列，将得到的全序列与EMBL Bank以及GENEBANK等核苷酸数据库比较，用DNASIS软件进行分析。发现有一个阳性克隆与拟南芥AtHSP90.1有很高同源性，为85.63％，且具有细胞质HSP90保守的五肽结构(MEEVD)结构域。

4、通过5’RACE方法从小麦中获得一个新的HSP90基因全长序列。

将序列表的序列1所示的蛋白命名为TaHSP90-1蛋白，由700个氨基酸残基组成，自氨基端第695位-700位氨基酸残基序列为保守的保守的五肽结构(MEEVD)。同源序列比对结果如图3所示(黑框表示一致的氨基酸部分)，表明TaHSP90-1与已报道的拟南芥AtHSP90.1有85.63％的同源性，且在小麦中尚未发现有HSP90研究的报道，说明TaHSP90-1是一个新发现的小麦基因。将TaHSP90-1蛋白的编码基因命名为TaHSP90-1基因，其开放阅读框架为自序列表的序列2的5′端第71位至2173位核苷酸。

实施例2、实时荧光定量PCR分析TaHSP90-1的表达特性

一、进行各种胁迫处理

苗龄为10天的小白麦幼苗，进行以下处理：

(1)干旱处理：将水培的小麦幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)盐渍处理：将小麦幼苗置于2％的由NaCl和Na₂SO₄组成的钠盐溶液中(NaCl与Na₂SO₄的质量百分比为3∶2)中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(3)脱落酸处理：将小麦幼苗置于200μM的脱落酸(ABA)溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(4)冷害处理：将小麦幼苗置于4℃培养箱，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时后取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(5)茉莉酸甲酯处理：将小麦幼苗置于50μM的茉莉酸甲酯(JA)溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(6)乙烯处理：小麦幼苗置于含有乙烯的塑料袋中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(7)水杨酸处理：将小麦幼苗置于50μM的水杨酸(SA)溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(8)高温处理：将小麦幼苗置于42℃下，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(9)对照的处理：直接取未经任何处理的小麦幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。

二、mRNA的分离

采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)进行mRNA的分离。

三.反转录为cDNA

采用R103-Quant_Reverse_Transcriptase(TIANGEN)将纯化的mRNA反转录为cDNA。

四、实时荧光定量PCR

根据TaHSP90-1序列，在其可变区设计特异引物90RTF和90RTR。以actin为内参基因，引物为actin-2F和actin-2R。

90RTF：5’-TCTGTCAAGGACCTTGTGAT-3’；

90RTR：5’-ACCATCGAACTTCGACACT-3’。

actin-2F：5’-CTCCCTCACAACAACCGC-3’；

actin-2R：5’-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3’。

TaHSP90-1对各个胁迫及激素表现出响应，见图4。

实施例3、亚细胞定位分析

一、载体构建

PCR扩增TaHSP90-1基因全长。将目的片段连接到同样双酶切的亚细胞定位载体163hGFP上，热激转化E.coli DH5α。对重组质粒进行PCR检测。将阳性克隆测序。提取质粒，得到重组质粒16318hGFP-HSP90-1(见图5)。

二、材料准备：

3μg重组质粒DNA加入直径为1.0μM的金粉悬液6μl(50mg/ml)，0.1M亚精胺(spermidine)4μl，2.5M CaCl₂ 6μl，将金粉、DNA、亚精胺和氯化钙先分别振荡混匀，然后混合振荡混匀3min后，冰上静置15min。12000rpm离心10s(转速达到12000rpm后10s)，弃上清。加入140μl无水乙醇，粗振荡后(打散金粉)12000rpm离心10s，收集金粉沉淀。20μl无水乙醇悬浮沉淀，点膜。

三、基因枪轰击受体材料：

①选用一定压力的可裂膜(本实验用1100psi)，与轰击膜一起，在70％的酒精中浸泡1～2h，取出晾干；

②金属挡板用酒精浸泡，在酒精灯上灭菌，基因枪的超净工作台紫外灭菌；

③取20μl上述制备好的金粉-质粒复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置上，不要涂于整个膜上，大小与载体固定圈上的孔径范围一致，晾干，然后固定在载体固定圈上；

④将上述载体固定圈安装到发射装置上；

⑤将可裂膜安装到气体加速管下端；

⑥将洋葱表皮培养皿放入真空室内，取下培养皿盖；

⑦抽真空指针到26In/Hg；

⑧放氦气于气体加速管，直到管中压力达到可裂膜所能承受的压力时，可裂膜破开；

⑨气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属挡板挡住，而下面的金粉-质粒复合体却透过金属挡板的网孔射向靶细胞；

⑩将轰击好的洋葱表皮细胞放入25℃培养箱中，暗培养16～24h后在激光共聚焦显微镜下观察。

四、洋葱表皮细胞镜检：

将基因枪轰击、暗培养16-24h之后的洋葱表皮压片，然后在激光扫描共聚焦显微镜(Bio-Rad MicroRadiance)(Laser scanning confocal microscopy，LSMC)观察GFP(绿色荧光蛋白)荧光，并进行扫描照像。结果表明TaHSP90-1定位到细胞质中。LSCM的工作参数为：Ex＝488nm，Em＝525±15nm，Power＝10％，Zoom7，中速扫描，Frame512×512。软件为TIME-COURSE和PHOTOSHOP5.0。见图6。

实施例4、TaHSP90-1提高拟南芥的抗旱性

一、重组表达载体的构建

1、TaHSP90-1基因的克隆

根据TaHSP90-1基因的序列设计引物对(TaHSP90-1F和TaHSP90-1R)，引物末端分别引入SmaI和SpeI酶切识别位点，以小白麦的cDNA为模板，PCR扩增TaHSP90-1。

TaHSP90-1-121F：5’-AACCCGGGGCCATGGCGACGGAGACC-3’；

TaHSP90-1-121R：5’-AAACTAGTGCTTAGTCGACCTCCTCCATCTTGC-3’。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化2.1Kb左右的条带。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶Sma I和Spe I酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶Sma I和Spe I酶切pBI121(Clontech公司购买)，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(天根生化科技(北京)有限公司购买)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pBI121-TaHSP90-1(在pBI121的SmaI和Spe I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’端第68位-2175位核苷酸所示的DNA片段；见图7)。

二、转基因植物的获得

1、用重组质粒pBI121-TaHSP90-1转化农杆菌C58(北京拜尔迪生物技术公司购买)，得到重组农杆菌。

2、将重组农杆菌接种于YEP液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时；

3、将步骤2的菌液转至YEP液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平)中，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)；

4、收集菌体，4℃、4000g离心10min，用10％蔗糖(含0.02％silwet)稀释至OD600约为0.8-1.0；

5、将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司购买)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T₁代种子，卡那霉素筛选(浓度为50μg/L卡那霉素)阳性植株(大部分非转基因植株黄化死去，而转基因植株能够正常生长)。将阳性植株进行PCR鉴定，鉴定结果表明，得到的转基因植株(转TaHSP90-1基因植株)。

T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

三、转空载体对照植物的获得

用质粒pBI121转化农杆菌，得到重组农杆菌，用重组农杆菌转化拟南芥，得到转空载体对照植株，方法同步骤二。

四、转基因植物的生长能力鉴定

分别将T₃代转基因植株、T₃代转空载体对照植株和拟南芥Col-0(各60株)进行生长能力鉴定。

将处于相同生长期的幼苗转入营养土中生长，观察表型。见图8；A：转入营养土中3d后的拟南芥；B：转入营养土中两周后的拟南芥；C：转入营养土中两周后拟南芥的叶形比较；①转基因拟南芥；②非转基因拟南芥。转基因植株与野生型植株相比生长速度稍快，叶片稍大，并且转基因植株生长周期较长，比野生型植株晚成熟一周左右。转空载体对照植株的表型与拟南芥Col-0一致。

五、转基因植物的耐旱性鉴定

分别将T₃代转基因植株、T₃代转空载体对照植株和拟南芥Col-0(各60株)进行耐旱性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。

将正常生长15天的幼苗进行干旱处理，连续不浇水直至拟南芥Col-0枯萎(约20天)，然后复水7天，统计成活率。拟南芥Col-0全部死亡，但25％转基因植株存活且能正常生长。转空载体对照植株的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>植物耐逆性相关蛋白TaHSP90-1及其编码基因和应用

 

<130>CGGNARY102251

 

<160>2

 

<210>1

<211>700

<212>PRT

<213>小麦属小麦(Triticum aestiVum L.)

 

<400>1

Met Ala Thr Glu Thr Glu Thr Phe Ala Phe Gln Ala Glu Ile Asn Gln

1                   5                   10                  15

Leu Leu Ser Leu Ile Ile Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Lys Glu Ile Phe

            20                  25                  30

Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ser Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg

        35                  40                  45

Phe Glu Ser Leu Thr Asp Lys Ser Lys Leu Asp Ala Gln Pro Glu Leu

    50                  55                  60

Phe Ile His Ile Ile Pro Asp Lys Ala Thr Asn Thr Leu Thr Ile Val

65                  70                  75                  80

Asp Ser Gly Ile Gly Met Thr Lys Ser Asp Leu Val Asn Asn Leu Gly

                85                  90                  95

Thr Ile Ala Arg Ser Gly Thr Lys Glu Phe Met Glu Ala Leu Ala Ala

            100                 105                 110

Gly Ala Asp Val Ser Met Ile Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser

        115                 120                 125

Ala Tyr Leu Val Ala Glu Arg Val Val Val Thr Thr Lys His Asn Asp

    130                 135                 140

Asp Glu Gln Tyr Val Trp Glu Ser Gln Ala Gly Gly Ser Phe Thr Val

145                 150                 155                 160

Thr Arg Asp Thr Ser Gly Glu Gln Leu Gly Arg Gly Thr Lys Met Val

                165                 170                 175

Leu Tyr Leu Lys Asp Asp Gln Met Glu Tyr Leu Glu Glu Arg Arg Ile

            180                 185                 190

Lys Asp Leu Val Lys Lys His Ser Glu Phe Ile Ser Tyr Pro Ile Ser

        195                 200                 205

Leu Trp Thr Glu Lys Thr Thr Glu Lys Glu Ile Ser Asp Asp Glu Asp

    210                 215                 220

Glu Glu Glu Lys Lys Asp Thr Glu Glu Gly Lys Val Glu Asp Val Asp

225                 230                 235                 240

Glu Glu Lys Glu Glu Lys Glu Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Glu Val

                245                 250                 255

Ser His Glu Trp Asn Leu Val Asn Lys Gln Lys Pro Ile Trp Met Arg

            260                 265                 270

Lys Pro Glu Glu Ile Asn Lys Glu Glu Tyr Ala Ala Phe Tyr Lys Ser

        275                 280                 285

Leu Thr Asn Asp Trp Glu Glu His Leu Ala Val Lys His Phe Ser Val

    290                 295                 300

Glu Gly Gln Leu Glu Phe Lys Ala Val Leu Phe Val Pro Lys Arg Ala

305                 310                 315                 320

Pro Phe Asp Leu Phe Asp Asn Lys Lys Lys Ala Asn Asn Ile Lys Leu

                325                 330                 335

Tyr Val Arg Arg Val Phe Ile Met Asp Asn Cys Glu Glu Leu Ile Pro

            340                 345                 350

Glu Tyr Leu Ser Phe ValLys Gly Ile Val Asp Ser Glu Asp Leu Pro

        355                 360                 365

Leu Asn Ile Ser Arg Glu Thr Leu Gln Gln Asn Lys Ile Leu Lys Val

    370                 375                 380

Ile Arg Lys Asn Leu Val Lys Lys Cys Ile Glu Leu Phe Phe Glu Ile

385                 390                 395                 400

Ala Glu Asn Lys Glu Asp Tyr Asn Lys Phe Tyr Glu Ala Phe Ser Lys

                405                 410                 415

Asn Leu Lys Leu Gly Ile His Glu Asp Ser Gln Asn Arg Thr Lys Ile

            420                 425                 430

Ala Glu Leu Leu Arg Tyr His Ser Thr Lys Ser Gly Asp Glu Leu Thr

        435                 440                 445

Ser Leu Lys Asp Tyr Val Thr Arg Met Lys Glu Gly Gln Asn Glu Ile

    450                 455                 460

Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ser Lys Lys Ala Val Glu Asn Ser Pro Phe

465                 470                 475                 480

Leu Glu Lys Leu Lys Lys Lys Gly Tyr Glu Val Ile Tyr Met Val Asp

                485                 490                 495

Ala Ile Asp Glu Tyr Ala Ile Gly Gln Leu Lys Glu Phe Glu Gly Lys

            500                 505                 510

Lys Leu Val Ser Ala Thr Lys Glu Gly Leu Lys Leu Asp Glu Ser Glu

        515                 520                 525

Asp Glu Lys Lys Lys Gln Glu Glu Leu Lys Glu Lys Phe Glu Gly Leu

    530                 535                 540

Cys Lys Val Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp Lys Val Glu Lys Val Ile

545                 550                 555                 560

Val Ser Asp Arg Val Val Asp Ser Pro Cys Cys Leu Val Thr Gly Glu

                565                 570                 575

Tyr Gly Trp Thr Ala Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln Ala Leu

            580                 585                 590

Arg Asp Ser Ser Met Ala Gly Tyr Met Ser Ser Lys Lys Thr Met Glu

        595                 600                 605

Ile Asn Pro Glu Asn Ala Ile Met Asp Glu Leu Arg Lys Arg Ala Asp

    610                 615                 620

Ala Asp Lys Asn Asp Lys Ser Val Lys Asp Leu Val Met Leu Leu Phe

625                 630                 635                 640

Glu Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Phe Ser Leu Glu Asp Pro Asn Thr

                645                 650                 655

Phe Gly Thr Arg Ile His Arg Met Leu Lys Leu Gly Leu Ser Ile Asp

            660                 665                 670

Glu Asp Asp Glu Ala Pro Glu Asn Asp Thr Asp Met Pro Pro Leu Glu

        675                 680                 685

Asp Asp Ala Gly Glu Ser Lys Met Glu Glu Val Asp

    690                 695                 700

 

<210>2

<211>2411

<212>DNA

<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)

 

<400>2

ctagccgcct cctgcacgct tctcctccgc tccccgcccc gcctcgagca gctcaggaac     60

gcgcgcagcc atggcgacgg agaccgagac cttcgccttc caggccgaga tcaaccagct    120

cctctcgctc atcatcaaca ccttctactc caacaaggag atcttcctcc gcgagctcat    180

ctccaactcc tccgatgcct tggacaagat caggttcgag agcctcacgg acaagagcaa    240

gctcgatgcg cagcccgagc tcttcatcca catcatcccc gacaaggcga ccaacacgct    300

cacgatcgtc gacagcggca ttggcatgac caagtcggac ctcgtcaaca acctcgggac    360

catcgccagg tcggggacca aggagttcat ggaggccctc gccgccggcg ccgacgtgtc    420

catgattggg cagtttggtg tcggtttcta ctccgcctac ctcgtcgccg agagggttgt    480

cgtcaccacc aagcacaacg acgacgagca gtacgtgtgg gagtcccagg ccggtggctc    540

cttcaccgtc actcgtgata cgtctgggga gcagctcggc aggggtacca agatggtcct    600

ctacctcaag gacgaccaga tggaatacct tgaggagcgc cgcatcaagg atctagttaa    660

gaagcactct gagtttatca gctaccccat ctccctgtgg actgagaaga ccactgagaa    720

ggaaatttct gatgatgaag atgaggagga gaagaaggat actgaggagg gcaaggttga    780

ggatgttgat gaggagaagg aagagaagga aaagaagaaa aagaagatca aggaagtctc    840

tcatgagtgg aacttggtca acaagcagaa gcctatctgg atgaggaaac cagaggagat    900

caacaaggaa gagtacgcag ctttttacaa gagcttgacc aatgactggg aggagcattt    960

ggctgtcaag cacttctctg ttgagggtca gcttgagttc aaggctgtcc tgtttgtgcc   1020

caagagggcc cccttcgacc tcttcgacaa caagaagaag gccaacaaca tcaagctgta   1080

cgtgcgccgt gtcttcatca tggacaactg tgaggagttg atccctgagt acctgagctt   1140

tgtcaagggt attgttgatt cagaggacct tcccctgaac atctcccgtg agactctcca   1200

gcagaacaag atcctcaagg tcatcaggaa gaaccttgtc aagaagtgca ttgagctctt   1260

ctttgagatt gctgagaaca aggaggacta caacaagttc tacgaggcct tctccaagaa   1320

cctcaagctt ggcatccacg aggactccca gaacaggacc aagattgccg agcttctgag   1380

gtaccactcc accaagagtg gcgatgagct gacaagcctg aaggactatg tgaccaggat   1440

gaaggaggga cagaacgaga tctactacat cactggtgag agcaagaagg ctgtggagaa   1500

ctctcccttc cttgagaagc tgaagaagaa gggctatgag gtcatctaca tggttgacgc   1560

cattgatgag tatgccattg gtcagctcaa ggagtttgag gggaagaagc ttgtctctgc   1620

caccaaggag ggtctgaagc ttgatgagag cgaggacgag aagaagaagc aggaggagct   1680

caaggagaag ttcgagggtc tgtgcaaggt catcaaggag gtgctgggtg acaaggtgga   1740

gaaggtcatc gtctctgacc gtgttgtgga ctctccttgc tgtctggtga ctggtgagta   1800

tgggtggact gccaacatgg agaggatcat gaaggcccag gccttgaggg actcgagcat   1860

ggctggctac atgtcgagca agaagaccat ggagatcaac cctgagaacg ccatcatgga   1920

cgagcttcgc aagcgcgccg acgccgacaa gaacgacaag tctgtcaagg accttgtgat   1980

gctgctcttc gagacctccc tgctcacctc cggcttcagc ctggaggacc ccaacacctt   2040

cggcaccagg atccaccgca tgctcaagct tggcctgagc attgacgagg acgacgaggc   2100

gcctgagaac gacaccgaca tgccacccct ggaggatgac gctggtgaga gcaagatgga   2160

ggaggtcgac taagcgcaag gccgtcggct gtcgtcgttg gatgtccatg ccctgcgttg   2220

tttttatctt tagtgtcgaa gttcgatggt tttggcacgt ttagctgtat cggttttgtc   2280

ttttggctgg ccaaacatta agcgcggtta gctgtttgtg gtactcgtgg aacagttcgt   2340

tattgttggt tctacaatat gtgttagcta tatttttata ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa   2400

aaaaaaaaaa a                                                        2411

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性和/或生长能力相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因，优选为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’端第71至2173位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2自5’端第68至2175位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列2所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性和/或生长能力相关蛋白的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码耐逆性和/或生长能力相关蛋白的DNA分子。

3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pBI121-TaHSP90-1；所述pBI121-TaHSP90-1为将权利要求2所述基因插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5’端第68位-2175位位核苷酸所示的DNA片段插入pBI121的Sma I和Spe I酶切识别位点之间得到的重组质粒。

5.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：权利要求2所述基因通过权利要求3或4所述重组表达载体导入所述目的植物中；所述耐逆性为耐旱。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述目的植物为拟南芥，优选为哥伦比亚生态型拟南芥。

8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2所述基因导入目的植物中，得到生长能力优于所述目的植物的转基因植物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2所述基因通过权利要求3或4所述重组表达载体导入所述目的植物中；所述生长能力体现为生长速度高和/或生长周期长。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述目的植物为拟南芥，优选为哥伦比亚生态型拟南芥。

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