CN103254301B - 植物抗病相关蛋白GbMBL1及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物抗病相关蛋白GbMBL1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为GbMBL1蛋白，来源于海岛棉(Gossypium barbadense)，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供的蛋白及其编码基因可用于培育抗病植物新品种，在植物的抗黄萎病分子育种方面具有重要的应用价值。

Description

植物抗病相关蛋白GbMBL1及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗病相关蛋白GbMBL1及其编码基因和应用。

背景技术

棉花黄萎病是一种世界性病害，由大丽轮枝菌侵染所致，是制约我国棉花生产的主要病害。目前我国各棉区的发病面积已占植棉总面积的50％以上，每年损失皮棉7.5-10万吨，直接经济损失16-20亿元。面对棉花黄萎病在生产上的危害，加强棉花抗病性研究，筛选抗病基因并研究其对黄萎病的抗病机制，利用基因工程方法提高棉花栽培品种的抗病性具有重要应用意义。

凝集素广泛分布于植物、动物和微生物中，是一类非免疫来源的对糖及其缀合物能够可逆专一识别的蛋白质分子，可以凝集细胞或沉淀糖缀合物。1888年，植物凝集素由俄国Dorpt大学的Stillmark首次在蓖麻子中发现，随后，人们又发现了上百个此类蛋白并对它们的结合特性、分子结构和生物学功能进行了分析。1995年，植物凝集素被统一定义为至少具有一个可与单糖或寡聚糖特异可逆结合的非催化结构域的植物蛋白。除几丁质酶等几种酶之外，凝集素是仅有的可以识别并结合昆虫肠胃及真菌、细菌等微生物表面的糖缀合物的植物蛋白，几乎能够识别目前所知的所有表面糖类，在植物抗病毒、细菌、真菌、虫害乃至动物危害方面发挥着非常重要的作用。基于水稻、拟南芥、大豆来源的植物凝集素的序列、结构特征及进化关系，植物凝集素的最新分类为12类，其中有4类系新近发现。

甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin)最早发现于雪花莲球茎中，它能专一性结合甘露糖，被命名为雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin，GNA)。当前，甘露糖结合凝集素通常是指一类与雪花莲凝集素相似的凝集素，它们含有一个或两个GNA结构域，能够识别并结合外源微生物中的甘露糖型聚糖，在植物防御中起到很重要的作用。对雪花莲凝集素的结合特性研究表明，它的每个亚基都具有三个相似的甘露糖结合位点，这些位点可紧密附着甘露寡糖或高甘露糖型聚糖，但与甘露糖单体仅有较弱的相互作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗病相关蛋白GbMBL1及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，命名为GbMBL1蛋白，来源于海岛棉(Gossypiumbarbadense)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明提供的GbMBL1蛋白，具有大丽轮枝菌应答属性，在蛋白水平和转录水平都能够受大丽轮枝菌强烈诱导，生物信息学分析属于甘露糖结合凝集素。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因具体可为如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的DNA分子：

(1)序列表中序列2自5’末端第15至1334位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2自5’末端第15至1337位核苷酸所示的DNA分子；

(3)序列表中序列2所示的DNA分子；

(4)在严格条件下与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子；

(5)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且植物抗病相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接根据表型筛选。

所述重组载体具体可为将所述基因插入载体pPZP-GFP的多克隆位点得到的重组质粒。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的重组载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化所述植物的细胞或组织。所述抗病性具体可为对黄萎病的抗性。所述黄萎病具体可为大丽轮枝菌引发的黄萎病。所述抗病性具体可为对大丽轮枝菌引发的病害的抗性。所述目的植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明还保护所述蛋白或所述基因在调控植物抗病性中的应用。所述抗病性具体可为对黄萎病的抗性。所述黄萎病具体可为大丽轮枝菌引发的黄萎病。所述抗病性具体可为对大丽轮枝菌引发的病害的抗性。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明提供的蛋白及其编码基因可用于培育抗病植物新品种，特别是抗黄萎病的棉花新品种，在植物抗黄萎病分子育种方面具有重要的应用价值。

备注：本发明由农业部“转基因生物新品种培育重大专项”(课题号：2009ZX08005-001B；2009ZX08010-001B)资助。

附图说明

图1为GbMBL1蛋白受大丽轮枝菌的诱导表达。

图2为GbMBL1基因受大丽轮枝菌的诱导表达。

图3为GbGML1在棉花中不同组织器官中的表达特征。

图4为拟南芥在大丽轮枝菌侵染后的生长情况。

图5为拟南芥在大丽轮枝菌侵染后的病叶率统计。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

哥伦比亚生态型拟南芥(Columbia ecotype Arabidopsis thaliana，col-0)：购自英国Nottingham.Arabidopsis Stock Centre。

实施例中所用的海岛棉(Gossypium barbadense)品种为Hai7124，大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)菌株为新疆V592；公众可以从中国科学院微生物研究所获得该品种的海岛棉和该大丽轮枝菌菌株；提及该品种的海岛棉和该大丽轮枝菌菌株的参考文献：Wang FX，Ma YP，Yang CL，Zhao PM，Yao Y，Jian GL，Luo YM，Xia GX.(2011)Proteomic analysis of the sea-island cotton roots infected by wilt pathogenVerticillium dahliae.Proteomics，11(22)：4296-4309。

农杆菌EHA105：公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：Hood EE，Gelvin SB，Melchers LS，Hoekema A.(1993)New Agrobacterium helper plasmids forgene transfer to plants.Transgenic Res，2：208-218。

载体pPZP-GFP：公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：马银平，沈法富，夏桂先，王付欣，杨淳淋(2012).海岛棉几丁质酶基因GbCHI的克隆与功能分析.遗传，V34(2)。

实施例1、植物抗性相关蛋白GbMBL1及其编码基因的发现

通过用大丽轮枝菌新疆V592菌株对海岛棉品种Hai7124的有效接种、高质量根部蛋白的提取、双向电泳、MS/MS分析、棉花EST数据库搜寻，共得到69个不同功能分类的差异表达蛋白，其中GbMBL1蛋白的表达能受到大丽轮枝菌的强烈诱导。GbMBL1蛋白在大丽轮枝菌假接种和接种处理5天后的根部总蛋白的代表性Blue silver染色双向凝胶分析图中的位置及在接种后第1、3、5、7天及对照的定量分析的结果如图1所示。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为GbMBL1蛋白，由440个氨基酸残基组成。将编码GbMBL1蛋白的基因命名为GbMBL1基因，其开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第15至1334位核苷酸所示。

实施例2、GbMBL1基因的表达分析

一、大丽轮枝菌侵染后GbMBL1基因的表达分析

为了分析GbMBL1基因在大丽轮枝菌侵染后的转录表达特征，进行如下实验：

用大丽轮枝菌V592菌株侵染海岛棉品种Hai7124(接种处理)；同时设置用水代替大丽轮枝菌V592菌株的平行处理，即假接种处理。分别在接种和假接种处理12、24、36、48、60、72、84、96小时后收取样品，提取各个样品的总RNA且反转录为cDNA。等量混合假接种各时间段的cDNA作为假接种对照cDNA样品。将假接种对照cDNA样品以及各个时间段收取的接种样本的cDNA分别进行实时荧光定量PCR分析，以假接种对照cDNA样品中的GbMBL1基因量作为本底，计算接种处理不同时间后GbMBL1基因的相对表达量，结果见图2。

在受大丽轮枝菌诱导后12-96小时海岛棉中GbMBL1基因的转录水平都有不同程度的增高，在侵染后12小时就达到了近60倍高峰值，在诱导后24、36、48小时的增加幅度也都大于10倍，表明GbMBL1基因可以受到大丽轮枝菌迅速而强烈的诱导。

二、GbMBL1基因在棉花不同组织器官中的表达特征分析

为了分析GbMBL1基因不同组织器官中的表达特征，进行如下实验：

分别提取海岛棉品种Hai7124的根、茎、叶、花的总RNA且反转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR分析，以棉花组成型基因histone 3的表达量为本底表达量，计算不同组织器官中GbMBL1基因的相对表达量，结果见图3。

GbMBL1基因在根、茎、叶、花中都有表达，以在根中的表达量最高，在茎、叶、花中的表达量相近，约为根中表达量的一半，表明GbMBL1基因可能在棉花各器官中都能够发挥作用，尤其在根中可能有重要功能。

实施例3、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体的构建

1、GbMBL1基因的克隆

提取海岛棉Hai7124的总RNA，将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，用Primer-F和Primer-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收1300bp左右的目的片段。

Primer-F：5’-TAGGATCCATGTCTCTTCACTCTTCTCTCACCA-3’(下划线标注BamH I酶切识别位点)；

Primer-R：5’-GCTGACGAGCTCTCACTGTTGGGGTGCCTTTATATAAC-3’(下划线标注SacI酶切识别位点)。

PCR扩增体系(50μl)：含有10×LA Buffer 5μl，MgCl₂ 2.5mmol/L，Primer-F与Primer-R各0.3μmol/L，dNTP 0.2mmol/L，LA Taq 3U，cDNA模板0.4μg；试剂和酶均购自Takara公司。

PCR扩增条件：95℃热变性3min；94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 30s，28个循环；最后72℃延伸10min。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切步骤1回收的目的片段，回收酶切产物。

②用限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切载体pPZP-GFP，回收载体骨架(约9.9kb)。

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，从重组质粒进行结构描述如下：在载体pPZP-GFP的BamH I和Sac I酶切位点之间插入了序列表中序列2自5’末端第15至1334位核苷酸所示的GbMBL1基因。

二、转基因植物的获得

1、重组农杆菌的获得

用步骤一得到的重组质粒转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

2、转基因拟南芥的获得

利用重组农杆菌，通过花浸泡法(Clough，S.J.，and Bent，A.F.(1998).Floraldip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.Plant J 16，735-743.)将GbMBL1基因导入哥伦比亚生态型拟南芥，得到T1代种子。

T1代种子收获后在MS培养基(含有50mg/L的卡那霉素)中筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，收获T2代种子并将其培育为植株(T2代植株)。

分别提取T1代植株和T2代植株的叶片的总RNA并反转录为cDNA，用Primer-F和Primer-R组成的引物对对来自各个样本的cDNA进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即转基因植株。对于某一T1代植株，如果其T2代植株均PCR鉴定为阳性，则该植株为纯合的转基因植株，该植株及其后代即为1个纯合的转基因株系。

T2代转基因植株自交产生T3代种子。

随机选取两个转基因植株株系(L1、L6、)的T3代种子进行步骤四的鉴定。

三、转空载体植株的获得

用载体pPZP-GFP代替重组质粒，其它同步骤二，得到转空载体植株的T3代种子，作为转基因植株T3代种子的对照。

四、抗病性鉴定

两个转基因植株株系(L1和L6)的T3代植种子(每个株系100粒)，转空载体植株的T3代种子(100粒)，哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)的种子(100粒)，分别进行如下抗病性鉴定(采用平行处理)：

1、接种

将种子播种在1/2MS培养基平板上，萌发6天后将幼苗移栽到1/2MS培养基上，将培养皿竖直放置，培养3天(为了发根，便于接种)，然后随机均分为两组，其中第一组用大丽轮枝菌V592孢子液(1×10⁷个/毫升)浸根接种，第二组用水进行浸根接种(假接种)。

2、转GbMBL1基因与野生型拟南芥在大丽轮枝菌侵染后的生长差异

从接种开始计时，7天后观察到的植物的生长差异，如图4所示。哥伦比亚生态型拟南芥已表现出典型的黄萎病症状，底部叶片失绿变黄，整株萎蔫。相比哥伦比亚生态型拟南芥，转GbMBL1基因拟南芥的生长仅受到抑制，尚未出现典型的黄萎病病症。转空载体植株的表型与哥伦比亚生态型拟南芥没有显著差异。上述结果表明，转基因植株在大丽轮枝菌侵染后的抗病能力显著优于野生型植株，具有较强的抵抗初侵染能力。

3、转GbMBL1基因与野生型拟南芥在大丽轮枝菌侵染后的病叶率统计

将病叶率(对于1个植株，病叶数与全部叶数的百分比)为病情指标，在大丽轮枝菌接种后7、14和21天对各个株系的病叶率进行统计(取该株系内所有植株的平均值)，结果如图5所示。

接种7天后，转基因植株的病叶率不及10％，而哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体植株的病叶率已近30％。接种14天后，哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体植株的病叶率均增至近60％，而转基因拟南芥的两个株系的病叶率大约为20％和30％。接种21天后，哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体植株的病叶率均增至近80％，而转基因拟南芥的两个株系的病叶率反而有所下降，约降至原来的一半。上述结果表明，转基因植株在大丽轮枝菌侵染后的抗病能力显著优于野生型植株和转空载体植株，同时具有较强的抵抗初侵染和耐病能力，在大丽轮枝菌处理后能够保持较好的生长势。

Claims (9)

1.蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)或(3)所述的DNA分子：

(1)序列表中序列2自5’末端第15至1334位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2自5’末端第15至1337位核苷酸所示的DNA分子；

(3)序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物；所述目的植物为拟南芥；所述抗病性为对大丽轮枝菌所引发的病害的抗性。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求3所述基因通过权利要求4所述重组载体导入所述目的植物中。