CN102676572B

CN102676572B - 植物抗病相关蛋白xa5PG1及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN102676572B
Application number: CN 201110060465
Authority: CN
Inventors: 翟文学; 江光怀; 尹德东
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2011-03-14
Filing date: 2011-03-14
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2031-03-14
Also published as: CN102676572A

Abstract

本发明公开了一种植物抗病相关蛋白xa5PG1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白如序列表的序列1所示。将所述蛋白的编码基因导入目的植物中，可以得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物。用本发明提供的基因构建重组质粒，并转化到感病水稻，可以获得抗病性明显增强的转基因水稻，打破了传统上利用隐性抗原的限制，极大地提高了隐性抗病基因的利用效率。本发明对于培育抗病水稻具有重大应用前景。

Description

植物抗病相关蛋白xa5PG1及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗病相关蛋白xa5PG1及其编码基因和应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主要食物。全球每年因水稻白叶枯病造成的水稻减产达11％～30％，严重时减产达40％～50％，甚至颗粒无收。

一般认为水稻抗病品种的应用是降低水稻病害的最为经济有效和绿色环保的办法。目前，已从水稻中至少鉴定了30个白叶枯病抗性基因，其中有显性基因，也有隐性基因。AP2/EREBP是一个多基因家族，其编码的蛋白因含有一个约50-60个氨基酸残基的保守结构域。其家族成员因具有AP2/EREBP结构域而得名，按照所包含的保守结构域数目的差异，该家族成员被进一步归类到EREBP亚家族(含1个AP2/EREBP结构域)和AP2亚家族(含2个AP2/EREBP结构域)，它们的功能涉及植物生长发育调控和对逆境应答等许多方面。在不同的逆境条件下，像干旱、低温、高盐、水害、病害等，AP2类转录因子会对生物和非生物胁迫做出相应的响应。目前在多种在植物中鉴定到该家族成员，如拟南芥中有147个成员，葡萄中有132个成员，白杨中有200个成员，在水稻中有163个成员。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗病相关蛋白xa5PG1及其编码基因和应用。

本发明提供的植物抗病相关蛋白(xa5PG1蛋白)，来自水稻品种IRBB5，属于AP2类转录因子，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由187个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH

FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因(xa5PG1基因)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)至5)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’末端第131至694位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)序列表中序列3所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物抗病性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在植物双元表达载体pZH01的多克隆位点插入序列表的序列2自5’末端第131至694位核苷酸所示DNA得到的重组质粒。

扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述蛋白或所述基因可用于培育抗病植物。所述植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻(如水稻品种TP309)。所述抗病具体可为抗白叶枯病(如菲律宾小种PXO86引起的白叶枯病)。所述抗病具体可为抗菲律宾小种PXO86引起的病害(如白叶枯病)。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻(如水稻品种TP309)。所述抗病具体可为抗白叶枯病(如菲律宾小种PXO86引起的白叶枯病)。所述抗病具体可为抗菲律宾小种PXO86引起的病害(如白叶枯病)。

本发明利用接菌后的水稻材料进行芯片分析，在水稻品种IRBB5(含纯合隐性抗病基因xa5的抗病材料)中鉴定到xa5基因特异启动的抗病关键基因。用本发明提供的基因构建强启动子驱动的重组质粒，并转化到感病水稻材料，可以获得抗病性明显增强的转基因水稻，打破了传统上利用隐性抗原的限制，极大地提高了隐性抗病基因的利用效率。本发明对于培育抗病水稻具有重大应用前景。

附图说明

图1为芯片预测基因xa5PG1的Northern-blot图；IR24为感白叶枯病水稻，IRBB5为抗白叶枯病水稻。

图2为PCR扩增xa5PG1基因电泳图。

图3为重组质粒pZH01-xa5PG1的结构示意图。

图4为转基因植物的潮霉素抗性基因鉴定图。

图5为转基因植物的xa5PG1基因鉴定图。

图6为转基因植物的抗病表型。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。水稻品种IRBB5(抗白叶枯病水稻)：菲律宾国际水稻所。水稻品种TP309：菲律宾国际水稻所。植物双元表达载体pCAMBIA1300：购自CAMBIA(http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)。水稻品种日本晴：购自日本RGRC(Centerhttp://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/index.html.en；Rice GenomeResource)。

植物双元表达载体pZH01：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：Plant Molecular Biology，2003，52：957-966；植物双元表达载体pZH01约10000bp，来源于pCAMBIA1300)。

农杆菌EHA105：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：Plant Molecular Biology，2003，52：957-966。

水稻白叶枯病菌菲律宾小种PXO86(菲律宾小种PXO86)：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：Mol Genet Genomics.2006，275(4)：354-66。

实施例1、植物抗病相关蛋白及其编码基因的发现

1、水稻IRBB5剪叶法接菌取材料。

2、提取接种白叶枯病小种PXO86的水稻RNA进行芯片分析。

3、获得表达水平显著上调的一个AP2类蛋白。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为xa5PG1蛋白。将xa5PG1蛋白的编码基因命名为xa5PG1基因，其cDNA如序列表的序列2所示(开放阅读框为序列表的序列2自5’末端第131至694位核苷酸)，基因组DNA如序列表的序列3所示。

4、对接种PXO86的水稻感抗材料IR24和IRBB5进行Northeren-blot分析，确定xa5PG1的表达模式(图1)。

研究发现，水稻品种日本晴中也具有序列相同的xa5PG1基因，该基因在接种PXO86小种后的日本晴中的表达模式与IR24相似，不受小种特异诱导上调。

实施例2、转基因植物的获得

一、重组表达载体的构建

1、提取水稻品种IRBB5的总RNA，反转录为cDNA。

2、以步骤1的cDNA为模板，用PG1-F和PG1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PG1-F：5′-ctctagaATGCCTCGCCGAGCTCCGCCAC-3′；

PG1-R：5′-cgtcgacCTATTCCAACGGCTGGGATCTAATC-3′。

PCR扩增体系(25μl)：10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP Mixture(2.5mM)2.5μl，KOD酶(5U/μl)0.2μl，PG1-F(10mM)0.25μl，PG1-R(10mM)0.25μl，模板(DNA)1μl，MgSO₄(25mM)1.6μl，DMSO 1.6μl，ddH₂O 15.1μl。

PCR扩增条件：先95℃预变性5min；然后95℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸1min，共30个循环；最后68℃延伸5分钟。

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，见图2。获得约600bp左右的条带。

回收PCR扩增产物与pEasy-Blunt载体(购于全式金公司)连接，得到重组质粒pEasy-PG1。重组质粒pEasy-PG1的测序结果表明，在peasy-Blunt载体中插入了序列表的序列2自5’末端第131至694位核苷酸所示的DNA(564bp)。

3、用限制性内切酶XbaI和SalI酶切步骤2中的pEasy-PG1质粒，回收约600bp的酶切产物。

4、用限制性内切酶XbaI和SalI酶切植物双元表达载体pZH01，回收载体骨架(约10000bp)。

5、将步骤3的酶切产物与步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pZH01-xa5PG1。根据测序鉴定，对重组质粒pZH01-xa5PG1的结构描述如下：在植物双元表达载体pZH01的XbaI和SalI酶切位点间插入了序列表的序列2自5’末端第131至694位核苷酸所示的DNA。重组质粒pZH01-xa5PG1的结构示意图见图3(外源DNA处于35S启动子控制下；骨架上具有潮霉素抗性基因)。

二、转基因植物的获得

利用农杆菌EHA105介导将重组质粒pZH01-xa5PG1导入到水稻品种TP309(转基因具体方法见Plant Molecular Biology，2003，52：957-966)，得到转基因水稻。共获得了6个T₀代转基因水稻株系(OE1、OE2、OE3、OE4、OE5和OE6)。

三、转空载体植物的获得

利用农杆菌EHA105介导，将植物双元表达载体pZH01导入到水稻品种TP309，得到转空载体水稻，作为转基因水稻的对照。共获得了8个T₀代转空载体水稻株系(CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7和CK8)。

四、转基因植物的分子水平鉴定

1、潮霉素抗性基因鉴定

将水稻品种TP309(TP309)，1个T₀代转空载体水稻株系(CK1)、6个T₀代转基因水稻株系(OE1、OE2、OE3、OE4、OE5和OE6)分别提取基因组DNA进行潮霉素抗性基因鉴定(采用HYGF和HYGR组成的引物对，靶序列约800bp)。

HYGF：5′-GACGGTGTCGTCCATCACAGTTT-3′；

HYGR：5′-ACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAA-3′。

鉴定结果见图4。6个T₀代转基因水稻株系和1个T₀代转空载体水稻株系都为阳性结果，水稻品种TP309为阴性结果。

2、xa5PG1基因鉴定

将水稻品种TP309(TP309)，1个T₀代转空载体水稻株系(CK1)、6个T₀代转基因水稻株系(OE1、OE2、OE3、OE4、OE5和OE6)分别提取总RNA，反转录为cDNA后进行xa5PG1基因表达分析(采用PG1-F和PG1-R组成的引物对，扩增靶序列约600bp)。以Actin为检测内参(采用ActinF和ActinR组成的引物对，靶序列约660bp)。

ActinF：5′-AGCAACTGGGATGATATGGA-3′；

ActinR：5′-CAGGGCGATGTAGG AAAGC-3′。

鉴定结果见图5。所有植株的内参基因均为阳性结果。6个T₀代转基因水稻株系的xa5PG1基因都为阳性结果，水稻品种TP309和T₀代转空载体水稻株系的xa5PG1基因为阴性结果。

五、转基因植物的抗病性(抗白叶枯病)鉴定

对水稻品种TP309(TP309)，水稻品种IRBB5(IRBB5)、8个T₀代转空载体水稻株系(CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7和CK8)、6个T₀代转基因水稻株系(OE1、OE2、OE3、OE4、OE5和OE6)的植株分别进行白叶枯病抗病性鉴定(接种方法参考“Testifying the rice bacterial blight resistance gene xa5 by geneticcomplementation and further analyzing xa5(Xa5)in comparison with its homologTFIIAgamma1”文章(Mol Genet Genomics.2006，275(4)：354-66))：在分蘖期用剪叶法在水稻的叶片上接种菲律宾小种PXO86，接种后7天到15天进行连续观察。

结果发现，6个转基因株系和水稻品种IRBB5具有显著的水稻白叶枯病抗性。水稻品种TP309和8个T₀代转空载体水稻株系具有明显的发病表型。接种15天后部分植物的照片见图6。

Claims

1.一种培育转基因植物的方法，是将xa5PG1蛋白的编码基因导入目的植物中，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物；

所述xa5PG1蛋白是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述抗病为抗白叶枯病；所述目的植物为水稻。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述xa5PG1蛋白的编码基因是序列表中序列2自5’末端第131至694位核苷酸所示的DNA分子。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述xa5PG1蛋白的编码基因通过重组表达载体导入所述目的植物中；所述重组表达载体为在植物双元表达载体pZH01的多克隆位点插入序列表的序列2自5’末端第131至694位核苷酸所示DNA得到的重组质粒。

4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述抗病为抗水稻白叶枯病菌菲律宾小种PXO86引起的病害。

5.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

6.编码权利要求5所述蛋白质的基因，是序列表中序列2自5’末端第131至694位核苷酸所示的DNA分子。

7.含有权利要求6所述基因的重组表达载体。

8.含有权利要求6所述基因的表达盒。

9.含有权利要求6所述基因的转基因细胞系。

10.含有权利要求6所述基因的重组菌。

11.权利要求5所述蛋白质或权利要求6所述基因在培育抗病植物中的应用；所述抗病为抗白叶枯病；所述植物为水稻。