CN104152454B - 来源于大豆的干旱诱导启动子GmMYB363P及其应用 - Google Patents
来源于大豆的干旱诱导启动子GmMYB363P及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104152454B CN104152454B CN201310174327.6A CN201310174327A CN104152454B CN 104152454 B CN104152454 B CN 104152454B CN 201310174327 A CN201310174327 A CN 201310174327A CN 104152454 B CN104152454 B CN 104152454B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gmmyb363p
- promoter
- dna molecular
- drought
- soybean
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 title claims abstract description 13
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 title claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 5
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001473 noxious effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 25
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 10
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 7
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 2
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 2
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 2
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 239000005712 elicitor Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000005213 imbibition Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229960003511 macrogol Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000005080 plant death Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000006965 reversible inhibition Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了来源于大豆的干旱诱导启动子GmMYB363P及其应用。GmMYB363P,是如下a)、b)或c)的DNA分子:a)核苷酸序列是SEQ?ID?No.1的DNA分子;b)与a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性,且具有启动子功能的DNA分子;c)在高严谨条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交,且具有启动子功能的DNA分子。GmMYB363P为干旱诱导型启动子。利用GmMYB363P可以使基因在干旱诱导条件下表达,因而避免了组成型启动子过量表达带来的负作用——产生大量的异源蛋白和有毒物质。
Description
技术领域
本发明涉及来源于大豆的干旱诱导启动子GmMYB363P及其应用。
背景技术
启动子(Promoter)是基因组基因的一个重要组成部分,它像“开关”一样,在转录水平上基本决定其控制下的编码基因是否表达、何时表达、何处表达和表达强度。一般根据启动子作用方式和功能将其大体可以分为三大类:组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子(Constitutivepromoter)是指能够驱使其控制下的编码基因在不同器官和/或组织大体恒定表达的一类启动子。它的特点是:受其控制的编码基因的表达具有持续性,但不具有时空特异性;RNA和蛋白质表达量相对恒定,不受外界因素的诱导。诱导型启动子(Induciblepromoter)是指能够响应某些特定的物理、化学和生物信号(统称为“诱导子”或“诱导因子”)而驱动其控制的编码基因大幅度地增加转录水平的一类启动子。诱导型启动子常常根据其诱导信号来分类和命名,例如:真菌诱导启动子、共生细菌诱导启动子、化学诱导启动子、金属离子诱导启动子、光诱导启动子、热诱导启动子和创伤诱导启动子等。器官和/或组织特异性启动子(Organ-and/orTissue-specificpromoter),能够驱使其控制下的编码基因仅仅在生物体的某一或某些特定的器官和/或组织,或者仅仅在生长发育的某一或某些特定阶段表达的一类基因。它的特征为,受其控制或调节的基因表达具有明显的时空性,并往往表现出发育调节的特性。例如,植物上的根特异性启动子、叶片特异性启动子、花特异性启动子、气孔特异性启动子、气孔绒毡层特异性启动子、花粉特异性启动子、果实特异性启动子、种子特异性启动子、胚乳特异性启动子、棉花纤维特异性启动子和韧皮部特异性启动子等等。
在自然环境中,植物生长在开放的系统中,经常会遇到冷、热、旱、涝、盐碱、大气污染等不良环境的影响。不良环境作用于植物,将会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应,表现为代谢和生长的可逆性抑制,严重时甚至引起不可逆伤害,导致整个植株死亡。在各种环境胁迫中,干旱、低温、高热和高盐等非生物胁迫对植物的影响尤为突出,表现为不同程度地对植物体内水分状况的影响,因此又成为水分胁迫,是制约植物生长和农作物产量的最主要非生物性逆境因子。植物在长期的进化中,逐渐形成了一系列应答逆境胁迫的生理、代谢以及防御系统。从植物中克隆非生物逆境诱导启动子将为提高植物对非生物胁迫的抗性奠定物质基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供植物受干旱诱导启动子。
本发明所提供的启动子,名称为GmMYB363P,来源于大豆,是如下a)、b)或c)的DNA分子:
a)核苷酸序列是SEQIDNo.1的DNA分子;
b)与a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性,且具有启动子功能的DNA分子;
c)在高严谨条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交,且具有启动子功能的DNA分子。
其中,SEQIDNo.1由1384个核苷酸组成。
上述75%或75%以上一致性,可为80%、85%、90%、95%以上的一致性。
所述高严谨条件是指,将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液,pH7.2,7%SDS)中,65℃预杂交30min;弃预杂交液,加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液,pH7.2,7%SDS,同位素标记的核苷酸片段),65℃杂交12hr;弃杂交液,加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液,pH7.2,5%SDS),65℃洗膜2次,每次30min;加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液,pH7.2,1%SDS),65℃洗膜30min。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法,例如定向进化和点突变的方法,对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的,具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸,只要保持了表达靶基因的启动子活性,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同源性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的启动子核苷酸序列具有优选地75%或更高,更优选地85%或更高,甚至更优选地90%或更高,以及最优选地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件,两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关序列之间的同源性。
含有GmMYB363P的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
所述含有GmMYB363P的表达盒,是指能够在宿主细胞中表达目的基因的DNA,该DNA不但包括启动所述目的基因的GmMYB363P,还可包括终止所述目的基因转录的终止子。进一步,所述表达盒还可包括增强子序列。所述转录终止子包括但不限于:农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见,例如:Odell等人(I985)Nature313:810;Rosenberg等人(1987)Gene,56:125;Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等人GenesDev.,5:141;Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261;Munroe等人(1990)Gene,91:151;Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891;Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。
所述的含有GmMYB363P的重组载体具体可为用SEQIDNo.1的第1-1384位所示的启动子GmMYB363P替换pCAMBIA-1301的HindⅢ和BglⅡ之间片段得到的GUS基因重组表达载体pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS。所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中,细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。所述的转基因细胞系不包括动物和植物的繁殖材料。
本发明中,携带有GmMYB363P的植物表达载体可通过使用包含但不限于Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。
扩增GmMYB363P全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
实验证明,GmMYB363P可在4%分子量为6000的聚乙二醇(PEG6000)水溶液模拟的干旱胁迫诱导下启动目的基因在的表达。
GmMYB363P可用于培育转基因植物,该转基因植物在干旱胁迫诱导下能增加目的基因的表达量。
上述应用中,所述植物可为单子叶植物或双子叶植物,如大豆。
所述转基因植物理解为不仅包含将目的基因转化目的植物得到的第一代转基因植物,也包括其子代。对于转基因植物,可以在该物种中繁殖该基因,也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种,特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明的GmMYB363P为干旱诱导型启动子。利用GmMYB363P可以使基因在干旱诱导条件下表达,因而避免了组成型启动子过量表达带来的负作用—产生大量的异源蛋白和有毒物质。本发明的GmMYB363P对通过目的基因在干旱胁迫下的高表达来提高转基因植物耐旱性有重要意义。
附图说明
图1为植物表达载体pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS示意图。
图中,GmMYB363promoter表示GmMYB363P。
图2为转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根在水中或4%PEG6000水溶液中培养12小时后的GUS染色图。
图2中,左图为转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根在水中培养12小时后的GUS染色图;右图为转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根在4%PEG6000水溶液中培养12小时后的GUS染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
大豆南农1138-2(由南京农业大学国家大豆改良中心提供,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得,以重复本申请的实验,记载在文献W.K.Zhang,Y.J.Wang,G.Z.Luo,J.S.Zhang,C.Y.He,X.L.Wu,J.Y.Gai,S.Y.Chen,QTLmappingoftenagronomictraitsonthesoybean(GlycinemaxL.Merr.)geneticmapandtheirassociationwithESTmarkers,Theor.Appl.Genet,2004,108:1131-1139)。
大豆科丰1号(GlycinemaxL.Merr.Kefeng1)记载在W.K.Zhang,Y.J.Wang,G.Z.Luo,J.S.Zhang,C.Y.He,X.L.Wu,J.Y.Gai,S.Y.Chen,QTLmappingoftenagronomictraitsonthesoybean(GlycinemaxL.Merr.)geneticmapandtheirassociationwithESTmarkers,Theor.Appl.Genet,2004,108:1131-1139中,公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得,以重复本申请的实验。
植物表达载体pCAMBIA-1301,记载于ZhengSJ,etal.,Molecularcharacterizationoftransgenicshallots(AlliumcepaL.)byadaptorligationPCR(AL-PCR)andsequencingofgenomicDNAflankingT-DNAborders,TransgenicRes.2001,10(3):237-45。
发根农杆菌K599记载在AttilaKereszt,etal.,Agrobacteriumrhizogenes-mediadedtransformationofsoybeantostudyofrootbiology,NatureProtocols,2007,2(4),549-552)中,公众可从PeterMGressnon教授,TheUniversityofQueensland,StLucia,Queensland4072,Australia获得,或经PeterMGressnon教授同意(书面同意书)后由中科院遗传与发育生物学研究所获得,以重复本申请的实验。
实施例1、干旱诱导启动子GmMYB363P的克隆及转基因载体的构建
一、干旱诱导启动子GmMYB363P的克隆
发明人将大豆南农1138-2基因组进行了99X测序和拼接,构建了基因组物理图谱。根据测序数据,获得了启动子GmMYB363P区域序列,据此,设计了启动子GmMYB363P序列的克隆引物,正向引物中含有HindⅢ识别序列,反向引物中含有BamHⅠ识别序列:
正向:5’-AAGCTTATCTACCACGGAGACAA-3’;
反向:5’-GGATCCGGATCTATCTTTGCCTT-3’。
用上述引物以大豆南农1138-2的基因组DNA为模板,扩增得到1384bp的扩增产物,将该PCR扩增产物与pMD18-T克隆载体连接后测序。将测序结果表明含有SEQIDNo.1的第1-1384位所示的DNA分子的重组载体命名为pMD18-T-GmMYB363P。其中,SEQIDNo.1由1384个核苷酸组成,为启动子GmMYB363P的核苷酸序列。
二、重组表达载体的构建
由于BamHⅠ的酶切识别位点为5’G^GATCC3’,而BglII的酶切识别位点为5’A^GATCT3’,因此上述两个酶切片段可连接。HindⅢ和BamHⅠ双酶切pMD18-T-GmMYB363P,回收GmMYB363P片段并与HindⅢ和BglII酶切后的pCAMBIA-1301(GenBank:AF234297.1)植物表达载体连接,得到由启动子GmMYB363P启动GUS基因转录的重组表达载体pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS。经测序证实,pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS为用SEQIDNo.1的第1-1384位所示的启动子GmMYB363P替换pCAMBIA-1301的HindⅢ和BglII之间片段得到的GUS基因重组表达载体。
实施例2、利用启动子GmMYB363P培育转基因大豆
运用发根农杆菌介导转基因毛状根方法,将pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS转化到发根农杆菌K599中。
发根农杆菌侵染法根据AttilaKereszt等方法(AttilaKereszt,etal.,Agrobacteriumrhizogenes-mediadedtransformationofsoybeantostudyofrootbiology,NatureProtocols,2007,2(4),549-552)进行,该方法获得的新生毛状根多于96%均为转基因毛状根。
具体操作如下:
1)首先将含有GUS基因的pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS,通过电击法导入发根农杆菌K599中,得到重组农杆菌。提取重组农杆菌的质粒,用PCR方法鉴定重组农杆菌中所含启动子GmMYB363P,所用引物为
正向:5’-AAGCTTATCTACCACGGAGACAA-3’;
反向:5’-GGATCCGGATCTATCTTTGCCTT-3’。
将鉴定结果表明含有SEQIDNo.1的第1-1384位所示的启动子GmMYB363P的重组农杆菌命名为K599/GmMYB363P。
2)大豆科丰1号种子播种于蛭石中,待长出2片真叶待用。
3)在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基中划线活化K599/GmMYB363P,挑单菌落在含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中摇菌过夜,得到K599/GmMYB363P发根农杆菌菌液。
4)用步骤3)得到的K599/GmMYB363P发根农杆菌菌液,用注射器接种6天含两片真叶的步骤2)获得的大豆幼苗,保湿生长:光照16小时,温度25℃,湿度50%。2周后,长出毛状根。
当毛状根长度为5-10厘米时,剪去老根,新的毛状根即为转化的根,可进一步用于鉴定。
将新的转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根分为两组,每组10根,一组置于水中培养,一组置于4%PEG6000水溶液中,12小时后分别进行GUS染色。将毛状根直接放在下列染色液:50mMNaPO4pH7.2水溶液,2mMX-gluc,0.5mMK3Fe(CN)6,and0.5mMK4Fe(CN)6中,37℃过夜,毛状根经系列浓度70、50、30%乙醇洗(脱色),之后放在重蒸水中,观察,结果如图2所示,可以看出,经GUS染色表明在水中培养12小时的转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根显示GUS染色较浅,表明GmMYB363P启动子驱动GUS基因的表达较弱;而在4%PEG6000水溶液处理12小时后,GmMYB363P启动子受诱导,驱动GUS基因的表达,因此转基因毛状根经染色后呈现明显的深蓝色。按照Cote等方法(CoteCetal.,AnimprovedMUGfluorescentassayforthedeterminationoftheGUSactivitywithintransgenictissueofwoodyplants,PlantCellRep.,2003,21(6),619-624)对水中培养12小时的转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根和在4%PEG6000水溶液处理12小时的转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根进行GUS基因表达的荧光定量分析,结果显示在4%PEG6000水溶液培养12小时的转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根的GUS活性值为287±20nmol4-MUmin-1mg-1蛋白,水中培养12小时的转pCAMBIA-1301-GmMYB363P–GUS毛状根的GUS活性值为64±13nmol4-MUmin-1mg-1蛋白,GUS基因的表达在PEG模拟的干旱胁迫情况下是水中(正常情况)的4.5倍。上述结果表明启动子GmMYB363P受干旱诱导。
聚乙二醇6000(PEG6000)是亲水性大分子,具有很强的吸水性,可以使植物失水,造成干旱胁迫。所以本实施例采用PEG6000来模拟干旱。
Claims (7)
1.核苷酸序列是SEQIDNo.1的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。
3.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体,或含有权利要求2所述表达盒的重组载体。
4.含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物、含有权利要求2所述表达盒的重组微生物、或含有权利要求3所述重组载体的重组微生物。
5.含有权利要求1所述DNA分子的转基因细胞系、含有权利要求2所述表达盒的转基因细胞系、或含有权利要求3所述重组载体的转基因细胞系。
6.权利要求1所述的DNA分子在干旱胁迫诱导下启动目的基因在大豆中表达的应用。
7.权利要求1所述的DNA分子在培育转基因大豆中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310174327.6A CN104152454B (zh) | 2013-05-13 | 2013-05-13 | 来源于大豆的干旱诱导启动子GmMYB363P及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310174327.6A CN104152454B (zh) | 2013-05-13 | 2013-05-13 | 来源于大豆的干旱诱导启动子GmMYB363P及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104152454A CN104152454A (zh) | 2014-11-19 |
CN104152454B true CN104152454B (zh) | 2016-05-25 |
Family
ID=51878081
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310174327.6A Expired - Fee Related CN104152454B (zh) | 2013-05-13 | 2013-05-13 | 来源于大豆的干旱诱导启动子GmMYB363P及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104152454B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US12031140B2 (en) | 2019-11-25 | 2024-07-09 | Syngenta Crop Protection Ag | Glycine regulatory elements and uses thereof |
CN113462689B (zh) * | 2021-07-02 | 2022-06-21 | 河南大学 | 大豆基因启动子pEIF1和pEIF1-I在大豆、拟南芥及烟草中的应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101050461A (zh) * | 2007-04-02 | 2007-10-10 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 来源于拟南芥的与耐逆性相关的转录因子及其编码基因与应用 |
WO2011002945A1 (en) * | 2009-06-30 | 2011-01-06 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean transcription factors and other genes and methods of their use |
-
2013
- 2013-05-13 CN CN201310174327.6A patent/CN104152454B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101050461A (zh) * | 2007-04-02 | 2007-10-10 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 来源于拟南芥的与耐逆性相关的转录因子及其编码基因与应用 |
WO2011002945A1 (en) * | 2009-06-30 | 2011-01-06 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean transcription factors and other genes and methods of their use |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
GBrowse Details:Glyma.01g224900;Schmutz J,et al.;《SoyBase and the Soybean Breeder’s Toolbox》;20100114;Details部分 * |
Glycine max genome assembly version Glyma.Wm82.a2(Gmax2.0);Schmutz J,et al.;《Glycine max Wm82.a2.v1》;20100114;全文 * |
玉米胁迫相关基因的启动子克隆和多基因表达载体的构建;官赟赟;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑,2010年第9期》;20100915;正文第40页最后一段 * |
高等植物启动子的研究进展;王颖等;《西北植物学报》;20031231;全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104152454A (zh) | 2014-11-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105037521B (zh) | 一种与植物抗逆性相关蛋白TaWrky48及其编码基因与应用 | |
WO2006066193A2 (en) | Root active promoters and uses thereof | |
CN109266650B (zh) | 一种诱导型启动子、其重组载体、转化体以及诱导基因表达的方法及其应用 | |
CN103275983B (zh) | 一个逆境诱导表达的基因启动子及其应用 | |
CN107099535A (zh) | 一种受低温、高盐、干旱或aba诱导的启动子hlp4 | |
CN102712929B (zh) | 植物根特异表达启动子的鉴定和应用 | |
CN102234647B (zh) | 一个水稻逆境诱导启动子kt619p的鉴定和应用 | |
CN107012147A (zh) | 一种来源于番茄的干旱和/或高盐诱导启动子SlWRKY8P及其应用 | |
CN110229818A (zh) | 蜡梅CpSNAC1基因启动子及其应用 | |
CN103290014B (zh) | 一个逆境诱导表达的基因启动子及其应用 | |
JP7123803B2 (ja) | 植物調節エレメント及びその使用法 | |
CN104152454B (zh) | 来源于大豆的干旱诱导启动子GmMYB363P及其应用 | |
CN103667296B (zh) | 一个组成型表达启动子及其应用 | |
CN105585623B (zh) | 抗病转TaMYB-KW基因小麦的培育方法及相关生物材料与应用 | |
WO2006066168A2 (en) | Drought responsive promoters and uses thereof | |
CN104630228B (zh) | 棉花热激转录因子基因GhHsf39的启动子及其应用 | |
CN103588867B (zh) | 大豆转录因子GmMYB174a及其编码基因与应用 | |
CN110734910B (zh) | 胚珠特异启动子PMEI_d及其应用 | |
CN107058324A (zh) | 水稻根特异表达启动子POsRO4及相应水稻培育方法 | |
CN101182530B (zh) | 一种诱导增强性组成型启动子及其应用 | |
CN109504680B (zh) | 盐胁迫诱导型启动子及其引物、表达载体和应用 | |
CN106399312B (zh) | 一种诱导启动子NtPCS1P及其应用 | |
CN103757025B (zh) | 一个逆境诱导表达的启动子及其应用 | |
CN117660451B (zh) | 一种紫花苜蓿根尖特异启动子及其应用 | |
CN102690838A (zh) | OsMADS57蛋白或其编码基因在促进水稻分蘖中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160525 Termination date: 20190513 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |