CN113462689B

CN113462689B - 大豆基因启动子pEIF1和pEIF1-I在大豆、拟南芥及烟草中的应用

Info

Publication number: CN113462689B
Application number: CN202110748303.1A
Authority: CN
Inventors: 王学路; 王海娇; 彭亚齐
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2021-07-02
Filing date: 2021-07-02
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2041-07-02
Also published as: BR112023010403A2; CN113462689A; WO2023273420A1; US20230250442A1

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及大豆基因启动子pEIF1和pEIF1‑I在大豆、拟南芥及烟草中的应用。本发明从大豆中克隆了基因RPS28和基因EIF1；通过CTAB法获取启动子pEIF1和启动子pEIF1‑I，然后构建大豆稳定转化载体，并实现pEIF1和pEIF1‑I驱动的GUS蛋白在大豆遗传转化各阶段的表达，发现pEIF1、pEIF1‑I驱动的GUS在子叶、胚根、胚芽、真叶、复叶、芽、叶柄、节间、根和根瘤中均有表达，表明pEIF1和pEIF1‑ I是泛表达启动子，并对GUS蛋白在大豆中表达产物的活性进行了测定。另外，还实现了pEIF1和pEIF1‑I驱动GUS蛋白在拟南芥和烟草转化中的转化。

Description

大豆基因启动子pEIF1和pEIF1-I在大豆、拟南芥及烟草中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及大豆基因启动子pEIF1和pEIF1-I在大豆、拟南芥及烟草中的应用。

背景技术

启动子是调控植物基因表达的重要组成部分。按照来源，启动子可以分为外源启动子和内源启动子。外源启动子可以异源调控基因的表达，但是在制备转基因材料时往往会出现转基因安全问题，尤其是常用的来源于病毒的启动子，如烟草花叶病毒35S启动子。此外，在同一个转基因事件中使用同一个启动子还有可能发生转基因沉默现象。因此，内源启动子是制备转基因材料更加受到青睐的启动子。按照表达特征，启动子分为组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子等。其中组成型启动子调控的表达不受组织特异性、时空等的影响。在制备一些转基因材料时，组成型启动子驱动的基因表达会更加稳定。

大豆是重要的油料作物和蛋白质作物，并且能够与根瘤菌共生，形成根瘤，将空气中的氮气转化为可供植物利用的氨。通过根瘤固氮，大豆不但可以为自己提供氮源，还可以通过间作、轮作的方式为其他作物提供氮源，进而减少化肥施用，建立绿色生态型农业系统。但是大豆的产量一直很低，通过转基因手段获得性状优良、产量高的大豆品种是未来大豆研究的重要方向之一。除了外源的病毒启动子，如35S启动子、CMV启动子等用于大豆的转化外，一些内源启动子也被陆续报道，这些内源启动子包括高表达和泛表达的组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子等，其中组成型启动子是指在生长发育的不同阶段、不同组织、不同生长条件都能够驱动基因稳定表达的启动子。

已经报道的大豆组成型启动子中，Gmubi启动子由于较高的表达量使其成为目前应用比较广泛的启动子。此外，在筛选手段方面，已经报道的组成型启动子的筛选条件大都不完善，大部分启动子都是根据大豆生长发育的单一时期的组织表达得到的，而在大豆根瘤发育过程中组成型表达的启动子几乎没有报道。在筛选技术上，大部分报道的启动子是通过传统的qRT-PCR方法检测的，通过高通量的RNA测序方法检测表达水平的报道并不多。文献（Ning Zhang,Leah K. McHale,John J. Finer. Isolation and characterizationof “GmScream” promoters that regulate highly expressing soybean (Glycine maxMerr.) genes[J]. Plant Science,2015,241.）根据来源于大豆品系Williams82（WS82）的31个文库的RNA测序数据筛选到了10个可能的组成型启动子的表达基因，但是其中并没有涉及一个大豆生长发育的连续过程及根瘤发育中的表达情况。同时，在同一株植物中转入多个基因时，如果用同一个启动子驱动容易造成基因沉默。

因此，开发在大豆不同发育时期和组织及根瘤发育过程中泛表达的启动子对大豆转基因工程的应用非常重要。

发明内容

本发明的目的在于获得用于分析大豆生长发育不同时期、不同组织中表达情况，及根瘤发育情况的内参基因RPS28和EIF1，并同时获得其启动子pRPS28和pEIF1。

本发明的另一个目的是提供启动子pRPS28、启动子pEIF1在调控大豆基因或其他植物（例如烟草、拟南芥）基因的组成型、或者非组织特异性表达中的应用，具体为实现全长型启动子pRPS28及内含子存在型启动子pRPS28-I，全长型启动子pEIF1及内含子存在型启动子pEIF1-I分别驱动目的基因在大豆、拟南芥、烟草中的高表达和泛表达。

为了实现上述目的，本发明首先提供了大豆基因启动子在外源基因表达中的应用。

所述启动子包括全长型启动子pRPS28或内含子存在型启动子pRPS28-I，全长型启动子pEIF1或内含子存在型启动子pEIF1-I，所述启动子作为泛表达启动子，用于驱动外源基因表达。

所述外源基因为GUS基因。

上述大豆基因启动子在用于大豆基因表达时，能够驱动外源基因在大豆子叶、胚根、胚芽、真叶、复叶、芽、叶柄、节间、根和根瘤中表达。

上述大豆基因启动子在用于拟南芥基因表达时，能够驱动外源基因在拟南芥全株、花、荚果中表达。

上述大豆基因启动子在用于烟草基因表达时，能够驱动外源基因在烟草叶片中表达。

进一步的，本发明还提供了一种含有大豆基因启动子的重组载体。

所述重组载体在构建时，将大豆基因启动子重组进入载体pCAMBIA1391Z-BAR中构建获得，具体步骤如下：以pRPS28、pRPS28-I、pEIF1、pEIF1-I的PCR扩增片段为模板，并将PCR扩增片段克隆进大豆稳定转化载体pCAMBIA1391Z-BAR中，获得大豆稳定转化载体pRPS28-GUS-BAR、pRPS28-I-GUS-BAR、pEIF1-GUS-BAR、pEIF1-I-GUS-BAR。

进一步的，本发明还提供了PCR扩增大豆RPS28基因和EIF1基因用引物对。

具体为，扩增RPS28的引物：

RPS28-F：ATGGAGTCTCAGGTGAAGCAC

RPS28-R：CTAGCGCAATCTTCTTGCTTC

扩增EIF1的引物：

EIF1-F：ATGTCTGAATTAGACGATCAAATTCC

EIF1-R：TCAGAAACCATGAATCTTGATATGATC。

进一步的，本发明还提供了PCR扩增大豆基因启动子的引物对。

构建pRPS28-GUS表达载体所用引物为：pRPS28-GUS-bar-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTTCACCACCCAATCCATAACCACCAC

pRPS28-GUS-bar-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCCCTGATGCAAAACACGAACAAAGAAAG

构建pRPS28-I-GUS表达载体所用引物为：

pRPS28-I-GUS-bar-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTTCACCACCCAATCCATAACCACCAC

pRPS28-I-GUS-bar-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCC CCTGCTCAAACACAATCAACAG

构建pEIF1-GUS表达载体所用引物为：pEIF1-GUS-bar-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTT GGAGAGAAGTTGAACTCTGAGTTGTG

pEIF1-GUS-bar-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCC CTGATCGTAAATTTAAGGTTTCG

构建pEIF1-I-GUS表达载体所用引物为：

pEIF1-I-GUS-bar-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTT GGAGAGAAGTTGAACTCTGAGTTGTG

pEIF-I-GUS-bar-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCC AAAACTTGACTCACTAAGACCAAAGG。

本发明通过上述方法获得了启动子pRPS28的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，启动子pRPS28-I的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明通过上述方法获得了启动子pEIF1的核苷酸序列，如SEQ ID NO.5所示，以及启动子pEIF1-I的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6所示。

本发明进一步提供了全长型启动子pRPS28及内含子存在型启动子pRPS28-I在提高外源基因在大豆中表达活性的应用。

本发明进一步提供了全长型启动子pEIF1及内含子存在型启动子pEIF1-I在提高外源基因在大豆中表达活性的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过RPS28基因、EIF1基因在大豆生长发育的不同时期、不同组织的RNA测序分析，以及在接种根瘤菌前后相对应的不同时期、不同组织的RNA测序分析，发现都有较高的、及组成型的表达。本发明涉及的发育时期包括：地上部分萌发后8天或地下部分萌发后8天，并接种慢生型根瘤菌USDA110的发育情况，在现有报道的大豆启动子中，本发明首次对多种组织的发育情况进行了研究，同时比较了根瘤菌处理对各个组织的影响。

本发明pRPS28启动子和pEIF1启动子在大豆稳定转化植株中各个组织部位（包括根瘤中）能够驱动目的基因实现组成型表达。

本发明的pRPS28启动子驱动GUS在大豆稳定转化植株中的活性与现有的GmUbi启动子相当。与现有的GmUbi启动子相比，pEIF1启动子的intron对启动子驱动性能贡献很大，本发明的pEIF-I启动子驱动GUS在大豆稳定转化植株中的活性与现有的GmUbi启动子相当。

附图说明

图1为RPS28基因在大豆生长发育和根瘤发育过程中的表达分析；

图2为EIF1基因在大豆生长发育和根瘤发育过程中的表达分析；

图3为启动子pRPS28和启动子pEIF1的表达载体的结构示意图；

图4为启动子pRPS28和启动子pEIF1驱动GUS在大豆稳定转化过程中的活性检测；

图5为启动子pRPS28驱动GUS在转基因大豆T2代植株不同部位中的表达情况，；

图6为启动子pEIF1驱动GUS在转基因大豆T2代植株不同部位中的表达情况；

图7为pRPS28启动子、pRPS28-I启动子、pEIF1启动子、pEIF1-I启动子与pGmUbi启动子分别驱动GUS蛋白在转基因大豆中GUS的活性检测结果；

图8为pRPS28启动子、pRPS28-I启动子与pGmUbi启动子分别驱动GUS蛋白在转基因拟南芥T3代植株不同部位中的表达情况；

图9为pEIF1启动子、pEIF1-I启动子与pGmUbi启动子分别驱动GUS蛋白在转基因拟南芥T3代植株不同部位中的表达情况；

图10为pRPS28启动子、pEIF1启动子分别驱动GUS蛋白在转基因烟草叶片的瞬时表达情况。

具体实施方式

本发明从大豆中克隆了基因RPS28及基因EIF1；通过CTAB法获取启动子pRPS28和启动子pEIF1，然后构建pRPS28-GUS、pRPS28-I-GUS、pEIF1-GUS、pEIF1-I-GUS启动子大豆稳定转化载体，并实现pRPS28和pEIF1驱动的GUS蛋白在大豆遗传转化各阶段的表达，发现pRPS28、pRPS28-I、pEIF1、pEIF1-I驱动的GUS在子叶、胚根、胚芽、真叶、复叶、芽、叶柄、节间、根和根瘤中均有表达，表明pRPS28和pEIF1是泛表达启动子，并对GUS蛋白在大豆中表达产物的活性进行了测定。另外，还实现了pRPS28和pEIF1驱动GUS蛋白在拟南芥和烟草中表达。

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或生物材料，如未特别说明，均已公开。

实施例

一、RPS28基因和EIF1基因的筛选

选取大豆品种--冀豆17作为材料，播种后，待真叶展开（播种后8 d）时接种慢生型根瘤菌USDA110，接菌后1、2、4、6、8、10、15、20、25和30 d时分别选取根、根瘤、下胚轴、子叶、上胚轴、真叶、真叶节、复叶、节间、叶柄和顶芽等样品，同时在所选大豆品种的RNA-seq数据中进行筛选，提取RNA做RNA测序，RNA提取和测序方法采用现有技术即可，且不是本发明的发明点所在，故不再赘述。并根据以下条件进行了筛选：

1、根据本实验大豆RNA-seq数据，分析在各个时期、各个组织部位均有表达的基因，根据其FPKM值从大到小排序，挑选排名靠前的20个大豆泛表达基因为候选基因。

2、将这些候选基因的RNA测序数据作图，挑选各个时期、组织部位表达量波动不大，且不受接种根瘤菌影响（变异系数CV≤0.3）的10个基因作为进一步分析的候选基因。

3、然后用这10个大豆泛表达候选基因，以本实验大豆整合转录组数据中的表达量作图，挑选不易受环境影响的两个基因，并分析它们的启动子序列，以及进一步的表达分析相关研究。

筛选到一个编码核糖体40S小亚基蛋白S28的基因，将其命名为RPS28，并获得cDNA序列如SEQ ID NO.1所示；筛选到一个编码真核生物翻译起始因子SUI1的基因，将其命名为EIF1，并获得cDNA序列如SEQ ID NO.4所示。

根据基因RPS28和EIF1的表达量的结果显示，这两个基因在大豆真叶展开后1 d ~30 d内各个组织部位均有高表达，且接种根瘤菌前后表达量影响不大（图1和图2所示）。

图1为RPS28基因在大豆生长发育和根瘤发育过程中的表达分析。其中图1a-b是RPS28基因在大豆真叶展开后接种根瘤菌和不接种根瘤菌1、4、6、8、10和20天取样，通过RNA-Seq检测RPS28基因在下胚轴、子叶、上胚轴、真叶、真叶节、复叶、节间、叶柄和顶芽等组织部位的表达量，发现RPS28基因在检测的各个组织部位均稳定且高表达，接种根瘤菌对其表达量影响不大。1c图是RPS28基因在大豆真叶展开后接种根瘤菌和不接种根瘤菌1、2、4、6、8、10、15、20、25和30天取样，通过RNA-Seq检测RPS28基因在根和根瘤发育中的表达，发现RPS28基因在根和根瘤中稳定且高表达。

图2为EIF1基因在大豆生长发育和根瘤发育过程中的表达分析。其中图2a-b图是EIF1基因在大豆真叶展开后接种根瘤菌和不接种根瘤菌1、4、6、8、10和20天取样，通过RNA-Seq检测EIF1基因在下胚轴、子叶、上胚轴、真叶、真叶节、复叶、节间、叶柄和顶芽等组织部位的表达量，发现EIF1基因在检测的各个组织部位均稳定且高表达，接种根瘤菌对其表达量影响不大。2c图是EIF1基因在大豆真叶展开后接种根瘤菌和不接种根瘤菌1、2、4、6、8、10、15、20、25和30天取样，通过RNA-Seq检测RPS28基因在根和根瘤发育中的表达，发现EIF1基因在根和根瘤中稳定且高表达。

二、启动子pRPS28和启动子pEIF1的获得

根据试验一、的筛选结果，发现RPS28和EIF1这两个基因的基因组序列及转录起始位点上游分别2357bp（RPS28）和1640bp（EIF1）的启动子序列，分析发现这两个基因（RPS28和EIF1）的翻译起始密码子ATG与5’UTR之间具有内含子。因此我们设计两种启动子形式，一种全长型启动子，一种内含子存在型启动子，分别命名为pRPS28、pRPS28-I，以及pEIF1、pEIF1-I。

采用CTAB法提取的大豆DNA为模板，扩增RPS28片段和RPS28-I片段；扩增pEIF1片段和pEIF1-I片段。具体的扩增体系及引物设计如下：

反应体系的总体积为50μl，模板为大豆品系Williams82 （WS82）的基因组DNA 1μl(约100ng)、2×phanta MAX fertility酶反应缓冲液25μl、10mM dNTP 1μl、4 μM引物 5μl（每条引物浓度为10mM，均为2 μl）、1μl phanta MAX fertility酶，加ddH₂O（无菌去离子水）至50μl。

反应程序为：94℃变性2min，94℃ 10 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，30cycles，72℃延伸5min。

所述引物为：

扩增RPS28基因片段的引物：

F：ATGGAGTCTCAGGTGAAGCAC

R：CTAGCGCAATCTTCTTGCTTC

扩增EIF1基因片段的引物：

F：ATGTCTGAATTAGACGATCAAATTCC

R：TCAGAAACCATGAATCTTGATATGATC

扩增pRPS28的引物：

pRPS28-F：CACCACCCAATCCATAACCACCAC

pRPS28-R：CTGATGCAAAACACGAACAAAGAAAG

最终获得的DNA序列见SEQ ID NO.2

扩增pRPS28-I的引物：

pRPS28-I-F：CACCACCCAATCCATAACCACCAC

pRPS28-I-R：CCTGCTCAAACACAATCAACAG

最终获得的DNA序列见SEQ ID NO.3

扩增pEIF1的引物：

pEIF1-F: GGAGAGAAGTTGAACTCTGAGTTGTG

pEIF1-R: CTGATCGTAAATTTAAGGTTTCG

最终获得的DNA序列见SEQ ID NO.5

扩增pEIF1-I的引物：

pEIF1-I -F: GGAGAGAAGTTGAACTCTGAGTTGTG

pEIF1-I-R: AAAACTTGACTCACTAAGACCAAAGG

最终获得的DNA序列见SEQ ID NO.6

三、启动子pRPS28和启动子pEIF1在大豆中的稳定遗传转化

pRPS28和pEIF1驱动的GUS蛋白在大豆稳定遗传转化各阶段都有表达，包括共培养、芽诱导、芽伸长等过程，本试验构建pRPS28-GUS、pRPS28-I-GUS、pEIF1-GUS、pEIF1-I-GUS大豆稳定转化载体，同时构建pGmUbi-GUS大豆稳定转化载体作为对照组，所构建的表达载体的结构如图3所示。具体的试验步骤为：

1、大豆稳定转化载体的构建

以试验二、中得到的pRPS28、pRPS28-I、pEIF1、pEIF1-I的PCR扩增片段为模板，并将上述PCR产物片段通过无缝克隆法克隆进大豆稳定转化载体pCAMBIA1391Z-BAR中，获得大豆稳定转化载体pRPS28-GUS-BAR、pRPS28-I-GUS-BAR、pEIF1-GUS-BAR、pEIF1-I-GUS-BAR、pGmUbi-GUS-BAR，并转入大豆品系WS82中。

具体的扩增体系及引物设计如下：

反应体系的总体积为50μl，模板（上述扩增的DNA片段）1μl (约100ng)、2×phantaMAX fertility酶反应缓冲液25μl、10mM dNTP 1μl、4 μM引物 5μl（每条引物浓度为10mM，均为2 μl）、1μl phanta MAX fertility酶，加ddH₂O（无菌去离子水）至50μl。

构建pRPS28-GUS表达载体所用引物为：

pRPS28-GUS-bar-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTTCACCACCCAATCCATAACCACCAC

pRPS28-GUS-bar-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCCCTGATGCAAAACACGAACAAAGAAAG

构建pRPS28-I-GUS表达载体所用引物为：

pRPS28-I-GUS-bar-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTTCACCACCCAATCCATAACCACCAC

pRPS28-I-GUS-bar-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCC CCTGCTCAAACACAATCAACAG

构建pEIF1-GUS表达载体所用引物为：

pEIF1-GUS-bar-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTT GGAGAGAAGTTGAACTCTGAGTTGTG

pEIF1-GUS-bar-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCC CTGATCGTAAATTTAAGGTTTCG

构建pEIF1-I-GUS表达载体所用引物为：

pEIF1-I-GUS-bar-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTT GGAGAGAAGTTGAACTCTGAGTTGTG

pEIF-I-GUS-bar-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCC AAAACTTGACTCACTAAGACCAAAGG

构建pGmUbi-GUS表达载体所用引物为：

pGmUbi-GUS-bar-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTT GGGCCCAATATAACAACGAC

pGmUbi-GUS-bar-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCC ctgtcgagtcaacaatcaca

本发明中所使用的转化载体pCAMBIA1391Z-BAR是将商业化市售的pCAMBIA1391Z载体，首先采用限制性内切酶XhoI将载体线性化，然后再通过无缝克隆的方法将其中的筛选标记HygR基因替换为BAR基因实现的，具体的，替换筛选标记基因时采用的引物序列为pCAMBIA1391Z-BAR-F：TACAAATCTATCTCTCTCGAGatgagcccagaacgacgcccg，pCAMBIA1391Z-BAR-R：CATTATTATGGAGAAACTCGAGTCAGATCTCGGTGACGGGCAGGAC。

本发明所使用的无缝克隆的方法采用本领域的常规手段实现即可，且不是本发明的发明点所在，故不再赘述。

2、大豆遗传转化及遗传转化中的GUS染色

具体的，将得到的启动子驱动GUS的大豆稳定转化载体转入大豆品系WS82中的方法均采用农杆菌EHA105介导的大豆子叶节转化法，具体方法参考文献（Luth D, WarnbergK, Wang K. Soybean [Glycine max (L.) Merr]. Methods Mol Biol. 2015;1223:275-84. doi: 10.1007/978-1-4939-1695-5_22. PMID: 25300848.)中的转化方法，同时本试验在此基础上作了适应性改进，具体步骤如下：

大豆种子灭菌及萌发：挑取无破损、无病斑的大豆种子用氯气灭菌（量取100 ml次氯酸钠置入250ml烧杯中，沿杯壁缓缓加入5ml浓盐酸，即产生氯气，密封灭菌16小时）。将灭过菌的大豆种子放置于萌发培养基中，放置于22℃培养箱中暗培养16~24小时使其萌发。

农杆菌的活化和侵染液的制备：将pRPS28-GUS-BAR、pRPS28-I-GUS-BAR、pEIF1-GUS-BAR、pEIF1-I-GUS-BAR、pGmUbi-GUS-BAR表达载体通过电激法转化到农杆菌EHA105中，并在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上生长。取单个阳性克隆到6mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，于28℃，摇床转速220rpm条件下过夜培养。取250μl的菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体平板上，28℃培养过夜。用一次性接种环刮取菌膜，垂悬于液体共培养基里，用分光光度计测定菌液浓度，使终浓度OD₆₀₀ = 0.5~0.6。

外植体准备和侵染：保留萌发后种子3~5mm长的下胚轴，分离两片子叶，去除种皮，切除初生芽后，用刀片在子叶节部位划几刀，得到用于转化的子叶节外植体。将其置于侵染液中，于水平旋转仪上振荡（转速50~80r/min）侵染30min。

共培养：倒掉菌液，将外植体转移至铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，每皿15~20个，22℃培养箱中暗培养3~5天，取外植体进行GUS染色。

筛选培养和植株再生（具体的培养基以及培养条件参见文献Luth D, WarnbergK, Wang K. Soybean [Glycine max (L.) Merr]. Methods Mol Biol. 2015;1223:275-84. doi: 10.1007/978-1-4939-1695-5_22. PMID: 25300848.）：芽诱导培养：共培养3~5天之后，将外植体转移至芽诱导培养基中，每皿放5个外植体，光周期16/8小时（光照/黑暗）、25℃条件下培养，每2周继代一次，继代2次。对长出芽的外植体进行GUS染色。芽伸长培养：除去死芽，切掉子叶部分，将外植体转移至芽伸长培养基中，每皿放5个外植体，光周期16/8 小时（光照/黑暗）、25℃条件下培养，每3周继代一次，继代2~4次。取外植体进行GUS染色。生根诱导：当伸长苗长至3cm长之后，切下转移至根诱导培养基中，光周期16/8 小时（光照/黑暗）、25℃条件下培养。

如图4所示，为启动子pRPS28和启动子pEIF1分别驱动GUS在大豆遗传转化组织培养阶段的表达情况，图中分为共培养（a）、芽诱导2周（b）、芽诱导4周（c）、芽伸长（d）阶段的结果，图4的结果说明启动子pRPS28和启动子pEIF1分别驱动的GUS蛋白在大豆遗传转化阶段有表达。

炼苗及移栽培养：当再生植株生根并长出两片以上复叶后，取出植株，洗净根部的培养基，栽入盛有灭菌蛭石的小花盆中，在人工智能培养箱（温度25℃，光周期16/8小时，相对湿度85%RH，光照强度90 μM/m²/s）炼苗5~7天。待壮苗之后将其移栽到大花盆（营养土：蛭石=1:1）中，移至培养室（温度28±2℃，光周期13.5/10.5h，相对湿度40%~60%RH，光照强度90μM/m²/s）中生长至成熟。

利用转基因T1代再生植株对植株进行鉴定：取T1代转基因大豆植株的叶片提取DNA，利用BAR基因对T1代的全部植株进行PCR扩增，挑选能扩增出BAR特异条带的单株即为转基因成功植株。

PCR体系和反应条件：反应体系的总体积为10μl，模板（上述T1代植株DNA片段）0.5-1μl、2×taq mix反应液5μl、引物 0.5μl（BAR-F和BAR-R均为0.25 μl），加ddH₂O（无菌去离子水）至10μl。反应程序为94℃变性2min，94℃ 10 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，30cycles，72℃延伸5min。

所用引物如下：

BAR-F: ATGAGCCCAGAACGACGCCCGGCC

BAR-R: TTAGATCTCGGTGACGGGCAGGAC

最终获得的BAR 基因序列如SEQ ID NO.7所示

3、GUS染色结果测定

上述方法获得的稳定转化植株，得到纯合植株后，在生长后5天和15天取样，进行GUS染色分析。具体的染色方法为：丙酮固定30 ~ 60 min，后弃去丙酮，加入GUS染液缓冲液洗去样品表面残留的丙酮，加适量GUS工作液（GUS buffer﹢1 mg/L X-GLuc），遮光处理下抽真空30 ~ 60 min，37℃遮光处理4 ~ 8 h，加入75%酒精脱色，对染色结果进行拍照观察。

如图5所示，为启动子pRPS28驱动GUS在转基因大豆T2代植株不同部位中的表达情况，a为卷纸萌发5d的大豆，b为胚芽，c为生长15d的大豆植株，d为生长15d植株的真叶、复叶、芽、叶柄、节间，e为根和根瘤，f为未成熟的胚，g为荚果。

图6为启动子pEIF1驱动GUS在转基因大豆T2代植株不同部位中的表达情况，a为卷纸萌发5d的大豆，b为胚芽，c为生长15d的大豆植株，d为生长15d植株的真叶、复叶、芽、叶柄、节间，e为根和根瘤，f为未成熟的胚，g为荚果。

上述转基因方法获得的植株在萌发后5天，发现pRPS28、pRPS28-I、pEIF1、pEIF1-I驱动的GUS在子叶、胚根、胚芽处均有表达；15天后，发现pRPS28、pRPS28-I、pEIF1、pEIF1-I驱动的GUS在真叶、复叶、芽、叶柄、节间、根和根瘤中均有表达，并发现pRPS28、pRPS28-I、pEIF1、pEIF1-I驱动的GUS在未成熟的胚、鼓粒期荚果和种子中均有表达。以上结果表明pRPS28和pEIF1是泛表达启动子。

4、pRPS28启动子、pEIF1启动子与pGmUbi启动子分别驱动GUS蛋白在大豆中表达产物的活性比较。

将含pRPS28-GUS-BAR、pRPS28-I-GUS-BAR、pEIF1-GUS-BAR、pEIF1-I-GUS-BAR、pGmUbi-GUS-BAR重组载体的大豆转基因植株T3代纯合体培养15天，取根、三出复叶、真叶、子叶等组织，液氮速冻保存。对GUS活性进行定量测定，以4-MU为标准品，以4-MUG为底物，通过酶标仪，在激发光为365nm，发射光为455nm条件下测定产生的值。然后根据标准曲线，计算产生的4-MU的值，并计算GUS活性pmol 4-MU/μg总蛋白/min。

如图7所示，为pRPS28启动子、pRPS28-I启动子、pEIF1启动子、pEIF1-I启动子与pGmUbi启动子分别驱动GUS蛋白在大豆根、复叶、真叶、子叶等组织部位的活力检测结果。从图中可以看出pRPS28、pRPS28-I、pEIF1、pEIF1-I驱动的GUS在上述组织部位泛表达，结果表明pRPS28启动子驱动GUS蛋白的活性强于pRPS28-I启动子，pEIF1-I启动子驱动GUS蛋白的活性强于pEIF1启动子。从图中可以看出pRPS28启动子驱动GUS蛋白在大豆#20子叶中的活力为25.93pmolMU/min/μg，pRPS28启动子驱动GUS蛋白在大豆#35子叶中的活力为38pmolMU/min/μg，pEIF1-I启动子驱动GUS蛋白在大豆#13子叶中的活力为42.77pmolMU/min/μg，pEIF1启动子驱动GUS蛋白在大豆#77子叶中的活力为26.92pmolMU/min/μg，说明pRPS28启动子、pRPS28-I启动子、pEIF1启动子、pEIF1-I启动子能够驱动外源蛋白在大豆特定部位中具有较高的表达量以及活性，同时说明本发明的启动子更加适用于转化事件。

四、pRPS28和pEIF1驱动GUS蛋白在拟南芥和烟草中的转化

1、pRPS28-GUS、pRPS28-I-GUS、pEIF1-GUS、pEIF1-I-GUS启动子拟南芥转化载体、以及烟草转化载体的构建。

以试验二、中得到的pRPS28、pRPS28-I、pEIF1、pEIF1-I的PCR扩增片段为模板，并将上述PCR产物通过无缝克隆克隆进pCAMBIA1391Z-GUS-HYG（在转基因植物中为潮霉素抗性）的载体中，获得能够在拟南芥和烟草中转化的载体pRPS28-GUS-HYG、pRPS28-I-GUS-HYG、pEIF1-GUS-HYG、pEIF1-I-GUS-HYG载体，并分别转入拟南芥和烟草中，具体的扩增体系及引物设计如下：

反应体系：总体积为50μl，模板（上述扩增的DNA片段）1μl (约100ng)、2×phantaMAX fertility酶反应缓冲液25μl、10mM dNTP 1μl、4 μM引物 5μl（每条引物浓度为10mM，均为2 μl）、1μl phanta MAX fertility酶，加ddH₂O（无菌去离子水）至50μl。

构建pRPS28-GUS-HYG表达载体所用引物为：

pRPS28-GUS-HYG-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTTCACCACCCAATCCATAACCACCAC

pRPS28-GUS-HYG-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCCCTGATGCAAAACACGAACAAAGAAAG

构建pRPS28-I-GUS-HYG表达载体所用引物为：

pRPS28-I-GUS-HYG-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTTCACCACCCAATCCATAACCACCAC

pRPS28-I-GUS-HYG-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCC CCTGCTCAAACACAATCAACAG

构建pEIF1-GUS-HYG表达载体所用引物为：

pEIF1-GUS-HYG-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTT GGAGAGAAGTTGAACTCTGAGTTGTG

pEIF1-GUS-HYG-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCC CTGATCGTAAATTTAAGGTTTCG

构建pEIF1-I-GUS-HYG表达载体所用引物为：

pEIF1-I-GUS-HYG-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTT GGAGAGAAGTTGAACTCTGAGTTGTG

pEIF-I-GUS-HYG-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCC AAAACTTGACTCACTAAGACCAAAGG

2、pRPS28和pEIF1驱动GUS在拟南芥中的表达分析。

1）将含pRPS28-GUS-HYG、pRPS28-I-GUS-HYG、pEIF1-GUS-HYG、pEIF1-I-GUS-HYG重组载体的农杆菌GV3101重悬于拟南芥转化缓冲液中，花序浸染法转化拟南芥Col-0，筛选阳性苗，得到转基因拟南芥。

2）在pRPS28-GUS-HYG中筛选到GUS蛋白表达量一致的转基因line#5、#25、#38，在pRPS28-I-GUS-HYG中筛选到GUS蛋白表达量一致的转基因line#2、#5、#13，在pEIF1-GUS-HYG中筛选到GUS蛋白表达量一致的转基因line#3、#7、#12，在pEIF1-I-GUS-HYG中筛选到GUS蛋白表达量一致的转基因line#10、#11、#12，将以上转基因拟南芥的T3代苗撒种于拟南芥潮霉素筛选培养基中，置于4℃冰箱春化2 d。

3）然后移至光照培养箱（22±2℃，16/8 h）中培养7 d，每个line挑选5株T3代阳性植株幼苗进行GUS染色。然后将T3代阳性幼苗种入盆中（每盆5株），22±2°C，16/8 h条件下生长。待开花结荚期，选取拟南芥的花、荚果进行GUS染色，观察GUS的表达情况。

如图8所示，为pRPS28启动子、pRPS28-I启动子与pGmUbi启动子分别驱动GUS蛋白在转基因拟南芥T3代植株不同部位中的表达情况，a为pRPS28启动子驱动的GUS蛋白在拟南芥全株、花、荚果中的表达情况，b为pRPS28-I启动子驱动的GUS蛋白在拟南芥全株、花、荚果中的表达情况，说明pRPS28可以驱动目的基因（GUS基因）在拟南芥中异源泛表达。

图9所示，为pEIF1启动子、pEIF1-I启动子与pGmUbi启动子分别驱动GUS蛋白在转基因拟南芥T3代植株不同部位中的表达情况，a为pEIF1启动子驱动的GUS蛋白在拟南芥全株、花、荚果中的表达情况，b为pEIF1-I启动子驱动的GUS蛋白在拟南芥全株、花、荚果中的表达情况，说明pEIF1可以驱动目的基因（GUS基因）在拟南芥中异源泛表达。

3、pRPS28和PEIF1驱动GUS在烟草叶片中的表达分析。

将含pRPS28-GUS-HYG、pRPS28-I-GUS-HYG、pEIF1-GUS-HYG、pEIF1-I-GUS-HYG重组载体的农杆菌GV3101重悬于烟草叶片侵染液中，将浸染液用注射器注射到烟草Nicotianabenthamiana的叶片中，共培养2 d之后剪取转化的烟草叶片，GUS染色。

如图10所示，为pRPS28启动子、pEIF1启动子分别驱动GUS蛋白在转基因烟草叶片的瞬时表达情况，注射了空载体pCAMBIA1391Z的mock组的叶片无GUS表达，而pRPS28和pEIF1启动子组的叶片有GUS表达，试验结果表明pRPS28和pEIF1启动子驱动的GUS可以在烟草叶片中瞬时表达，表明pRPS28和pEIF1启动子可以异源驱动基因在烟草中表达。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南大学

<120> 大豆基因启动子pEIF1和pEIF1-I在大豆、拟南芥及烟草中的应用

<130> none

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 538

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 1

aatttttctc tctcgtctcg tggaagtgta agcaagcaaa accctagcgg cgcctgcttt 60

ctttgttcgt gttttgcatc agatggagtc tcaggtgaag cacgcacttg ttgtcaaagt 120

tatgggtcgt actggatcca gaggacaagt gacccaggtt agagtgaagt ttttggatga 180

tcagaaccgt cacatcatga ggaatgtgaa aggacctgtg agagaaggag acattctcac 240

cctactcgag tctgaaaggg aagcaagaag attgcgctag atggtctctt ttttttggct 300

tgcctccaaa ttcgaacaaa agcaatattt ttcttgatat ttatggtagt tagtcggtgc 360

taaaggggtt atagcaccct atcttattgt tttggatcta ttttcattcg aattattgct 420

tgaattttgt atgtttaaac ttcgagattg aggtatgctt tggtttaata tatgatttga 480

attatggctt aaattttgga ttaatatatg atatgtcttc tatatatggc gccattcc 538

<210> 2

<211> 2357

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 2

caccacccaa tccataacca ccacaccatc tccatcctat atctgaacat agcgacccca 60

atgctggccg cgtgcagcac cagcacggtc caacaacgtc gcgccactct gatgcaatcc 120

tccctaggaa gggaccaatc actagaacca tgagcaagag gctccaagaa gattgggcta 180

gagctgctga agaaggccct agggttctca tgaaccttag ggtagatttc tgagcccatg 240

ggccaaggtt gggtccaatt atctttgtac atattagact aggatgtcat tatatttggt 300

ccttgtatat agggctccat attgtaggta gggtacccta gaaatatagg atttttcagc 360

ccttgtattt ttgggcacct agactagttt ttgtattagg ggtagttttg taatttcaca 420

tgcactaagt ggatatttga tgtgtgtggt tggaaataaa tttaattgaa ttggtagaag 480

cccaatccaa ttaaatttta gagggggagg tgagcatttg cttactacac cccattgcca 540

catcatatag tcacactttg tgcatgtcct tcatgctttt catgcctcat gacacctaag 600

cacacttagt ggagaatctt gtaattgatc ttggattagt gggctgaacc ataactaaaa 660

ttcactaatc ataattagtg aaattttggc tccaaagttt ggctccacaa attcaatttc 720

aaattcaagt gaaatttgaa tttccctcca attttgtgtg acacttaggt tataaataga 780

ggtcatgtgt gtgtattttt ttcaactttg atcatttgaa tattaaactt cagatttcaa 840

agctcattta gagcacaaaa tttcgtgctc ttctctccct ctcccttcat tcatctcctt 900

cttcctccaa gctcttatcc atggcctcct atggtggtga gcttcttcta gactcatctt 960

ctccttgaag tggcgtctcc tctctctctc cctttctcca ttccgctgcc gttcatcttc 1020

caagaagcaa aggaatccat tgatgaagaa gatcctaggc ctacaagctc caatggagct 1080

tgcatcacac tccctaccca cgacccacga cccctacgcg cacgacctca atctctgagg 1140

ctcttcgtgt gtgactctct atcttcagat atgggttctt gggtttgggg atttttggat 1200

ttgttgggtt tctaggtttg ggatggagac cggggtctat ggtgtcgggg tggttgttgt 1260

tccaatgatg ttaagccaac aatggaaaca cgatttcatt tttggaatta cataaaaact 1320

caaccacgtg gatagtgaca ataatacttt tggtggtgcc aatagtagct tcccaagact 1380

tatttatttt tatgtgttat ttttttttgg ccttggcccg ttgattagaa aaaaataata 1440

cgaaggttaa aaacgtcatt tttgaattat taggccctat ataaatttcg ggaggggcta 1500

aatttttctc tctcgtctcg tggaagtgta agcaagcaaa accctagcgg cgcctgcttt 1560

ctttgttcgt gttttgcatc aggtgcgaac tcaccctatt gatttctatc cacagctgat 1620

ccttcttctc taattaattt attattattt ttcatgtatt gttctcgctt cactgcttct 1680

tatttggctc cgtcatttga aattgttttc ttttaattcg agtttcaaat tttcaatatc 1740

tgttactgtg tttatgattt caatttcatg gtggaattat tattgctttc tacgtgacgt 1800

tgaatttgta ctgtatgtgt tgatcttttg ttcttaattt gggtcgcata gtgtttgtgg 1860

cttgtttggt gaagtaacgt agacccgagt gttctaacaa atgatatgtt ggattctttc 1920

attagcatgc tttttggaat ttttgacctt tggaagtcgt atactgttca gcatcactaa 1980

atttagtcct ccctcaacaa aagaatctgg tgtaggatgc atcctatcaa atgaaacaag 2040

gtttatgctg aagtacaaga agactgatct gttattttga tgttattgct ggacttggtt 2100

ttcttttttc cttttatgtg atgtgtgcca tgtccatatt tgtattttta ccctatcagt 2160

tgtttggttc gtgtgaaact gtgaatgctt ttgttatttc ctgttacttt ggatgtcttc 2220

aatttaaggt ttttagtctt ctggatttcg aaggtgatac atatttacct gtcacggtga 2280

ccaattagct gtgatgcatt aaacccaatt gttttccaca ttcatctcat aaaaactgtt 2340

gattgtgttt gagcagg 2357

<210> 3

<211> 2357

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 3

caccacccaa tccataacca ccacaccatc tccatcctat atctgaacat agcgacccca 60

atgctggccg cgtgcagcac cagcacggtc caacaacgtc gcgccactct gatgcaatcc 120

tccctaggaa gggaccaatc actagaacca tgagcaagag gctccaagaa gattgggcta 180

gagctgctga agaaggccct agggttctca tgaaccttag ggtagatttc tgagcccatg 240

ggccaaggtt gggtccaatt atctttgtac atattagact aggatgtcat tatatttggt 300

ccttgtatat agggctccat attgtaggta gggtacccta gaaatatagg atttttcagc 360

ccttgtattt ttgggcacct agactagttt ttgtattagg ggtagttttg taatttcaca 420

tgcactaagt ggatatttga tgtgtgtggt tggaaataaa tttaattgaa ttggtagaag 480

cccaatccaa ttaaatttta gagggggagg tgagcatttg cttactacac cccattgcca 540

catcatatag tcacactttg tgcatgtcct tcatgctttt catgcctcat gacacctaag 600

cacacttagt ggagaatctt gtaattgatc ttggattagt gggctgaacc ataactaaaa 660

ttcactaatc ataattagtg aaattttggc tccaaagttt ggctccacaa attcaatttc 720

aaattcaagt gaaatttgaa tttccctcca attttgtgtg acacttaggt tataaataga 780

ggtcatgtgt gtgtattttt ttcaactttg atcatttgaa tattaaactt cagatttcaa 840

agctcattta gagcacaaaa tttcgtgctc ttctctccct ctcccttcat tcatctcctt 900

cttcctccaa gctcttatcc atggcctcct atggtggtga gcttcttcta gactcatctt 960

ctccttgaag tggcgtctcc tctctctctc cctttctcca ttccgctgcc gttcatcttc 1020

caagaagcaa aggaatccat tgatgaagaa gatcctaggc ctacaagctc caatggagct 1080

tgcatcacac tccctaccca cgacccacga cccctacgcg cacgacctca atctctgagg 1140

ctcttcgtgt gtgactctct atcttcagat atgggttctt gggtttgggg atttttggat 1200

ttgttgggtt tctaggtttg ggatggagac cggggtctat ggtgtcgggg tggttgttgt 1260

tccaatgatg ttaagccaac aatggaaaca cgatttcatt tttggaatta cataaaaact 1320

caaccacgtg gatagtgaca ataatacttt tggtggtgcc aatagtagct tcccaagact 1380

tatttatttt tatgtgttat ttttttttgg ccttggcccg ttgattagaa aaaaataata 1440

cgaaggttaa aaacgtcatt tttgaattat taggccctat ataaatttcg ggaggggcta 1500

aatttttctc tctcgtctcg tggaagtgta agcaagcaaa accctagcgg cgcctgcttt 1560

ctttgttcgt gttttgcatc aggtgcgaac tcaccctatt gatttctatc cacagctgat 1620

ccttcttctc taattaattt attattattt ttcatgtatt gttctcgctt cactgcttct 1680

tatttggctc cgtcatttga aattgttttc ttttaattcg agtttcaaat tttcaatatc 1740

tgttactgtg tttatgattt caatttcatg gtggaattat tattgctttc tacgtgacgt 1800

tgaatttgta ctgtatgtgt tgatcttttg ttcttaattt gggtcgcata gtgtttgtgg 1860

cttgtttggt gaagtaacgt agacccgagt gttctaacaa atgatatgtt ggattctttc 1920

attagcatgc tttttggaat ttttgacctt tggaagtcgt atactgttca gcatcactaa 1980

atttagtcct ccctcaacaa aagaatctgg tgtaggatgc atcctatcaa atgaaacaag 2040

gtttatgctg aagtacaaga agactgatct gttattttga tgttattgct ggacttggtt 2100

ttcttttttc cttttatgtg atgtgtgcca tgtccatatt tgtattttta ccctatcagt 2160

tgtttggttc gtgtgaaact gtgaatgctt ttgttatttc ctgttacttt ggatgtcttc 2220

aatttaaggt ttttagtctt ctggatttcg aaggtgatac atatttacct gtcacggtga 2280

ccaattagct gtgatgcatt aaacccaatt gttttccaca ttcatctcat aaaaactgtt 2340

gattgtgttt gagcagg 2357

<210> 4

<211> 834

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 4

cttgcgatat cttcactatt aaatatctgt tcttccaacc ataaccacac cacaccgagt 60

cgcagaaaaa gaaaaaagcg atcatagttt cacttcggcc ttatccagtt tagggtttcg 120

gttctctacc ctatctttca cgtatcgaaa ccttaaattt acgatcaggt ctgagcaatc 180

tggttggtag aacctttggt cttagtgagt caagttttat gtctgaatta gacgatcaaa 240

ttcctactgc cttcgatcct tttgctgatg caaatgctga tgactcgggt gctgggtcaa 300

aggagtatgt gcatattcgt gtacagcagc gaaatggtag gaaaagcctg acaaccgttc 360

agggattgaa aaaggaattc agctataaca agatacttaa agacgtcaag aaagagttct 420

gttgcaatgg aacagttgtt caggacccag aactaggaca ggttattcaa cttcaaggtg 480

atcagaggaa gaatgtttct accttcctag tccaggctgg tatcgtgaag aaggatcata 540

tcaagattca tggtttctga gcggttggag tcttaagtgt caaattttac ctgcctgact 600

atgtgttagg cataatatat aatctgagtc gtgtggatgt gattgtggta tttctaatgt 660

gttcttatgt tttaccatgt gatgtgggat tatggatttc agaacattgt gtgttatttg 720

ctttgaagac ttatatgaaa acggtttaat ggacccccgt atttaatctt atttcattta 780

gaacatataa aaaatgtagc tttgaaggct cgagctcttg taagctgtcg cttc 834

<210> 5

<211> 1640

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 5

ggagagaagt tgaactctga gttgtgtctc acaagactct cattcatcaa agttacaaca 60

agtgttacac atgcttctat ttatagacta ggtagcttcc ttgagaagct ttcttgagaa 120

aactttcttg agaagcttct ttgagaaaac ttccttgaga agctagagct tagctacaca 180

cacccctcta ataactaagc tcacctcctt gagaagcttc cttgagaaga ttcctaaaaa 240

agctagagct tagttacaca caccccctat aatagctaag ctcaccccca tgccaaaata 300

catgaaaata taaaaaaaaa tctctattac aaagattact caaaatgccc tgaaatacaa 360

ggctaaaacc ctatactact agaatggcca aaatacaagg ctcaaaagaa ggaaaaccca 420

attctaacat ttacaaagaa gaatggatcc aaccttgacc catgggctca aaaatctacc 480

ctaaggttca tgagaacctt agggccttct ttagtagctc tagcccaagc ctcttggagt 540

cttctatcca atacccttgg ggggtaggat tacatcagac tagacaattc aaaaaatatt 600

tgtccaacat ttgatttaaa aaatgactga gggataggac aaaataaaga aggatggact 660

ggatgaatac ccaaaaactt gtaactcact aaacttccat acaacttttt gtctagtgtc 720

taacaaaagt aaaaatacaa tactattcct atttttgact tttcattatt tcacaccttc 780

tttcttattc catatgcgcc tcattctcca aatattaaca agctcatcgc cctcctatcc 840

atcatcgtgc tggagctctc ccaattcgcc tccaccatac cccttatcgt ggatctctca 900

gaccactcct ccctctccat tctcttcgtc cccaacacct acctcgctgc cgacgaccac 960

cacttctccc cgaccacctt catcgacgcc aatcgctacc acttcctcct ccaattcctt 1020

tcttggtccg acctttgcgt cttccccctt ggcaagctca tcaccacact tcttcaaatc 1080

accgcccgtg ctaccaacaa tttcagtttc gtgaacctca tctgcgactc tcattctaat 1140

gtcatctcaa tccggtttcc cgcgactctt aatctaatgt tttccattaa tggacattag 1200

ctaatatttt taatggaaaa cataaaaaat gactaaaaga aaactcttaa tataacttat 1260

taaaatatat attttttaaa tttataaaat gacagtgaaa tataataaat caatagtaat 1320

atttaattta ataaaaatat ttaaacataa atcttattat tttaaaatta attttacaaa 1380

attaatttat ttaaaatcaa ttttatgaat gctgatataa gtatcgactt tattccctgt 1440

ttttcggatc ataacacgtg acacgcgtgc ttcttgcgat atcttcacta ttaaatatct 1500

gttcttccaa ccataaccac accacaccga gtcgcagaaa aagaaaaaag cgatcatagt 1560

ttcacttcgg ccttatccag tttagggttt cggttctcta ccctatcttt cacgtatcga 1620

aaccttaaat ttacgatcag 1640

<210> 6

<211> 2370

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 6

ggagagaagt tgaactctga gttgtgtctc acaagactct cattcatcaa agttacaaca 60

agtgttacac atgcttctat ttatagacta ggtagcttcc ttgagaagct ttcttgagaa 120

aactttcttg agaagcttct ttgagaaaac ttccttgaga agctagagct tagctacaca 180

cacccctcta ataactaagc tcacctcctt gagaagcttc cttgagaaga ttcctaaaaa 240

agctagagct tagttacaca caccccctat aatagctaag ctcaccccca tgccaaaata 300

catgaaaata taaaaaaaaa tctctattac aaagattact caaaatgccc tgaaatacaa 360

ggctaaaacc ctatactact agaatggcca aaatacaagg ctcaaaagaa ggaaaaccca 420

attctaacat ttacaaagaa gaatggatcc aaccttgacc catgggctca aaaatctacc 480

ctaaggttca tgagaacctt agggccttct ttagtagctc tagcccaagc ctcttggagt 540

cttctatcca atacccttgg ggggtaggat tacatcagac tagacaattc aaaaaatatt 600

tgtccaacat ttgatttaaa aaatgactga gggataggac aaaataaaga aggatggact 660

ggatgaatac ccaaaaactt gtaactcact aaacttccat acaacttttt gtctagtgtc 720

taacaaaagt aaaaatacaa tactattcct atttttgact tttcattatt tcacaccttc 780

tttcttattc catatgcgcc tcattctcca aatattaaca agctcatcgc cctcctatcc 840

atcatcgtgc tggagctctc ccaattcgcc tccaccatac cccttatcgt ggatctctca 900

gaccactcct ccctctccat tctcttcgtc cccaacacct acctcgctgc cgacgaccac 960

cacttctccc cgaccacctt catcgacgcc aatcgctacc acttcctcct ccaattcctt 1020

tcttggtccg acctttgcgt cttccccctt ggcaagctca tcaccacact tcttcaaatc 1080

accgcccgtg ctaccaacaa tttcagtttc gtgaacctca tctgcgactc tcattctaat 1140

gtcatctcaa tccggtttcc cgcgactctt aatctaatgt tttccattaa tggacattag 1200

ctaatatttt taatggaaaa cataaaaaat gactaaaaga aaactcttaa tataacttat 1260

taaaatatat attttttaaa tttataaaat gacagtgaaa tataataaat caatagtaat 1320

atttaattta ataaaaatat ttaaacataa atcttattat tttaaaatta attttacaaa 1380

attaatttat ttaaaatcaa ttttatgaat gctgatataa gtatcgactt tattccctgt 1440

ttttcggatc ataacacgtg acacgcgtgc ttcttgcgat atcttcacta ttaaatatct 1500

gttcttccaa ccataaccac accacaccga gtcgcagaaa aagaaaaaag cgatcatagt 1560

ttcacttcgg ccttatccag tttagggttt cggttctcta ccctatcttt cacgtatcga 1620

aaccttaaat ttacgatcag gtaatctccg atcatttttt ctcagatttg atttatcttc 1680

cgcgctaatt ttagggttcg actttcgctt tgtctcccat gatctaagtt tgactcaatt 1740

ttcttttctg ctttttttcc ccgttaccgt acattttttt tggggttcga tatatttttt 1800

atcagatctt tcagctataa atcgtgtatt tgttgttagt gaaaagtgtt ttttttttcc 1860

ttttcctaat tcagtatttc attttgattt aagtgtacga tgatttttga gttatgggct 1920

ttttttttct gtgataactt tttgacggtg tggttgctag attgtcacca tgaactatat 1980

caattttaag tcaaaacctg taatctagga aagcattctg ttttatgctg ctgagatctt 2040

ttgaatgtat ctaaagttga aactaattgt gggatttttt taatcgcttt cattttaaat 2100

cattcagttg cattattttt ggtgttttta atttgaagca aaggtaatta ggtaggcaat 2160

ttttaataca tgggatggtc attgctgata tcttctttcg tttggtgtgt tgaagattgt 2220

tttgatgcga tgattaatga cactggtttt gcttttgaat ttttgtaaag tttgctatta 2280

tagtaattca atttaactaa catgttgatt ttattttcag gtctgagcaa tctggttggt 2340

agaacctttg gtcttagtga gtcaagtttt 2370

<210> 7

<211> 552

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 7

atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 60

gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 120

caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 180

gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc 240

aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 300

ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 360

agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 420

ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 480

gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc 540

accgagatct ga 552

Claims

1.大豆基因启动子在外源基因表达中的应用，其特征在于，所述启动子为全长型启动子pEIF1或内含子存在型启动子pEIF1-I，所述启动子作为泛表达启动子，用于驱动外源基因表达；启动子pEIF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，启动子pEIF1-I的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外源基因为GUS基因。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述启动子用于大豆时，能够驱动外源基因在大豆子叶、胚根、胚芽、真叶、复叶、芽、叶柄、节间、根和根瘤中表达。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述启动子用于拟南芥时，能够驱动外源基因在拟南芥全株、花、荚果中表达。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述启动子用于烟草时，能够驱动外源基因在烟草叶片中表达。

6.含有大豆基因启动子的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将大豆基因启动子pEIF1或pEIF1-I重组进入载体pCAMBIA1391Z-BAR中构建获得，具体步骤如下：以pEIF1或pEIF1-I的PCR扩增片段为模板，并将PCR扩增片段通过无缝克隆法克隆进大豆稳定转化载体pCAMBIA1391Z-BAR中，获得大豆稳定转化载体pEIF1-GUS-BAR、pEIF1-I-GUS-BAR；

所述载体pCAMBIA1391Z-BAR，是将载体pCAMBIA1391Z首先采用限制性内切酶XhoI将载体线性化，然后再通过无缝克隆的方法将载体中的筛选标记HygR基因替换为BAR基因得到的；

构建pEIF1-GUS-BAR表达载体所用引物为：

pEIF1-GUS-BAR-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTT GGAGAGAAGTTGAACTCTGAGTTGTG

pEIF1-GUS- BAR-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCC CTGATCGTAAATTTAAGGTTTCG，

构建pEIF1-I-GUS-BAR表达载体所用引物为：

pEIF1-I-GUS-BAR-F：

GACCATGATTACGCCAAGCTT GGAGAGAAGTTGAACTCTGAGTTGTG

pEIF1-I-GUS-BAR-R：

CCAGTGAATTCCCGGGGATCC AAAACTTGACTCACTAAGACCAAAGG，

启动子pEIF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，启动子pEIF1-I的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。